BR112012004706B1 - bactéria do ácido lático que carreia uma mutação na região -10 do gene galk, seu método de fabricação, composição, produto de laticínio ou produto de leite fermentado e método de fabricação dos mesmos - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a uma célula bacteriana com propriedade de texturização, culturas inicadoras compreendendo a célula, e produtos laticínios fermentados com a cultura iniciadora.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para BACTÉRIA DO ÁCIDO LÁTICO QUE CARREIA UMA MUTAÇÃO NA REGIÃO -10 DO GENE GALK, SEU MÉTODO DE FABRICAÇÃO, COMPOSIÇÃO, PRODUTO DE LATICÍNIO OU PRODUTO DE LEITE FERMENTADO E MÉTODO DE FABRICAÇÃO DOS MESMOS.
Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a uma célula bacteriana com propriedade de texturização, culturas iniciadoras compreendendo a célula, e produtos laticínios fermentados com a cultura iniciadora.
Antecedentes da Invenção [002] A indústria de alimento usa numerosas bactérias, em particular bactérias lácticas, de modo a aperfeiçoar o sabor e a textura de alimentos mas também para estender a vida de prateleira destes alimentos. No caso da indústria de laticínios, bactérias láticas são usadas intensivamente de modo a efetuarem a acidulação de leite (através de fermentação), mas também de modo a texturizarem o produto no qual elas são incorporadas.
[003] Entre as bactérias láticas usadas na indústria alimentícia, aqui podem ser mencionados os gêneros Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e Bifidobacterium.
[004] As bactérias láticas das espécies Streptococcus thermophilus são usadas extensivamente sozinhas ou em combinação com outras bactérias para a produção de produtos alimentícios, em particular produtos fermentados. Elas são usadas em particular na formulação dos fermentos usados para a produção de leites fermentados, por exemplo, iogurtes. Certas das mesmas desempenham um papel dominante no desenvolvimento da textura do produto fermentado. Esta característica está ligada de perto à produção de polissacarídeos. Entre as linhagens de Streptococcus thermophilus é possível distinguir linhagens texturizantes e nãoPetição 870180068048, de 06/08/2018, pág. 11/49
2/18 texturizantes.
[005] De modo a satisfazer os requisitos da indústria, tornou-se necessário propor novas linhagens texturizantes de bactérias láticas, em particular de Streptococcus thermophilus.
[006] WO2007095958A1 mostra linhagens de Streptococcus thermophilus com propriedades texturizantes. Na figura 1 pode ser visto que a linhagem mais texturizante CHCC8833 (DSM17876) tem um valor de tensão de cisalhamento de ao redor de 59 Pa.
[007] J Dairy Sci. 92:477-482 (2009) mostra um estudo que mostra que é possível aumentar a produção de EPS através de linhagens filamentosas de Streptococcus thermophilus através de engenharia genética através de aumento de atividade GalK. É concluído que quando uma tal linhagem é usada em combinação com Lactobacillus bulgaricus para fabricação de iogurte, a superprodução EPS da linhagem recombinante não é significante.
[008] Assim, o problema que a invenção propõe resolver é prover uma linhagem de bactéria lática tendo boas propriedades para texturização de produtos alimentícios, especialmente produtos onde linhagem texturizante da bactéria lática (como Streptococcus thermophilus) é usada junto com uma linhagem de uma espécie Lactobacillus.
Sumário da Invenção [009] Os presentes inventores surpreendentemente verificaram que bactérias de ácido lático com mutações no gene GalK (galacto cinase) geram uma maior viscosidade em leite fermentado que a linhagem tipo selvagem (mãe), especialmente quando usadas para fermentação de leite junto com bactérias Lactobacillus.
[0010] De acordo com esta surpreendente verificação, a presente invenção refere-se a novas linhagens de bactérias de ácido lático supertexturizantes, tais como linhagens S. thermophilus, com
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3/18 mutações no gene GalK, e a um método para produção destas linhagens, e a produtos de leite fermentado fabricados usando tais linhagens.
