WO2023038073A1 - 乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、発酵乳の製造方法、及び乳酸菌のスクリーニング方法 - Google Patents

乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、発酵乳の製造方法、及び乳酸菌のスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023038073A1
WO2023038073A1 PCT/JP2022/033649 JP2022033649W WO2023038073A1 WO 2023038073 A1 WO2023038073 A1 WO 2023038073A1 JP 2022033649 W JP2022033649 W JP 2022033649W WO 2023038073 A1 WO2023038073 A1 WO 2023038073A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lactic acid
acid bacteria
fermented milk
acid bacterium
bacteria
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/033649
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
恵理 山本
佳子 本目
恵美 遠山
浩文 後藤
Original Assignee
株式会社明治
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社明治 filed Critical 株式会社明治
Priority to JP2023546976A priority Critical patent/JPWO2023038073A1/ja
Priority to CN202280060943.6A priority patent/CN117957307A/zh
Publication of WO2023038073A1 publication Critical patent/WO2023038073A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to lactic acid bacteria, lactic acid starter, fermented milk, and a method for producing fermented milk, more specifically, lactic acid bacteria, lactic acid bacteria starter and fermented milk containing the same, and methods for producing fermented milk, and further, lactic acid bacteria. It relates to a screening method.
  • fermented milk, etc. containing non-fat milk solids equal to or higher than milk is fermented with lactic acid bacteria or yeast. made into a paste or liquid, or frozen.
  • fermented milk include yogurt such as set type yogurt (solid fermented milk), soft type yogurt (paste-like fermented milk), and drink type yogurt (liquid fermented milk).
  • yogurt for example, in the "Codex standards (FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) / WHO (World Health Organization))", which is a food standard shared by the international community, "Lactobacillus delbrueckii subspecies Bulgari bulgaricus and Streptococcus thermophilus (S. thermophilus), which are subjected to lactic acid fermentation.”
  • FEO Food and Agriculture Organization of the United Nations
  • WHO World Health Organization
  • yogurt generally refers to a product obtained by adding these two types of bacteria as a starter to raw milk and fermenting the lactose in the raw milk, and having a sour taste mainly due to the lactic acid produced by the fermentation. characterized by
  • lactic acid bacteria such as Streptococcus thermophilus can produce lactic acid by fermentation even at low temperatures
  • the fermented product after the fermentation for example, fermented milk such as yogurt
  • the fermented product after the fermentation cannot be stored under low temperature conditions. Even so, there was a problem that the amount of lactic acid produced was excessive and the acidity increased (that is, the pH decreased), and the flavor was spoiled.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-236416
  • Patent Document 2 describes an acid production-suppressing strain of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus for the purpose of obtaining fermented milk with little increase in acidity under low-temperature storage. and a viscous-producing strain of Streptococcus salivarius subspecies thermophilus.
  • Patent Document 2 12% reduced skim milk with 0.05% yeast extract is coagulated at 37 to 43 ° C. within 3 hours, and 0.05% yeast extract is solidified at 15 to 25 ° C.
  • a lactic acid bacterium strain belonging to cold-sensitive Streptococcus thermophilus that does not clot added 12% reconstituted skim milk within 3 days is patented, and Streptococcus thermophilus SBT0144 is described as said lactic acid bacterium strain.
  • Patent Document 3 describes a Lactobacillus delbrueckii subsp.
  • H + is not excreted outside the cells, and the pH in the cells decreases, suppressing growth (that is, causing so-called apoptosis). It is described that the amount of lactic acid produced is reduced.
  • Patent Document 4 describes a Lactococcus lactis subspecies lactis mutant strain with reduced ATPase activity.
  • Patent Document 5 describes the use of Lactobacillus lactic acid bacteria with low ATPase activity for the purpose of suppressing an increase in lactic acid acidity during long-term low-temperature storage.
  • JP-A-7-236416 Japanese Patent No. 4331309 JP-A-2001-95561 Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-9954 JP-A-7-123977
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and provides fermented milk in which a decrease in pH during low-temperature storage is suppressed and the number of viable lactic acid bacteria is sufficiently maintained even by the low-temperature storage.
  • An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium that can be obtained, a lactic acid starter and fermented milk containing the lactic acid bacterium, a method for producing the fermented milk, and a method for screening the lactic acid bacterium.
  • the present inventors have conducted intensive research to achieve the above objects. Genome analysis was performed between lactic acid bacteria that produce high acidity and lactic acid bacteria that cannot suppress the same pH drop (high acid-producing lactic acid bacteria). In this genome analysis, multiple mutations that are common to low-acid-producing lactic acid bacteria and are accompanied by amino acid mutations (loss-of-function mutations) were extracted. Then, recombinant strains of low-acid-producing and high-acid-producing lactic acid bacteria were It was created and verified whether each mutation contributes to the amount of acid production.
  • the present inventors have found that, according to lactic acid bacteria in which the function of the ATP synthase complex containing the ⁇ subunit is suppressed, a decrease in pH is suppressed even by low-temperature storage, and that the low-temperature storage
  • fermented milk in which the viable count of lactic acid bacteria is sufficiently maintained can be obtained, and have completed the present invention.
  • Such aspects of the present invention are as follows.
  • [1] A lactic acid bacterium in which the function of the ATP synthase complex is suppressed.
  • [2] The lactic acid bacterium according to [1], wherein the function of the ⁇ subunit of the ATP synthase complex is suppressed.
  • [3] The lactic acid bacterium according to [1] or [2], which is a Streptococcus lactic acid bacterium.
  • the lactic acid bacterium according to [3] which belongs to Streptococcus thermophilus.
  • [5] The lactic acid bacterium according to [4], which carries the PrtS gene.
  • [6] The lactic acid bacterium according to any one of [1] to [5], wherein the function suppression of the ATP synthase complex is a loss-of-function mutation in the ⁇ subunit gene.
  • [9] The lactic acid bacterium composition according to [8], wherein the lactic acid bacterium is a Streptococcus lactic acid bacterium and further contains a Lactobacillus lactic acid bacterium.
  • a method for screening lactic acid bacteria comprising a selection step of selecting low-acid-producing lactic acid bacteria using inhibition of the function of the ATP synthase complex as an index.
  • a method for producing fermented milk comprising a fermentation step of obtaining fermented milk by adding lactic acid bacteria selected by the screening method for lactic acid bacteria according to [14] to a formula liquid containing raw material milk and fermenting them.
  • a lactic acid bacterium capable of obtaining fermented milk in which a decrease in pH during storage at a low temperature (for example, 10° C.) is suppressed and in which the number of viable lactic acid bacteria is sufficiently maintained even by the storage at a low temperature can be obtained. It is possible to provide a lactic acid bacteria starter and fermented milk, a method for producing fermented milk, and a method for screening lactic acid bacteria.
  • FIG. 10 is a graph showing the fermentation time (minutes) of the recombinant strain, the P2101201 strain, and the OLS4803 strain in Test Example 3.
  • FIG. 10 is a graph showing changes over time in pH of the recombinant strain, P2101201 strain, and OLS4803 strain during storage at 10° C. in Test Example 3.
  • FIG. 10 is a graph showing changes over time in viable cell counts of recombinant strains, P2101201 strain, and OLS4803 strain when stored at 10° C. in Test Example 3.
  • lactic acid bacteria is a general term for microorganisms capable of assimilating glucose to produce lactic acid at a yield of 50% or more based on sugar, and as physiological properties, they are Gram-positive cocci or bacilli. characteristics such as no motility, no ability to form spores in many cases (some lactic acid bacteria have the ability to form spores, such as Bacillus coagulans), and negative catalase.
  • lactic acid bacteria of the present invention examples include Streptococcus lactic acid bacteria, Lactobacillus lactic acid bacteria (e.g., Lactobacillus delbrueckii (particularly, Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus (Bulgaria bacterium), Lactobacillus delbrueckii), Lactobacillus delbrueckii subspecies delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis, Lactobacillus delbrueckii subspecies indicus, Lactobacillus delbrueckii subspecies sunki, Lactobacillus delbrueckii subspecies Jacobseni, etc.) , Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus paragasseri, Lactobacillus amylovoros, Lacto
  • Streptococcus lactic acid bacteria are aerobic Gram-positive cocci. Lactic acid bacteria belonging to the genus Streptococcus include Streptococcus thermophilus and Streptococcus salivarius. Among these, the lactic acid bacterium of the present invention preferably belongs to Streptococcus thermophilus.
  • Streptococcus thermophilus also called Streptococcus thermophilus, is a lactic acid bacterium capable of producing lactic acid from lactose.
  • lactic acid bacteria belonging to Streptococcus thermophilus are sometimes referred to as "S. thermophilus”.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is S.
  • Thermophilus it preferably possesses the prtS gene.
  • S. cerevisiae harboring the prtS gene By using Thermophilus, the time required for completion of fermentation can be shortened, and fermented milk with a more favorable flavor tends to be obtained.
  • the "prtS gene” refers to a gene encoding a cell wall-bound serine protease that degrades casein.
  • S. Thermophilus possesses the prtS gene, for example, S. cerevisiae, which can be obtained from public databases (Genbank, etc.).
  • a sequence highly conserved among prtS genes of Thermophilus is selected, a part of the prtS gene is amplified by PCR using a primer set prepared based on the sequence, and the desired PCR product is obtained. can do.
  • the primer set include, but are not limited to, a primer set consisting of Fprimer and Rprimer described in the Examples below.
  • the lactic acid bacteria of the present invention are lactic acid bacteria whose ATP synthase complex is functionally suppressed (including lactic acid bacteria whose ATP synthase complex is artificially functionally suppressed).
  • the "ATP synthase complex” is a protein complex composed of a plurality of constituent proteins, has a molecular weight exceeding 500,000, and has enzymatic activity to synthesize ATP from ADP and inorganic phosphate. Eight proteins, A subunit, B subunit, C subunit, ⁇ subunit, ⁇ subunit, ⁇ subunit, ⁇ subunit, and ⁇ subunit, are known as constituent proteins of the ATP synthase complex. ing.
  • the amino acid sequence of each constituent protein of the ATP synthase complex and the base sequence encoding it can be obtained from public databases (Genbank, etc.).
  • the amino acid sequences of each constituent protein derived from Thermophilus and the nucleotide sequences encoding them typically include the sequences shown in Table 1 below.
  • Table 1 shows S.M.
  • SEQ ID NOs showing typical amino acid sequences of each constituent protein from Thermophilus are indicated respectively.
  • the ATP synthase complex is a S. It functions not only in Thermophilus but also in a wide range of lactic acid bacteria. For example, among Streptococcus lactic acid bacteria, it has a high identity of almost 100% (at least 90% or more, more preferably 93% or more).
  • "Inhibition of ATP synthase complex function" in the present invention includes decreased activity including inactivation of the ATP synthase complex and decreased expression of the ATP synthase complex. Suppression of the function of the ATP synthase complex may be suppression of the function of the entire complex, or suppression of the function of one or a combination of two or more of the constituent proteins. It preferably includes functional suppression of the unit and/or the ⁇ subunit, more preferably includes at least functional suppression of the ⁇ subunit.
  • Reduced activity of the ATP synthase complex means that the intrinsic activity of the ATP synthase complex is decreased, and the activity level is usually lower than that of the control. means that in addition, “reduced activity of ATP synthase complex” includes both inactivation and reduced activity of part or all of the ATP synthase complex.
  • the method for directly confirming the "decreased activity of the ATP synthase complex" of lactic acid bacteria is not particularly limited, but for example, a protein sample is prepared from the target lactic acid bacterium, NADH is added in the presence of an indicator (for example, luciferase) or the like, fluorescence change due to proton (H + ) transport activity in ATP synthase activity is measured, and the activity is compared with that in a control.
  • an indicator for example, luciferase
  • fluorescence change due to proton (H + ) transport activity in ATP synthase activity is measured, and the activity is compared with that in a control.
  • the measuring method for example, Suzuki et al. , 2007, PNAS, Vol. 104, no.
  • the protein sample is added to PA3 buffer containing 2.5 mM potassium phosphate, 0.5 mM ADP, and 2.5 mM NaCl ( 10 mM Hepes/KOH (pH 7.5), 10% Glycerol, 5 mM MgCl 2 ) to prepare a reaction solution, add an appropriate amount of luciferase to the reaction solution, and add NADH at a final concentration of 1.7 mM.
  • a method of starting a reaction, measuring fluorescence, and measuring the amount of change in fluorescence as proton transport activity, ie, ATP synthase activity, can be used.
  • the amount of the protein sample, the reaction solution, and the luciferase can be appropriately adjusted depending on the conditions of the sample.
  • the method for preparing a protein sample from the lactic acid bacteria is not particularly limited, and a known method or a method based thereon can be appropriately employed.
  • the activity is decreased compared to the control, it can be determined that the activity of the ATP synthase complex is decreased in the lactic acid bacterium, that is, the function of the ATP synthase complex is suppressed.
  • the criterion is not particularly limited, but for example, if the activity (SD: standard deviation) is 4 SD or less, 3 SD or less, or 2 SD or less of the average value of the activity in the control, the ATP synthase activity is low, that is, the It may be determined that the activity of the ATP synthase complex is reduced in lactic acid bacteria.
  • Examples of controls at this time include lactic acid bacteria known to have no reduction in the activity of the ATP synthase complex, more specifically, for example, Streptococcus thermophilus OLS4496 identified by accession number NITE BP-02875. (hereinafter sometimes referred to as "OLS4496 strain").
  • the OLS4496 strain is (1) Identification: Streptococcus thermophilus OLS4496, (2) Accession number: NITE BP-02875, (3) Accession date: February 5, 2019, (4) Depository: Independent administrative agency It has been deposited at the Patent Microorganism Depositary Center, National Institute of Technology for Product Evaluation (2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Room 122).
  • a decrease in the activity of the ATP synthase complex is typically caused by loss-of-function mutations in the genes of the constituent proteins that constitute the complex. Therefore, in the present invention, the "reduced activity of the ATP synthase complex" of lactic acid bacteria is indirectly obtained by detecting "loss-of-function mutations in genes of constituent proteins" in lactic acid bacteria in which the mutations have been detected. It can be determined that the activity of the ATP synthase complex is reduced, that is, the function of the ATP synthase complex is inhibited.
  • loss-of-function mutations refer to mutations accompanied by amino acid mutations, and the amino acid mutations include substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acids.
  • loss-of-function mutations include, but are not particularly limited to, missense mutations, nonsense mutations, or frameshift mutations due to substitution of one or more bases; and/or mutations associated with gene disruption (e.g., 1 or more, 5 or more, or 10 or more (preferably 20, 30, 40, 50, or 60 or more) amino acid substitutions and/or or mutation with deletion).
  • a loss-of-function mutation in the genes of the constituent proteins is a loss-of-function mutation in the A subunit gene and the ⁇ subunit.
  • it is at least one of loss-of-function mutations in the gene, more preferably loss-of-function mutations in the ⁇ subunit gene.
  • the A subunit one of the constituent proteins, is the part of the ATP synthase complex that has the catalytic activity of the same enzyme, loss-of-function mutations (amino acid mutations) in the gene encoding this A subunit When generated, it causes a decrease in activity of the ATP synthase complex. More specifically, the loss-of-function mutation in the A subunit gene is preferably a loss-of-function mutation in the base sequence of SEQ ID NO:1.
  • loss-of-function mutations in the A subunit gene include, for example, the first valine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or the valine corresponding to the first valine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. However, it is not limited thereto.
  • the ⁇ subunit which is one of the constituent proteins, contributes to binding to ATP in the ATP synthase complex, loss-of-function mutations (amino acid mutations) in the gene encoding this ⁇ subunit have been observed. When it occurs, it causes a decrease in the activity of the ATP synthase complex (Krah A. et al., 2018, rsob.royalsocietypublishing.org, Open Biol. 8:170275, etc.). More specifically, the loss-of-function mutation in the ⁇ subunit gene is preferably a loss-of-function mutation in the base sequence of SEQ ID NO:15.
  • loss-of-function mutations in the epsilon subunit gene include, for example, 10 or more (preferably 20 1, 30, 40, 50, or 60 or more, more preferably 20, 30 of the amino acids following the glutamic acid corresponding to the 86th glutamic acid in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, 40, 50, or 60 or more) amino acid substitutions (missenses) or deletions, base substitutions, deletions, or insertions (more preferably deletions or substitutions); Substitution of a base that causes substitution of the 30th glycine in the amino acid sequence or the glycine corresponding to the 30th glycine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 with another amino acid (e.g., alanine); and a sequence At least any one of the 86th glutamic acid, the 95th arginine, and the 129th arginine of the amino acid sequence described in number 16, or an amino acid corresponding to any of these amino acids, Examples include, but are not
  • an amino acid sequence or an amino acid sequence or an amino acid that "corresponds" to an amino acid refers to amino acid sequence analysis software (GENETYX-MAC, Sequencer, etc.) or BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information ( U.S. National Center for Biological Information Basic Local Alignment Search Tool)), etc. (e.g., parameter: default value (i.e., default value)), when the amino acid sequences are aligned, a reference amino acid sequence (e.g., sequence No.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16
  • amino acid e.g., valine at position 1 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, glycine at position 30 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, etc.
  • the method for detecting the "loss-of-function mutation of the gene of the constituent protein" in the present invention is not particularly limited, but includes, for example, the following methods.
  • detection of mutation of a gene means, in principle, detection of mutation in genomic DNA. Since it is reflected in changes in the transcription products and translation products, it also includes detection of the changes (that is, indirect detection).
  • One aspect of the detection method includes a method of detecting a mutation by directly determining the base sequence of the gene region of the constituent protein of the ATP synthase complex and comparing it with a control.
  • the "gene region of the constituent protein” means a certain region on the genomic DNA containing the gene of the constituent protein.
  • the regions independently include, in addition to the translation region, the expression control region of each gene (eg, promoter region, enhancer region) and the 5'-terminal untranslated region of each gene as untranslated regions.
  • DNA samples include genomic DNA samples and cDNA samples prepared by reverse transcription from RNA.
  • the method for extracting genomic DNA or RNA from the lactic acid bacteria and the method for preparing cDNA are not particularly limited, and known methods or methods based thereon can be appropriately employed.
  • DNA containing the gene region of the constituent protein is isolated, and the base sequence of the isolated DNA is determined. Isolation of the DNA can be carried out, for example, by PCR or the like using genomic DNA or RNA as a template, using a pair of oligonucleotide primers designed to sandwich all or part of the gene region of the constituent protein. can.
  • the base sequence of the isolated DNA can be determined by methods known to those skilled in the art, such as the Maxam-Gilbert method and the Sanger method.
  • a library can be prepared from the DNA sample, and the base sequence can be determined using a next-generation sequencer or the like capable of high-speed and comprehensive readout analysis of gene base sequences.
  • Controls at this time include known base sequences of the genes of each constituent protein, which can be obtained from public databases (Genbank, etc.). More specifically, for example, each base sequence listed in Table 1 can be mentioned.
  • Another embodiment of the detection method includes, for example, the following method: A method using Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP, in which DNA containing all or part of the gene region of a constituent protein is amplified, and the size of the DNA fragment produced by the restriction enzyme of the amplification product is compared with a control. or PCR-RFLP method; A PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method in which the amplified product is dissociated into single-stranded DNA, separated on a non-denaturing gel, and the mobility on the gel is compared with a control.
  • a method using Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP in which DNA containing all or part of the gene region of a constituent protein is amplified, and the size of the DNA fragment produced by the restriction enzyme of the amplification product is compared with a control.
  • PCR-RFLP method A PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method in which
  • a denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE) method in which the amplified products are separated on a DNA denaturant concentration gradient gel and the mobility on the gel is compared with a control;
  • DGGE denaturant gradient gel electrophoresis
  • a MALDI-TOF/MS method in which a ddNTP primer extension reaction is performed using a mass-determined genotype compared to a control; 5'-"All or part of the genetic region of the constituent protein and a base sequence complementary to the base sequence on the 5' side thereof"-"All or part of the 1 base 3' side of the genetic region of the constituent protein A base and a base sequence that does not hybridize with the base sequence on the 3' side thereof"-An oligonucleotide probe consisting of 3' (flap), and "all or part of the base of the gene region of the constituent protein and the base sequence on the 3' side thereof After hybridizing an oligonucleotide probe having a base sequence complementary to "to the DNA sample, the amount of flap released by cleavage with a single-stranded DNA cleaving enzyme is labeled with a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye.
  • the Invader method which measures based on oligonucleotide probes obtained and compares to a control;
  • the amplified product is dissociated into single strands, and only one strand is separated, followed by elongation reaction by one base from the vicinity of all or part of the bases of the gene region of the constituent protein, and pyrophosphate generated at that time.
  • Pyrosequencing method to measure and compare to control;
  • the AcycloPrime method in which a single-base extension reaction is performed with the "oligonucleotide primer having", and the degree of fluorescence polarization is measured and compared with a control; is mentioned.
  • DNA samples prepared in the same manner as described above from lactic acid bacteria known to have no gene mutation of each constituent protein can be mentioned.
