CN117957307A - 乳酸菌、乳酸菌酵种、发酵乳、发酵乳的制造方法、及乳酸菌的筛选方法 - Google Patents

乳酸菌、乳酸菌酵种、发酵乳、发酵乳的制造方法、及乳酸菌的筛选方法 Download PDF

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Abstract

一种ATP合成酶复合体的功能受到抑制的乳酸菌。

Description

乳酸菌、乳酸菌酵种、发酵乳、发酵乳的制造方法、及乳酸菌的 筛选方法
技术领域
本发明涉及乳酸菌、乳酸菌酵种、发酵乳、及发酵乳的制造方法，更详细而言，涉及乳酸菌、含有其的乳酸菌酵种及发酵乳、以及发酵乳的制造方法，进一步涉及乳酸菌的筛选方法。
背景技术
发酵乳例如在日本的“关于乳及乳制品的成分标准等的省令(乳等省令)”中被定义为“用乳酸菌或酵母使乳或含有与其同等以上的非脂乳固体成分的乳等发酵而呈糊状或液状的物质或这些的冷冻物”。作为所述发酵乳的代表例，可列举例如凝固型酸奶(固体状发酵乳)、软质酸奶(糊状发酵乳)及饮用型酸奶(液状发酵乳)等酸奶。需要说明的是，例如在国际社会通用的食品标准“Codex标准(FAO(联合国粮食及农业组织)/世界卫生组织(WHO)”中，酸奶被定义为“利用德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)及嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus、S.thermophilus)这两种菌乳酸发酵而成的物质”。一直以来，称为酸奶时通常是指将这两种菌作为酵种添加到原料乳中而将该原料乳中的乳糖发酵而得的物质，其特征在于，主要由于上述发酵中所产生的乳酸而具有酸味。
但是，嗜热链球菌等乳酸菌也能通过低温下发酵而产生乳酸，因此上述发酵后的发酵物(例如酸奶等发酵乳)存在如下课题：保存时，即使是在低温条件下，乳酸的产生量也过多而酸度上升(即，pH降低)，损害其风味。
因此，此前为了抑制这样的乳酸菌在低温下产酸的问题而进行了一些研究。例如，日本特开平7-236416号公报(专利文献1)中记载：为了得到低温保存下酸度的上升少的发酵乳，使用德氏乳杆菌保加利亚亚种的酸生成抑制株和唾液链球菌嗜热亚种的粘性物生产株。另外，日本专利第4331309号公报(专利文献2)中，在37～43℃下在3小时以内使添加了0.05％酵母提取物的12％还原脱脂乳凝固且在15～25℃下在3天以内不使添加了0.05％酵母提取物的12％还原脱脂乳凝固的低温敏感性的属于嗜热链球菌的乳酸菌株获得了专利授权，作为上述乳酸菌株，记载了嗜热链球菌SBT0144。
进而，日本特开2001-95561号公报(专利文献3)中记载了细胞膜结合性腺苷三磷酸酶(ATPase)活性降低的德氏乳杆菌保加利亚亚种变异株，并且记载了该变异株由于在发酵过程中pH降低时不将H+排出到菌体外而导致菌体内的pH降低、抑制生育(即，引起所谓细胞凋亡)，因此其结果是乳酸的产生量降低。另外，日本特开平9-9954号公报(专利文献4)中记载了ATPase活性降低的乳酸乳球菌乳亚种变异株，并且记载了该变异株在发酵过程中当pH降低时生育得到抑制，因此乳酸的产生量减少。进而，日本特开平7-123977号公报(专利文献5)中记载了：为了抑制长期低温保存时乳酸酸度上升，使用ATPase活性低的乳杆菌属乳酸菌。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平7-236416号公报
专利文献2：日本专利第4331309号公报
专利文献3：日本特开2001-95561号公报
专利文献4：日本特开平9-9954号公报
专利文献5：日本特开平7-123977号公报
发明内容
发明要解决的问题
但是，除了上述的ATPase活性以外，有助于乳酸菌的发酵乳的低温下产酸量的因子尚无报道。另外，本发明人们发现，使用ATPase活性降低的乳酸菌时，虽然得到的发酵乳的低温下产酸量确实有所降低、pH降低得到抑制，但是存在到发酵完成(例如pH达到4.7或4.6以下)为止所需的时间长、低温保存下乳酸菌的活菌数减少的课题。
本发明是鉴于上述现有技术所具有的课题而进行的，目的在于，提供能够得到低温保存下的pH降低得到抑制且通过上述低温保存也充分维持了乳酸菌的活菌数的发酵乳的乳酸菌、含有其的乳酸菌酵种及发酵乳、以及发酵乳的制造方法，进一步提供乳酸菌的筛选方法。
用于解决问题的方案
本发明人们为了达到上述目的进行了深入研究，首先，为了检索有助于乳酸菌低温下产酸量的因子，在能够抑制低温保存下pH降低的乳酸菌(低产酸乳酸菌)与不能抑制该pH降低的乳酸菌(高产酸乳酸菌)之间进行了基因组分析。所述基因组分析中，提取出多个在低产酸乳酸菌之间共有且伴有氨基酸变异的变异(功能缺失型变异)，因此接下来制作低产酸乳酸菌和高产酸乳酸菌的重组株并验证了各变异是否有助于产酸量。其结果是，发现编码构成ATP合成酶复合体的ε亚基(ATP synthase epsilon chain)的基因(ε亚基基因)中的变异有助于乳酸菌的低产酸。进而，该ε亚基基因具有功能缺失型变异的乳酸菌通过低温保存也充分维持了活菌数，因此发现，通过与以往的专利文献3～5所记载的降低ATPase活性不同的机制可实现低产酸。
因此，本发明人们基于这些见解发现，利用包含ε亚基的ATP合成酶复合体的功能受到抑制的乳酸菌能得到即使低温保存也抑制pH降低且通过上述低温保存也充分维持了乳酸菌的活菌数的发酵乳，从而完成了本发明。
这样的本发明的方式如下所述。
[1]一种乳酸菌，其ATP合成酶复合体的功能受到抑制。
[2]根据[1]所述的乳酸菌，其中，上述ATP合成酶复合体的ε亚基的功能受到抑制。
[3]根据[1]或[2]所述的乳酸菌，其为链球菌属(Streptococcus)乳酸菌。
[4]根据[3]所述的乳酸菌，其为属于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的乳酸菌。
[5]根据[4]所述的乳酸菌，其保有PrtS基因。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的乳酸菌，其中，上述ATP合成酶复合体的功能抑制为ε亚基基因的功能缺失型变异。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的乳酸菌，其中，上述ATP合成酶复合体的功能抑制为ε亚基蛋白质的表达下降。
[8]一种乳酸菌组合物，其含有[1]～[7]中任一项所述的乳酸菌。
[9]根据[8]所述的乳酸菌组合物，其中，上述乳酸菌为链球菌属(Streptococcus)乳酸菌，并且所述乳酸菌组合物还含有乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌。
[10]根据[8]或[9]所述的乳酸菌组合物，其为乳酸菌酵种。
[11]根据[8]或[9]所述的乳酸菌组合物，其为发酵乳。
[12]一种发酵乳的制造方法，其包括下述发酵工序：将[1]～[7]中任一项所述的乳酸菌或[8]～[11]中任一项所述的乳酸菌组合物添加到含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
[13]根据[12]所述的发酵乳的制造方法，其中，上述乳酸菌为链球菌属(Streptococcus)乳酸菌，并且还向上述调制乳液体中添加乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌。
[14]一种乳酸菌的筛选方法，其包括下述选择工序：以ATP合成酶复合体的功能抑制为指标来选择低产酸的乳酸菌。
[15]一种发酵乳的制造方法，其包括下述发酵工序：将通过[14]所述的乳酸菌的筛选方法选择出的乳酸菌添加到含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
发明的效果
根据本发明，可以提供能够得到低温(例如10℃)保存下的pH降低得到抑制且通过上述低温保存也充分维持了乳酸菌的活菌数的发酵乳的乳酸菌、含有其的乳酸菌酵种及发酵乳、以及发酵乳的制造方法，还能够提供乳酸菌的筛选方法。
附图说明
图1为示出试验例3中的重组株、P2101201株、OLS4803株的发酵时间(分钟)的图。
图2为示出试验例3中的重组株、P2101201株、OLS4803株的10℃保存时的pH的经时变化的图。
图3为示出试验例3中的重组株、P2101201株、OLS4803株的10℃保存时的活菌数的经时变化的图。
具体实施方式
以下基于本发明的优选实施方式来详细说明本发明。
＜乳酸菌＞
本发明中，“乳酸菌”是将葡萄糖同化并产生以相对于糖的收率为50％以上的乳酸的微生物的总称，作为生理学性质，其具有如下特征：为革兰氏阳性菌，为球菌或杆菌，无运动性，大多情况下无孢子形成能力(也有例如像凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)那样具有孢子形成能力的乳酸菌)，过氧化氢酶阴性等。