Exposição Detalhada [0011] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para fabricação de uma bactéria do ácido lático (tal como uma bactéria que gera maior viscosidade em leite fermentado comparada à linhagem mãe, ou como uma bactéria que gera uma viscosidade em leite fermentado maior que cerca de 70 Pa (por exemplo, maior que 71 ou maior que 73 Pa, medida como uma tensão de cisalhamento após 12 horas de crescimento a 37 graus Celsius), compreendendo:
a) provimento de uma linhagem bacteriana de ácido lático (a linhagem mãe); e
b) introdução de uma mutação no gene GalK da linhagem.
[0012] Assim, modalidades do primeiro aspecto são:
- um método para fabricação de uma bactéria do ácido lático que gera maior viscosidade de leite fermentado comparada à linhagem mãe (por exemplo, medida como tensão de cisalhamento, tal
como após 12 horas de crescimento a 37 graus Celsius)
compreendendo:
a) provimento de uma linhagem bacteriana de ácido
lático (a linhagem mãe); e
b) introdução de uma mutação no gene GalK da
linhagem.
- Um método para fabricação de bactéria do ácido lático que gera uma viscosidade em leite fermentado maior que cerca de 70Pa (por exemplo, medida como tensão de cisalhamento, tal como após 12 horas de crescimento a 37 graus C) compreendendo:
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a) provimento de uma linhagem bacteriana de ácido lático (a linhagem mãe); e
b) introdução de uma mutação no gene GalK da linhagem.
[0013] Em modalidades presentemente preferidas, a viscosidade é medida como tensão de cisalhamento após 12 horas de crescimento a 37 graus Celsius, e/ou como medida no ensaio descrito abaixo. Assim, uma modalidade presentemente preferida do primeiro aspecto da invenção é um método para fabricação de uma bactéria do ácido lático que gera uma viscosidade em leite fermentado maior que cerca de 70 Pa, medida como tensão de cisalhamento após 12 horas de crescimento a 37 graus Celsius, compreendendo:
a) provimento de uma linhagem bacteriana de ácido lático (a linhagem mãe); e
b) provimento de uma mutação no gene GalK da linhagem.
[0014] O método da invenção ainda pode compreender uma ou mais etapas selecionadas do grupo consistindo em:
c1) seleção de uma linhagem mutante que gera textura, tal como uma linhagem que gera mais textura que a linhagem mãe, ou aumenta a viscosidade de um substrato leite; e c2) seleção de uma linhagem mutante tendo fenótipo Gal+, tal como aperfeiçoada atividade de degradação / fermentação de galactose comparada à linhagem mãe.
[0015] A mutação pode ser introduzida na região promotora do gene, tal como na região -10 (a caixa Pribnow) do gene.
[0016] Em uma interessante modalidade do método da invenção, a mutação resulta na substituição de um ou ambos de C e G na região 10 tipo selvagem (TACGAT) com um nucleotídeo selecionado independentemente do grupo consistindo em A e T.
[0017] A mutação pode resultar na substituição de C na região -10
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5/18 tipo selvagem (TACGAT) com um nucleotídeo selecionado independentemente do grupo consistindo em A e T.
[0018] Em uma modalidade, a mutação resulta na substituição de C da região -10 tipo selvagem (TACGAT) com T, e/ou a mutação resulta em uma região -10 que tem a sequência de nucleotídeos TATGAT, TATTAT ou TACTAT.
[0019] A mutação pode ser introduzida através do uso de técnicas de engenharia genética, e/ou através de uso de mutagênese, por exemplo, através de radiação ou tratamento com um composto químico, opcionalmente seguido por uma análise do gene GalK de modo a verificar mutação no gene GalK.
[0020] A bactéria (a linhagem mãe) pode ser selecionada de um gênero pertencendo ao grupo consistindo em Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e Bifidobacterium. Uma bactéria interessante pertence à espécie Streptococcus thermophilus.
[0021] Ainda em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma bactéria do ácido lático que é obtenível através do método da invenção.
[0022] Também, a invenção refere-se a uma bactéria do ácido lático que gera uma viscosidade em leite fermentado maior que cerca de 70 Pa (tal como maior que 71 Pa ou 73 Pa), medida como tensão de cisalhamento após 12 horas de crescimento a 37 graus Celsius; a uma bactéria e ácido lático que transporta uma mutação na região -10 do gene GalK (comparado à região -10 de tipo selvagem (TACGAT)), onde a mutação resulta em uma região -10 que tem a sequência de nucleotídeos TATGAT, TATAT ou TACTAT; e a uma bactéria do ácido lático que transporta uma mutação na região -10 do gene GalK, cuja mutação resulta na substituição de C na região -10 tipo selvagem (TACGAT) com um nucleotídeo selecionado independentemente do
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6/18 grupo consistindo em A e T. Em uma modalidade interessante, a mutação resulta no substituição de C na região -10 tipo selvagem (TACGAT) com T.