  • the following method Using the DNA sample as a template, which is hybridized with an oligonucleotide probe having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence containing the mutation site of the gene region of the constituent protein and labeled with a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye.
  • a double-dye probe method for amplifying a nucleotide sequence containing a mutation site in the gene region of the constituent protein and detecting fluorescence emitted by the reporter fluorescent dye;
  • the DNA sample is used as a template to amplify and detect a nucleotide sequence containing a mutation site in a gene region of a constituent protein (HRM).
  • HRM constituent protein
  • a DNA array method or the like using a substrate on which a DNA containing a mutation site in a gene region of a constituent protein and an oligonucleotide probe that hybridizes to the DNA is immobilized may be employed.
  • a protein sample is prepared from the target lactic acid bacterium, and a molecule (e.g., antibody) that specifically binds to the amino acid mutation site is used to detect the mutation site.
  • a molecule e.g., antibody
  • method for detecting peptide mass fingerprinting method (PMF), protein sequencer (Edman degradation method), etc.
  • PMF peptide mass fingerprinting method
  • protein sequencer Edman degradation method
  • an antigen-antibody reaction is performed on the protein sample using the antibody to detect the constituent protein having the amino acid mutation site.
  • the constituent protein of interest can be directly detected. Protein A) may be acted upon and indirectly detected.
  • Examples of such methods include immunohistochemistry (immunostaining), Western blotting, ELISA, flow cytometry, imaging cytometry, radioimmunoassay, immunoprecipitation, analysis using antibody arrays, and the like.
  • the method for preparing a protein sample from the lactic acid bacteria is not particularly limited, and a known method or a method based thereon can be appropriately employed.
  • the decreased expression of the constituent proteins is preferably decreased expression of the A subunit protein and/or the ⁇ subunit protein. , more preferably down-regulation of the epsilon subunit protein. More specifically, such expression reduction is more preferably (a) reduction in expression of a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 16 (preferably SEQ ID NO: 16).
  • the amino acid sequence encoded by the sequence may be mutated due to mutation of the nucleotide sequence.
  • it may be decreased expression of a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 (preferably SEQ ID NO: 16).
  • the one or more amino acid residues are preferably 1 to 10 amino acid residues, more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 3, particularly preferably 2 or less.
  • the reduced expression of the constituent protein is (c) an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 16 (preferably SEQ ID NO: 16). It may be a decrease in expression of a protein consisting of.
  • amino acid sequence identity can be determined using, for example, the BLASTP program (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 1990, p. 403-410).
  • identity with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 16 may be 80% or more, preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more (e.g., 96% or more) , 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the proteins (b) and (c) whose expression levels are to be detected need to be proteins whose functions are not suppressed.
  • the constituent protein whose expression is decreased in the lactic acid bacterium of the present invention may be at least one of the above (a) to (b), but the above (a) is preferred.
  • RNA is first extracted from the target lactic acid bacterium, and a cDNA sample is prepared by reverse transcription from the RNA.
  • the method for extracting RNA from the lactic acid bacteria and the method for preparing the cDNA sample are not particularly limited, and known methods or methods based thereon can be appropriately employed.
  • an amplification reaction using oligonucleotide primers or a hybridization reaction using oligonucleotide probes is performed to detect the amplification product or hybrid product, and quantify the amount if necessary.
  • RNA-seq method can be the expression level at the transcription level.
  • Such methods include, for example, RT-PCR method, Northern blot method, dot blot method, DNA array method, in situ hybridization method, RNase protection assay method, mRNA-seq method and the like.
  • typical sequences of amino acids of each constituent protein that can be obtained from public databases (Genbank, etc.) and base sequences encoding them (more specifically, for example, the amino acid sequences and base sequences described in Table 1) sequence), oligonucleotide primers and oligonucleotide probes suitable for each method can be designed by conventional methods.
  • the expression level at the detected transcription level is lower than in the control, it is determined that the expression level of the constituent protein is reduced in the lactic acid bacterium, that is, the function of the ATP synthase complex is suppressed. can do.
  • the criterion is not particularly limited, but for example, if the expression level is 4 SD or less, 3 SD or less, or 2 SD or less of the average expression level in the control, the expression level of the ATP synthase complex in the lactic acid bacterium is reduced. It may be determined that
  • a cDNA sample prepared in the same manner as described above from lactic acid bacteria known to have no decrease in the expression of each constituent protein can be mentioned. More specifically, for example, OLS4496 strain in the same manner as described above Prepared cDNA samples.
  • a protein sample is prepared from the target lactic acid bacterium.
  • a method for preparing a protein sample from the lactic acid bacteria is not particularly limited, and a known method or a method based thereon can be appropriately employed.
  • an antigen-antibody reaction is performed using an antibody specific to the constituent protein, the constituent protein is detected, and the amount thereof is quantified as necessary, whereby the expression level at the translation level can be obtained.
  • protein detection methods using such antibodies include immunohistochemistry (immunostaining), Western blotting, ELISA, flow cytometry, imaging cytometry, radioimmunoassay, immunoprecipitation, and antibody arrays. Analysis methods and the like are included.
  • the detection of the constituent proteins can also be performed using mass spectrometry (MS).
  • MS mass spectrometry
  • proteins contained in the protein sample are labeled, the labeled proteins are fractionated, the fractionated proteins are subjected to mass spectrometry, and constituent proteins are identified from the mass spectrometric values. Methods to identify and optionally quantify are included.
  • an isotope labeling reagent known in the art can be used, and a suitable labeling reagent can be obtained as a commercial product. Fractionation can also be performed by a method known in the art, such as using a commercially available ion exchange column.
  • promoter hypermethylation is one of the causes of decreased gene expression. Therefore, it is conceivable to detect the expression level of the constituent protein at the translation level by using the methylation of the gene promoter of the constituent protein as an index.
  • a method of directly detecting changes in the base sequence after bisulfite treatment which has the activity of converting methylated cytosine to uracil, by base sequencing
  • a known method such as a method of indirect detection using a restriction endonuclease that can recognize (can cut) the base sequence of , but cannot recognize (cannot cut) the base sequence after bisulfite treatment can be used.
  • the expression level of the constituent protein is reduced in the lactic acid bacterium, that is, the function of the ATP synthase complex is suppressed. can do.
  • the criterion is not particularly limited, but for example, if the expression level is 4 SD or less, 3 SD or less, or 2 SD or less of the average expression level in the control, the expression level of the ATP synthase complex in the lactic acid bacterium is reduced. It may be determined that
  • a protein sample prepared in the same manner as described above from lactic acid bacteria known to have no decrease in expression of each constituent protein can be mentioned. More specifically, for example, OLS4496 strain in the same manner as described above. A prepared protein sample is included.
  • any one of the determination methods described above can be adopted as a method for confirming the "suppression of the function of the ATP synthase complex" of lactic acid bacteria, and two or more of them may be combined.
  • the method of determining functional suppression of the ATP synthase complex by detecting loss-of-function mutations in the genes of the constituent proteins in the target lactic acid bacterium is preferred.
  • the lactic acid bacteria of the present invention in fermented milk obtained using such lactic acid bacteria, the amount of acid production during low-temperature storage is reduced to suppress the pH drop, and the number of viable lactic acid bacteria is sufficiently increased even by the low-temperature storage. can be maintained at Therefore, as the lactic acid bacterium of the present invention, After culturing in a 10% skimmed milk medium at 43°C until the pH of the culture solution reaches 4.7 or less, when stored at 10°C for 10 days, (A1) the number of viable bacteria in the culture solution after storage is 1 ⁇ 10 8 cfu/g or more, and (A2) pH of the culture solution after storage is 4.2 or higher, is preferably satisfied.
  • the time until the pH of the culture solution becomes 4.7 or less in the culture is 7 hours or less from the start of the culture, and/or (A4)
  • the pH of the culture solution after 20 hours from the start of the culture is 4.1 or more, It is more preferable to satisfy the conditions of
  • skim milk powder medium indicates a medium containing 10% by mass of skim milk powder.
  • the skim milk powder according to the present invention refers to powdered skim milk obtained by removing fat from animal milk (preferably cow's milk). (Hereinafter referred to as "Milk Ministerial Ordinance” in some cases)", the milk solid content is 95.0% or more and the water content is 5.0% or less.
  • the composition of such skimmed milk powder includes, for example, a composition containing the composition described in "Japanese Food Standard Composition Tables 2015 Edition (7th Edition)", that is, 100 g, energy 300 to 400 (preferably 359) kcal, water 3-5 (preferably 3.8) g, protein 30-40 (preferably 34.0) g, lipid 0.2-2 (preferably 1.0) g, carbohydrates (including lactose) 45-60 ( Preferably 53.3) g, calcium 900-2000 (preferably 1100) mg, vitamin A 3-10 (preferably 6) ⁇ g, vitamin B 2 0.5-2 (preferably 1.60) mg, cholesterol 10 30 (preferably 25) mg, equivalent to 0.5 to 2 (preferably 1.4) g of salt.
  • the pH of such a 10% skim milk powder medium is usually 6-7.
  • the 10% skim milk medium according to conditions (A1) to (A4) may contain other components other than the skim milk powder, but even in that case, the content of the other component is 0. It is preferably 1% by mass or less, more preferably 0.01% by mass or less, and is particularly composed of 10% by mass of skim milk powder and 90% by mass of water (preferably drinking water) preferable.
  • the other components include yeast extract and peptides.
  • the 10% skim milk powder medium according to the above conditions preferably does not substantially contain the yeast extract.
  • "substantially does not contain” means, for example, 0.001% by mass or less with respect to the total mass.
  • the lactic acid bacterium of the present invention can satisfy the above conditions even in a medium that does not contain the yeast extract.
  • the 10% skim milk powder medium according to conditions (A1) to (A4) is preferably sterilized or sterilized. These conditions are not particularly limited, but for example, the sterilization conditions include conditions of 70 to 130° C. for 1 minute to 1 hour, and the sterilization conditions include conditions of 75 to 125° C. Conditions for 10 minutes to 30 minutes can be mentioned.
  • the 10% skim milk powder medium the following first 10% skim milk powder medium and second 10% skim milk powder medium have the same composition and / or the same sterilization treatment or sterilization treatment. or may have different compositions and/or treatments.
  • the second 10% skim milk powder medium may contain part or all of the culture solution after the first culture.
  • activation culture (first culture)
  • first culture a 10% skim milk medium
  • first 10% skim milk powder medium a 10% skim milk medium
  • the amount of lactic acid bacteria to be subjected to the first culture is preferably an amount such that the number of viable bacteria is 1 ⁇ 10 2 to 2 ⁇ 10 8 cfu/g in the first 10% skim milk powder medium. , 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 cfu/g.
  • the number of viable bacteria is measured by, for example, an appropriately diluted lactic acid bacteria-containing solution (for example, in the case of the first culture, the culture solution of the first culture (lactic acid bacteria and the first 10% skim milk powder The diluted solution of the medium)) is spread on a suitable agar medium, for example, a BCP-added plate count agar medium, which is an official medium stipulated by the Ministerial Ordinance for Milk, etc., cultured, and measured by counting the number of colonies that appear. can be done. Since the viable count value (cfu/g) at this time is the viable count in the lactic acid bacteria-containing solution (g), the viable count in the culture solution of the first culture, for example, is calculated from this. do.
  • an appropriately diluted lactic acid bacteria-containing solution for example, in the case of the first culture, the culture solution of the first culture (lactic acid bacteria and the first 10% skim milk powder The diluted solution of the medium)
  • a suitable agar medium for example, a BCP-added plate count
  • the anaerobic culture method is not particularly limited, but a method conventionally known as an anaerobic culture method for lactic acid bacteria, for example, in the presence of an oxygen concentration adjusting agent (e.g., Anaeropack Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company)) Static culture in
  • an oxygen concentration adjusting agent e.g., Anaeropack Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company)
  • Static culture e.g., Anaeropack Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company) Static culture in the present invention
  • the first culture may be repeated a plurality of times (for example, two times or less) by inoculating the culture solution after the culture into the first powdered skim milk medium again.
  • culture (hereinafter sometimes referred to as “second culture”) is performed using lactic acid bacteria or the culture solution after the first culture (that is, culture solution containing activated lactic acid bacteria).
  • culture is performed at 43° C. in a 10% skim milk powder medium (hereinafter, the medium for the second culture is sometimes referred to as a “second 10% skim milk powder medium”).
  • the amount of lactic acid bacteria to be subjected to the second culture is preferably an amount such that the number of viable bacteria is 2 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 7 cfu/g for the second 10% skim milk powder medium.
  • the culture method for the second culture is not particularly limited, but a method conventionally known as a fermentation method for fermented milk using lactic acid bacteria, such as static culture, can be appropriately employed.
  • the lactic acid lowers the pH of the culture solution.
  • the completion of this fermentation is when the pH of the culture solution (that is, the pH of the second 10% skim milk medium containing lactic acid bacteria) is 4.7 or less (more preferably 4.6 or less). ).
  • the time to complete the fermentation (that is, the pH reaches 4.7) must be 7 hours or less from the start of the second culture, and 6 hours or less. Especially preferably, it is more preferably 5 hours or less.
  • a lactic acid bacterium whose time until completion of fermentation exceeds the upper limit is not preferable in terms of production efficiency because it takes time to produce fermented milk, and low-temperature storage reduces the number of viable bacteria in fermented milk.
  • the lower limit of the time until completion of the fermentation is not particularly limited, but for example, it is preferably 1 hour or more, more preferably 2 hours or more.
  • the pH of the culture solution after 20 hours from the start of the second culture must be 4.1 or higher, and the pH of the culture solution after 24 hours is 4.1. It is particularly preferable to be above.
  • the upper limit of the time from the start of the second culture in which the pH can be maintained at 4.1 or higher is not particularly limited, but is preferably 30 hours or less, for example. The present inventors have found that lactic acid bacteria that can maintain a pH of 4.1 or higher after long-term culture at 43° C.
  • condition (A1) and / or condition (A3) may be maintained. not satisfied.
  • the culture solution after the fermentation is completed (that is, after the pH reaches 4.7) is rapidly cooled and stored.
  • the storage conditions are not particularly limited, but include a method conventionally known as a storage method for fermented milk, for example, a method in which the culture solution is enclosed (preferably sealed) in a container and allowed to stand.
  • the storage temperature for conditions (A1) and (A2) must be low, more specifically, 10°C.
  • the storage period for these conditions is independently required to be 10 days or more, particularly preferably 16 days or more, more preferably 20 days or more, and 35 days or more. It is even more preferable to have Even if the lactic acid bacteria of the present invention are stored under low-temperature conditions for a long period of time, the amount of acid production is sufficiently low and the number of viable bacteria is sufficiently maintained.
  • Lactic acid bacteria are usually capable of producing lactic acid even at low temperatures, so if the culture solution after completion of fermentation is stored for a long time as described above, the amount of lactic acid produced increases even under low temperature conditions.
  • the pH of the culture solution further decreases along with this.
  • the pH of the culture solution after storage at 10° C. for 10 days (that is, the pH of the second 10% skimmed milk medium containing lactic acid bacteria) is 4.2 or higher (preferably 4. 3 or more, more preferably 4.4 or more)
  • the pH of the culture solution after storage at 10 ° C. for 16 days is 4.2 or more (preferably 4.3 or more, more preferably 4.4).
  • the pH of the culture solution after storage at 10°C for 35 days is 4.2 or higher (preferably 4.3 or higher, more preferably 4.4 or higher).
  • lactic acid bacteria that are said to be cold-sensitive may not lower the pH of the culture solution even after long-term storage at low temperatures.
  • conventionally known cold-sensitive lactic acid bacteria such as those described in Patent Document 2
  • the present inventors have newly discovered that. This is because, like the bacterium described in Patent Document 3, in conventionally known cold-sensitive lactic acid bacteria, when the pH drops, H + is not excreted out of the cell, and the pH inside the cell drops and the growth is suppressed. The present inventors presume that this is because apoptosis is induced.
  • the present inventors have found that even lactic acid bacteria that suppress the pH drop during low-temperature storage can sufficiently maintain the number of viable bacteria during low-temperature storage, that is, lactic acid bacteria that satisfy the condition (A1). was found to exist.
  • condition (A1) the number of viable bacteria in the culture solution after storage at 10°C for 10 days must be 1 ⁇ 10 8 cfu/g or more, and the viable count in the culture solution after storage at 10°C for 16 days is required. It is particularly preferable that the number is 1 ⁇ 10 8 cfu/g or more, and it is more preferable that the viable cell count in the culture solution after storage at 10° C. for 20 days is 1 ⁇ 10 8 cfu/g or more, at 10° C. More preferably, the viable cell count in the culture medium after storage for 35 days is 1 ⁇ 10 8 cfu/g or more.
  • Conventionally known cold-sensitive lactic acid bacteria do not satisfy the condition (A1) and/or the condition (A3).
  • the lactic acid bacteria of the present invention may be used singly or in combination of two or more.
  • the lactic acid bacteria of the present invention more specifically, for example, Streptococcus thermophilus OLS4801 (hereinafter sometimes referred to as "OLS4801 strain") specified by Accession No. NITE BP-03504, Accession No.
  • NITE BP-03505 Identified Streptococcus thermophilus OLS4802 (hereinafter sometimes referred to as "OLS4802 strain”), Streptococcus thermophilus OLS4803 identified by accession number NITE BP-03506 (hereinafter sometimes referred to as “OLS4803 strain”), accession number and Streptococcus thermophilus OLS4824 (hereinafter sometimes referred to as "OLS4824 strain”) specified in NITE BP-03508. All of these exemplified lactic acid bacteria are S. It is a thermophilus and carries the PrtS gene.
  • the OLS4801 strain and the OLS4802 strain have a loss-of-function mutation in the ⁇ subunit gene that inhibits the function of the ATP synthase complex, and corresponds to the 30th glycine (Gly) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • Alanine (Ala) is substituted for glycine (G30A).
  • the OLS4803 strain has a loss-of-function mutation in the ⁇ subunit gene as a function suppression of the ATP synthase complex, and lacks the base corresponding to the 258th A in the base sequence of SEQ ID NO: 15.
  • glutamic acid (Q86FS) corresponding to the 86th glutamic acid (Glu) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the OLS4824 strain has a loss-of-function mutation in the A subunit gene as a function suppressor of the ATP synthase complex, which corresponds to the first valine (Val) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Alanine (Ala) is substituted for valine (V1A).
  • the OLS4801 strain has (1) identification indication: Streptococcus thermophilus OLS4801, (2) accession number: NITE BP-03504, (3) acceptance date: August 4, 2021, and the OLS4802 strain has (1) identification Indication: Streptococcus thermophilus OLS4802, (2) Accession number: NITE BP-03505, (3) Accession date: August 4, 2021, OLS4803 strain is (1) Identification indication: Streptococcus thermophilus OLS4803, (2) Accession number: NITE BP-03506, (3) Accession date: August 4, 2021, the OLS4824 strain is (1) Identification: Streptococcus thermophilus OLS4824, (2) Accession number: NITE BP-03508, (3) Acceptance date: August 4, 2021, respectively (4) Depositary institution: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary Center (zip code 292-0818, 2-5 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture) -8 Room 122).
  • the S.M.A.R.T. Thermophilus may be a subcultured strain of the same strain, or an artificial mutant, natural mutant, genetically modified strain, or derivative strain of the same strain or its subculture within the range that does not impair the effects of the present invention. you can
  • a lactic acid bacterium (preferably S. thermophilus, more preferably S. thermophilus possessing the PrtS gene), which is appropriately known or exists in nature, is artificially added with the above ATP synthase. It may be a lactic acid bacterium into which functional inhibition of the complex has been introduced.
  • a method for artificially inhibiting the function of the ATP synthase complex in lactic acid bacteria conventionally known methods can be appropriately employed depending on the mode of function inhibition.
  • loss-of-function mutations into the gene of each constituent protein by homologous recombination or gene targeting (knockout or knock-in); X-ray, alpha ray, beta ray, gamma ray, ion beam or other radiation treatment for each constituent protein Gene mutagenesis (loss-of-function mutagenesis); Gene mutagenesis (loss-of-function mutagenesis) of each constituent protein by ultraviolet radiation; Each constituent protein by chemicals such as ethyl methanesulfonate (EMS) mutagenesis of the gene (induction of loss-of-function mutation); and methods such as reducing the expression level by methylation of the gene promoter of each constituent protein.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • the lactic acid bacterium of the present invention may further have mutations other than the loss-of-function mutations in the genes of the constituent proteins described above.
  • ⁇ Screening method for lactic acid bacteria Lactic acid bacteria in which the function of the ATP synthase complex is suppressed produce a small amount of acid during low-temperature storage, and the number of viable bacteria does not decrease even with the low-temperature storage. It is possible to screen lactic acid bacteria suitable for producing fermented milk in which the decrease in pH during low-temperature storage is suppressed and the number of viable lactic acid bacteria is sufficiently maintained even by the low-temperature storage. Therefore, the present invention also provides a method for screening lactic acid bacteria, which comprises a selection step of selecting low-acid-producing lactic acid bacteria using inhibition of the function of the ATP synthase complex as an indicator.