作为本发明的乳酸菌，可列举链球菌属(Streptococcus)乳酸菌、乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌(例如德氏乳杆菌(特别是德氏乳杆菌保加利亚亚种(保加利亚菌)、德氏乳杆菌德氏亚种、德氏乳杆菌乳亚种、德氏乳杆菌印度亚种、德氏乳杆菌桑基亚种、德氏乳杆菌雅各布森亚种等)、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、约氏乳杆菌、格氏乳杆菌、副格氏乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、卷曲乳杆菌等)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌、片球菌属(Pediococcus)乳酸菌、明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌、乳球菌属(Lactococcus)乳酸菌。作为本发明的乳酸菌，优选其中的链球菌属乳酸菌。
(链球菌属乳酸菌)
链球菌属(Streptococcus)乳酸菌为需氧性革兰氏阳性球菌。作为属于链球菌属的乳酸菌，可列举嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)。作为本发明的乳酸菌，优选其中的属于嗜热链球菌者。
嗜热链球菌是也被称为嗜热菌的链球菌，是能够由乳糖产生乳酸的乳酸菌。本说明书中，有时将属于嗜热链球菌的乳酸菌称为“S.thermophilus”。
本发明的乳酸菌为嗜热链球菌时，优选保有prtS基因。通过使用保有prtS基因的嗜热链球菌，有能够进一步缩短至完成发酵所需的时间、进而得到风味更优选的发酵乳的倾向。本发明中，“prtS基因”表示编码可分解酪蛋白的细胞壁结合型丝氨酸蛋白酶的基因。另外，本发明中，例如可以在可从公共数据库(Genbank等)获得的嗜热链球菌的prtS基因之间选择保守性高的序列，使用基于该序列制作的引物组，通过PCR法扩增prtS基因的一部分，根据得到期望的PCR产物来判定嗜热链球菌保有prtS基因。作为上述引物组，可列举例如包含下述的实施例中记载的F引物及R引物的引物组，但是不限于此。
(ATP合成酶复合体)
本发明的乳酸菌为ATP合成酶复合体的功能受到抑制的乳酸菌(包括人工地使ATP合成酶复合体的功能受到抑制的乳酸菌)。“ATP合成酶复合体”为包含多个构成蛋白的蛋白复合体，分子量超过50万，具有由ADP和无机磷酸合成ATP的酶活性。作为上述ATP合成酶复合体的构成蛋白，已知有A亚基、B亚基、C亚基、α亚基、β亚基、γ亚基、δ亚基、ε亚基这8个蛋白。
上述ATP合成酶复合体的各构成蛋白的氨基酸序列和编码其的碱基序列可以从公共数据库(Genbank等)获得，例如，作为嗜热链球菌来源的各构成蛋白的氨基酸序列和编码其的碱基序列(基因的碱基序列)，典型地可列举下述的表1所示的各序列。表1分别示出嗜热链球菌来源的各构成蛋白的基因名和示出其典型碱基序列的序列号、以及示出嗜热链球菌来源的各构成蛋白的典型氨基酸序列的序列号。需要说明的是，即使是未发生变异的构成蛋白，也可能由于多肽性等而在序列方面产生个体差异。ATP合成酶复合体不限于嗜热链球菌，在广泛的乳酸菌中起作用，例如链球菌属乳酸菌之间具有几乎100％(至少90％以上、更优选为93％以上)的高同源性。
【表1】
(ATP合成酶复合体的功能抑制)
本发明中的“ATP合成酶复合体的功能抑制”包括：包括ATP合成酶复合体失活在内的活性降低和ATP合成酶复合体的表达下降。作为上述ATP合成酶复合体的功能抑制，可以为复合体整体的功能抑制，也可以为上述构成蛋白中的1种或2种以上的组合的功能抑制，优选至少包含A亚基和/或ε亚基的功能抑制，更优选至少包含ε亚基的功能抑制。
〔ATP合成酶复合体的活性降低〕
“ATP合成酶复合体的活性降低”是指ATP合成酶复合体原本所具有的活性降低，通常是指在与对照的比较中活性水平低于对照。另外，“ATP合成酶复合体的活性降低”包括ATP合成酶复合体的一部分或全部的失活和活性降低这两者。
〈ATP合成酶复合体的直接的活性降低〉
本发明中，作为直接确认乳酸菌的“ATP合成酶复合体的活性降低”的方法，没有特别限定，可列举例如下述方法：由对象乳酸菌制备蛋白质试样，在荧光性pH指示剂(例如萤光素酶)等存在下向其中加入NADH，测定ATP合成酶活性的质子(H+)输送活性所引起的荧光变化，并与对照的活性进行比较。作为上述测定方法，可列举例如Suzuki et al.，2007，PNAS，Vol.104，no.52，20776-20781中记载的测定方法，更具体而言，可列举例如：将上述蛋白质试样适量添加到含有2.5mM磷酸钾、0.5mM ADP、和2.5mM NaCl的PA3缓冲液(10mMHepes/KOH(pH7.5)、10％甘油、5mM MgCl2)中而制备反应液，向上述反应液中加入适量的萤光素酶，加入终浓度1.7mM的NADH，从而开始反应，测定荧光，并且测定荧光的变化量作为质子输送活性、即ATP合成酶活性。上述蛋白质试样、上述反应液、上述萤光素酶的量可根据试样的条件等适当调整。另外，作为由上述乳酸菌制备蛋白质试样的方法，没有特别限制，可以适当采用公知的方法或基于公知方法的方法。
上述活性与对照相比降低的情况下，可以判定为该乳酸菌中ATP合成酶复合体的活性降低、即ATP合成酶复合体的功能受到抑制。作为上述判定基准，没有特别限制，例如，如果为对照的活性的平均值的4SD以下、3SD以下、或2SD以下的活性(SD：标准偏差)，则可以判定为ATP合成酶活性低、即该乳酸菌中ATP合成酶复合体的活性降低。
作为此时的对照，可列举已知ATP合成酶复合体的活性未降低的乳酸菌，更具体而言，可列举例如以保藏号NITE BP-02875号规定的嗜热链球菌OLS4496(以下有时称为“OLS4496株”)。OLS4496株以(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4496、(2)保藏号：NITE BP-02875号、(3)保藏日：2019年2月5日保藏于(4)保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD))(邮编292-0818日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)。
〈ATP合成酶复合体构成蛋白的基因的变异〉
ATP合成酶复合体的活性降低典型情况下起因于构成该复合体的构成蛋白的基因中的功能缺失型变异。因此，本发明中，乳酸菌的“ATP合成酶复合体的活性降低”可以通过检测“构成蛋白的基因的功能缺失型变异”来间接地判定检测到上述变异的乳酸菌中ATP合成酶复合体的活性降低、即ATP合成酶复合体的功能受到抑制。
本发明中，功能缺失型变异是指伴有氨基酸变异的变异，作为上述氨基酸变异，可列举1或多个氨基酸的置换、缺失、插入和/或添加。作为这样的功能缺失型变异，没有特别限制，可列举例如由1或多个碱基的置换导致的错义突变、无义突变、或移码突变；基因的整体或局部的缺失或插入，优选伴有基因破坏的变异(例如，伴有1个以上、5个以上、或10个以上(优选为20个、30个、40个、50个、或60个以上)氨基酸的置换和/或缺失的变异)。
这些中，作为本发明的乳酸菌，优选上述构成蛋白的基因的功能缺失型变异(即，ATP合成酶复合体的功能抑制)为A亚基基因中的功能缺失型变异和ε亚基基因中的功能缺失型变异中的至少1种，更优选为ε亚基基因中的功能缺失型变异。
作为构成蛋白之一的A亚基在ATP合成酶复合体中为具有该酶的催化活性的部分，因此如果编码该A亚基的基因发生功能缺失型变异(氨基酸变异)，则会引发ATP合成酶复合体的活性降低。作为A亚基基因中的功能缺失型变异，更具体而言，优选为序列号1记载的碱基序列中的功能缺失型变异。
作为A亚基基因中的功能缺失型变异的例子，可列举例如使序列号2记载的氨基酸序列的第1位的缬氨酸或序列号2记载的氨基酸序列的第1位的缬氨酸所对应的缬氨酸置换为此外的氨基酸(例如丙氨酸)的碱基置换等，但是不限于此。
作为构成蛋白之一的ε亚基在ATP合成酶复合体中为有助于与ATP的结合性，因此如果编码该ε亚基的基因发生功能缺失型变异(氨基酸变异)，则会引起ATP合成酶复合体的活性降低(Krah A.et al.，2018，rsob.royalsocietypublishing.org，Open Biol.8：170275等)。作为ε亚基基因中的功能缺失型变异，更具体而言，优选序列号15记载的碱基序列中的功能缺失型变异。
作为ε亚基基因中的功能缺失型变异的例子，可列举例如：使序列号16记载的氨基酸序列或序列号16记载的氨基酸序列所对应的氨基酸序列中10个以上(优选为20个、30个、40个、50个、或60个以上，进一步优选为与序列号16记载的氨基酸序列的第86位的谷氨酸相当的谷氨酸及以后的氨基酸中的20个、30个、40个、50个、或60个以上)氨基酸发生置换(错义)或缺失的碱基置换、缺失或插入(更优选为缺失或置换)；使序列号16记载的氨基酸序列的第30位的甘氨酸或序列号16记载的氨基酸序列的第30位的甘氨酸所对应的甘氨酸置换为此外的氨基酸(例如丙氨酸)的碱基置换；和，使序列号16记载的氨基酸序列的第86位的谷氨酸、第95位的精氨酸、和第129位的精氨酸中的至少任一氨基酸或这些中的任意氨基酸所对应的氨基酸置换为此外的氨基酸(例如丙氨酸)中的至少1个的碱基置换等，但是不限于这些。