[0023] Em uma modalidade interessante, a bactéria do ácido lático da invenção compreende SEQ ID NO: 5, ou sua região promotora, incluindo a região -35 e a região -10. A bactéria do ácido lático preferivelmente pertence às espécies Streptococcus thermophilus.
[0024] Ainda em uma modalidade, a invenção refere-se a uma linhagem bacteriana pertencendo às espécies Streptococcus thermophilus, selecionada do grupo consistindo em: CHCC11379 (DSM 22884), CHCC11342, CHCC11976, e mutantes e variantes de quaisquer destes. Em adição, a invenção refere-se a todas as novas linhagens aqui mencionadas, assim como seus mutantes e variantes.
[0025] Ainda em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição compreendendo bactérias de ácido lático da invenção, tais como bactérias pertencendo à linhagem CHCC11379. É preferido que tal composição compreenda pelo menos 1010 CFU (unidades formadoras de célula) das referidas bactérias.
[0026] A composição pode compreender, tanto como uma mistura ou como um kit de partes,
- uma linhagem pertencendo a uma espécie Lactobacillus, tal como uma linhagem L. bulgaricus ou L. fermentum; e
- uma linhagem de bactéria do ácido lático da invenção, tal como uma linhagem pertencendo às espécies Streptococcus thermophilus.
[0027] É presentemente preferido que a linhagem pertencendo a uma espécie Lactobacillus seja uma linhagem pertencendo a uma espécie Lactobacillus produzindo enzima polissacarídeo (tal como hetero polissacarídeo, homo polissacarídeo) e/ou frutosil transferase.
[0028] A composição pode compreender pelo menos 1010 CFU
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7/18 (unidades de formação de célula) de uma linhagem pertencendo a uma espécie Lactobacillus; e pelo menos 1010 CFU de uma linhagem pertencendo à espécie Streptococcus thermophilus.
[0029] A composição é preferivelmente utilizável como uma cultura iniciadora,e está em forma congelada, congelada - seca ou líquida.
[0030] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para produção de um produto laticínio / produto de leite fermentado, compreendendo fermentação de um substrato leite (tal como leite de vaca) com uma bactéria do ácido lático, uma linhagem, ou uma composição da invenção.
[0031] O método ainda pode compreender fermentação de substrato leite com uma linhagem pertencendo a uma espécie Lactobacillus, tal como uma linhagem de L. bulgaricus ou L. fermentum, por exemplo, uma linhagem selecionada do grupo consistindo em LB18, CHCC10019 (DSM 19252), DSM22584, ou CHCC3984 (DSM19251), e mutantes e variantes de quaisquer destas linhagens.
[0032] O substrato leite pode ser fermentado com uma linhagem ou bactéria de qualquer reivindicação anterior, tal como uma linhagem pertencendo à espécie Streptococcus thermophilus antes, durante, ou após a fermentação com uma linhagem pertencendo a uma espécie Lactobacillus.
[0033] O método pode compreender adição de uma enzima ao substrato leite antes, durante e/ou após a fermentação, tal como uma enzima selecionada do grupo consistindo em: uma enzima capaz de reticular proteínas, transglutaminase, uma protease aspártica, quimosina e rennet.
[0034] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um produto laticínio, tal como um produto leite fermentado (por exemplo, iogurte ou leite de manteiga) ou um queijo (por exemplo, queijo fresco
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8/18 ou pasta filata), obtenível através do método da invenção. O produto leite fermentado pode, por exemplo, ser um produto tipo agitado, ou um produto tipo fixo.
[0035] O produto laticínio opcionalmente pode compreender um ingrediente selecionado do grupo consistindo em: um concentrado de fruta, um xarope, uma cultura bacteriana probiótica, um agente corante, um agente espessante, um agente aromatizante, e um agente preservativo; e/ou que está na forma de um produto tipo agitado, um produto tipo fixo, ou um produto bebível.