  • the term "low-acid-producing lactic acid bacteria” refers to lactic acid bacteria capable of suppressing a decrease in pH during low-temperature storage and maintaining the number of viable bacteria in fermented milk obtained using the same. . More specifically, lactic acid bacteria that satisfy the above conditions (A1) and (A2) can be mentioned, and it is preferable that the above conditions (A3) and/or (A4) are satisfied.
  • the function of the ATP synthase complex is suppressed (that is, the direct activity reduction of the ATP synthase complex, the mutation of the gene of the ATP synthase complex constituent protein, the ATP synthase complex Decreased expression of the body) is used to determine whether or not the function of the ATP synthase complex is suppressed by at least one of the determination methods listed above, and the lactic acid bacteria confirmed to have the function of the ATP synthase complex are It is selected as being the lactic acid bacterium with low acid production.
  • the determination method including its preferred mode, is as described above.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is further cultured and stored under the conditions described in the second culture and, if necessary, the first culture, and storage, and the above conditions ( It may further include a step of determining and selecting lactic acid bacteria that satisfy A1) and (A2) and, if necessary, conditions (A3) and/or (A4) as the low-acid-producing lactic acid bacteria.
  • the above conditions including their preferred embodiments, are as described for the lactic acid bacteria of the present invention.
  • lactic acid bacterium composition refers to a composition containing lactic acid bacteria, but is not particularly limited. lactic acid bacteria of the present invention), and may consist of only the lactic acid bacteria of the present invention (including a combination of two or more of the lactic acid bacteria of the present invention).
  • the lactic acid bacteria composition of the present invention includes, for example, the following lactic acid bacteria starter and fermented milk.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention may further contain components other than the lactic acid bacterium of the present invention.
  • Examples of the other components include, but are not limited to, a solvent such as water; culture of the lactic acid bacterium; A culture that is the supernatant of the culture solution after completion, a medium component, etc.; It may be a combination of species or more.
  • a solvent such as water
  • culture of the lactic acid bacterium A culture that is the supernatant of the culture solution after completion, a medium component, etc.; It may be a combination of species or more.
  • the lactic acid bacterium starter of the present invention contains at least the lactic acid bacterium of the present invention, and can be suitably used for the following method for producing fermented milk of the present invention.
  • Such a lactic acid bacterium starter of the present invention may consist of only the lactic acid bacterium of the present invention, or may further contain the other ingredients, other lactic acid bacteria, and yeast.
  • the other lactic acid bacteria and yeast include lactic acid bacteria and yeast that are conventionally known to be contained in fermented milk.
  • the other lactic acid bacteria include lactic acid bacteria other than the lactic acid bacteria of the present invention, and one of them may be used alone or two or more of them may be used in combination.
  • the lactic acid bacteria starter of the present invention preferably further contains Lactobacillus lactic acid bacteria other than the lactic acid bacteria of the present invention, Lactobacillus delbrueckii subspecies - It is more preferable to contain lactic acid bacteria belonging to bulgaricus.
  • the lactic acid bacteria starter of the present invention preferably contains Streptococcus lactic acid bacteria of the present invention and Lactobacillus lactic acid bacteria of the present invention.
  • the lactic acid bacteria starter of the present invention may be liquid or solid such as a frozen state or dry powder, and may further contain other ingredients.
  • Other components that can be contained in the lactic acid bacteria starter include, for example, fermentation promoters (formic acid, nucleic acids, etc.); protective agents (sugars); medium components (milk, whey, etc.). It may be one of or a combination of two or more.
  • the content of the lactic acid bacteria of the present invention in the lactic acid bacteria starter of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 100% by mass, more preferably 0.1 to 90% by mass.
  • the viable count is preferably 1 ⁇ 10 7 cfu/g or more, more preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 11 cfu/g.
  • the lactic acid bacteria starter further contains other lactic acid bacteria
  • the content of the lactic acid bacteria of the present invention preferably Streptococcus lactic acid bacteria
  • the content of the other lactic acid bacteria preferably Lactobacillus lactic acid bacteria other than the lactic acid bacteria of the present invention
  • Amount ratio and the content of Streptococcus lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria starter when it contains Streptococcus lactic acid bacteria that is the lactic acid bacterium of the present invention and Lactobacillus lactic acid bacteria that is the lactic acid bacterium of the present invention and Lactobacillus lactic acid bacteria
  • the ratio to the content of each independently is preferably 1:0.1 to 1:100, preferably 1:1 to 1:10, in terms of the number of bacteria (in terms of the number of viable bacteria, the same shall apply hereinafter). It is more preferable to have
  • the lactic acid bacteria starter of the present invention can be used, for example, in combination with the composition containing the other lactic acid bacteria (second lactic acid bacteria composition) as a lactic acid bacteria starter kit containing the lactic acid bacteria starter of the present invention and the second lactic acid bacteria composition. good.
  • additives for producing fermented milk Fermentation promoting substance, protective agent, etc.
  • a container, instructions for use of the lactic acid bacteria starter, etc. may be combined to form a lactic acid bacteria starter kit.
  • the fermented milk of the present invention contains at least the lactic acid bacterium of the present invention, and can be obtained, for example, by the following method for producing fermented milk of the present invention.
  • a decrease in pH during low-temperature storage is suppressed, and the number of viable bacteria contained is sufficiently maintained even by the low-temperature storage.
  • the fermented milk of the present invention is not particularly limited. 0% or more, and the number of lactic acid bacteria or yeast (preferably the number of lactic acid bacteria (more preferably the number of lactic acid bacteria of the present invention), hereinafter the same) of 10 million/mL or more).
  • the fermented milk of the present invention satisfies the standards of "dairy lactic acid bacteria beverage" according to the milk ministerial ordinance (more specifically, the content of non-fat milk solids is 3.0% or more, the number of lactic acid bacteria Or those with a yeast count of 10 million / mL or more); 1,000,000/mL or more) are also included.
  • the non-fat milk solids content refers to the remaining components (mainly protein, lactose, minerals, etc.) after subtracting the fat content from the whole milk solids.
  • the number of viable bacteria measured by a predetermined test method, the method using the BCP-added plate count agar medium, but when the fermented milk is sterilized, it is measured by the test method before the sterilization. It is a viable cell count conversion.
  • the fermented milk of the present invention may be a fermented product after the fermentation step in the method for producing fermented milk described below, or may be a fermented product that has been sterilized (pulverized, heat-treated, etc.). Alternatively, they may be concentrated, diluted, dried, frozen, or the like. In addition, in this invention, when the said fermented milk is pasteurized, the number of lactic acid bacteria in the said fermented milk is conversion of viable count.
  • the lactic acid bacteria contained in the fermented milk of the present invention include not only live bacteria but also dead bacteria, crushed products and heat-treated products of lactic acid bacteria, concentrates, diluted products, dried products, and frozen products thereof.
  • the fermented milk of the invention preferably contains at least live lactic acid bacteria, and more preferably contains the lactic acid bacteria of the present invention as live bacteria.
  • the fermented milk of the present invention contains ingredients derived from the lactic acid bacterium of the present invention and the following raw material milk (preferably emulsion liquid).
  • the lactic acid bacteria starter, other lactic acid bacteria, and yeast may be further contained within a range that does not impair the effects of the present invention.
  • it may contain various components that can be contained in food and drink.
  • fermented milk examples include sugars, sugar alcohols, minerals, vitamins, proteins, peptides, amino acids, organic acids, pH adjusters, starch and Modified starch, dietary fiber, fruits/vegetables and their processed products, animal and plant crude drug extracts, naturally derived polymers (collagen, hyaluronic acid, chondroitin, etc.), fats and oils, thickeners, emulsifiers, solvents, surfactants, gelling agents, stabilizers, buffers, suspending agents, thickening agents, excipients, disintegrating agents, binders, fluidizing agents, preservatives, coloring agents, flavoring agents, flavoring agents, sweetening agents and the like. It may be one of or a combination of two or more.
  • Yogurt, cheese, fermented cream, fermented butter, etc. are preferable as such fermented milk, and yogurt is particularly preferable.
  • Specific examples of the yogurt include set-type yogurt (solid fermented milk) such as plain yogurt, soft-type yogurt (paste-like fermented milk), and drink-type yogurt (liquid fermented milk). It may be frozen yogurt used as.
  • the fermented milk of the present invention can also be used as a material for fermented foods such as cheese, fermented cream, fermented butter and kefir.
  • the fermented milk of the present invention can also be used as a lactic acid bacteria starter in a method for producing fermented milk, provided that it has not been pasteurized.
  • the lactic acid bacterium of the present invention (including the lactic acid bacterium selected by the screening method for lactic acid bacteria of the present invention) or the lactic acid bacterium composition of the present invention is added to a milk formula containing raw material milk. and fermented to obtain fermented milk.
  • the method for producing fermented milk of the present invention may include the selection step. only.
  • the production method of the present invention by fermenting the raw material milk using the lactic acid bacterium of the present invention, the decrease in pH during low-temperature storage is suppressed, and the number of viable bacteria contained even by the low-temperature storage is sufficiently high. It becomes possible to produce fermented milk that is maintained. Furthermore, the production method of the present invention also makes it possible to sufficiently shorten the time until completion of fermentation.
  • the emulsion liquid according to the present invention contains raw material milk.
  • the raw material milk preferably contains lactose, for example, raw milk (e.g., milk of cow, buffalo, sheep, goat, etc.), pasteurized milk, whole milk, skim milk, whey, and these Processed products (e.g. whole milk powder, whole milk concentrate, skim milk powder, skim concentrate, condensed milk, whey powder, buttermilk, butter, cream, cheese, whey protein concentrate (WPC), whey protein isolate (WPI ), ⁇ -lactalbumin ( ⁇ -La), ⁇ -lactoglobulin ( ⁇ -Lg)), and one of them or a mixture of two or more thereof may be used.
  • raw milk e.g., milk of cow, buffalo, sheep, goat, etc.
  • WPC whey protein concentrate
  • WPI whey protein isolate
  • ⁇ -La ⁇ -lactoglobulin
  • ⁇ -Lg ⁇ -Lg
  • the emulsion liquid according to the present invention may consist of only the raw material milk, or may be an aqueous solution, a diluted solution, or a concentrated liquid of the raw material milk. It may further contain other components. Such other ingredients include water; soymilk, sugars and other sugars, sweeteners, flavorings, fruit juices, pulp, vitamins, minerals, fats and oils, ceramides, collagen, milk phospholipids, foods such as polyphenols, food ingredients, or food additives; pectin, soybean polysaccharides, CMC (carboxymethylcellulose), agar, gelatin, carrageenan, stabilizers such as gums, thickeners, gelling agents, etc., and one of these It may be one or a mixture of two or more.
  • the liquid formula can be prepared by mixing the ingredients, optionally with heating and/or while optionally homogenizing.
  • heat sterilized or sterilized liquid can also be used as the emulsion liquid.
  • the fermentation step of adding the lactic acid bacterium of the present invention or the lactic acid bacterium composition of the present invention to the emulsion preparation and fermenting the mixture a conventionally known method can be appropriately employed, and is not particularly limited.
  • the amount of the lactic acid bacterium of the present invention or the lactic acid bacterium composition of the present invention to be added can be appropriately set according to the amount of the lactic acid bacterium starter to be added that is employed in conventionally known methods for producing fermented milk.
  • the viable cell count of the lactic acid bacteria of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 9 cfu/g, more preferably 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 9 cfu/g, relative to the mass of the emulsion. is more preferred.
  • the other lactic acid bacteria and yeast may be added to the emulsion preparation.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is a Streptococcus lactic acid bacterium
  • lactic acid bacteria belonging to Delbrueckii subspecies bulgaricus are further added.
  • the ratio of the added amount of the lactic acid bacteria of the present invention preferably Streptococcus lactic acid bacteria
  • the added amount of the other lactic acid bacteria preferably Lactobacillus lactic acid bacteria
  • the ratio of the added amount of the other lactic acid bacteria preferably Lactobacillus lactic acid bacteria
  • the ratio is preferably 1:0.1 to 1:100, more preferably 1:1 to 1:10, in terms of the number of bacteria (the same shall apply hereinafter).
  • the conditions for the fermentation are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the growth conditions of the lactic acid bacteria of the present invention to be added, the amount of the emulsion preparation, and the like.
  • the pH of the emulsion containing the lactic acid bacterium of the present invention or the lactic acid bacterium composition of the present invention is 4.7 or less, more preferably 4.6 or less, and more preferably 4.6 or less. It is preferable to leave or stir (preferably leave) until it reaches 4.0 to 4.5, usually for 2 to 24 hours, more preferably 3 to 8 hours, and even more preferably 4 to 6 hours.
  • the anaerobic conditions for example, fermentation under nitrogen aeration conditions can be employed.
  • the fermented milk of the present invention can be obtained by the above fermentation.
  • the fermented product after the fermentation step can be used as the fermented milk of the present invention as it is or by concentrating, diluting, drying, freezing, or the like as necessary.
  • the fermented milk of the present invention may be obtained by crushing or heat-treating the lactic acid bacteria in the fermented product, or by concentrating, diluting, drying, freezing, or the like as necessary. Therefore, the method for producing fermented milk of the present invention may further include these steps (concentration step, dilution step, drying step, freezing step, crushing step, heat treatment step, etc.).
  • Test example 1 (1) The following four strains of lactic acid bacteria: P2101201 strain (Comparative Example 1): S. cerevisiae harboring the prtS gene. thermophilus. Strains deposited by the Meiji Innovation Center of Meiji Co., Ltd., 1-29-1 Shichikoku, Hachioji-shi, Tokyo 192-0919 Japan; Strain OLS4801 (Example 1): S. cerevisiae identified by accession number NITE BP-03504. thermophilus. carrying the prtS gene; Strain OLS4802 (Example 2): S. cerevisiae identified by accession number NITE BP-03505. thermophilus. prtS gene; and OLS4803 strain (Example 3): S.
  • thermophilus A strain carrying the prtS gene was used. In the test examples described herein, the presence or absence of the prtS gene in each lactic acid bacteria strain was confirmed by the following method. That is, first, five strains of S. cerevisiae whose genome sequences are known were isolated. The prtS gene sequence of Thermophilus was obtained from the NCBI database, and primers (Fprimer: SEQ ID NO: 17, Rprimer: SEQ ID NO: 18) were prepared from highly conserved sequences. Genomic DNA was also extracted from the M17 culture medium of each strain using InstaGeneMatrix (manufactured by BioRad).
  • the mass of the culture solution after activation is 2% by mass (lactic acid bacteria viable count: 1 ⁇ 10 7 to 2 ⁇ 10 7 cfu / g, hereinafter the same ), statically cultured (fermented) at 43° C., and measured the time from the inoculation until the pH of the culture solution decreased to 4.7 (fermentation time). Furthermore, when the pH reaches 4.7, the culture is terminated, immediately cooled to 10° C., sealed to prevent air from entering, and left to stand for 10 days, 17 days, 20 days, or 35 days for storage. The pH (10°C pH) after each storage was measured. The results are shown in Table 2 below.
  • Test example 2 (1) The same strains of lactic acid bacteria as the four strains of lactic acid bacteria used in Test Example 1 were each statically cultured in M17 culture medium (0.5 w/v% lactose) at 37°C under anaerobic conditions for 16 hours, After the cells were collected by centrifugation, the cells were washed with physiological saline and collected again by centrifugation. This was suspended in 100 ⁇ L of solution 1 (6.7% sucrose, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)), and 20 ⁇ L of 10 mg/mL lysozyme and 5 ⁇ L of 10 U/ ⁇ L mutanolysin were added to the suspension.
  • solution 1 (6.7% sucrose, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)
  • genomic DNA was extracted using Wizard Genomic DNA Purification Kit (manufactured by Promega). The DNA concentration was measured by Qubit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and diluted with ultrapure water to 0.1 ng/ ⁇ L to obtain a genomic DNA sample.
  • Table 3 below shows the gene name of the extracted gene mutation site, the number of bases and the number of amino acids encoded by the same base sequence, the base mutation site and its type, and the amino acid Mutation sites are indicated, and strains from which these mutations were extracted are indicated by black circles.
  • Test example 3 From Test Example 2, it was first investigated whether the ATP synthase epsilon chain contributes to low acid production. Specifically, whether or not the low acid productivity is lost in a recombinant strain in which the sequence of the ATP synthase episilon chain gene of the P2101201 strain, which was a high acid-producing lactic acid bacterium, was introduced into the OLS4803 strain, which was a low acid-producing lactic acid bacterium. verified.
  • a recombinant strain of the OLS4803 strain was produced by double crossover by homologous recombination. That is, first, a fragment containing the full-length ATP synthase episilon chain gene was amplified by PCR from the genomic DNA extracted from the P2101201 strain using the primer combinations shown in Table 4 below. Then, the resulting fragment was inserted into the temperature-sensitive vector pTERM09 to prepare plasmid DNA for recombination. Note that pTERM09 has the property that it can replicate at low temperature (30° C.) but cannot replicate at high temperature (37° C.), and additionally has an erythromycin resistance gene.
  • the prepared plasmid DNA was introduced into the OLS4803 strain by electroporation to obtain a transformant at 30°C.
  • the resulting transformants were cultured at 37° C. under selective pressure with the addition of erythromycin (25 ⁇ g/mL) to obtain a strain in which the plasmid DNA was incorporated into the genomic DNA of strain OLS4803 by homologous recombination. Then, culture is performed at 30° C. under conditions where selective pressure is not applied by addition of erythromycin, and a second homologous recombination is performed to obtain the sequence of the P2101201 strain derived from the plasmid DNA and the sequence on the genomic DNA of the OLS4803 strain.
  • the activation medium was prepared by sterilizing 10% reduced skim milk containing 0.1 w/v% Meast P2G (manufactured by Asahi Food and Healthcare Co., Ltd.) at 121°C for 7 minutes.
  • the frozen bacterial solution of the recombinant strain obtained in (1) above was inoculated into the activation medium to a concentration of 1% by mass, and activation culture was performed twice at 37° C. under anaerobic conditions for 16 hours.
  • inoculate a 10% skim milk powder medium that has been sterilized at 95 ° C. so that the mass of the culture solution after activation is 2% by mass, static culture (fermentation) at 43 ° C., and the pH of the culture solution.
  • the time from the inoculation (fermentation time) until the M.O.D. dropped to 4.6 was measured. Furthermore, when the pH of the culture solution reached 4.6, the culture was terminated, immediately cooled to 10°C, sealed to prevent air from entering, and allowed to stand for 1 day, 7 days, 14 days, or 21 days. and stored, and the pH (10°C pH) after each storage was measured. In addition, a suspension obtained by diluting the culture solution after each storage is spread on a BCP-added plate count agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) and cultured, and the number of colonies that appear is counted. Viable counts (cfu/g) were determined.
  • FIG. 1 shows the fermentation time (minutes) of the recombinant strain
  • Fig. 2 shows the pH (pH at 10°C) for each number of days after storage at 10°C
  • the number of viable bacteria (cfu/g) for each number of days after storage at 10°C. ) are shown in FIG. Figures 1 to 3 also show the results of fermentation time measurement, pH measurement after storage at 10°C, and viable count measurement after storage at 10°C for the non-recombinant P2101201 strain and OLS4803 strain, respectively. is shown. 10 recombinant strains were obtained and measured, but there was no difference in the results among the 10 strains. Therefore, one of the 10 strains (No. Only the results of 1) are shown.
  • Test example 4 From Test Example 2, it was then examined whether other 3 genes (16S rRNA methyltransferase gene, transcriptional regulator LacI family gene, insulinase family protein gene) contribute to low acid production. Specifically, it was verified whether or not a recombinant strain in which the sequence of each gene of the high-acid-producing lactic acid bacterium OLS4803 strain was introduced into the low-acid-producing lactic acid bacterium P2101201 strain exhibited low acid-producing properties. bottom.
  • a recombinant strain of the P2101201 strain was produced by double crossover by homologous recombination. That is, from genomic DNA extracted from the OLS4803 strain, a fragment containing the full length of each gene was amplified by PCR using the combination of each primer shown in Table 5 below.
  • Each gene sequence of each recombinant strain (OLS4803 strain) was introduced in the same manner as in (1) of Test Example 3, except that the prepared plasmid DNA was introduced into the P2101201 strain using each of the obtained fragments. 7 strains (Nos. 1 to 7) of each strain P2101201) were obtained.
  • each recombinant strain obtained was cultured (fermented) in the same manner as in Test Example 3 (2), and the time from the inoculation until the pH of the culture solution decreased and reached 4.6 ( Fermentation time) was measured. Furthermore, when the pH of the culture solution reached 4.6, the culture was terminated, immediately cooled to 10° C. and sealed so as not to enter air, for 6 days, 7 days, 8 days, 14 days, 15 days. , 33 days, or 34 days, and the pH (10°C pH) after each storage was measured.
  • Table 6 shows the results for the 16S rRNA methyltransferase gene recombinant strains
  • Table 7 shows the results for the transcriptional regulator Lacl family gene recombinant strains
  • Table 8 shows the results for the insulinase family protein gene recombinant strains.
  • Tables 6 to 8 also show the results of similarly measuring the fermentation time and pH after storage at 10° C. for the non-recombinant P2101201 strain and OLS4803 strain, respectively.
  • a lactic acid bacterium capable of obtaining fermented milk in which a decrease in pH during low-temperature storage is suppressed and the number of viable lactic acid bacteria is sufficiently maintained even by the low-temperature storage, It is possible to provide a lactic acid bacteria starter and fermented milk containing, a method for producing fermented milk, and a screening method for lactic acid bacteria.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されている乳酸菌。