需要说明的是，本发明中，氨基酸序列或氨基酸“所对应的”氨基酸序列或氨基酸是指：使用氨基酸序列分析软件(GENETYX-MAC、Sequencher等)、BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool at the National Center for Biological Information(美国国立生物信息中心的基本局部比对检索工具))等(例如参数：默认值(即，初始设定值))来排列氨基酸序列时，与对照的氨基酸序列(例如序列号2、序列号16记载的氨基酸序列)或氨基酸(例如序列号2记载的氨基酸序列的第1位的缬氨酸、序列号16记载的氨基酸序列的第30位的甘氨酸等)处于同一列的氨基酸序列或氨基酸。
作为本发明中的“构成蛋白的基因的功能缺失型变异”的检测方法，没有特别限定，可列举例如下述的方法。需要说明的是，本发明中基因的“变异的检测”原则上是指检测基因组DNA上的变异，由于该基因组DNA上的变异会反映在转录产物中的碱基变化、翻译产物中的氨基酸变化上，因此也包括检测这些的转录产物、翻译产物中的该变化(即，间接检测)。
作为上述检测方法的一方式，可列举直接确定ATP合成酶复合体的构成蛋白的基因区域的碱基序列并且与对照进行比较、从而检测变异的方法。本发明中“构成蛋白的基因区域”是指包含构成蛋白的基因的基因组DNA上的一定区域。该区域各自独立地除了翻译区以外还包含作为非翻译区的各基因的表达控制区域(例如启动子区域、增强子区域)、各基因的5’末端非翻译区等。
该方式中，首先从对象乳酸菌制备DNA试样。作为DNA试样，可列举基因组DNA试样和由RNA通过逆转录制备的cDNA试样。作为从上述乳酸菌提取基因组DNA或RNA的方法、和制备cDNA的方法，没有特别限制，可以分别适当采用公知方法或基于公知方法的方法。接着，分离包含构成蛋白的基因区域的DNA，确定分离出的DNA的碱基序列。该DNA的分离例如可以通过PCR等来进行，所述PCR使用以夹持构成蛋白的基因区域的全部或一部分的方式设计的一对寡核苷酸引物，并且以基因组DNA、或RNA为模板。分离出的DNA的碱基序列的确定可以通过Maxam-Gilbert法、桑格法等本领域技术人员公知的方法来进行。另外，也可以由上述DNA试样制备文库，使用可高速且总括性读出、解析基因的碱基序列的下一代测序仪等来确定碱基序列。
通过与所确定DNA或cDNA的碱基序列与对照进行比较，可以判断对象的乳酸菌的ATP合成酶复合体中的构成蛋白的基因区域有无变异。作为此时的对照，可列举各构成蛋白的基因的公知的碱基序列，可以从公共数据库(Genbank等)获得。更具体而言，可列举例如表1记载的各碱基序列。
作为上述检测方法的另一方式，可列举例如下述方法：
利用限制酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)的方法、PCR-RFLP法，扩增包含构成蛋白的基因区域的全部或一部分的DNA、并且将扩增产物的限制酶切DNA片段的大小与对照进行比较；
PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism、单链高级结构多态性)法，将上述扩增产物解离为单链DNA，在非变性凝胶上分离，将凝胶上的迁移率与对照进行比较；
变性剂浓度梯度凝胶电泳(denaturant gradient gel electrophoresis：DGGE)法，将上述扩增产物在DNA变性剂存在浓度梯度的凝胶上分离，将该凝胶上的迁移率与对照进行比较；
MALDI-TOF/MS法，以上述DNA试样为模板，使用“具有构成蛋白的基因区域的全部或一部分的碱基的单个3’侧碱基和与其3’侧的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸引物”进行ddNTP引物延伸反应并通过质谱来确定基因型、并且与对照进行比较；
Invader法，使5’-“与构成蛋白的基因区域的全部或一部分的碱基和其5’侧的碱基序列互补的碱基序列”-“与构成蛋白的基因区域的全部或一部分的单个3’侧碱基和其3’侧的碱基序列不杂交的碱基序列”-3’(FLAP)所构成的寡核苷酸探针和“具有与构成蛋白的基因区域的全部或一部分碱基和其3’侧的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸探针”与上述DNA试样杂交后，用单链DNA切割酶切断，对于游离出的FLAP量，基于用报告荧光色素和淬灭荧光色素标记的寡核苷酸探针进行测定，并且与对照进行比较；
焦磷酸测序(Pyrosequencing)法，将上述扩增产物解离为单链，仅分离其中的一条链，从构成蛋白的基因区域的全部或一部分碱基的附近起，逐个碱基进行延伸反应，测定此时生成的焦磷酸，与对照进行比较；
AcycloPrime法，在荧光标记核苷酸存在下，以上述扩增产物为模板，用“具有与构成蛋白的基因区域的全部或一部分碱基的单个3’侧碱基和其3’侧的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸引物”进行单碱基延伸反应，测定荧光的偏光度，与对照进行比较；SNuPE法，对上述单碱基延伸反应中使用的碱基种类进行判定，与对照进行比较；等。
作为此时的对照，可列举从已知各构成蛋白的基因无变异的乳酸菌与上述同样地制备的DNA试样，更具体而言，可列举例如从OLS4496株与上述同样地制备的DNA试样。
另外，作为上述检测方法的另一方式，在基因的变异位置已知晓的情况下，也可以采用例如下述方法：
双染料探针(Double Dye Probe)法(所谓的TaqMan(注册商标)探针法)，将杂交有寡核苷酸探针的上述DNA试样作为模板，所述寡核苷酸探针具有与包含构成蛋白的基因区域的变异部位的碱基序列互补的碱基序列、且用报告荧光色素和淬灭荧光色素进行了标记，对包含该构成蛋白的基因区域的变异部位的碱基序列进行扩增，检测上述报告荧光色素所发出的荧光；
HRM(high resolution melting、高分辨熔解曲线分析)法，在包含插入DNA双链间则发出荧光的嵌入剂的反应体系中，以上述DNA试样为模板，扩增包含构成蛋白的基因区域的变异部位的碱基序列并进行检测；
DNA阵列法，使用包含构成蛋白的基因区域的变异部位的DNA和与固定有该DNA杂交的寡核苷酸探针的基板；等。
进而，构成蛋白的氨基酸变异部位已知晓的情况下，可以采用例如：从对象乳酸菌制备蛋白质试样，使用与该氨基酸变异部位特异性结合的分子(例如抗体)来检测该变异部位的方法；肽质量指纹谱法(PMF)、蛋白测序(埃德曼分解法)等。例如，在上述使用抗体的检测方法中，针对上述蛋白质试样使用上述抗体进行抗原抗体反应，检测具有上述氨基酸变异部位的构成蛋白。上述抗体被标记的情况下，可以对目标构成蛋白直接进行检测，在未标记的情况下，可以使识别该抗体且经标记的分子(例如二抗、蛋白A)进行作用而间接地检测。作为这样的方法，可列举免疫组织化学(免疫染色)法、免疫印迹法、ELISA法、流式细胞术、成像细胞仪、放射免疫分析、免疫沉淀法、使用抗体阵列的分析法等。需要说明的是，作为从上述乳酸菌制备蛋白质试样的方法，没有特别限制，可以适当采用公知方法或基于公知方法的方法。
〔ATP合成酶复合体的表达下降〕
“ATP合成酶复合体的表达下降”通常是指：在与对照的比较中，与对照相比表达量少。本发明中，乳酸菌的“ATP合成酶复合体的表达下降”与上述构成蛋白中的至少1种的表达下降的意思相同，作为确认ATP合成酶复合体的表达下降的方法，可列举在转录水平或翻译水平上检测上述构成蛋白中的至少1种的表达量，并且与对照进行比较的方法。
这些中，作为本发明的乳酸菌，上述构成蛋白的表达下降(即，ATP合成酶复合体的功能抑制)优选为A亚基蛋白质和/或ε亚基蛋白质的表达下降，更优选为ε亚基蛋白质的表达下降。作为这样的表达下降，更具体而言，更优选(a)由序列号2或序列号16(优选序列号16)记载的氨基酸序列构成的蛋白质的表达下降。
另外，自然界中，随着碱基序列的变异，该序列所编码的氨基酸序列有时也可能发生变异，作为本发明的乳酸菌，上述构成蛋白的表达下降可以为(b)由在序列号2或序列号16(优选序列号16)记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加了1或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质的表达下降。这种情况下，1或多个氨基酸残基优选氨基酸残基为1个以上且10个以下、更优选为1个以上且5个以下、进一步优选为1个以上且3个以下、特别优选为2个以下。
进而，根据现在的技术水平，本领域技术人员例如获得了序列号2或序列号16记载的氨基酸序列则能够基于编码其的核苷酸序列通过杂交技术(Southern，E.M.，J.Mol.Biol.，98，1975年，p.503-517)、聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki，R.K.等，Science，230，1985年，p.1350-1354、Saiki，R.K等，Science，239，1988年，p.487-491)等获得编码类似氨基酸序列的基因。