[0036] A invenção também se refere a um produto de laticínio, que é fabricado por fermentação de um substrato leite (tal como leite de vaca) com uma bactéria do ácido lático da invenção (por exemplo, uma linhagem pertencendo à espécie Streptococcus thermophilus, tal como DSM 22884) e uma bactéria do ácido lático de uma espécie selecionada de Lactobacillus bulgaricus e Lactobacillus fermentum (tais como CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251) e CHCC2008 (DSM 22584)).
[0037] Em um interessante produto laticínio da invenção tem uma viscosidade de mais que 100 Pa (tal como mais que 102 ou mais que 104 Pa), medido como tensão de cisalhamento, por exemplo, após 12 horas de crescimento a 37 graus Celsius. Em uma modalidade presentemente preferida, a viscosidade de mais que 100 Pa é obtida através de crescimento das células bacterianas sozinhas, porém maiores valores de viscosidade podem ser obtidos através de adição de compostos químicos, como gelatina, uma carragenan, etc.
Definições [0038] Como aqui usado, o termo “bactéria do ácido lático” designa uma bactéria gram-positiva, microaerofílica ou anaeróbica, que fermenta açúcares com a produção de ácidos incluindo ácido lático como o ácido predominantemente produzido, ácido acético e
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9/18 ácido propiônico. As bactérias de ácido lático mais industrialmente úteis são encontradas dentro da ordem “Lactobacillales” que inclui Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. e Propionibacterium spp.
[0039] Adicionalmente, bactérias produzindo ácido lático pertencendo ao grupo das bactérias anaeróbicas estritas, bifidobactérias, isto é, Bifidobacterium spp., são genericamente incluídas no grupo de bactérias de ácido lático. Estas são frequentemente usadas como culturas de alimentos sozinhas ou em combinação com outras bactérias de ácido lático. Bactérias de ácido lático, incluindo bactérias das espécies Lactobacillus sp. e Streptococcus thermophilus, são normalmente supridas para a indústria de laticínios tanto como culturas congeladas ou secadas congeladas para propagação iniciadora de volume ou como assim chamadas culturas “Fixação Direta em Vaso” (DVS), pretendidas para inoculação direta em um vaso de fermentação ou tina para a produção de um produto laticínio, tal como um produto leite fermentado. Tais culturas são em geral referidas como “culturas iniciadoras” ou “iniciadoras”.
[0040] O termo “leite” é para ser entendido como a secreção láctea obtida por ordenha de qualquer mamífero, como vacas, ovelhas, cabras, búfalas ou camelos. Em uma modalidade preferida, o leite é leite de vaca. O termo leite também inclui soluções de proteína / gordura fabricadas de materiais de plantas, por exemplo, leite de soja.
[0041] O termo “substrato leite” pode ser qualquer material de leite bruto e/ou processado que possa ser submetido a fermentação de acordo com o método da invenção. Assim, substratos leites úteis incluem, mas não são limitados a, soluções / suspensões de qualquer leite ou produtos semelhantes a leite compreendendo proteína, tal
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10/18 como leite integral ou baixo teor de gordura, leite desnatado, leite de manteiga, leite reconstituído, leite condensado, leite seco, soro de leite coalhado, permeado de soro de leite coalhado, líquido mãe de cristalização de lactose, concentrado de proteína de soro de leite coalhado, ou creme. Obviamente, o substrato leite pode se originar de qualquer mamífero, por exemplo, sendo leite de mamífero substancialmente puro, ou leite em pó reconstituído.
[0042] Antes de fermentação, o substrato leite pode ser homogeneizado e pasteurizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0043] “Homogeneização” como aqui usado significa mistura intensiva para obter uma suspensão ou emulsão solúvel. Se homogeneização é realizada antes de fermentação, ela pode ser realizada de modo a quebrar a gordura de leite em menores tamanhos de modo que ela não mais se separa do leite. Isto pode ser realizado forçando-se o leite em alta pressão através de pequenos orifícios.
[0044] “Pasteurização” como aqui usado significa tratamento do substrato leite para reduzir ou eliminar a presença de organismos vivos, tais como microrganismos. Preferivelmente, pasteurização é obtida por manutenção de uma especificada temperatura por um especificado período de tempo. A temperatura especificada é usualmente obtida através de aquecimento. A temperatura e duração podem ser selecionadas de modo a matar ou inativar certas bactérias, tais como bactérias perigosas. Uma rápida etapa de resfriamento pode se seguir.