Description

乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、発酵乳の製造方法、及び乳酸菌のスクリーニング方法
　本発明は、乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、及び発酵乳の製造方法に関し、より詳細には、乳酸菌、これを含有する乳酸菌スターター及び発酵乳、並びに、発酵乳の製造方法、さらには、乳酸菌のスクリーニング方法に関する。
　発酵乳は、例えば、日本の「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）」において、「乳又はこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させ、糊状又は液状にしたもの、又はこれらを凍結したもの」と定義されている。かかる発酵乳の代表例としては、例えば、セットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトタイプヨーグルト（糊状発酵乳）、及びドリンクタイプヨーグルト（液状発酵乳）といったヨーグルトが挙げられる。なお、ヨーグルトは、例えば、国際社会で共有されている食品規格である「Ｃｏｄｅｘ規格（ＦＡＯ（国連食糧農業機関）／ＷＨＯ（世界保健機関））」において、「ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．サーモフィルス）の２種類で乳酸発酵しているもの」と定義されている。従来より、ヨーグルトといえば一般に、これら２種の菌をスターターとして原料乳に添加し、当該原料乳中の乳糖を発酵させたものを示し、主に前記発酵で産生された乳酸によって酸味を有することを特徴とする。
　しかしながら、ストレプトコッカス・サーモフィルス等の乳酸菌は低温においても発酵により乳酸を産生することが可能であるため、前記発酵後の発酵物（例えば、ヨーグルト等の発酵乳）では、保存中に、低温条件下であっても、乳酸の産生量が過剰となって酸度が上昇（すなわちｐＨが低下）してしまい、その風味が害されてしまうという課題を有していた。
　そのためこれまで、このような乳酸菌の低温における酸産生を抑制することを目的とした研究がいくつかなされている。例えば、特開平７－２３６４１６号公報（特許文献１）には、低温保存下において酸度の上昇が少ない発酵乳を得ることを目的として、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクスの酸生成抑制株とストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシズ・サーモフィルスの粘性物生産株とを用いることが記載されている。また、特許第４３３１３０９号公報（特許文献２）では、３７～４３℃で０．０５％酵母エキス添加１２％還元脱脂乳を３時間以内に凝固させ、１５～２５℃で０．０５％酵母エキス添加１２％還元脱脂乳を３日間以内に凝固させない低温感受性のストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌株が特許許可されており、前記乳酸菌株としてストレプトコッカス・サーモフィルスＳＢＴ０１４４が記載されている。
　さらに、特開２００１－９５５６１号公報（特許文献３）には、細胞膜結合性アデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性が低下しているラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクス変異株が記載されており、同変異株では、発酵過程においてｐＨが低下すると、Ｈ＋が菌体外に排出されずに菌体内のｐＨが低下して生育が抑制される（すなわち、所謂アポトーシスが引き起こされる）ため、その結果として、乳酸の産生量が低下することが記載されている。また、特開平９－９９５４号公報（特許文献４）には、ＡＴＰａｓｅ活性が低下しているラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・ラクチス変異株が記載されており、同変異株では、発酵過程においてｐＨが低下すると生育が抑制されるため乳酸の産生量が低下することが記載されている。さらに、特開平７－１２３９７７号公報（特許文献５）には、長期低温保存した際の乳酸酸度の上昇を抑制することを目的として、ＡＴＰａｓｅ活性の低いラクトバチルス属乳酸菌を用いることが記載されている。
特開平７－２３６４１６号公報 特許第４３３１３０９号公報 特開２００１－９５５６１号公報 特開平９－９９５４号公報 特開平７－１２３９７７号公報
　しかしながら、上記のＡＴＰａｓｅ活性以外に、乳酸菌の発酵乳における低温での酸産生量に寄与する因子は報告されていない。また、ＡＴＰａｓｅ活性が低下している乳酸菌を用いた場合には、確かに得られた発酵乳における低温での酸産生量が低減してｐＨの低下は抑制されるものの、発酵が完了（例えばｐＨが４．７又は４．６以下に到達）するまでに時間を要したり、低温保存中に乳酸菌の生菌数が減少してしまうという課題があることを本発明者らは見出した。
　本発明は、上記従来技術が有する課題に鑑みてなされたものであり、低温保存中のｐＨ低下が抑制され、かつ、前記低温保存によっても乳酸菌の生菌数が十分に維持される発酵乳を得ることができる乳酸菌、これを含有する乳酸菌スターター及び発酵乳、並びに、発酵乳の製造方法、さらには、乳酸菌のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行い、先ず、乳酸菌における低温での酸産生量に寄与する因子を探索するために、低温保存中のｐＨ低下を抑制できる乳酸菌（低酸産生乳酸菌）と、同ｐＨ低下を抑制できない乳酸菌（高酸産生乳酸菌）との間で、ゲノム解析をおこなった。かかるゲノム解析では、低酸産生乳酸菌に共通する変異であってアミノ酸変異を伴う変異（機能欠失型変異）が複数抽出されたため、次いで、低酸産生乳酸菌及び高酸産生乳酸菌の組換え株を作成して、各変異が酸産生量に寄与するかを検証した。その結果、ＡＴＰ合成酵素複合体を構成するεサブユニット（ＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ｃｈａｉｎ）をコードする遺伝子（εサブユニット遺伝子）における変異が乳酸菌の低酸産生に寄与することを見出した。さらに、かかるεサブユニット遺伝子に機能欠失型変異を有する乳酸菌では、低温保存によっても生菌数が十分に維持されたことから、従来の特許文献３～５に記載されているようなＡＴＰａｓｅ活性の低下とは別の機構によって低酸産生が発揮されることを見出した。
　よって、本発明者らは、これら知見から、εサブユニットが含まれるＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されている乳酸菌によれば、低温保存によってもｐＨ低下が抑制され、かつ、前記低温保存によっても乳酸菌の生菌数が十分に維持される発酵乳が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
　このような本発明の態様は以下のとおりである。
［１］
　ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されている乳酸菌。
［２］
　前記ＡＴＰ合成酵素複合体のεサブユニットが機能抑制されている［１］に記載の乳酸菌。
［３］
　ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌である、［１］又は［２］に記載の乳酸菌。
［４］
　ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属する乳酸菌である、［３］に記載の乳酸菌。
［５］
　ＰｒｔＳ遺伝子を保有する、［４］に記載の乳酸菌。
［６］
　前記ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制が、εサブユニット遺伝子における機能欠失型変異である、［１］～［５］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌。
［７］
　前記ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制が、εサブユニットタンパク質の発現低下である、［１］～［６］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌。
［８］
　［１］～［７］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物。
［９］
　前記乳酸菌がストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌であり、かつ、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌をさらに含有する、［８］に記載の乳酸菌組成物。
［１０］
　乳酸菌スターターである、［８］又は［９］に記載の乳酸菌組成物。
［１１］
　発酵乳である、［８］又は［９］に記載の乳酸菌組成物。
［１２］
　［１］～［７］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌又は［８］～［１１］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物を、原料乳を含有する調乳液に添加して発酵させ、発酵乳を得る発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
［１３］
　前記乳酸菌がストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌であり、かつ、前記調乳液にラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌をさらに添加する、［１２］に記載の発酵乳の製造方法。
［１４］
　ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制を指標として、低酸産生の乳酸菌を選択する選択工程を含む、乳酸菌のスクリーニング方法。
［１５］
　［１４］に記載の乳酸菌のスクリーニング方法で選択された乳酸菌を、原料乳を含有する調乳液に添加して発酵させ、発酵乳を得る発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
　本発明によれば、低温（例えば１０℃）保存中のｐＨ低下が抑制され、かつ、前記低温保存によっても乳酸菌の生菌数が十分に維持される発酵乳を得ることができる乳酸菌、これを含有する乳酸菌スターター及び発酵乳、並びに、発酵乳の製造方法、さらには、乳酸菌のスクリーニング方法を提供することが可能となる。
試験例３における、組換え株、Ｐ２１０１２０１株、ＯＬＳ４８０３株の発酵時間（分）を示すグラフである。 試験例３における、組換え株、Ｐ２１０１２０１株、ＯＬＳ４８０３株の１０℃保存時のｐＨの経時変化を示すグラフである。 試験例３における、組換え株、Ｐ２１０１２０１株、ＯＬＳ４８０３株の１０℃保存時の生菌数の経時変化を示すグラフである。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
　＜乳酸菌＞
　本発明において、「乳酸菌」とは、ブドウ糖を資化して対糖収率で５０％以上の乳酸を生産可能な微生物の総称であり、生理学的性質としては、グラム陽性菌の球菌又は桿菌であって、運動性なし、多くの場合胞子形成能なし（バシラス・コアギュランスのように胞子形成能のある乳酸菌もある）、カタラーゼ陰性等の特徴を有する。
　本発明の乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌（例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー（特に、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクス（ブルガリア菌）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・デルブルッキー、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ラクティス、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・インディカス、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・スンキ、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ヤコブセニ等）、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・パラガセリ、ラクトバチルス・アミロボロス、ラクトバチルス・クリスパータス等）、ラクチカゼイバチルス属（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、ラクチプランチバチルス属（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、リコリラクトバチルス属（Ｌｉｑｕｏｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、ラチラクトバチルス属（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、リギラクトバチルス属（Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、リモシラクトバチルス属（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、レンチラクトバチルス属（Ｌｅｎｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、レビラクトバチルス属（Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）乳酸菌、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌が挙げられる。本発明の乳酸菌としては、このうち、ストレプトコッカス属乳酸菌であることが好ましい。
　（ストレプトコッカス属乳酸菌）
　ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌は、好気性グラム陽性球菌である。ストレプトコッカス属に属する乳酸菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）が挙げられる。本発明の乳酸菌としては、このうち、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属することが好ましい。
　ストレプトコッカス・サーモフィルスは、サーモフィルス菌とも呼称される連鎖球菌であり、乳糖から乳酸を産生することが可能な乳酸菌である。本明細書において、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を、場合により「Ｓ．サーモフィルス」という。
　本発明の乳酸菌がＳ．サーモフィルスである場合には、ｐｒｔＳ遺伝子を保有するものであることが好ましい。ｐｒｔＳ遺伝子を保有するＳ．サーモフィルスを用いることにより、発酵完了までの時間をより短縮することができ、さらに、より好ましい風味の発酵乳を得られる傾向にある。本発明において、「ｐｒｔＳ遺伝子」とは、カゼインを分解する細胞壁結合型セリンプロテアーゼをコードする遺伝子を示す。また、本発明において、Ｓ．サーモフィルスがｐｒｔＳ遺伝子を保有することは、例えば、公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）から取得できるＳ．サーモフィルスのｐｒｔＳ遺伝子間で保存性の高い配列を選択し、その配列に基づいて作製したプライマーセットを用いてｐｒｔＳ遺伝子の一部をＰＣＲ法によって増幅し、所望のＰＣＲ産物が得られることによって判定することができる。前記プライマーセットとしては、例えば、下記の実施例に記載のＦｐｒｉｍｅｒ及びＲｐｒｉｍｅｒからなるプライマーセットが挙げられるが、これに限定されるものではない。
　（ＡＴＰ合成酵素複合体）
　本発明の乳酸菌は、ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されている乳酸菌（人為的にＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されている乳酸菌を含む）である。「ＡＴＰ合成酵素複合体」は、複数の構成タンパク質からなるタンパク質複合体であり、分子量は５０万を越え、ＡＤＰと無機リン酸とからＡＴＰを合成する酵素活性を有する。前記ＡＴＰ合成酵素複合体の構成タンパク質としては、Ａサブユニット、Ｂサブユニット、Ｃサブユニット、αサブユニット、βサブユニット、γサブユニット、δサブユニット、εサブユニットの８つのタンパク質が知られている。
　前記ＡＴＰ合成酵素複合体の各構成タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）から取得することができ、例えば、Ｓ．サーモフィルス由来の各構成タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列（遺伝子の塩基配列）として、典型的には、下記の表１に示される各配列が挙げられる。表１には、Ｓ．サーモフィルス由来の各構成タンパク質の遺伝子名及びその典型的な塩基配列を示す配列番号、並びに、Ｓ．サーモフィルス由来の各構成タンパク質の典型的なアミノ酸配列を示す配列番号をそれぞれ示す。なお、変異を生じていない構成タンパク質であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。ＡＴＰ合成酵素複合体は、Ｓ．サーモフィルスに限らず、幅広い乳酸菌で機能しており、例えば、ストレプトコッカス属乳酸菌の間では、ほぼ１００％（少なくとも９０％以上、より好ましくは９３％以上）の高い同一性を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制）
　本発明における「ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制」には、ＡＴＰ合成酵素複合体の不活性化を含む活性低下、及びＡＴＰ合成酵素複合体の発現低下が含まれる。前記ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制としては、複合体全体の機能抑制であっても、前記構成タンパク質のうちの１種又は２種以上の組み合わせの機能抑制であってもよいが、少なくともＡサブユニット及び／又はεサブユニットの機能抑制を含むことが好ましく、少なくともεサブユニットの機能抑制を含むことがより好ましい。
　〔ＡＴＰ合成酵素複合体の活性低下〕
　「ＡＴＰ合成酵素複合体の活性低下」とは、ＡＴＰ合成酵素複合体が本来有している活性が低下していることを意味し、通常、対照との比較において、それよりも活性レベルが低いことを意味する。また、「ＡＴＰ合成酵素複合体の活性低下」には、ＡＴＰ合成酵素複合体の一部又は全部の不活性化及び活性低下の双方が含まれる。
　〈ＡＴＰ合成酵素複合体の直接的活性低下〉
　本発明において、乳酸菌の「ＡＴＰ合成酵素複合体の活性低下」を直接的に確認する方法としては、特に制限はないが、例えば、対象の乳酸菌からタンパク質試料を調製し、これに、蛍光性ｐＨ指示薬（例えば、ルシフェラーゼ）等の存在下でＮＡＤＨを加え、ＡＴＰ合成酵素活性におけるプロトン（Ｈ＋）輸送活性による蛍光変化を測定し、対照における活性と比較する方法が挙げられる。前記測定方法としては、例えば、Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００７，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．５２，２０７７６－２０７８１に記載の測定方法が挙げられ、より具体的には、例えば、前記タンパク質試料を、２．５ｍＭリン酸カリウム、０．５ｍＭ　ＡＤＰ、及び２．５ｍＭ　ＮａＣｌを含有するＰＡ３バッファー（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に適量添加して反応液を調製し、前記反応液に適量のルシフェラーゼを加え、終濃度１．７ｍＭのＮＡＤＨを加えることで反応を開始させて蛍光を測定し、蛍光の変化量を、プロトン輸送活性、すなわちＡＴＰ合成酵素活性として測定する方法が挙げられる。前記タンパク質試料、前記反応液、前記ルシフェラーゼの量は、適宜試料の条件等に応じて調整することができる。また、前記乳酸菌からタンパク質試料を調製する方法としては特に制限はなく、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。
　前記活性が対照との比較において低下している場合、当該乳酸菌においてＡＴＰ合成酵素複合体の活性が低下している、すなわち、ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されていると判定することができる。前記判定基準としては、特に制限されないが、例えば、対照における活性の平均値の４ＳＤ以下、３ＳＤ以下、又は２ＳＤ以下の活性（ＳＤ：標準偏差）であれば、ＡＴＰ合成酵素活性が低い、すなわち当該乳酸菌においてＡＴＰ合成酵素複合体の活性が低下していると判定してもよい。
　このときの対照としては、ＡＴＰ合成酵素複合体の活性低下がないことが既知の乳酸菌が挙げられ、より具体的には、例えば、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２８７５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィルス　ＯＬＳ４４９６（以下、場合により「ＯＬＳ４４９６株」という）が挙げられる。ＯＬＳ４４９６株は、（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４４９６、（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２８７５号、（３）受託日：２０１９年２月５日で、（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に寄託されている。
　〈ＡＴＰ合成酵素複合体構成タンパク質の遺伝子の変異〉
　ＡＴＰ合成酵素複合体の活性低下は、典型的には、当該複合体を構成する構成タンパク質の遺伝子における機能欠失型変異に起因するものである。そのため、本発明において、乳酸菌の「ＡＴＰ合成酵素複合体の活性低下」は、「構成タンパク質の遺伝子の機能欠失型変異」を検出することにより、間接的に、前記変異が検出された乳酸菌においてＡＴＰ合成酵素複合体の活性が低下している、すなわち、ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されていると判定することができる。
　本発明において、機能欠失型変異とは、アミノ酸変異を伴う変異のことを示し、前記アミノ酸変異としては、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加が挙げられる。このような機能欠失型変異としては、特に制限されないが、例えば、１若しくは複数の塩基の置換によるミスセンス変異、ナンセンス変異、又はフレームシフト変異；遺伝子の全体若しくは部分的な欠失若しくは挿入が挙げられ、遺伝子の破壊を伴う変異（例えば、１個以上、５個以上、又は１０個以上（好ましくは、２０個、３０個、４０個、５０個、又は６０個以上）のアミノ酸の置換及び／又は欠失を伴う変異）であることが好ましい。
　これらの中でも、本発明の乳酸菌としては、前記構成タンパク質の遺伝子の機能欠失型変異（すなわち、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制）が、Ａサブユニット遺伝子における機能欠失型変異及びεサブユニット遺伝子における機能欠失型変異のうちの少なくとも１つであることが好ましく、εサブユニット遺伝子における機能欠失型変異であることがより好ましい。
　構成タンパク質の１つであるＡサブユニットは、ＡＴＰ合成酵素複合体の中でも同酵素の触媒活性を有する部分であるため、このＡサブユニットをコードする遺伝子に機能欠失型変異（アミノ酸変異）が生じると、ＡＴＰ合成酵素複合体の活性低下を惹き起こす。Ａサブユニット遺伝子における機能欠失型変異として、より具体的には、配列番号１に記載の塩基配列における機能欠失型変異であることが好ましい。
　Ａサブユニット遺伝子における機能欠失型変異の例としては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１番目のバリン又は配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１番目のバリンに対応するバリンの、それ以外のアミノ酸（例えば、アラニン）への置換を起こす塩基の置換等が挙げられるが、これに制限されるものではない。