因此，作为本发明的乳酸菌，上述构成蛋白的表达下降可以为(c)由与序列号2或序列号16(优选序列号16)记载的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成的蛋白质的表达下降。这种情况下，氨基酸序列的一致性例如可以使用BLASTP的程序(Altschul等，J.Mol.Biol.，215，1990年、p.403-410)来确定。另外，与上述序列号2或序列号16记载的氨基酸序列的一致性为80％以上即可，优选为85％以上、90％以上、95％以上(例如96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)。
作为要检测表达量的上述(b)的蛋白质和(c)的蛋白质，需要为功能未受抑制的蛋白质。作为本发明的乳酸菌中发生了表达下降的构成蛋白，可以为上述(a)～(b)中的至少1种，优选上述(a)。
〈ATP合成酶复合体构成蛋白的转录水平下的表达量〉
在转录水平检测构成蛋白的表达量的方法中，例如首先从对象乳酸菌提取RNA，通过从RNA的逆转录来制备cDNA试样。作为从上述乳酸菌提取RNA的方法和制备cDNA试样的方法，没有特别限制，可以分别适当采用公知方法或基于公知方法的方法。接着，将上述cDNA试样作为模板，通过使用寡核苷酸引物的扩增反应或使用寡核苷酸探针的杂交反应来检测其扩增产物或杂交产物，根据需要对其量进行定量，将其作为转录水平下的表达量。作为这样的方法，可列举例如RT-PCR法、Northern印迹法、点印迹法、DNA阵列、原位杂交、RNase检测、mRNA-seq等。本领域技术人员可以基于可从公共数据库(Genbank等)获得的各构成蛋白的氨基酸、编码其的碱基序列的典型序列(更具体而言，例如表1记载的氨基酸序列、碱基序列)，通过常规方法设计适合于各方法的寡核苷酸引物、寡核苷酸探针。
当检测出的转录水平下的表达量在与对照的比较中降低时，可以判定为该乳酸菌中该构成蛋白的表达量降低、即ATP合成酶复合体的功能受到抑制。作为上述判定基准，没有特别限制，例如，如果为对照的表达量的平均值的4SD以下、3SD以下、或2SD以下的表达量，则可以判定为该乳酸菌中ATP合成酶复合体的表达量降低。
作为此时的对照，可列举从已知各构成蛋白的表达没有下降的乳酸菌与上述同样地制备的cDNA试样，更具体而言，可列举例如从OLS4496株与上述同样地制备的cDNA试样。
〈ATP合成酶复合体构成蛋白的翻译水平下的表达量〉
在翻译水平下检测构成蛋白的表达量的方法中，例如，首先从对象乳酸菌制备蛋白质试样。作为从上述乳酸菌制备蛋白质试样的方法，没有特别限制，可以适当采用公知方法或基于公知方法的方法。接着，使用构成蛋白特异性抗体进行抗原抗体反应而检测构成蛋白，根据需要对其量进行定量，作为翻译水平下的表达量。作为这样的使用抗体的蛋白质检测法，可列举免疫组织化学(免疫染色)法、免疫印迹法、ELISA法、流式细胞术、成像细胞仪、放射免疫分析、免疫沉淀法、使用抗体阵列的分析法等。
在翻译水平上检测构成蛋白的表达量的方法中，构成蛋白的检测也可使用质谱分析法(MS)进行。作为这样的利用质谱分析法的检测方法，可列举例如下述方法：对上述蛋白质试样中包含的蛋白质进行标记，对标记后的蛋白质进行分级，将分级后的蛋白质供于质谱分析，基于质谱分析值鉴定构成蛋白，根据需要进行定量。作为上述标记，可以使用该技术领域公知的同位素标记试剂，可以以市售品形式获得适当的标记试剂。另外，分级也可以通过该技术领域公知的方法来进行，例如可以使用市售的离子交换柱等进行。
另外，本领域技术领域公知的是，基因表达下降的原因之一是启动子的过度甲基化。因此，作为构成蛋白的表达量的翻译水平上的检测，也想到了以构成蛋白的基因启动子的甲基化为指标来检测。启动子的甲基化的检测中，例如可以使用公知方法，如对于具有将甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶的活性的亚硫酸氢盐处理后的碱基序列的变化，通过碱基序列测定直接来检测的方法；利用亚硫酸氢盐处理前碱基序列可识别(可切割)、但亚硫酸氢盐处理后的碱基序列不能识别(不能切割)的限制性核酸内切酶酶间接地进行检测的方法；等。
当检测出的翻译水平下的表达量在与对照的比较中降低时，可以判定为该乳酸菌中该构成蛋白的表达量降低、即ATP合成酶复合体的功能受到抑制。作为上述判定基准，没有特别限制，例如如果为对照的表达量的平均值的4SD以下、3SD以下、或2SD以下的表达量，则可以判定为该乳酸菌中ATP合成酶复合体的表达量降低。
作为此时的对照，可列举从已知各构成蛋白的表达未下降的乳酸菌与上述同样地制备的蛋白质试样，更具体而言，可列举例如从OLS4496株与上述同样地制备的蛋白质试样。
本发明中，作为确认乳酸菌的“ATP合成酶复合体的功能抑制”的方法，可以采用上述中的任意1种判定方法，也可以将2种以上组合。这些中，从精度和简便性的观点出发，优选对于对象乳酸菌检测上述构成蛋白的基因的功能缺失型变异来判定ATP合成酶复合体的功能抑制的方法。
(低温保存下的产酸和活菌数)
根据本发明的乳酸菌，使用该乳酸菌得到的发酵乳能够实现低温保存下产酸量降低而抑制pH降低、且通过上述低温保存也充分维持乳酸菌的活菌数。因此，作为本发明的乳酸菌，优选满足下述条件：
在10％脱脂奶粉培养基中在43℃下培养至培养液的pH达到4.7以下之后，在10℃下保存10天时、
(A1)上述保存后的培养液中的活菌数为1×108cfu/g以上；并且
(A2)上述保存后的培养液的pH为4.2以上。
另外，作为本发明的乳酸菌，更优选还满足下述条件：
(A3)通过上述培养，培养液的pH达到4.7以下为止的时间为上述培养开始起7小时以下、和/或
(A4)上述培养开始起20小时后的培养液的pH为4.1以上。
〔脱脂奶粉培养基〕
条件(A1)～(A4)中，“10％脱脂奶粉培养基”是指含有10质量％脱脂奶粉的培养基。本发明的脱脂奶粉是指将来自动物乳汁(优选牛乳)的除去了脂肪成分的脱脂乳干燥为粉末状而成的物质，可列举例如日本的“关于乳及乳制品的成分标准等的省令(以下有时称为“乳等省令”)”中规定为乳固体成分95.0％以上、水分5.0％以下的物质。作为这样的脱脂奶粉的组成，可列举例如包含“日本食品标准成分表2015年版(第七次修订)”中记载的组成的组成，即，在100g中，能量300～400(优选为359)kcal、水分3～5(优选为3.8)g、蛋白质30～40(优选为34.0)g、脂质0.2～2(优选为1.0)g、碳水化合物(包括乳糖)45～60(优选为53.3)g、钙900～2000(优选为1100)mg、维生素A 3～10(优选为6)μg、维生素B2 0.5～2(优选为1.60)mg、胆固醇10～30(优选为25)mg、食盐相当量0.5～2(优选为1.4)g的组成。作为这样的10％脱脂奶粉培养基的pH，通常为6～7。
作为条件(A1)～(A4)的10％脱脂奶粉培养基，可以含有除上述脱脂奶粉以外的其它成分，这种情况下，该其它成分的含量优选为0.1质量％以下，更优选为0.01质量％以下，特别优选由10质量％的脱脂奶粉和90质量％的水(优选适合饮用的水)构成。作为上述其它成分，可列举例如酵母提取物、肽，特别地，作为上述条件的10％脱脂奶粉培养基，优选实质上不含上述酵母提取物。需要说明的是，本发明中，“实质上不含”例如是指相对于总质量为0.001质量％以下。本发明的乳酸菌在上述不含酵母提取物的培养基中也能够满足上述条件。
作为条件(A1)～(A4)的10％脱脂奶粉培养基，优选实施过灭菌处理或杀菌处理者。作为这些的条件，没有特别限定，例如，作为上述灭菌处理的条件，可列举70～130℃下1分钟～1小时的条件，作为上述杀菌处理的条件，可列举75～125℃下10分钟～30分钟的条件。另外，作为上述10％脱脂奶粉培养基，可以为与下述的第一10％脱脂奶粉培养基和第二10％脱脂奶粉培养基组成相同者、和/或实施过相同的灭菌处理或杀菌处理者，也可以为组成彼此不同和/或实施过彼此不同的处理者。另外，进行下述的活化培养时，第二10％脱脂奶粉培养基中可以包含第一培养后的培养液的一部分或全部。
〔活化培养(第一培养)〕
关于条件(A1)～(A4)，在乳酸菌于低温、冷冻下保存时等，优选首先对该乳酸菌进行活化培养。作为该活化培养(以下有时称为“第一培养”)，优选在10％脱脂奶粉培养基(以下有时将第一培养用的培养基称为“第一10％脱脂奶粉培养基”)中在37℃、厌氧下进行16～18小时(优选为16小时)的培养。此时，作为供于第一培养的乳酸菌量，优选为相对于第一10％脱脂奶粉培养基以活菌数计达到1×102～2×108cfu/g的量，更优选为达到1×104～1×106cfu/g的量。
需要说明的是，本发明中活菌数的测定例如可以如下来进行：将适当稀释的含乳酸菌液体(例如第一培养时，第一培养的培养液(乳酸菌及第一10％脱脂奶粉培养基))的稀释液涂抹在合适的琼脂培养基、例如乳等省令规定的法定培养基即BCP平板计数琼脂培养基上并培养，对出现的菌落数进行计数从而测定。此时的活菌数的值(cfu/g)为上述含乳酸菌液体(g)中的活菌数，因此例如由此来计算上述第一培养的培养液中的活菌数。