[0045] “Fermentação” nos métodos da presente invenção significa a conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos através da ação de um microrganismo. Preferivelmente, fermentação nos métodos da invenção compreende conversão de lactose em ácido lático.
[0046] Métodos de fermentação para serem usados na produção
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11/18 de produtos de leite fermentado são bem conhecidos e aqueles versados na técnica saberão como selecionar apropriadas condições de método, tais como temperatura, oxigênio, quantidade e características de microrganismo(s) e tempo de método. Obviamente, condições de fermentação são selecionadas de modo a suportarem a obtenção da presente invenção, isto é para obter um produto laticínio em forma sólida ou líquida (produto de leite fermentado).
[0047] O termo “produto tipo agitado” refere-se especificamente a um produto de leite fermentado que sustenta um tratamento mecânico após fermentação, resultando em uma desestruturação e liquefação do coágulo formado sob o estágio de fermentação. O tratamento mecânico é tipicamente mas não exclusivamente obtido através de agitação, bombeamento, filtração ou homogeneização de gel, ou através de mistura do mesmo com outros ingredientes. Produtos tipo agitado tipicamente mas não exclusivamente têm um teor não-gordura de sólidos de leite de 9 a 15%.
[0048] O termo “produto tipo fixo” inclui um produto baseado em leite que foi inoculado com uma cultura iniciadora, por exemplo, uma cultura iniciadora, e embalado seguindo a etapa de inoculação e então fermentado na embalagem.
[0049] No presente contexto, o termo “mutante” deve ser entendido como uma linhagem derivada de uma linhagem da invenção por meio de, por exemplo, engenharia genética, radiação e/ou tratamento químico. É preferido que o mutante seja um mutante funcionalmente equivalente, por exemplo, um mutante que tem substancialmente as mesmas, ou aperfeiçoadas, propriedades (por exemplo, com relação a textura, tensão de cisalhamento, viscosidade, rigidez de gel, revestimento bucal, aroma, pós-acidulação, velocidade de acidulação, e/ou robustez de fago) como a linhagem mãe. Um tal mutante é uma parte da presente invenção. Especialmente, o termo
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12/18 “mutante” refere-se a uma linhagem obtida através de sujeição de uma linhagem da invenção a qualquer tratamento de mutagênese convencionalmente usado incluindo tratamento com um mutagênico químico tal como sulfonato de etano metano (SEM) ou N-metil-N'-nitroN-em nitroguanidina (NTG), luz UV ou a um mutante ocorrendo espontaneamente. Um mutante pode ter sido submetido a vários tratamentos de mutagênese (um tratamento único deve ser entendido como uma etapa de mutagênese seguida por uma etapa de separação / seleção), mas é presentemente preferido que não mais que 20, ou não mais que 10, ou não mais que 5, tratamentos (ou etapas de separação / seleção) sejam realizadas. Em um mutante presentemente preferido, menos que 5%, ou menos que 1% ou mesmo menos que 0,1% dos nucleotídeos no genoma bacteriano foram trocados com um outro nucleotídeo, ou suprimidos, comparado à linhagem mãe. No presente contexto, o termo “variante” deve ser entendido como uma linhagem que é funcionalmente equivalente a uma linhagem da invenção, por exemplo, tendo substancialmente as mesmas, ou aperfeiçoadas, propriedades, por exemplo, com relação a textura, tensão de cisalhamento, viscosidade, rigidez de gel, revestimento bucal, aroma, pós-acidulação, velocidade de acidulação, e/ou robustez de fago). Tais variantes, que podem ser identificadas usando apropriadas técnicas de separação, são uma parte da presente invenção.
[0050] No presente contexto, “textura” é medida como tensão de cisalhamento após 12 horas de crescimento a 37 graus Celsius. Um ensaio a ser usado para análise de textura: O dia após incubação, o leite fermentado foi levado para 13oC e suavemente agitado por meio de um bastão adaptado com um disco perfurado até homogeneidade da amostra. As propriedades reológicas da amostra foram avaliadas em um reômetro (StressTech, Reologica Instruments, Sweden)
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13/18 equipado com um sistema de medição coaxial C25. O teste de medição de viscosidade foi feito com taxas de cisalhamento variando de 0,27 a 300 1/s em 21 etapas. Taxas de cisalhamento foram aumentadas e então diminuídas e as curvas ascendentes e descendentes de força de cisalhamento e viscosidade aparente foram anotadas. Tempos de retardo e integração foram 5 s e 10 s, respectivamente.