　構成タンパク質の１つであるεサブユニットは、ＡＴＰ合成酵素複合体の中でもＡＴＰとの結合性に寄与しているため、このεサブユニットをコードする遺伝子に機能欠失型変異（アミノ酸変異）が生じると、ＡＴＰ合成酵素複合体の活性低下を惹き起こす（Ｋｒａｈ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，２０１８，ｒｓｏｂ．ｒｏｙａｌｓｏｃｉｅｔｙｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．ｏｒｇ，Ｏｐｅｎ　Ｂｉｏｌ．８：１７０２７５等）。εサブユニット遺伝子における機能欠失型変異として、より具体的には、配列番号１５に記載の塩基配列における機能欠失型変異であることが好ましい。
　εサブユニット遺伝子における機能欠失型変異の例としては、例えば、配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列のうちの１０個以上（好ましくは、２０個、３０個、４０個、５０個、又は６０個以上、さらに好ましくは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列の第８６番目のグルタミン酸に相当するグルタミン酸以降のアミノ酸のうちの２０個、３０個、４０個、５０個、又は６０個以上）のアミノ酸の、置換（ミスセンス）又は欠失を起こす、塩基の置換、欠失、又は挿入（より好ましくは欠失又は置換）；配列番号１６に記載のアミノ酸配列の第３０番目のグリシン又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列の第３０番目のグリシンに対応するグリシンの、それ以外のアミノ酸（例えば、アラニン）への置換を起こす塩基の置換；及び、配列番号１６に記載のアミノ酸配列の第８６番目のグルタミン酸、第９５番目のアルギニン、及び第１２９番目のアルギニンのうちの少なくともいずれかのアミノ酸、又はこれらのうちのいずれかのアミノ酸に対応するアミノ酸の、それ以外のアミノ酸（例えば、アラニン）への置換のうちの少なくとも１つを起こす塩基の置換等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
　なお、本発明において、アミノ酸配列又はアミノ酸に「対応する」アミノ酸配列又はアミノ酸とは、アミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））、アミノ酸配列を整列させた際に、対照のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、配列番号１６に記載のアミノ酸配列）又はアミノ酸（例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１番目のバリン、配列番号１６に記載のアミノ酸配列の第３０番目のグリシン等）と同列になるアミノ酸配列又はアミノ酸のことである。
　本発明における「構成タンパク質の遺伝子の機能欠失型変異」の検出方法としては、特に制限はないが、例えば、下記の方法が挙げられる。なお、本発明において遺伝子の「変異の検出」とは、原則として、ゲノムＤＮＡ上の変異を検出することを意味するが、当該ゲノムＤＮＡ上の変異は転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映されるため、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること（すなわち、間接的な検出）をも含む意味である。
　前記検出方法の一態様としては、ＡＴＰ合成酵素複合体の構成タンパク質の遺伝子領域の塩基配列を直接決定して対照と比較することにより、変異を検出する方法が挙げられる。本発明において「構成タンパク質の遺伝子領域」とは、構成タンパク質の遺伝子を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域を意味する。該領域には、それぞれ独立に、翻訳領域以外に非翻訳領域として各遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）や各遺伝子の５’末端非翻訳領域なども含まれる。
　この態様においては、先ず、対象の乳酸菌からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料としては、ゲノムＤＮＡ試料、及びＲＮＡからの逆転写によって調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。前記乳酸菌からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する方法、及びｃＤＮＡを調製する方法としては特に制限はなく、それぞれ公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。次いで、構成タンパク質の遺伝子領域を含むＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。該ＤＮＡの単離は、例えば、構成タンパク質の遺伝子領域の全て又は一部を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ、或いはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、マキサムギルバート法やサンガー法など当業者に公知の方法で行うことができる。また、前記ＤＮＡ試料からライブラリーを調製して、遺伝子の塩基配列を高速かつ網羅的に読み出せる解析が可能な次世代シーケンサー等を用いて塩基配列を決定することもできる。
　決定したＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの塩基配列を対照と比較することにより、対象の乳酸菌のＡＴＰ合成酵素複合体における構成タンパク質の遺伝子領域の変異の有無を判別することができる。このときの対照としては、各構成タンパク質の遺伝子の公知の塩基配列が挙げられ、公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）から取得することができる。より具体的には、例えば、表１に記載の各塩基配列が挙げられる。
　前記検出方法の別の態様としては、例えば、下記の方法：
　構成タンパク質の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅し、増幅産物の制限酵素によるＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する制限酵素断片長変異（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法；
　前記増幅産物を一本鎖ＤＮＡに解離させ、非変性ゲル上で分離してゲル上での移動度を対照と比較するＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造変異）法；
　前記増幅産物をＤＮＡ変性剤の濃度勾配のあるゲル上で分離し、当該ゲル上での移動度を対照と比較する変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法；
　前記ＤＮＡ試料を鋳型として、「構成タンパク質の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を用いてｄｄＮＴＰプライマー伸長反応を行い、質量測定により決定した遺伝子型を対照と比較するＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法；
　５’－「構成タンパク質の遺伝子領域の全て又は一部の塩基及びその５’側の塩基配列と相補的な塩基配列」－「構成タンパク質の遺伝子領域の全て又は一部の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列とハイブリダイズしない塩基配列」－３’（フラップ）からなるオリゴヌクレオチドプローブ、及び「構成タンパク質の遺伝子領域の全て又は一部の塩基及びその３’側の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ」を前記ＤＮＡ試料にハイブリダイズさせた後、一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断して遊離させたフラップ量をレポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブに基づいて測定し、対照と比較するＩｎｖａｄｅｒ法；
　前記増幅産物を一本鎖に解離させてその片鎖のみを分離し、構成タンパク質の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を測定して対照と比較するＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法；
　蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、前記増幅産物を鋳型として「構成タンパク質の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」で一塩基伸長反応を行い、蛍光の偏光度を測定して対照と比較するＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法や前記一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定して対照と比較するＳＮｕＰＥ法
等が挙げられる。
　このときの対照としては、各構成タンパク質の遺伝子の変異がないことが既知の乳酸菌から上記と同様にして調製したＤＮＡ試料が挙げられ、より具体的には、例えば、ＯＬＳ４４９６株から上記と同様にして調製したＤＮＡ試料が挙げられる。
　また、前記検出方法の別の一態様として、遺伝子の変異箇所がわかっている場合には、例えば、下記の方法：
　構成タンパク質の遺伝子領域の変異部位を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有し、かつ、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせた前記ＤＮＡ試料を鋳型として、当該構成タンパク質の遺伝子領域の変異部位を含む塩基配列を増幅し、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出するダブルダイプローブ法（いわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法）；
　ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記ＤＮＡ試料を鋳型として、構成タンパク質の遺伝子領域の変異部位を含む塩基配列を増幅して検出するＨＲＭ（ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｌｔｉｎｇ、高分解融解曲線解析）法；
　構成タンパク質の遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡ、及び、該ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を用いるＤＮＡアレイ法
等を採用してもよい。
　さらに、構成タンパク質におけるアミノ酸変異部位がわかっている場合には、例えば、対象の乳酸菌からタンパク質試料を調製し、当該アミノ酸変異部位に特異的に結合する分子（例えば、抗体）を用いて当該変異部位を検出する方法；ペプチドマスフィンガープリンティング法（ＰＭＦ）、プロテインシーケンサー（エドマン分解法）等を採用してもよい。例えば、前記抗体を用いた検出方法においては、前記タンパク質試料に対して前記抗体を用いて抗原抗体反応を行い、前記アミノ酸変異部位を有する構成タンパク質を検出する。前記抗体が標識されている場合には、目的の構成タンパク質を直接検出することができるが、標識されていない場合には、さらに、当該抗体を認識する標識された分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）を作用させ、間接的に検出してもよい。このような方法としては、免疫組織化学（免疫染色）法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法等が挙げられる。なお、前記乳酸菌からタンパク質試料を調製する方法としては特に制限はなく、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。
　〔ＡＴＰ合成酵素複合体の発現低下〕
　「ＡＴＰ合成酵素複合体の発現低下」とは、通常、対照との比較において、これよりも発現量が少ないことを意味する。本発明において、乳酸菌の「ＡＴＰ合成酵素複合体の発現低下」は、前記構成タンパク質のうちの少なくとも１種の発現低下と同義であり、ＡＴＰ合成酵素複合体の発現低下を確認する方法としては、前記構成タンパク質のうちの少なくとも１種の発現量を転写レベル又は翻訳レベルで検出し、対照と比較する方法が挙げられる。
　これらの中でも、本発明の乳酸菌としては、前記構成タンパク質の発現低下（すなわち、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制）が、Ａサブユニットタンパク質及び／又はεサブユニットタンパク質の発現低下であることが好ましく、εサブユニットタンパク質の発現低下であることがより好ましい。このような発現低下として、より具体的には、（ａ）配列番号２又は配列番号１６（好ましくは配列番号１６）に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現低下であることがより好ましい。
　また、自然界において、塩基配列の変異によってその配列がコードするアミノ酸配列が変異することは起こり得ることであるため、本発明の乳酸菌としては、前記構成タンパク質の発現低下が、（ｂ）配列番号２又は配列番号１６（好ましくは配列番号１６）に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質の発現低下であってもよい。この場合、１若しくは複数個のアミノ酸残基とは、好ましくはアミノ酸残基が１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、特に好ましくは２個以下である。
　さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、配列番号２又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列が得られた場合、それをコードするヌクレオチド配列に基づいて、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，１９７５年，ｐ．５０３－５１７）や、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１９８５年，ｐ．１３５０－１３５４、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１９８８年，ｐ．４８７－４９１）等により、類似したアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得可能である。
　そのため、本発明の乳酸菌としては、前記構成タンパク質の発現低下が、（ｃ）配列番号２又は配列番号１６（好ましくは配列番号１６）に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質の発現低下であってもよい。この場合、アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴＰのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，１９９０年、ｐ．４０３－４１０）を用いて決定することができる。また、前記配列番号２又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列との同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
　発現量を検出する上記（ｂ）のタンパク質及び（ｃ）のタンパク質としては、機能抑制されていないタンパク質であることが必要である。本発明の乳酸菌において発現低下している構成タンパク質としては、上記（ａ）～（ｂ）のうちの少なくとも１種であってよいが、上記（ａ）であることが好ましい。
　〈ＡＴＰ合成酵素複合体構成タンパク質の転写レベルでの発現量〉
　構成タンパク質の発現量を転写レベルで検出する方法においては、例えば、先ず、対象の乳酸菌からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡからの逆転写によってｃＤＮＡ試料を調製する。前記乳酸菌からＲＮＡを抽出する方法、及びｃＤＮＡ試料を調製する方法としては特に制限はなく、それぞれ公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。次いで、前記ｃＤＮＡ試料を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅反応、又はオリゴヌクレオチドプローブ用いたハイブリダイゼーション反応により、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出し、その量を必要に応じて定量することにより、転写レベルでの発現量とすることができる。このような方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノザンブロット法、ドットブロット法、ＤＮＡアレイ法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ｍＲＮＡ－ｓｅｑ等が挙げられる。当業者であれば、公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）から取得可能な各構成タンパク質のアミノ酸やそれをコードする塩基配列の典型配列（より具体的には、例えば、表１に記載のアミノ酸配列、塩基配列）を基に、各方法に適したオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブを常法により設計することができる。
　検出した転写レベルでの発現量が対照との比較において低下している場合、当該乳酸菌において当該構成タンパク質の発現量が低下している、すなわち、ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されていると判定することができる。前記判定基準としては、特に制限されないが、例えば、対照における発現量の平均値の４ＳＤ以下、３ＳＤ以下、又は２ＳＤ以下の発現量であれば、当該乳酸菌においてＡＴＰ合成酵素複合体の発現量が低下していると判定してもよい。
　このときの対照としては、各構成タンパク質の発現低下がないことが既知の乳酸菌から上記と同様にして調製したｃＤＮＡ試料が挙げられ、より具体的には、例えば、ＯＬＳ４４９６株から上記と同様にして調製したｃＤＮＡ試料が挙げられる。
　〈ＡＴＰ合成酵素複合体構成タンパク質の翻訳レベルでの発現量〉
　構成タンパク質の発現量を翻訳レベルで検出する方法においては、例えば、先ず、対象の乳酸菌からタンパク質試料を調製する。前記乳酸菌からタンパク質試料を調製する方法としては特に制限はなく、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。次いで、構成タンパク質に特異的な抗体を用いて抗原抗体反応を行い、構成タンパク質を検出し、その量を必要に応じて定量することにより、翻訳レベルでの発現量とすることができる。このような抗体を用いたタンパク質の検出法としては、免疫組織化学（免疫染色）法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法等が挙げられる。
　構成タンパク質の発現量を翻訳レベルで検出する方法において、構成タンパク質の検出は、質量分析法（ＭＳ）を使用して行うこともできる。このような質量分析法による検出方法としては、例えば、前記タンパク質試料に含まれるタンパク質を標識し、標識したタンパク質を分画し、分画したタンパク質を質量分析に供し、質量分析値から構成タンパク質を同定し、必要に応じて定量する方法が挙げられる。前記標識としては、当技術分野で公知の同位体標識試薬を用いることができ、適当な標識試薬を市販品として入手することができる。また分画も当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば市販のイオン交換カラム等を用いて行うことができる。
　また、遺伝子の発現低下は、プロモーターの過剰メチル化が要因の一つであることが当該技術分野で公知である。したがって、構成タンパク質の発現量の翻訳レベルでの検出としては、構成タンパク質の遺伝子プロモーターのメチル化を指標として検出することも考えられる。プロモーターのメチル化の検出には、例えば、メチル化されたシトシンをウラシルに変換する活性を有するバイサルファイト処理後の塩基配列の変化を塩基配列決定により直接的に検出する方法や、バイサルファイト処理前の塩基配列は認識できる（切断できる）がバイサルファイト処理後の塩基配列は認識できない（切断できない）制限エンドヌクレアーゼを利用して間接的に検出する方法などの公知の方法を利用することができる。
　検出した翻訳レベルでの発現量が対照との比較において低下している場合、当該乳酸菌において当該構成タンパク質の発現量が低下している、すなわち、ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されていると判定することができる。前記判定基準としては、特に制限されないが、例えば、対照における発現量の平均値の４ＳＤ以下、３ＳＤ以下、又は２ＳＤ以下の発現量であれば、当該乳酸菌においてＡＴＰ合成酵素複合体の発現量が低下していると判定してもよい。
　このときの対照としては、各構成タンパク質の発現低下がないことが既知の乳酸菌から上記と同様にして調製したタンパク質試料が挙げられ、より具体的には、例えば、ＯＬＳ４４９６株から上記と同様にして調製したタンパク質試料が挙げられる。
　本発明において、乳酸菌の「ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制」を確認する方法としては、上記のうちのいずれか１種の判定方法を採用することができ、２種以上を組み合わせてもよい。これらの中でも、精度及び簡便性の観点からは、対象の乳酸菌において、前記構成タンパク質の遺伝子の機能欠失型変異を検出することにより、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制を判定する方法が好ましい。
　（低温保存における酸産生及び生菌数）
　本発明の乳酸菌によれば、かかる乳酸菌を用いて得られる発酵乳において、低温保存中の酸産生量を低減させてｐＨ低下を抑制し、かつ、前記低温保存によっても乳酸菌の生菌数を十分に維持することが可能となる。したがって、本発明の乳酸菌としては、
　１０％脱脂粉乳培地において、４３℃で培養液のｐＨが４．７以下となるまで培養をした後、１０℃で１０日間保存したとき、
（Ａ１）前記保存後の培養液における生菌数が１×１０８ｃｆｕ／ｇ以上となり、かつ、
（Ａ２）前記保存後の培養液のｐＨが４．２以上となる、
の条件を満たすことが好ましい。また、本発明の乳酸菌としては、さらに、
（Ａ３）前記培養で培養液のｐＨが４．７以下となるまでの時間が前記培養開始から７時間以下となる、及び／又は
（Ａ４）前記培養開始から２０時間後の培養液のｐＨが４．１以上となる、
の条件を満たすことがより好ましい。
　〔脱脂粉乳培地〕
　条件（Ａ１）～（Ａ４）において、「１０％脱脂粉乳培地」とは、脱脂粉乳を１０質量％含有する培地を示す。本発明に係る脱脂粉乳とは、獣乳（好ましくは牛乳）から脂肪分を除いた脱脂乳を粉末状に乾燥させたものを示し、例えば、日本の「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（以下、場合により「乳等省令」という）」において、乳固形分９５．０％以上、水分５．０％以下と定められているものが挙げられる。このような脱脂粉乳の組成としては、例えば、「日本食品標準成分表２０１５年版（七訂）」に記載の組成を含む組成、すなわち、１００ｇ中、エネルギー３００～４００（好ましくは３５９）ｋｃａｌ、水分３～５（好ましくは３．８）ｇ、タンパク質３０～４０（好ましくは３４．０）ｇ、脂質０．２～２（好ましくは１．０）ｇ、炭水化物（乳糖を含む）４５～６０（好ましくは５３．３）ｇ、カルシウム９００～２０００（好ましくは１１００）ｍｇ、ビタミンＡ　３～１０（好ましくは６）μｇ、ビタミンＢ２０．５～２（好ましくは１．６０）ｍｇ、コレステロール１０～３０（好ましくは２５）ｍｇ、食塩相当量０．５～２（好ましくは１．４）ｇの組成が挙げられる。このような１０％脱脂粉乳培地のｐＨとしては、通常、６～７である。