作为上述厌氧培养方法，没有特别限定，可列举以往作为乳酸菌厌氧培养方法而已知的方法，例如，氧浓度调节剂(例如Anaeropack-anaero(三菱瓦斯化学公司制))存在下的静置培养。本发明中，可以将上述培养后的培养液再次接种于第一脱脂奶粉培养基而重复进行多次(例如2次以下)第一培养。
〔培养(第二培养)〕
关于条件(A1)～(A4)，使用乳酸菌或第一培养后的培养液(即，含有活化乳酸菌的培养液)进行培养(以下有时称为“第二培养”)。第二培养中，在10％脱脂奶粉培养基(以下有时将第二培养用的培养基称为“第二10％脱脂奶粉培养基”)中在43℃下进行培养。此时，作为供于第二培养的乳酸菌量，优选为相对于第二10％脱脂奶粉培养基以活菌数计达到2×106～5×107cfu/g的量，更优选为达到4×106～4×107cfu/g的量，更优选为达到1×107～2×107cfu/g的量。作为第二培养中的培养方法，没有特别限定，可以适当采用以往作为基于乳酸菌的发酵乳的发酵方法已知的方法，例如静置培养等。
第二培养中，进行由第二10％脱脂奶粉培养基所含的乳糖通过乳酸菌的代谢而产生乳酸的发酵，上述乳酸使培养液的pH降低。上述条件的第二培养中，该发酵的完成以培养液的pH(即，包含乳酸菌的第二10％脱脂奶粉培养基的pH)达到4.7以下为基准(更优选为4.6以下)。
条件(A3)中上述发酵完成(即，pH达到4.7)所需的时间需要为第二培养开始起7小时以下，特别优选为6小时以下，进一步优选为5小时以下。上述发酵完成所需的时间超过上述上限的乳酸菌的情况下，用于制造发酵乳时，制造所需时间长因此在制造效率上不优选，另外，低温保存会使发酵乳中的活菌数变少。作为上述发酵的完成所需的时间的下限，没有特别限制，例如，优选为1小时以上，更优选为2小时以上。
第二培养持续20小时以上时，通常会持续产生上述乳酸，因此随着该乳酸的产生量的增加而培养液的pH进一步降低。与此相对地，条件(A4)中，第二培养开始起20小时后的培养液的pH需要为4.1以上，24小时后的培养液的pH特别优选为4.1以上。另外，作为能够使pH维持在4.1以上的第二培养开始起的时间的上限，没有特别限制，例如优选为30小时以下。本发明人们发现，利用这样的在43℃下长时间培养后pH能维持在4.1以上的乳酸菌，还能够抑制得到的发酵乳在低温(例如10℃)保存时pH降低。需要说明的是，若利用发酵能力低的乳酸菌，在43℃下长时间培养后有时pH能维持在4.1以上，但是此情况不满足条件(A1)和/或条件(A3)。
〔保存〕
条件(A1)及条件(A2)的情况下，将上述发酵完成后(即，pH达到4.7后)的培养液迅速冷却并保存。作为上述保存的条件，没有特别限定，可列举作为以往的发酵乳保存方法而已知的方法、例如将上述培养液封入容器(优选密封)而静置的方法。
作为条件(A1)及条件(A2)的保存温度，需要为低温，更具体而言，需要为10℃。另外，作为这些条件下的保存时间，分别独立地，需要为10天以上，特别优选为16天以上，更优选为20天以上，进一步优选为35天以上。本发明的乳酸菌即使如此地在低温条件下长期保存，也充分减少产酸量且充分维持了活菌数。
乳酸菌通常在低温下也能产生上述乳酸，因此如上述那样将完成发酵后的培养液长时间保存时，在低温条件下，该培养液的pH也会随着该乳酸的产生量增加而进一步降低。与此相对地，条件(A2)的情况下，在10℃下保存10天后的培养液的pH(即，包含乳酸菌的第二10％脱脂奶粉培养基的pH)需要为4.2以上(优选为4.3以上、更优选为4.4以上)，特别优选在10℃下保存16天后的培养液的pH为4.2以上(优选为4.3以上、更优选为4.4以上)，进一步优选在10℃下保存35天后的培养液的pH为4.2以上(优选为4.3以上、更优选为4.4以上)。
以往的乳酸菌中，被称为低温敏感性的乳酸菌存在即使是在低温下长时间保存培养液的pH也不降低的情况。但是本发明人新发现，例如专利文献2记载的以往已知有低温敏感性的乳酸菌存在如下课题：至完成发酵为止所需的时间长，另外低温保存会导致活菌数减少。本发明人们推测，这是由于专利文献3记载的细菌之类以往已知有低温敏感性的乳酸菌在pH降低时，不将H+排出菌体外，菌体内的pH降低，引发了生育抑制之类的细胞凋亡。与此相对地，本发明人们发现，存在即使抑制低温保存下的pH降低、也能够充分维持低温保存下的活菌数的乳酸菌、即满足条件(A1)的乳酸菌。条件(A1)的情况下，在10℃下保存10天后的培养液中的活菌数需要为1×108cfu/g以上，特别优选在10℃下保存16天后的培养液中的活菌数为1×108cfu/g以上，更优选在10℃下保存20天后的培养液中的活菌数为1×108cfu/g以上，进一步优选在10℃下保存35天后的培养液中的活菌数为1×108cfu/g以上。需要说明的是，以往已知有低温敏感性的乳酸菌不满足条件(A1)和/或条件(A3)。
作为本发明的乳酸菌，可以为单独一种，也可以为两种以上的组合。作为本发明的乳酸菌，更具体而言，可列举例如以保藏号NITE BP-03504号规定的嗜热链球菌OLS4801(以下有时称为“OLS4801株”)、以保藏号NITE BP-03505号规定的嗜热链球菌OLS4802(以下有时称为“OLS4802株”)、以保藏号NITE BP-03506号规定的嗜热链球菌OLS4803(以下有时称为“OLS4803株”)、以保藏号NITE BP-03508号规定的嗜热链球菌OLS4824(以下有时称为“OLS4824株”)。这些例示出的乳酸菌均为嗜热链球菌，保有PrtS基因。
OLS4801株和OLS4802株中，作为ATP合成酶复合体的功能抑制，具有ε亚基基因中的功能缺失型变异，与序列号16记载的氨基酸序列的第30位的甘氨酸(Gly)相当的甘氨酸被置换为丙氨酸(Ala)(G30A)。另外，OLS4803株中，作为ATP合成酶复合体的功能抑制，具有ε亚基基因中的功能缺失型变异，与序列号15记载的碱基序列的第258位的A对应的碱基发生缺失，由于移码而使与序列号16记载的氨基酸序列的第86位的谷氨酸(Glu)相当的谷氨酸及以后被置换(Q86FS)。进而，OLS4824株中，作为ATP合成酶复合体的功能抑制，具有A亚基基因中的功能缺失型变异，与序列号2记载的氨基酸序列的第1位的缬氨酸(Val)对应的缬氨酸被置换为丙氨酸(Ala)(V1A)。
OLS4801株以(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4801、(2)保藏号：NITE BP-03504号、(3)保藏日：2021年8月4日、OLS4802株以(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4802、(2)保藏号：NITE BP-03505号、(3)保藏日：2021年8月4日、OLS4803株以(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4803、(2)保藏号：NITE BP-03506号、(3)保藏日：2021年8月4日、OLS4824株以(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4824、(2)保藏号：NITE BP-03508号、(3)保藏日：2021年8月4日分别保藏于(4)保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD))(邮编292-0818日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)。需要说明的是，作为以这些保藏号规定的嗜热链球菌，也可以为所述株的传代株、或不抑制本发明的效果的范围内的所述株或其传代株的人工突变株、自发突变株、基因重组株、或派生株等。
另外，作为本发明的乳酸菌，可以为适当地向公知或自然界中存在的乳酸菌(优选为嗜热链球菌、更优选为保有PrtS基因的嗜热链球菌)中人为地导入了上述ATP合成酶复合体的功能抑制而成的乳酸菌。作为向乳酸菌中人为地导入ATP合成酶复合体的功能抑制的方法，可以根据上述功能抑制的方式而适当采用现有公知的方法，可列举例如下述方法：利用位点特异性突变导入法、同源重组法、基因打靶法(敲除或敲入)向各构成蛋白的基因导入功能缺失型变异；利用X射线、α射线、β射线、γ射线、离子束等放射线处理来诱发各构成蛋白的基因的变异(功能缺失型变异的诱发)；利用紫外线放射来诱发各构成蛋白的基因的变异(功能缺失型变异的诱发)；利用甲磺酸乙酯(EMS)等化学药品来诱发各构成蛋白的基因的变异(功能缺失型变异的诱发)；利用各构成蛋白的基因启动子的甲基化来降低表达量降低等。
另外，作为本发明的乳酸菌，可以还具有上述构成蛋白的基因的功能缺失型变异以外的变异。
＜乳酸菌的筛选方法＞
ATP合成酶复合体的功能受到抑制的乳酸菌由于低温保存下的产酸量少且通过上述低温保存活菌数也不会减少，因此能够以ATP合成酶复合体的功能抑制为指标，来筛选适合用于制造低温保存下的pH降低得到抑制且通过上述低温保存也充分维持了乳酸菌的活菌数的发酵乳的乳酸菌。因此，本发明还提供乳酸菌的筛选方法，其包括下述选择工序：以ATP合成酶复合体的功能抑制为指标，来选择低产酸的乳酸菌。本发明中，“低产酸的乳酸菌”是指：使用其得到的发酵乳中能够抑制低温保存下的pH降低且维持活菌数的乳酸菌。更具体而言，可列举满足上述(A1)和(A2)的条件的乳酸菌，优选满足上述(A3)和/或(A4)的条件。
上述选择工序中，对于上述本发明的乳酸菌，通过ATP合成酶复合体的功能抑制(即，ATP合成酶复合体的直接的活性降低、ATP合成酶复合体构成蛋白的基因的变异、ATP合成酶复合体的表达下降)中列举的判定方法中的至少1种来判断ATP合成酶复合体的功能是否受到抑制，将确认到ATP合成酶复合体的功能抑制的乳酸菌选择为上述低产酸的乳酸菌。作为上述判定方法，包括其优选方式在内，均如上所述。
另外，本发明的筛选方法可以还包括下述工序：对于上述本发明的乳酸菌，通过第二培养和根据需要的第一培养以及保存中所述的各条件来实施培养和保存，将满足上述条件(A1)和(A2)的乳酸菌以及根据需要满足条件(A3)和/或(A4)的乳酸菌判定为上述低产酸的乳酸菌并选择出。作为上述条件，包括其优选方式在内，均如上述本发明的乳酸菌中所述。
＜乳酸菌组合物＞
“乳酸菌组合物”是指含有乳酸菌的组合物，没有特别限定，作为本发明的乳酸菌组合物，只要至少含有上述本发明的乳酸菌(包括通过上述本发明的乳酸菌的筛选方法选择出的乳酸菌)即可，可以仅包含本发明的乳酸菌(包括2种以上的本发明的乳酸菌的组合)。本发明的乳酸菌组合物例如包含下述的乳酸菌酵种及发酵乳。作为本发明的乳酸菌组合物，可以还含有本发明的乳酸菌以外的其它成分，作为上述其它成分，没有特别限制，包括例如：水等溶剂；作为上述乳酸菌培养结束后的培养液上清、培养基成分等的培养物；上述培养物的浓缩物、稀释物、干燥物、冷冻物等，可以为这些中的单独1种，也可以为2种以上的组合。
(乳酸菌酵种)
本发明的乳酸菌酵种至少含有上述本发明的乳酸菌，可以优选用于下述的本发明的发酵乳的制造方法。作为这样的本发明的乳酸菌酵种，可以仅包含上述本发明的乳酸菌，也可以还含有上述其它成分、其它乳酸菌、酵母。
作为上述其它乳酸菌及酵母，可列举以往公知可包含于发酵乳的乳酸菌、酵母。例如，作为上述其它乳酸菌，可列举本发明的乳酸菌以外的乳酸菌，可以为这些中的单独1种，也可以为2种以上的组合。这些中，上述本发明的乳酸菌为链球菌属乳酸菌时，作为本发明的乳酸菌酵种，优选还含有本发明的乳酸菌以外的乳杆菌属乳酸菌，更优选含有属于德氏乳杆菌保加利亚亚种的乳酸菌。另外，作为本发明的乳酸菌酵种，还优选含有作为本发明的乳酸菌的链球菌属乳酸菌和作为本发明的乳酸菌的乳杆菌属乳酸菌。
作为本发明的乳酸菌酵种，可以为液体，也可以为冷冻状态、干燥粉末等固体，进而还可以含有其它成分。作为乳酸菌酵种可含有的进一步的其它成分，可列举例如发酵促进物质(甲酸、核酸等)；保护剂(糖类糖)；培养基成分(乳或乳清等)，可为这些中的1种，也可以为2种以上的组合。
作为本发明的乳酸菌酵种中的本发明的乳酸菌的含量，没有特别限制，优选为0.01～100质量％，更优选为0.1～90质量％。另外，以活菌数量计优选为1×107cfu/g以上，更优选为1×107～1×1011cfu/g。另外，作为进一步含有其它乳酸菌时该乳酸菌酵种中的本发明的乳酸菌(优选为链球菌属乳酸菌)的含量与上述其它乳酸菌(优选为本发明的乳酸菌以外的乳杆菌属乳酸菌)的含量之比、以及含有作为本发明的乳酸菌的链球菌属乳酸菌和作为本发明的乳酸菌的乳杆菌属乳酸菌时该乳酸菌酵种中的链球菌属乳酸菌的含量与乳杆菌属乳酸菌的含量之比，各自独立地以菌数(活菌数换算、以下同)比计优选为1：0.1～1：100，更优选为1：1～1：10。
本发明的乳酸菌酵种例如可以与含有上述其它乳酸菌的组合物(第二乳酸菌组合物)组合而制成包含本发明的乳酸菌酵种和第二乳酸菌组合物的乳酸菌酵种试剂盒。另外，例如可以与用于制造发酵乳的添加物(上述发酵促进物质、保护剂等)、容器、乳酸菌酵种的使用说明书等组合而制成乳酸菌酵种试剂盒。
(发酵乳)
本发明的发酵乳至少含有上述本发明的乳酸菌，例如，可以通过下述的本发明的发酵乳的制造方法而得到。本发明的发酵乳抑制了低温保存下的pH降低且通过上述低温保存也充分维持了所含有的活菌数。
作为本发明的发酵乳，没有特别限定，可列举例如满足上述乳等省令所规定的“发酵乳”标准的发酵乳(更具体而言，非脂乳固体成分的含量为8.0％以上、乳酸菌数或酵母数(优选为乳酸菌数(更优选为本发明的乳酸菌的数)、以下同)为1000万/mL以上者)。另外，本发明的发酵乳还包括满足上述乳等省令所规定的“乳制品乳酸菌饮料”标准者(更具体而言，非脂乳固体成分的含量为3.0％以上、乳酸菌数或酵母数为1000万/mL以上者)；满足“乳酸菌饮料”标准者(更具体而言，非脂乳固体成分的含量小于3.0％、乳酸菌数或酵母数为100万/mL以上者)。需要说明的是，上述非脂乳固体成分是指从总乳固体成分减去脂肪成分而剩余的成分(主要为蛋白质、乳糖、及矿物质等)，上述乳酸菌及酵母数为通过上述乳等省令规定的检查法、上述使用BCP平板计数琼脂培养基的方法而测定的活菌数，发酵乳进行过杀菌时，为该杀菌前通过上述检查法测定的活菌数换算值。
作为本发明的发酵乳，可以为下述发酵乳的制造方法的发酵工序后的发酵物，或对上述发酵物进行杀菌处理(粉碎处理、加热处理等)而得的物质，或对这些进行浓缩、稀释、干燥或冷冻等而得的物质。需要说明的是，本发明中，上述发酵乳进行过杀菌处理时，该发酵乳中的乳酸菌数为活菌数换算值。本发明的发酵乳所含有的乳酸菌中，除了活菌外还包括死菌，还包括乳酸菌的破碎物及加热处理物、这些的浓缩物、稀释物、干燥物、冷冻物，本发明的发酵乳优选至少含有乳酸菌的活菌，更优选以活菌形式含有本发明的乳酸菌。
本发明的发酵乳包含来自本发明的乳酸菌及下述的原料乳(优选为调制乳液体)的成分。另外，可以在不抑制本发明的效果的范围内，进一步含有上述乳酸菌酵种中列举的其它成分以及其它乳酸菌、酵母。进而，可以含有饮食品中可含有的各种成分。作为发酵乳中可含有的进一步成分，没有特别限制，可列举例如糖类、糖醇类、矿物质类、维生素类、蛋白质、肽、氨基酸类、有机酸、pH调节剂、淀粉及改性淀粉、膳食纤维、果实/蔬菜及其加工品、动物及植物生药提取物、天然来源高分子(胶原蛋白、透明质酸、软骨素等)、油脂、增稠剂、乳化剂、溶剂、表面活性剂、凝胶化剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮化剂、粘稠剂、赋形剂、崩解剂、结合剂、流动化剂、保存剂、着色剂、香料、矫味剂、甜味剂等，可以为这些中的1种，也可以为2种以上的组合。
作为这样的发酵乳，优选酸奶、乳酪、发酵奶油、发酵黄油等，特别优选酸奶。作为上述酸奶，具体而言，可列举凝结酸奶等凝固型酸奶(固体状发酵乳)、软质酸奶(糊状发酵乳)及饮用型酸奶(液状发酵乳)。可以是使用这些作为材料的冷冻酸奶。另外，本发明的发酵乳也可以作为乳酪、发酵奶油、发酵黄油、开菲尔酸奶等发酵食品的材料来使用。进而，本发明的发酵乳如果未进行杀菌处理，则在发酵乳的制造方法中，也可以作为乳酸菌酵种来使用。
＜发酵乳的制造方法＞
本发明的发酵乳的制造方法包括下述发酵工序：将上述本发明的乳酸菌(包括通过上述本发明的乳酸菌的筛选方法选择出的乳酸菌)或本发明的乳酸菌组合物添加到含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。需要说明的是，使用通过上述本发明的乳酸菌的筛选方法选择出的乳酸菌时，作为本发明的发酵乳的制造方法，可以包括上述选择工序，但是作为该选择工序，可以仅为最初的1次。根据本发明的制造方法，通过使用本发明的乳酸菌将原料乳发酵，从而能够制造低温保存下的pH降低得到抑制且通过上述低温保存也充分维持了所含有的活菌数的发酵乳。进而，通过本发明的制造方法还能够充分缩短完成发酵所需的时间。
(调制乳液体)
本发明的调制乳液体含有原料乳。作为上述原料乳，优选为含有乳糖的乳，可列举例如生乳(例如牛、水牛、绵羊、山羊等的乳)、杀菌乳、全脂乳、脱脂乳、乳清及这些的加工品(例如全脂奶粉、全脂浓缩乳、脱脂奶粉、脱脂浓缩乳、炼乳、乳清粉、酪乳、黄油、奶油、乳酪、乳清蛋白浓缩物(WPC)、分离乳清蛋白(WPI)、α-乳清蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg))，可以为这些中的1种，也可以为2种以上的混合物。
作为本发明的调制乳液体，可以仅包含上述原料乳，也可以为上述原料乳的水溶液、稀释液或浓缩液，除了上述原料乳以外可以根据需要还含有其它成分。作为这样的其它成分，可列举：水；豆乳、以砂糖为代表的糖类、甜味剂、香料、果汁、果肉、维生素、矿物质、油脂、神经酰胺、胶原蛋白、乳磷脂、多酚等食品、食品成分或食品添加剂；果胶、大豆多糖类、CMC(羧甲基纤维素)、琼脂、明胶、角叉菜胶、胶类等稳定剂、增稠剂、凝胶化剂等，可以为这些中的1种，也可以为2种以上的混合物。上述调制乳液体可以通过根据需要一边加温和/或根据需要而均质化、一边对上述成分进行混合而制备。另外，作为上述调制乳液体，也可以使用经加热灭菌或杀菌的调制乳液体。
(发酵)
作为向上述调制乳液体中添加本发明的乳酸菌或本发明的乳酸菌组合物而使其发酵的发酵工序，可以适当采用现有公知的方法，没有特别限制。另外，本发明的乳酸菌或本发明的乳酸菌组合物的添加量可以按照现有公知的发酵乳的制造方法中采用的乳酸菌酵种的添加量来适当设定，例如，相对于上述调制乳液体的质量，本发明的乳酸菌以活菌数计优选为1×107～5×109cfu/g，更优选为1×108～2×109cfu/g。