　条件（Ａ１）～（Ａ４）に係る１０％脱脂粉乳培地としては、前記脱脂粉乳以外の他の成分を含有していてもよいが、その場合であっても当該他の成分の含有量が０．１質量％以下であることが好ましく、０．０１質量％以下であることがより好ましく、１０質量％の脱脂粉乳と９０質量％の水（好ましくは飲適用の水）とからなることが特に好ましい。前記他の成分としては、例えば、酵母エキス、ペプチドが挙げられるが、特に、上記条件に係る１０％脱脂粉乳培地としては、前記酵母エキスを実質的に含有しないことが好ましい。なお、本発明において、「実質的に含有しない」とは、例えば、全質量に対して０．００１質量％以下であることをいう。本発明の乳酸菌は、前記酵母エキスを含有しない培地においても、上記条件を満たすことができる。
　条件（Ａ１）～（Ａ４）に係る１０％脱脂粉乳培地としては、滅菌処理又は殺菌処理が施されものであることが好ましい。これらの条件としては、特に限定されないが、例えば、前記滅菌処理の条件としては、７０～１３０℃において１分～１時間の条件が挙げられ、前記殺菌処理の条件としては、７５～１２５℃において１０分～３０分間の条件が挙げられる。また、前記１０％脱脂粉乳培地としては、下記の第１の１０％脱脂粉乳培地と第２の１０％脱脂粉乳培地とで同じ組成、及び／又は、同じ滅菌処理若しくは殺菌処理を施されたものであってもよく、互いに異なる組成及び／又は処理を施されたものであってもよい。また、下記の賦活培養を行う場合、第２の１０％脱脂粉乳培地には第１の培養後の培養液の一部又は全部が含まれていてもよい。
　〔賦活培養（第１の培養）〕
　条件（Ａ１）～（Ａ４）では、乳酸菌が低温や冷凍で保存されていた場合等には、先ず、当該乳酸菌に対し、賦活培養を行うことが好ましい。かかる賦活培養（以下、場合により「第１の培養」という）としては、１０％脱脂粉乳培地（以下、第１の培養用の培地を場合により「第１の１０％脱脂粉乳培地」という）において、３７℃、嫌気で１６～１８時間（好ましくは１６時間）、培養を行うことが好ましい。このとき、第１の培養に供する乳酸菌量としては、第１の１０％脱脂粉乳培地に対して、生菌数で１×１０２～２×１０８ｃｆｕ／ｇとなる量であることが好ましく、１×１０４～１×１０６ｃｆｕ／ｇとなる量であることがより好ましい。
　なお、本発明において、生菌数の測定は、例えば、適当に希釈した乳酸菌含有液（例えば、第１の培養の場合には第１の培養の培養液（乳酸菌及び第１の１０％脱脂粉乳培地））の希釈液を、好適な寒天培地、例えば、乳等省令で定められた公定培地であるＢＣＰ加プレートカウント寒天培地に広げて培養し、出現するコロニー数をカウントすることにより測定することができる。このときの生菌数の値（ｃｆｕ／ｇ）は、前記乳酸菌含有液（ｇ）中の生菌数であるため、これより、例えば前記第１の培養の培養液中の生菌数を算出する。
　前記嫌気での培養方法としては、特に限定されないが、従来乳酸菌の嫌気培養方法として知られている方法、例えば、酸素濃度調節剤（例えば、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製））の存在下での静置培養が挙げられる。本発明においては、上記培養後の培養液を再度第１の脱脂粉乳培地に接種して、第１の培養を複数回（例えば、２回以下）繰り返してもよい。
　〔培養（第２の培養）〕
　条件（Ａ１）～（Ａ４）では、乳酸菌又は第１の培養後の培養液（すなわち、賦活乳酸菌含有培養液）を用いて培養（以下、場合により「第２の培養」という）を行う。第２の培養では、１０％脱脂粉乳培地（以下、第２の培養用の培地を場合により「第２の１０％脱脂粉乳培地」という）において、４３℃で培養を行う。このとき、第２の培養に供する乳酸菌量としては、第２の１０％脱脂粉乳培地に対して、生菌数で２×１０６～５×１０７ｃｆｕ／ｇとなる量であることが好ましく、４×１０６～４×１０７ｃｆｕ／ｇとなる量であることがより好ましく、１×１０７～２×１０７ｃｆｕ／ｇとなる量であることがより好ましい。第２の培養での培養方法としては、特に限定されないが、従来乳酸菌による発酵乳の発酵方法として知られている方法、例えば、静置培養等を適宜採用することができる。
　第２の培養では、第２の１０％脱脂粉乳培地に含まれる乳糖から乳酸菌の代謝によって乳酸が生じる発酵が行われると、前記乳酸によって培養液のｐＨが低下する。上記条件に係る第２の培養において、この発酵の完了は、培養液のｐＨ（すなわち、乳酸菌を含む第２の１０％脱脂粉乳培地のｐＨ）が４．７以下（より好ましくは４．６以下）となることを基準とする。
　条件（Ａ３）では、前記発酵の完了（すなわち、ｐＨが４．７に達する）までの時間が、第２の培養開始から７時間以下であることが必要であり、６時間以下であることが特に好ましく、５時間以下であることがさらに好ましい。前記発酵の完了までの時間が前記上限を超える乳酸菌では、発酵乳の製造に用いたときに製造に時間を要するため製造効率上好ましくなく、また、低温保存によって発酵乳における生菌数が少なくなる。前記発酵の完了までの時間の下限としては、特に制限されないが、例えば、１時間以上であることが好ましく、２時間以上であることがより好ましい。
　第２の培養を２０時間以上続けると、通常、前記乳酸の産生が続くため、当該乳酸の産生量の増加に伴って培養液のｐＨはさらに低下する。これに対して、条件（Ａ４）では、第２の培養開始から２０時間後の培養液のｐＨが４．１以上となることが必要であり、２４時間後の培養液のｐＨが４．１以上となることが特に好ましい。また、ｐＨを４．１以上に維持できる第２の培養開始からの時間の上限としては、特に制限されないが、例えば、３０時間以下であることが好ましい。本発明者らは、このような４３℃で長時間培養後のｐＨを４．１以上に維持できる乳酸菌によれば、得られる発酵乳における低温（例えば１０℃）保存中のｐＨ低下も抑制できることを見出した。なお、発酵能の低い乳酸菌によっても、４３℃で長時間培養後のｐＨが４．１以上に維持される場合があるが、この場合には、条件（Ａ１）及び／又は条件（Ａ３）を満たさない。
　〔保存〕
　条件（Ａ１）及び条件（Ａ２）では、前記発酵が完了した後（すなわち、ｐＨが４．７に到達後）の培養液を速やかに冷却して保存する。前記保存の条件としては、特に限定されないが、従来発酵乳の保存方法として知られている方法、例えば、前記培養液を容器に封入（好ましくは密封）して静置する方法が挙げられる。
　条件（Ａ１）及び条件（Ａ２）に係る保存温度としては、低温であることが必要であり、より具体的には、１０℃であることが必要である。また、これら条件に係る保存期間としては、それぞれ独立に、１０日間以上であることが必要であり、１６日間以上であることが特に好ましく、２０日間以上であることがより好ましく、３５日間以上であることがさらに好ましい。本発明の乳酸菌では、このように低温条件下で長期間保存されても、酸産生量が十分に少なく、かつ、生菌数が十分に維持される。
　乳酸菌は、通常、低温においても前記乳酸を産生することが可能なため、上記のように発酵完了後の培養液を長時間保存すると、低温条件下であっても、当該乳酸の産生量の増加に伴って当該培養液のｐＨはさらに低下する。これに対して、条件（Ａ２）では、１０℃で１０日間保存後の培養液のｐＨ（すなわち、乳酸菌を含む第２の１０％脱脂粉乳培地のｐＨ）が４．２以上（好ましくは４．３以上、より好ましくは４．４以上）となることが必要であり、１０℃で１６日間保存後の培養液のｐＨが４．２以上（好ましくは４．３以上、より好ましくは４．４以上）となることが特に好ましく、１０℃で３５日間保存後の培養液のｐＨが４．２以上（好ましくは４．３以上、より好ましくは４．４以上）となることがさらに好ましい。
　従来の乳酸菌の中でも、低温感受性と言われる乳酸菌では、低温において長時間保存しても、培養液のｐＨが低下しない場合がある。しかしながら、例えば、特許文献２に記載されているような従来公知の低温感受性の乳酸菌では、発酵が完了するまでに時間を要したり、また、低温保存によって生菌数が低減するという課題を有することを本発明者らは新たに見出した。これは、特許文献３に記載の細菌のように、従来公知の低温感受性の乳酸菌では、ｐＨが低下すると、Ｈ＋が菌体外に排出されずに菌体内のｐＨが低下して生育が抑制されるといったアポトーシスが惹き起こされるためと本発明者らは推察する。これに対して、本発明者らは、低温保存中のｐＨ低下を抑制する乳酸菌であっても、同低温保存中の生菌数を十分に維持できる乳酸菌、すなわち、条件（Ａ１）を満たす乳酸菌が存在することを見出した。条件（Ａ１）では、１０℃で１０日間保存後の培養液における生菌数が１×１０８ｃｆｕ／ｇ以上となることが必要であり、１０℃で１６日間保存後の培養液における生菌数が１×１０８ｃｆｕ／ｇ以上となることが特に好ましく、１０℃で２０日間保存後の培養液における生菌数が１×１０８ｃｆｕ／ｇ以上となることがより好ましく、１０℃で３５日間保存後の培養液における生菌数が１×１０８ｃｆｕ／ｇ以上となることがさらに好ましい。なお、従来公知の低温感受性の乳酸菌では、条件（Ａ１）及び／又は条件（Ａ３）を満たさない。
　本発明の乳酸菌としては、１種を単独であっても、２種以上の組み合わせであってもよい。本発明の乳酸菌として、より具体的には、例えば、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０４号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィルス　ＯＬＳ４８０１（以下、場合により「ＯＬＳ４８０１株」という）、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィルス　ＯＬＳ４８０２（以下、場合により「ＯＬＳ４８０２株」という）、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０６号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィルス　ＯＬＳ４８０３（以下、場合により「ＯＬＳ４８０３株」という）、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０８号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィルス　ＯＬＳ４８２４（以下、場合により「ＯＬＳ４８２４株」という）が挙げられる。これらの例示した乳酸菌はいずれも、Ｓ．サーモフィルスであり、ＰｒｔＳ遺伝子を保有する。
　ＯＬＳ４８０１株及びＯＬＳ４８０２株は、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制として、εサブユニット遺伝子における機能欠失型変異を有し、配列番号１６に記載のアミノ酸配列の第３０番目のグリシン（Ｇｌｙ）に相当するグリシンがアラニン（Ａｌａ）に置換されている（Ｇ３０Ａ）。また、ＯＬＳ４８０３株は、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制として、εサブユニット遺伝子における機能欠失型変異を有し、配列番号１５に記載の塩基配列の第２５８番目のＡに対応する塩基が欠失しており、フレームシフトにより、配列番号１６に記載のアミノ酸配列の第８６番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）に相当するグルタミン酸以降が置換されている（Ｑ８６ＦＳ）。さらに、ＯＬＳ４８２４株は、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制として、Ａサブユニット遺伝子における機能欠失型変異を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１番目のバリン（Ｖａｌ）に対応するバリンがアラニン（Ａｌａ）に置換されている（Ｖ１Ａ）。
　ＯＬＳ４８０１株は、（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４８０１、（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０４号、（３）受託日：２０２１年８月４日で、ＯＬＳ４８０２株は、（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４８０２、（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０５号、（３）受託日：２０２１年８月４日で、ＯＬＳ４８０３株は、（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４８０３、（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０６号、（３）受託日：２０２１年８月４日で、ＯＬＳ４８２４株は、（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４８２４、（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０８号、（３）受託日：２０２１年８月４日で、それぞれ、（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に寄託されている。なお、これらの受託番号で特定されるＳ．サーモフィルスとしては、同株の継代株、又は本発明の効果を阻害しない範囲内において、同株又はその継代株の人工変異株、自然変異株、遺伝子組み換え株、又は派生株等であってよい。
　また、本発明の乳酸菌としては、適宜公知又は自然界に存在する乳酸菌（好ましくは、Ｓ．サーモフィルス、より好ましくは、ＰｒｔＳ遺伝子を保有するＳ．サーモフィルス）に、人為的に上記のＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制を導入した乳酸菌であってもよい。乳酸菌に人為的にＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制を導入する方法としては、上記の機能抑制の態様に応じて適宜従来公知の方法を採用することができ、例えば、部位特異的変異導入法、相同組換え法、遺伝子ターゲッティング法（ノックアウト又はノックイン）による各構成タンパク質の遺伝子への機能欠失型変異の導入；Ｘ線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビーム等の放射線処理による各構成タンパク質の遺伝子の変異誘発（機能欠失型変異の誘発）；紫外線放射による各構成タンパク質の遺伝子の変異誘発（機能欠失型変異の誘発）；エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）等の化学薬品による各構成タンパク質の遺伝子の変異誘発（機能欠失型変異の誘発）；各構成タンパク質の遺伝子プロモーターのメチル化による発現量低下等の方法が挙げられる。
　また、本発明の乳酸菌としては、上記の構成タンパク質の遺伝子の機能欠失型変異以外の変異をさらに有していてもよい。
　＜乳酸菌のスクリーニング方法＞
　ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されている乳酸菌では、低温保存中の酸産生量が少なく、かつ、前記低温保存によっても生菌数が減少しないため、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制を指標として、低温保存中のｐＨ低下が抑制され、かつ、前記低温保存によっても乳酸菌の生菌数が十分に維持される発酵乳を製造するために好適な乳酸菌をスクリーニングすることが可能となる。したがって、本発明は、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制を指標として、低酸産生の乳酸菌を選択する選択工程を含む、乳酸菌のスクリーニング方法も提供する。本発明において、「低酸産生の乳酸菌」とは、これを用いて得られた発酵乳において、低温保存中のｐＨ低下を抑制し、かつ、生菌数を維持することが可能な乳酸菌を示す。より具体的には、上記（Ａ１）及び（Ａ２）の条件を満たす乳酸菌が挙げられ、上記（Ａ３）及び／又は（Ａ４）の条件を満たすことが好ましい。
　前記選択工程では、上記本発明の乳酸菌において、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制（すなわち、ＡＴＰ合成酵素複合体の直接的活性低下、ＡＴＰ合成酵素複合体構成タンパク質の遺伝子の変異、ＡＴＰ合成酵素複合体の発現低下）で挙げた判定方法のうちの少なくとも１種により、ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されているか否かを判定し、ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制が確認された乳酸菌を、前記低酸産生の乳酸菌であるとして選択する。前記判定方法としては、その好ましい態様も含めて上述のとおりである。
　また、本発明のスクリーニング方法では、さらに、上記本発明の乳酸菌において第２の培養及び必要に応じて第１の培養、並びに、保存で述べた各条件によって培養及び保存を実施し、上記条件（Ａ１）及び（Ａ２）並びに必要に応じて条件（Ａ３）及び／又は（Ａ４）を満たす乳酸菌を、前記低酸産生の乳酸菌であると判定して選択する工程をさらに含んでいてもよい。上記条件としては、その好ましい態様も含めて、上記本発明の乳酸菌において述べたとおりである。
　＜乳酸菌組成物＞
　「乳酸菌組成物」とは、乳酸菌を含有する組成物を示すが、特に限定されず、本発明の乳酸菌組成物としては、少なくとも前記本発明の乳酸菌（前記本発明の乳酸菌のスクリーニング方法で選択された乳酸菌を含む）を含有するものであればよく、本発明の乳酸菌のみ（２種以上の本発明の乳酸菌の組み合わせを含む）からなるものであってもよい。本発明の乳酸菌組成物には、例えば、下記の乳酸菌スターター及び発酵乳が包含される。本発明の乳酸菌組成物としては、本発明の乳酸菌以外の他の成分をさらに含有していてもよく、前記他の成分としては、特に制限されないが、例えば、水等の溶媒；前記乳酸菌の培養終了後の培養液の上清や培地成分等である培養物；前記培養物の濃縮物、希釈物、乾燥物、凍結物等が含まれ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　（乳酸菌スターター）
　本発明の乳酸菌スターターは、前記本発明の乳酸菌を少なくとも含有し、下記の本発明の発酵乳の製造方法のために好適に用いることができる。このような本発明の乳酸菌スターターとしては、前記本発明の乳酸菌のみからなるものであっても、前記他の成分や他の乳酸菌、酵母をさらに含有するものであってもよい。
　前記他の乳酸菌及び酵母としては、従来から発酵乳に含有させることが公知の乳酸菌や酵母が挙げられる。例えば、前記他の乳酸菌としては、本発明の乳酸菌以外の乳酸菌が挙げられ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。これらの中でも、前記本発明の乳酸菌がストレプトコッカス属乳酸菌である場合、本発明の乳酸菌スターターとしては、本発明の乳酸菌以外のラクトバチルス属乳酸菌をさらに含有することが好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクスに属する乳酸菌を含有することがより好ましい。また、本発明の乳酸菌スターターとしては、本発明の乳酸菌であるストレプトコッカス属乳酸菌と本発明の乳酸菌であるラクトバチルス属乳酸菌とを含有していることも好ましい。
　本発明の乳酸菌スターターとしては、液体であっても凍結状態や乾燥粉末等の固体であってもよく、さらに他の成分を含有していてもよい。乳酸菌スターターに含有させることが可能な、さらなる他の成分としては、例えば、発酵促進物質（ギ酸、核酸等）；保護剤（糖類糖）；培地成分（乳又は乳清等）が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　本発明の乳酸菌スターターにおける本発明の乳酸菌の含有量としては、特に制限されないが、０．０１～１００質量％であることが好ましく、０．１～９０質量％であることがより好ましい。また、生菌数量で、１×１０７ｃｆｕ／ｇ以上であることが好ましく、１×１０７～１×１０１１ｃｆｕ／ｇであることがより好ましい。また、他の乳酸菌をさらに含有する場合の当該乳酸菌スターターにおける本発明の乳酸菌（好ましくはストレプトコッカス属乳酸菌）の含有量と前記他の乳酸菌（好ましくは本発明の乳酸菌以外のラクトバチルス属乳酸菌）の含有量との比、及び、本発明の乳酸菌であるストレプトコッカス属乳酸菌と本発明の乳酸菌であるラクトバチルス属乳酸菌とを含有している場合の当該乳酸菌スターターにおけるストレプトコッカス属乳酸菌の含有量とラクトバチルス属乳酸菌の含有量との比としては、それぞれ独立に、菌数（生菌数換算、以下同じ）比で、１：０．１～１：１００であることが好ましく、１：１～１：１０であることがより好ましい。
　本発明の乳酸菌スターターは、例えば、前記他の乳酸菌を含有する組成物（第２の乳酸菌組成物）と組み合わせて、本発明の乳酸菌スターターと第２の乳酸菌組成物とを含む乳酸菌スターターキットとしてもよい。また、例えば、発酵乳製造のための添加物（前記発酵促進物質、保護剤等）、容器、乳酸菌スターターの使用説明書等を組み合わせて、乳酸菌スターターキットとしてもよい。
　（発酵乳）
　本発明の発酵乳は、前記本発明の乳酸菌を少なくとも含有し、例えば、下記の本発明の発酵乳の製造方法によって得ることができる。本発明の発酵乳においては、低温保存中のｐＨ低下が抑制され、かつ、前記低温保存によっても含有される生菌数が十分に維持される。
　本発明の発酵乳としては、特に限定されるものではなく、例えば、前記乳等省令による「発酵乳」の規格を満たす発酵乳（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が８．０％以上、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数（より好ましくは本発明の乳酸菌の数）、以下同じ）が１，０００万／ｍＬ以上のもの）が挙げられる。また、本発明の発酵乳には、前記乳等省令による「乳製品乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％以上、乳酸菌数又は酵母数が１０００万／ｍＬ以上のもの）；「乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％未満、乳酸菌数又は酵母数が１００万／ｍＬ以上のもの）も含む。なお、前記無脂乳固形分とは、全乳固形分から脂肪分を差引いた残りの成分（主に、タンパク質、乳糖、及びミネラル等）を示し、前記乳酸菌及び酵母数は、前記乳等省令で定められた検査法、前記ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地を用いた方法により測定される生菌数であるが、発酵乳が殺菌されたものである場合には当該殺菌前において前記検査法により測定される生菌数換算である。
　本発明の発酵乳としては、下記の発酵乳の製造方法の発酵工程後の発酵物であっても、若しくは前記発酵物を殺菌処理（粉砕処理、加熱処理等）したものであってもよく、又はこれらを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等したものであってもよい。なお、本発明において、前記発酵乳が殺菌処理したものである場合、当該発酵乳における乳酸菌数は、生菌数換算である。本発明の発酵乳に含有される乳酸菌には、生菌の他、死菌も含み、乳酸菌の破砕物及び加熱処理物、これらの濃縮物、希釈物、乾燥物、凍結物も含むが、本発明の発酵乳には、少なくとも乳酸菌の生菌が含有されていることが好ましく、本発明の乳酸菌が生菌として含有されていることがより好ましい。
　本発明の発酵乳は、本発明の乳酸菌及び下記の原料乳（好ましくは調乳液）に由来する成分を含む。また、本発明の効果を阻害しない範囲内において、上記の乳酸菌スターターに挙げた他の成分や、他の乳酸菌や酵母をさらに含有していてもよい。さらに、飲食品に含有させることが可能な各種成分を含有してもよい。発酵乳に含有させることが可能な、さらなる成分としては、特に制限されず、例えば、糖類、糖アルコール類、ミネラル類、ビタミン類、タンパク質、ペプチド、アミノ酸類、有機酸、ｐＨ調整剤、澱粉及び加工澱粉、食物繊維、果実・野菜及びその加工品、動物及び植物生薬エキス、天然由来高分子（コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン等）、油脂、増粘剤、乳化剤、溶剤、界面活性剤、ゲル化剤、安定剤、緩衝剤、懸濁化剤、粘稠剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、保存料、着色料、香料、矯味剤、甘味剤等が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　このような発酵乳としては、ヨーグルト、チーズ、発酵クリーム、発酵バター等が好ましく、特にヨーグルトが好ましい。前記ヨーグルトとしては、具体的には、プレーンヨーグルト等のセットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトタイプヨーグルト（糊状発酵乳）、及びドリンクタイプヨーグルト（液状発酵乳）が挙げられ、これらを材料として用いたフローズンヨーグルトであってもよい。また、本発明の発酵乳は、チーズ、発酵クリーム、発酵バター、ケフィア等の発酵食品の材料として用いることもできる。さらに、本発明の発酵乳は、殺菌処理されていなければ、発酵乳の製造方法において、乳酸菌スターターとしても用いることもできる。
　＜発酵乳の製造方法＞