上述调制乳液体中，除了本发明的乳酸菌或本发明的乳酸菌组合物以外，还可以添加上述其它乳酸菌及酵母。这些中，上述本发明的乳酸菌为链球菌属乳酸菌时，作为本发明的发酵乳的制造方法，优选还添加作为上述其它乳酸菌的乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌，更优选还添加属于德氏乳杆菌保加利亚亚种的乳酸菌。另外，作为还添加其它乳酸菌时本发明的乳酸菌(优选为链球菌属乳酸菌)的添加量与上述其它乳酸菌(优选为乳杆菌属乳酸菌)的添加量之比、以及使用作为本发明的乳酸菌的链球菌属乳酸菌和作为本发明的乳酸菌的乳杆菌属乳酸菌时链球菌属乳酸菌的添加量与乳杆菌属乳酸菌的添加量之比，各自独立地以菌数(活菌数换算、以下同)比计优选为1：0.1～1：100、更优选为1：1～1：10。
作为上述发酵的条件，可根据所添加的本发明的乳酸菌的生育条件、上述调制乳液体的量等适当选择，没有特别限制，例如，优选在温度35～45℃、更优选温度38～43℃下在需氧或厌氧条件下静置或搅拌(优选为静置)通常2～24小时、更优选3～8小时、进一步优选4～6小时，直至添加有本发明的乳酸菌或本发明的乳酸菌组合物的调制乳液体的pH达到4.7以下、更优选4.6以下、进一步优选4.0～4.5。根据本发明，能够充分缩短发酵所需时间。另外，作为上述厌氧条件，可采用例如氮气通气条件下的发酵。
通过上述发酵，可以得到本发明的发酵乳。上述发酵工序后的发酵物可以直接作为本发明的发酵乳，或根据需要进行浓缩、稀释、干燥或冷冻等而制成本发明的发酵乳。另外，通过对上述发酵物中的乳酸菌进行破碎或加热处理等或根据需要对其进行浓缩、稀释、干燥或冷冻等，可以制成本发明的发酵乳。因此，作为本发明的发酵乳的制造方法，可以还包括这些工序(浓缩工序、稀释工序、干燥工序、冷冻工序、破碎工序、加热处理工序等)。
【实施例】
以下基于实施例及比较例更具体地说明本发明，但是本发明不受以下实施例限定。需要说明的是，下述的各试验例中，“w/v％”的记载在没有特别声明时表示重量/体积(w/v：g/mL)百分比。
(试验例1)
(1)使用下述4株乳酸菌：
P2101201株(比较例1)：保有prtS基因的嗜热链球菌。株式会社明治的明治技术革新中心(邮政编码192-0919日本东京都八王子市七国1-29-1)所保管的菌株；
OLS4801株(实施例1)：保藏号NITE BP-03504号规定的嗜热链球菌。保有prtS基因；及
OLS4802株(实施例2)：保藏号NITE BP-03505号规定的嗜热链球菌。
保有prtS基因；及
OLS4803株(实施例3)：保藏号NITE BP-03506号规定的嗜热链球菌。保有prtS基因。
本说明书所记载的试验例中，通过下述方法对各乳酸菌株是否保有prtS基因进行了确认。即，首先由NCBI数据库获得基因组序列已知的5株嗜热链球菌的prtS基因序列，由高保守性的序列制作引物(F引物：序列号17、R引物：序列号18)。另外，使用InstaGeneMatrix(BioRad公司制)，从各菌株的M17培养液提取基因组DNA。将提取出的基因组DNA(模板)0.5μL、制作的引物(5μM)各1μL、Phusion高保真DNA聚合酶0.1μL、5×HF缓冲液2μL、2.5mM dNTP 0.8μL、及超纯水4.6μL混合(总计10μL)，按照下述条件进行PCR：将98℃下30秒；98℃下5秒、63℃下20秒、72℃下20秒进行30个循环；72℃下5分钟；4℃下静置。对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将在684bp的位置确认到条带的菌株判定为保有prtS基因，将未确认到所述条带的菌株判定为不保有prtS基因。
(2)将上述4株乳酸菌分别在于121℃下灭菌7分钟的10％脱脂奶粉培养基(脱脂奶粉10质量份及蒸馏水90质量份(10质量％脱脂奶粉)、pH：6～7、以下同)中在37℃、厌氧条件下(使用氧浓度调节剂(Anaeropack-anaero、三菱瓦斯化学公司制)、以下同)静置培养16小时，由此进行活化。需要说明的是，活化后的培养液的菌数为5×108～1×109cfu/g。接着，对于在75℃下杀菌15分钟的10％脱脂奶粉培养基，以活化后的培养液的质量为2质量％(乳酸菌活菌数：1×107～2×107cfu/g，以下同)的方式进行接种，在43℃下静置培养(发酵)，测定上述接种起至培养液的pH降低至4.7为止所需的时间(发酵时间)。进而，在pH达到4.7的时刻结束培养，立即冷却到10℃并以不带入空气的方式密封，静置保存10天、17天、20天、或35天，测定各保存后的pH(10℃pH)。将结果示于下述表2。
【表2】
如表2所示，P2101201株、OLS4801株、OLS4802株、和OLS4803株中任一乳酸菌均在5小时以内完成了发酵(pH达到4.7)。另一方面，关于10℃保存所带来的pH的经时变化，P2101201株在保存17天时pH降低至4.11，确认为高产酸乳酸菌。与此相对地，OLS4801株、OLS4802株、和OLS4803株在保存35天后pH也未低于4.4，确认为低产酸乳酸菌。
(试验例2)
(1)将与试验例1中使用的4株乳酸菌相同的乳酸菌株分别在M17培养液(0.5w/v％乳糖)中在37℃、厌氧条件下静置培养16小时，通过离心分离收集菌体后，用生理盐水清洗，再次通过离心分离收集菌体。将其用1液(6.7％蔗糖、50mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0))100μL悬浮，向悬浮液中分别添加10mg/mL裂解酶20μL、10U/μL变溶菌素5μL，在37℃下进行10分钟溶菌。对于溶菌后的液体进行离心分离并除去上清，使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(Promega公司制)提取基因组DNA。用Qubit(Thermo Fisher Scientific公司制)测定DNA浓度，用超纯水稀释成0.1ng/μL，作为基因组DNA样品。
(2)从上述(1)中得到的基因组DNA样品中，使用Nextera XT DNA Library Prepkit(Illumina公司制)制备文库，用AMPure XP(Beckman Coulter Life Sciences公司制)纯化。接着，用High Sensitivity DNA kit(Agilent Technologies公司制)测定平均文库尺寸，用Quan-iT dsDNA High Sensitivity Assay kit(Thermo Fisher Scientific公司制)测定浓度。以DNA浓度为1.1nM的方式用超纯水稀释，将全部样品以等量混合。接着，向混合液45μL中加入1N氢氧化钠溶液5μL进行变性处理。将变性处理后的DNA 10μL和HT1缓冲液(Illumina公司制)990μL混合后，向其中等量混合0.2pM PhiX(Illumina公司制)，使用Miseq Reagent Kit v3(Illumina公司制、600cycles)，利用下一代测序仪Miseqsequencer(Illumina公司制)进行测序分析。
(3)将上述(2)中得到的序列数据转移到CLC Genomics Workbench(QIAGEN公司制)而制作contig后，添加注释。将试验例1中为高产酸乳酸菌的P2101201株的contig作为参照序列，对低产酸乳酸菌的OLS4801株、OLS4802株、和OLS4803株的contig进行定位而检测基因变异位置，仅提取伴有氨基酸变异的变异位置。在下述的表3中，示出上述3株低产酸乳酸菌中提取到的基因变异位置的基因名、其碱基数和该碱基序列所编码的氨基酸数、碱基的变异位置和其种类、以及氨基酸变异位置，将提取到这些变异的株用黑点表示。
【表3】
如表3所示，上述(3)的结果是，3株低产酸乳酸菌均确认到4个具有变异的基因(ATP合成酶ε链基因(ATP合成酶复合体ε亚基基因(atpC))、16SrRNA甲基转移酶基因、转录调控因子LacI家族基因、胰岛素酶家族蛋白基因)。
(试验例3)
由试验例2，首先调查了ATP合成酶ε链是否有助于低产酸。具体而言，对于将作为高产酸乳酸菌的P2101201株的ATP合成酶ε链基因的序列导入作为低产酸乳酸菌的OLS4803株而成的重组株，验证低产酸性是否丧失。
(1)通过基于同源重组的双交换而制作OLS4803株的重组株。即，首先由从P2101201株提取的基因组DNA，使用下述的表4所示的引物的组合通过PCR法扩增包含ATP合成酶ε链基因的全长的片段。接着，将得到的片段插入温度敏感性载体pTERM09，制备重组用质粒DNA。需要说明的是，pTERM09具有在低温(30℃)下能够复制、在高温(37℃)下不能复制的性质，而且保有红霉素抗性基因。将制备的质粒DNA通过电穿孔法导入OLS4803株，在30℃下获得转化体。将得到的转化体在37℃和添加红霉素(25μg/mL)所带来的选择压力下进行培养，获得通过同源重组而将上述质粒DNA摄入OLS4803株的基因组DNA的株。接着，在30℃下且不施加红霉素添加所带来的选择压力的条件下进行培养，进行第2次同源重组，由此使上述质粒DNA来源的P2101201株的序列与OLS4803株的基因组DNA上的序列交换，获得重组株(ATP合成酶ε链基因的序列被重组到P2101201株的序列的OLS4803株、比较例2)。将得到的重组株在-80℃下冷冻保存，直至使用。
【表4】
(2)将包含0.1w/v％Meast P2G(Asihi Food&Healthcare.Ltd公司制)的10％还原脱脂乳在121℃下杀菌7分钟而制备活化培养基。将上述(1)中得到的重组株的冷冻菌液以1质量％接种到上述活化培养基中，在37℃、厌氧条件下以16小时的条件活化培养2次。接着，对于经到达温度95℃灭菌的10％脱脂奶粉培养基，以活化后的培养液的质量为2质量％的方式进行接种，在43℃下静置培养(发酵)，测定从上述接种起至培养液的pH降低到4.6为止的时间(发酵时间)。进而，在培养液的pH达到4.6的时间点结束培养，立即冷却到10℃并以不带入空气的方式密封，静置保存1天、7天、14天、或21天，测定各保存后的pH(10℃pH)。另外，将对各保存后的培养液进行稀释而得的悬浮液涂抹在BCP平板计数琼脂培养基(荣研化学公司制)上并培养，对出现的菌落数进行计数，从而测定各培养液中的活菌数(cfu/g)。
将重组株的发酵时间(分钟)示于图1，将10℃保存后的各保存天数下的pH(10℃pH)示于图2，将10℃保存后的各保存天数下的活菌数(cfu/g)示于图3。图1～图3分别一并示出了对于未进行重组的P2101201株和OLS4803株同样进行发酵时间测定、10℃保存后的pH测定和10℃保存后的活菌数测定而得的结果。需要说明的是，获得10株重组株并分别进行了测定，但是这10株间的结果没有差异，因此图1～图3仅示出这10株中的1株(No.1)的结果。
如图1所示，重组株、P2101201株、和OLS4803株均在5小时以内完成了发酵(pH达到4.6)。另一方面，如图2所示，关于10℃保存所带来的pH的经时变化，重组株与P2101201株同样，保存7天时pH低于4.2，失去了在未重组的OLS4803株中确认到的低产酸性。因此，确认OLS4803株的ATP合成酶ε链基因和其所编码的氨基酸序列的变异有助于低产酸。
进而，如图3所示，可确认：关于10℃保存所带来的活菌数的经时变化，重组株、P2101201株、和OLS4803株之间几乎没有差异，不论有无上述变异均通过低温保存维持了活菌数。因此可以说，不是基于凋亡而发挥上述低产酸性的。
(试验例4)
由试验例2，接着调查了其它3个基因(16S rRNA甲基转移酶基因、转录调控因子LacI家族基因、胰岛素酶家族蛋白基因)是否有助于低产酸。具体而言，验证将作为高产酸乳酸菌的OLS4803株的各基因的序列导入作为低产酸乳酸菌的P2101201株而得的重组株是否可发挥低产酸性。
首先，通过基于同源重组的双交换而制作P2101201株的重组株。即，由从OLS4803株提取的基因组DNA，通过下述的表5所示的各引物的组合通过PCR法扩增包含各基因的全长的片段。将分别使用所得到的片段而制备的质粒DNA导入P2101201株中，除此以外与试验例3的(1)同样地进行，分别获得7株(No.1～7)各重组株(分别导入有OLS4803株的各基因的序列的P2101201株)。
【表5】
接着，对于得到的各重组株，与试验例3的(2)同样地进行培养(发酵)，测定从上述接种起至培养液的pH降低到4.6为止的时间(发酵时间)。进而，在培养液的pH达到4.6的时间点结束培养，立即冷却到10℃并以不带入空气的方式密封，静置保存6天、7天、8天、14天、15天、33天、或34天，测定各保存后的pH(10℃pH)。将16S rRNA甲基转移酶基因的重组株的结果示于表6，将转录调控因子LacI家族基因的重组株的结果示于表7，将胰岛素酶家族蛋白基因的重组株的结果示于表8。另外，表6～表8中分别一并示出了对于未进行重组的P2101201株和OLS4803株同样进行发酵时间测定、和10℃保存后的pH测定而得的结果。
【表6】
16S rRNA甲基转移酶
【表7】
转录调控因子Lacl家族
【表8】
胰岛素酶家族蛋白
如表6～表8所示，关于10℃保存所带来的pH的经时变化，各重组株和P2101201株之间几乎没有差异，任一重组株都未发挥OLS4803株这种低产酸性。因此确认，上述3个基因(16S rRNA甲基转移酶基因、转录调控因子LacI家族基因、胰岛素酶家族蛋白基因)对低产酸没有帮助，有助于乳酸菌的低产酸的是ATP合成酶ε链基因和其所编码的氨基酸序列的变异。
产业上的可利用性
如以上说明的那样，根据本发明，可以提供能够得到低温保存下的pH降低得到抑制且通过上述低温保存也充分维持了乳酸菌的活菌数的发酵乳的乳酸菌、含有其的乳酸菌酵种和发酵乳、以及发酵乳的制造方法，还可以提供乳酸菌的筛选方法。
【保藏号】
1.
(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4801
(2)保藏号：NITE BP-03504
(3)保藏日：2021年8月4日
(4)保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心
2.
(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4802
(2)保藏号：NITE BP-03505
(3)保藏日：2021年8月4日
(4)保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心
3.
(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4803
(2)保藏号：NITE BP-03506
(3)保藏日：2021年8月4日
(4)保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心
4.
(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4824
(2)保藏号：NITE BP-03508
(3)保藏日：2021年8月4日
(4)保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心
5.
(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4496株
(2)保藏号：NITE BP-02875号
(3)保藏日：2019年2月5日
(4)保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心

Claims (15)

1.一种乳酸菌，其ATP合成酶复合体的功能受到抑制。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌，其中，所述ATP合成酶复合体的ε亚基的功能受到抑制。
3.根据权利要求1所述的乳酸菌，其为链球菌属(Streptococcus)乳酸菌。
4.根据权利要求3所述的乳酸菌，其为属于嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的乳酸菌。
5.根据权利要求4所述的乳酸菌，其保有PrtS基因。
6.根据权利要求1所述的乳酸菌，其中，所述ATP合成酶复合体的功能抑制为ε亚基基因的功能缺失型变异。
7.根据权利要求1所述的乳酸菌，其中，所述ATP合成酶复合体的功能抑制为ε亚基蛋白质的表达下降。
8.一种乳酸菌组合物，其含有权利要求1所述的乳酸菌。
9.根据权利要求8所述的乳酸菌组合物，其中，所述乳酸菌为链球菌属(Streptococcus)乳酸菌，并且所述乳酸菌组合物还含有乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌。
10.根据权利要求8所述的乳酸菌组合物，其为乳酸菌酵种。
11.根据权利要求8所述的乳酸菌组合物，其为发酵乳。
12.一种发酵乳的制造方法，其包括下述发酵工序：将权利要求1所述的乳酸菌或权利要求8所述的乳酸菌组合物添加到含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
13.根据权利要求12所述的发酵乳的制造方法，其中，所述乳酸菌为链球菌属(Streptococcus)乳酸菌，并且还向所述调制乳液体中添加乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌。
14.一种乳酸菌的筛选方法，其包括下述选择工序：以ATP合成酶复合体的功能抑制为指标来选择低产酸的乳酸菌。
15.一种发酵乳的制造方法，其包括下述发酵工序：将通过权利要求14所述的乳酸菌的筛选方法选择出的乳酸菌添加到含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
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