　本発明の発酵乳の製造方法は、前記本発明の乳酸菌（前記本発明の乳酸菌のスクリーニング方法で選択された乳酸菌を含む）又は本発明の乳酸菌組成物を、原料乳を含有する調乳液に添加して発酵させ、発酵乳を得る発酵工程を含む。なお、前記本発明の乳酸菌のスクリーニング方法で選択された乳酸菌を用いる場合、本発明の発酵乳の製造方法としては、前記選択工程を含んでいてもよいが、当該選択工程としては最初の１回のみでよい。本発明の製造方法によれば、本発明の乳酸菌を用いて原料乳を発酵させることにより、低温保存中のｐＨ低下が抑制され、かつ、前記低温保存によっても含有される生菌数が十分に維持される発酵乳を製造することが可能となる。さらに、本発明の製造方法では、発酵完了までの時間を十分に短くすることも可能となる。
　（調乳液）
　本発明に係る調乳液は、原料乳を含有する。前記原料乳としては、乳糖を含有するものであることが好ましく、例えば、生乳（例えば、ウシ、スイギュウ、ヒツジ、ヤギ等の乳）、殺菌乳、全脂乳、脱脂乳、ホエイ、及びこれらの加工品（例えば、全脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂粉乳、脱脂濃縮乳、練乳、ホエイ粉、バターミルク、バター、クリーム、チーズ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α－ラクトアルブミン（α－Ｌａ）、β－ラクトグロブリン（β－Ｌｇ））が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。
　本発明に係る調乳液としては、前記原料乳のみからなるものであっても、前記原料乳の水溶液、希釈液、又は濃縮液であってもよく、前記原料乳の他に、必要に応じて他の成分をさらに含有するものであってもよい。このような他の成分としては、水；豆乳、砂糖を始めとする糖類や甘味料、香料、果汁、果肉、ビタミン、ミネラル、油脂、セラミド、コラーゲン、ミルクリン脂質、ポリフェノール等の食品、食品成分、又は食品添加物；ペクチン、大豆多糖類、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、寒天、ゼラチン、カラギーナン、ガム類などの安定化剤、増粘剤、ゲル化剤等が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。前記調乳液は、必要に応じて加温しながら、及び／又は、必要に応じて均質化させながら、前記成分を混合することにより調製することができる。また、前記調乳液としては、加熱滅菌又は殺菌したものを用いることもできる。
　（発酵）
　前記調乳液に、本発明の乳酸菌又は本発明の乳酸菌組成物を添加して発酵させる発酵工程としては、従来公知の方法を適宜採用することができ、特に制限されない。また、本発明の乳酸菌又は本発明の乳酸菌組成物の添加量は、従来公知の発酵乳の製造方法において採用されている乳酸菌スターターの添加量に従って、適宜設定することができるが、例えば、前記調乳液の質量に対して、本発明の乳酸菌の生菌数で、１×１０７～５×１０９ｃｆｕ／ｇであることが好ましく、１×１０８～２×１０９ｃｆｕ／ｇであることがより好ましい。
　前記調乳液には、本発明の乳酸菌又は本発明の乳酸菌組成物に加えて、前記他の乳酸菌及び酵母を添加してもよい。これらの中でも、前記本発明の乳酸菌がストレプトコッカス属乳酸菌である場合、本発明の発酵乳の製造方法としては、前記他の乳酸菌としてラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌をさらに添加することが好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクスに属する乳酸菌をさらに添加することがより好ましい。また、他の乳酸菌をさらに添加する場合の本発明の乳酸菌（好ましくはストレプトコッカス属乳酸菌）の添加量と前記他の乳酸菌（好ましくはラクトバチルス属乳酸菌）の添加量との比、及び、本発明の乳酸菌であるストレプトコッカス属乳酸菌と本発明の乳酸菌であるラクトバチルス属乳酸菌とを用いる場合のストレプトコッカス属乳酸菌の添加量とラクトバチルス属乳酸菌の添加量との比としては、それぞれ独立に、菌数（生菌数換算、以下同じ）比で、１：０．１～１：１００であることが好ましく、１：１～１：１０であることがより好ましい。
　前記発酵の条件としては、添加される本発明の乳酸菌の生育条件、前記調乳液の量等に応じて適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、温度３５～４５℃、より好ましくは温度３８～４３℃において、好気又は嫌気条件下で、本発明の乳酸菌又は本発明の乳酸菌組成物を添加した調乳液のｐＨが４．７以下、より好ましくは４．６以下、さらに好ましくは４．０～４．５になるまで、通常、２～２４時間、より好ましくは３～８時間、さらに好ましくは４～６時間、静置又は撹拌（好ましくは静置）することが好ましい。本発明によれば、発酵にかかる時間を十分に短くすることが可能である。また、前記嫌気条件としては、例えば、窒素通気条件下での発酵を採用することができる。
　上記発酵により、本発明の発酵乳を得ることができる。前記発酵工程後の発酵物は、そのまま、又は必要に応じて濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵乳とすることができる。また、前記発酵物における乳酸菌を破砕若しくは加熱処理等して、又は必要に応じてこれを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵乳としてもよい。したがって、本発明の発酵乳の製造方法としては、これらの工程（濃縮工程、希釈工程、乾燥工程、凍結工程、破砕工程、加熱処理工程等）をさらに含んでいてもよい。
　以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、下記の各試験例において、「ｗ／ｖ％」の表示は、特に記載のない場合、重量／容量（ｗ／ｖ：ｇ／ｍＬ）パーセントを示す。
　（試験例１）
　（１）下記の４株の乳酸菌：
　Ｐ２１０１２０１株（比較例１）：ｐｒｔＳ遺伝子を保有するＳ．サーモフィルス。株式会社明治の明治イノベーションセンター（郵便番号１９２－０９１９　日本国東京都八王子市七国１－２９－１）により保管されている菌株；
　ＯＬＳ４８０１株（実施例１）：受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０４号で特定されるＳ．サーモフィルス。ｐｒｔＳ遺伝子を保有する；
　ＯＬＳ４８０２株（実施例２）：受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０５号で特定されるＳ．サーモフィルス。ｐｒｔＳ遺伝子を保有する；及び
　ＯＬＳ４８０３株（実施例３）：受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０６号で特定されるＳ．サーモフィルス。ｐｒｔＳ遺伝子を保有する
を用いた。本明細書に記載の試験例において、各乳酸菌株のｐｒｔＳ遺伝子保有の有無の確認は、次の方法でおこなった。すなわち、先ず、ゲノム配列が既知である５株のＳ．サーモフィルスのｐｒｔＳ遺伝子配列をＮＣＢＩデータベースより取得し、保存性の高い配列からプライマー（Ｆｐｒｉｍｅｒ：配列番号１７、Ｒｐｒｉｍｅｒ：配列番号１８）を作製した。また、ＩｎｓｔａＧｅｎｅＭａｔｒｉｘ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、各菌株のＭ１７培養液からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡ（テンプレート）０．５μＬ、作製したプライマー（５μＭ）各１μＬ、Ｐｈｕｓｉｏｎ　ｈｉｇｈ　ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．１μＬ、５×ＨＦバッファー２μＬ、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ０．８μＬ、及び超純水４．６μＬを混合し（全１０μＬ）、次の条件：９８℃で３０秒；９８℃で５秒、６３℃で２０秒、７２℃で２０秒を３０サイクル；７２℃で５分；４℃にて静置；にてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、６８４ｂｐの位置にバンドが確認された菌株はｐｒｔＳ遺伝子を保有すると判定し、同バンドが確認されなかった菌株はｐｒｔＳ遺伝子を保有しないと判定した。
　（２）前記４株の乳酸菌をそれぞれ、１２１℃で７分間滅菌した１０％脱脂粉乳培地（脱脂粉乳１０質量部及び蒸留水９０質量部（１０質量％脱脂粉乳）、ｐＨ：６～７、以下同じ）において、３７℃、嫌気条件下（酸素濃度調節剤（アネロパック・ケンキ、三菱ガス化学社製）使用、以下同じ）で１６時間静置培養することにより、賦活した。なお、賦活後の培養液の菌数は、５×１０８～１×１０９ｃｆｕ／ｇであった。次いで、７５℃で１５分間殺菌した１０％脱脂粉乳培地に対して、賦活後の培養液の質量が２質量％（乳酸菌生菌数：１×１０７～２×１０７ｃｆｕ／ｇ、以下同じ）となるように接種し、４３℃で静置培養（発酵）し、培養液のｐＨが低下して４．７に達するまでの前記接種からの時間（発酵時間）を測定した。さらに、ｐＨが４．７に達した時点で培養を終了し、直ちに１０℃に冷却して空気が入らないように封入し、１０日間、１７日間、２０日間、又は３５日間静置して保存し、各保存後のｐＨ（１０℃　ｐＨ）を測定した。結果を下記の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示したように、Ｐ２１０１２０１株、ＯＬＳ４８０１株、ＯＬＳ４８０２株、及びＯＬＳ４８０３株のいずれの乳酸菌においても５時間以内に発酵が完了（ｐＨが４．７に到達）した。他方、１０℃保存によるｐＨの経時変化については、Ｐ２１０１２０１株では１７日間の保存でｐＨが４．１１まで低下し、高酸産生乳酸菌であることが確認された。これに対して、ＯＬＳ４８０１株、ＯＬＳ４８０２株、及びＯＬＳ４８０３株では、３５日間保存後であってもｐＨが４．４を下回ることがなく、低酸産生乳酸菌であることが確認された。
　（試験例２）
　（１）試験例１で用いた４株の乳酸菌と同じ株の乳酸菌を、それぞれ、Ｍ１７培養液（０．５ｗ／ｖ％ラクトース）において、３７℃、嫌気条件下で１６時間静置培養し、遠心分離により集菌した後、生理食塩水で洗浄し、再度遠心分離により集菌した。これを、１液（６．７％スクロース、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１００μＬで懸濁し、懸濁液に、１０ｍｇ／ｍＬ　リゾチームを２０μＬ、１０Ｕ／μＬ　ムタノリシンを５μＬ、それぞれ添加し、３７℃で１０分間溶菌を行った。溶菌後の液から遠心分離して上清を除き、Ｗｉｚａｒｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度をＱｕｂｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定し、超純水で０．１ｎｇ／μＬとなるように希釈してゲノムＤＮＡサンプルを得た。
　（２）上記（１）で得られたゲノムＤＮＡサンプルから、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いてライブラリを調製し、ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製した。次いで、Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ＤＮＡ　ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で平均ライブラリサイズを測定し、Ｑｕａｎ－ｉＴ　ｄｓＤＮＡ　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で濃度を測定した。ＤＮＡ濃度が１．１ｎＭとなるように超純水で希釈し、全サンプルを等量ずつ混合した。次いで、混合液４５μＬに、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液５μＬを加えて変性処理した。変性処理後のＤＮＡ　１０μＬとＨＴ１バッファー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）９９０μＬとを混合した後、これに０．２ｐＭ　ＰｈｉＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を等量混合し、Ｍｉｓｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｖ３　（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製、６００ｃｙｃｌｅｓ）を用いて、次世代シーケンサーＭｉｓｅｑ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）にてシーケンス解析を行った。
　（３）上記（２）で得られたシーケンスデータをＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に移し、ｃｏｎｔｉｇを作成した後、アノテーションを付加した。試験例１で高酸産生乳酸菌であったＰ２１０１２０１株のｃｏｎｔｉｇをリファレンス配列とし、低酸産生乳酸菌であったＯＬＳ４８０１株、ＯＬＳ４８０２株、及びＯＬＳ４８０３株のｃｏｎｔｉｇを張り付けて遺伝子変異箇所を検出し、アミノ酸変異を伴う変異箇所のみを抽出した。下記の表３に、前記３株の低酸産生乳酸菌において、抽出された遺伝子変異箇所の遺伝子名、その塩基数及び同塩基配列がコードするアミノ酸数、塩基の変異箇所及びその種類、並びに、アミノ酸変異箇所を示し、これら変異が抽出された株を黒丸で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示したように、上記（３）の結果、低酸産生乳酸菌３株に共通して変異を有する遺伝子が４つ（ＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ｃｈａｉｎ遺伝子（ＡＴＰ合成酵素複合体εサブユニット遺伝子（ａｔｐＣ））、１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ＬａｃＩ　ｆａｍｉｌｙ遺伝子、Ｉｎｓｕｌａｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子）確認された。
　（試験例３）
　試験例２より、先ず、ＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ｃｈａｉｎが低酸産生に寄与するかを調べた。具体的には、高酸産生乳酸菌であったＰ２１０１２０１株のＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ｃｈａｉｎ遺伝子の配列を低酸産生乳酸菌であったＯＬＳ４８０３株に導入した組換え株において、低酸産生性が失われるか否かを検証した。
　（１）相同組換えによる二重交叉によってＯＬＳ４８０３株の組換え株を作製した。すなわち、先ず、Ｐ２１０１２０１株から抽出したゲノムＤＮＡより、下記の表４に示すプライマーの組み合わせを用いてＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ｃｈａｉｎ遺伝子の全長を含む断片をＰＣＲ法により増幅した。次いで、得られた断片を、温度感受性ベクターｐＴＥＲＭ０９に挿入し、組換え用プラスミドＤＮＡを調製した。なお、ｐＴＥＲＭ０９は、低温（３０℃）では複製できるが、高温（３７℃）では複製できないという性質を持ち、加えて、エリスロマイシン耐性遺伝子を保有する。調製したプラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーション法にてＯＬＳ４８０３株に導入し、３０℃にて形質転換体を取得した。得られた形質転換体を、３７℃及びエリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）添加による選択圧下で培養し、相同組換えにより、前記プラスミドＤＮＡをＯＬＳ４８０３株のゲノムＤＮＡに取り込ませた株を取得した。次いで、３０℃にてエリスロマイシン添加による選択圧をかけない条件下で培養し、２回目の相同組換えを行うことで、前記プラスミドＤＮＡ由来のＰ２１０１２０１株の配列と、ＯＬＳ４８０３株のゲノムＤＮＡ上の配列とを入れ替え、組換え株（ＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ｃｈａｉｎ遺伝子の配列がＰ２１０１２０１株の配列に組換えられたＯＬＳ４８０３株、比較例２）を取得した。得られた組換え株は、使用まで－８０℃で凍結保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（２）賦活培地は、０．１ｗ／ｖ％ミーストＰ２Ｇ（アサヒフードアンドヘルスケア社製）を含む１０％還元脱脂乳を１２１℃で７分間殺菌して調製した。上記（１）で得られた組換え株の凍結菌液を前記賦活培地に１質量％となるように接種し、３７℃、嫌気条件化下で１６時間の条件で２回賦活培養した。次いで、９５℃達温殺菌した１０％脱脂粉乳培地に対して、賦活後の培養液の質量が２質量％となるように接種し、４３℃で静置培養（発酵）し、培養液のｐＨが低下して４．６に達するまでの前記接種からの時間（発酵時間）を測定した。さらに、培養液のｐＨが４．６に達した時点で培養を終了し、直ちに１０℃に冷却して空気が入らないように封入し、１日間、７日間、１４日間、又は２１日間静置して保存し、各保存後のｐＨ（１０℃　ｐＨ）を測定した。また、各保存後の培養液を希釈した懸濁液を、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製）に広げて培養し、出現するコロニー数をカウントすることによって、各培養液中の生菌数（ｃｆｕ／ｇ）を測定した。
　組換え株の発酵時間（分）を図１に、１０℃保存後の各保存日数におけるｐＨ（１０℃ｐＨ）を図２に、１０℃保存後の各保存日数における生菌数（ｃｆｕ／ｇ）を図３に、それぞれ示す。図１～図３には、それぞれ、組換えていないＰ２１０１２０１株及びＯＬＳ４８０３株について同様に発酵時間測定、１０℃保存後のｐＨ測定、及び１０℃保存後の生菌数測定を行った結果も合わせて示す。なお、組換え株は１０株取得してそれぞれ測定を行ったが、当該１０株の間で結果に差はなかったため、図１～図３には、当該１０株のうちの１株（Ｎｏ．１）の結果のみ示す。
　図１に示したように、組換え株、Ｐ２１０１２０１株、及びＯＬＳ４８０３株のいずれにおいても５時間以内に発酵が完了（ｐＨが４．６に到達）した。他方、図２に示したように、１０℃保存によるｐＨの経時変化については、組換え株は、Ｐ２１０１２０１株と同様に、７日間の保存でｐＨが４．２を下回り、組み換えていないＯＬＳ４８０３株では確認された低酸産生性が失われた。そのため、ＯＬＳ４８０３株のＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ｃｈａｉｎ遺伝子及びそれがコードするアミノ酸配列における変異が低酸産生に寄与することが確認された。
　さらに、図３に示したように、１０℃保存による生菌数の経時変化については、組換え株、Ｐ２１０１２０１株、及びＯＬＳ４８０３株の間でほとんど差はなく、前記変異の有無によらず、低温保存によっても生菌数が維持されることが確認された。そのため、前記低酸産生性は、アポトーシスによって発揮されたものではないといえる。
　（試験例４）
　試験例２より、次いで、他の３遺伝子（１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ＬａｃＩ　ｆａｍｉｌｙ遺伝子、Ｉｎｓｕｌａｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子）が低酸産生に寄与するかを調べた。具体的には、高酸産生乳酸菌であったＯＬＳ４８０３株の各遺伝子の配列を低酸産生乳酸菌であったＰ２１０１２０１株に導入した組換え株において、低酸産生性が発揮されるか否かを検証した。
　先ず、相同組換えによる二重交叉によってＰ２１０１２０１株の組換え株を作製した。すなわち、ＯＬＳ４８０３株から抽出したゲノムＤＮＡより、下記の表５に示す各プライマーの組み合わせによって各遺伝子の全長を含む断片をＰＣＲ法により増幅した。得られた断片をそれぞれ用い、調製したプラスミドＤＮＡをＰ２１０１２０１株に導入したこと以外は、試験例３の（１）と同様にして、各組換え株（ＯＬＳ４８０３株の各遺伝子の配列がそれぞれ導入されたＰ２１０１２０１株）をそれぞれ７株（Ｎｏ．１～７）取得した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　次いで、得られた各組換え株について、試験例３の（２）と同様にして培養（発酵）を行い、培養液のｐＨが低下して４．６に達するまでの前記接種からの時間（発酵時間）を測定した。さらに、培養液のｐＨが４．６に達した時点で培養を終了し、直ちに１０℃に冷却して空気が入らないように封入し、６日間、７日間、８日間、１４日間、１５日間、３３日間、又は３４日間静置して保存し、各保存後のｐＨ（１０℃　ｐＨ）を測定した。１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の組換え株の結果を表６に、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ＬａｃＩ　ｆａｍｉｌｙ遺伝子の組換え株の結果を表７に、Ｉｎｓｕｌａｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の組換え株の結果を表８に、それぞれ示す。また、表６～表８には、それぞれ、組換えていないＰ２１０１２０１株及びＯＬＳ４８０３株について同様に発酵時間測定、及び１０℃保存後のｐＨ測定を行った結果も合わせて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表６～表８に示したように、１０℃保存によるｐＨの経時変化については、各組換え株とＰ２１０１２０１株との間でほとんど差がなく、いずれの組換え株でもＯＬＳ４８０３株のような低酸産生性が発揮されなかった。したがって、前記３遺伝子（１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ＬａｃＩ　ｆａｍｉｌｙ遺伝子、Ｉｎｓｕｌａｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子）は低酸産生に寄与せず、乳酸菌の低酸産生に寄与するのは、ＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ｃｈａｉｎ遺伝子及びそれがコードするアミノ酸配列の変異であることが確認された。
　以上説明したように、本発明によれば、低温保存中のｐＨ低下が抑制され、かつ、前記低温保存によっても乳酸菌の生菌数が十分に維持される発酵乳を得ることができる乳酸菌、これを含有する乳酸菌スターター及び発酵乳、並びに、発酵乳の製造方法、さらには、乳酸菌のスクリーニング方法を提供することが可能となる。
１．
（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４８０１
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０４
（３）受託日：２０２１年８月４日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター
２．
（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４８０２
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０５
（３）受託日：２０２１年８月４日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター
３．
（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４８０３
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０６
（３）受託日：２０２１年８月４日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター
４．
（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４８２４
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５０８
（３）受託日：２０２１年８月４日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター
５．
（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ４４９６株
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２８７５号
（３）受託日：２０１９年２月５日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター

Claims (15)

  1. 　ＡＴＰ合成酵素複合体が機能抑制されている乳酸菌。
  2. 　前記ＡＴＰ合成酵素複合体のεサブユニットが機能抑制されている、請求項１に記載の乳酸菌。
  3. 　ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌である、請求項１に記載の乳酸菌。
  4. 　ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属する乳酸菌である、請求項３に記載の乳酸菌。
  5. 　ＰｒｔＳ遺伝子を保有する、請求項４に記載の乳酸菌。
  6. 　前記ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制が、εサブユニット遺伝子における機能欠失型変異である、請求項１に記載の乳酸菌。
  7. 　前記ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制が、εサブユニットタンパク質の発現低下である、請求項１に記載の乳酸菌。
  8. 　請求項１に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物。
  9. 　前記乳酸菌がストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌であり、かつ、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌をさらに含有する、請求項８に記載の乳酸菌組成物。
  10. 　乳酸菌スターターである、請求項８に記載の乳酸菌組成物。
  11. 　発酵乳である、請求項８に記載の乳酸菌組成物。
  12. 　請求項１に記載の乳酸菌又は請求項８に記載の乳酸菌組成物を、原料乳を含有する調乳液に添加して発酵させ、発酵乳を得る発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
  13. 　前記乳酸菌がストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌であり、かつ、前記調乳液にラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌をさらに添加する、請求項１２に記載の発酵乳の製造方法。
  14. 　ＡＴＰ合成酵素複合体の機能抑制を指標として、低酸産生の乳酸菌を選択する選択工程を含む、乳酸菌のスクリーニング方法。
  15. 　請求項１４に記載の乳酸菌のスクリーニング方法で選択された乳酸菌を、原料乳を含有する調乳液に添加して発酵させ、発酵乳を得る発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
PCT/JP2022/033649 2021-09-09 2022-09-08 乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、発酵乳の製造方法、及び乳酸菌のスクリーニング方法 WO2023038073A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023546976A JPWO2023038073A1 (ja) 2021-09-09 2022-09-08
CN202280060943.6A CN117957307A (zh) 2021-09-09 2022-09-08 乳酸菌、乳酸菌酵种、发酵乳、发酵乳的制造方法、及乳酸菌的筛选方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021147152 2021-09-09
JP2021-147152 2021-09-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023038073A1 true WO2023038073A1 (ja) 2023-03-16

Family

ID=85506408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/033649 WO2023038073A1 (ja) 2021-09-09 2022-09-08 乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、発酵乳の製造方法、及び乳酸菌のスクリーニング方法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPWO2023038073A1 (ja)
CN (1) CN117957307A (ja)
WO (1) WO2023038073A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07123977A (ja) 1993-11-04 1995-05-16 Calpis Food Ind Co Ltd:The 乳酸菌及び発酵乳製品
JPH07236416A (ja) 1994-03-02 1995-09-12 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 保存中の酸度上昇を抑制した発酵乳の製造法
JPH099954A (ja) 1995-07-04 1997-01-14 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 新規乳酸菌株
JP2001095561A (ja) 1999-09-30 2001-04-10 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 新規乳酸菌株
JP4331309B2 (ja) 1999-03-23 2009-09-16 雪印乳業株式会社 低温感受性乳酸菌株
WO2015068790A1 (ja) * 2013-11-08 2015-05-14 株式会社明治 酸度上昇が抑制された発酵乳およびその製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07123977A (ja) 1993-11-04 1995-05-16 Calpis Food Ind Co Ltd:The 乳酸菌及び発酵乳製品
JPH07236416A (ja) 1994-03-02 1995-09-12 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 保存中の酸度上昇を抑制した発酵乳の製造法
JPH099954A (ja) 1995-07-04 1997-01-14 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 新規乳酸菌株
JP4331309B2 (ja) 1999-03-23 2009-09-16 雪印乳業株式会社 低温感受性乳酸菌株
JP2001095561A (ja) 1999-09-30 2001-04-10 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 新規乳酸菌株
WO2015068790A1 (ja) * 2013-11-08 2015-05-14 株式会社明治 酸度上昇が抑制された発酵乳およびその製造方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Standards Tables of Food Composition in Japan", 2015
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
DATABASE PROTEIN ANONYMOUS : "F0F1 ATP synthase subunit epsilon [Streptococcus thermophilus]", XP093047501, retrieved from NCBI *
FENIOUK, B. A. ET AL.: "The role of subunit epsilon in the catalysis and regulation of FOF1- ATP synthase", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1757, 4 April 2006 (2006-04-04), pages 326 - 338, XP025062827, DOI: 10.1016/j.bbabio. 2006.03.02 2 *
HAMAOKA, NAOHIRO: "Efficient Evaluation and Selection Scheme of Lactic Acid Bacteria for Yoghurt Production", BULLETIN OF THE FOOD PROCESSING RESEARCH CENTER, vol. 15, 22 December 2020 (2020-12-22), pages 11 - 20, XP009544335 *
KRAH A. ET AL., OPEN BIOL., vol. 8, 2018, pages 170275, Retrieved from the Internet <URL:rsob.royalsocietypublishing.org>
SAIKI, R. K ET AL., SCIENCE, vol. 239, 1988, pages 487 - 491
SAIKI, R. K. ET AL., SCIENCE, vol. 230, 1985, pages 1350 - 1354
SOUTHERN, E.M., J. MOL. BIOL., vol. 98, 1975, pages 503 - 517
SUZUKI ET AL., PNAS, vol. 104, no. 52, 2007, pages 20776 - 20781

Also Published As

Publication number Publication date
CN117957307A (zh) 2024-04-30
JPWO2023038073A1 (ja) 2023-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
El-Baradei et al. Bacterial biodiversity of traditional Zabady fermented milk
US9562221B2 (en) Lactic bacterium for texturizing food products selected on the basis of phage resistance
Wang et al. Identification of yeasts and evaluation of their distribution in Taiwanese kefir and viili starters
US20170298457A1 (en) Lactic bacterium with modified galactokinase expression for texturizing food products by overexpression of exopolysaccharide
Hao et al. Identification of the bacterial biodiversity in koumiss by denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific polymerase chain reaction
EP3599877B1 (en) Lactic acid bacteria composition for preparing fermented food products with increased natural sweetness and flavor
EP1883695B1 (en) Probiotic bifidobacterial species
Broadbent et al. Microbiology of Cheddar cheese made with different fat contents using a Lactococcus lactis single-strain starter
ES2902866T3 (es) Uso de cepas de streptococcus thermophilus deficientes en glucosa en un proceso para producir productos lácteos fermentados
Berthoud et al. Development of new methods for the quantitative detection and typing of Lactobacillus parabuchneri in dairy products
Coppola et al. Evaluation of microbial diversity during the manufacture of Fior di Latte di Agerola, a traditional raw milk pasta-filata cheese of the Naples area
MX2012009975A (es) Un metodo para producir un alimento fermentado que contiene bifidobacterias.
Berta et al. Identification of lactic acid bacteria in Slovakian bryndza cheese.
WO2023038073A1 (ja) 乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、発酵乳の製造方法、及び乳酸菌のスクリーニング方法
Shevtsov et al. Identification of phenotypically and genotypically related Lactobacillus strains based on nucleotide sequence analysis of the groEL, rpoB, rplB, and 16S rRNA genes
Kunduhoglu et al. Genotypic identification and technological characterization of lactic acid bacteria isolated from traditional Turkish Kargi tulum cheese
US20240130384A1 (en) Lactic acid bacteria composition for preparing fermented products
Liu et al. A survey of the relationship between functional genes and acetaldehyde production characteristics in Streptococcus thermophilus by multilocus sequence typing
JP6412865B2 (ja) ビフィドバクテリウム・ブレーベ株特異的遺伝子
WO2023163015A1 (ja) 乳酸菌、乳酸菌組成物、乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法、乳酸菌のスクリーニング方法、及び発酵乳の製造方法
Labtar et al. Study on molecular identification of lactic acid bacteria from fermented milks and" Smen"(a traditional steppe butter) and their enzyme producing attributes.
WO2023038072A1 (ja) 乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、発酵乳の製造方法、及び乳酸菌のスクリーニング方法
KR20190044664A (ko) 새로운 세균
US20230404093A1 (en) Protein having fermented milk viscosity improving effect, fermented milk using the same and method for producing the same
Callanan et al. Insertion sequence elements as mediators of strain diversity in Lactobacillus helveticus

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22867394

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023546976

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280060943.6

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022867394

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022867394

Country of ref document: EP

Effective date: 20240409