[0051] O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e referências similares no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações que se seguem) é para ser construído para cobrir ambos, o singular e o plural, a menos que aqui indicado de outro modo ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “compreendendo”, “tendo”, “incluindo” e “contendo” são para serem construídos como termos de extremidade aberta (isto é, significando “incluindo, mas não limitado a”) a menos que de outro modo notado. Recitação aqui de faixas de valores é meramente pretendida servir como um método abreviado de referir-se individualmente a cada valor separado caindo dentro da faixa, a menos que de outro modo ali indicado, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente ali recitado. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem apropriada a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, “tal como”) aqui provido, é pretendido meramente melhor iluminar a invenção e não possui uma limitação sobre o escopo da invenção a menos que de outro modo reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser construída como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.
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14/18
Legendas [0052] A figura 1 mostra a tensão de cisalhamento de CHCC11379 medida com o reômetro StressTech. Resultado mostrando aperfeiçoada textura (tensão de cisalhamento) em leite coagulado com CHCC11379 após crescimento por toda noite a 43 graus C. Textura foi quantificada através de avaliação de tensão de cisalhamento medida em Pascal (Pa) através de uso de um reômetro StressTech como descrito sob “Análise de textura em leite fermentado”.
Exemplos [0053] Exemplo 1 Preparação de um mutante positivo para galactose de uma linhagem de Streptococcus
Isolamento de linhagem fermentando galactose [0054] Mutantes foram isolados como mutante fermentando galactose de linhagem CHCC6008 de S. thermophilus (=ST6008, DSM 18111). As células CHCC6008 não foram sofreram mutagênese com qualquer composto mutagênico nem por luz UV antes de etapa de isolamento de mutante. As linhagens isoladas parecem por isso mutantes positivos de galactose espontâneos de CHCC6008.
[0055] Antes de isolamento de mutante CHCC6008 foi feita estriamento sobre placas de ágar M17 com galactose 2% (placas M17gal). CHCC6008 não cresce sobre galactose como a única fonte de carboidrato.
[0056] Cultura por toda a noite de CHCC6008 foi então revestida sobre placas M17-gal e várias colônias podem ser isoladas após dois dias de crescimento a 37oC. Vários mutantes foram purificados sobre placas M17-gal e novamente testadas em caldo M17 contendo galactose 2% como único carboidrato.
[0057] Enquanto CHCC6008 não diminui significantemente o pH em caldo M17-gal, CHCC11379, um dos mutantes purificados, atingiu um pH de 5,3 após 10 horas a 37oC, e foi por isso considerado um
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15/18 mutante de CHCC6008 fermentando galactose.
[0058] Linhagens CHCC11342 e CHCC11976 foram isoladas da mesma maneira.
Isolamento de mutantes através de engenharia genética [0059] Mutantes positivos para galactose também podem ser gerados por mutagênese sítio direcionada. Oligonucleotídeos carreando o nucleotídeo mutante dentro da caixa promotora -10 GalK são usados para amplificar um fragmento de DNA específico através de PCR. O fragmento de PCR carreando a desejada mutação é clonado em um plasmídeo vetor e transformado na linhagem alvo S. thermophilus, e a mutação é integrada no cromossomo e trocando a região promotora galk tipo selvagem através de recombinação. Isolamento de linhagens é feito como acima.
Análises de textura em leite fermentado [0060] O dia após a incubação, o leite fermentado foi levado para 13oC e suavemente agitado por meio de um bastão adaptado com um disco perfurado até homogeneidade de amostra. As propriedades reológicas da amostra foram avaliadas em um reômetro (StressTech, Reologica Instruments, Sweden) equipado com um sistema de medição coaxial C25.
[0061] O teste de medição de viscosidade foi realizado com taxas de cisalhamento variando de 0,27 a 300 1/s em 21 etapas. Taxas de cisalhamento foram aumentadas e então diminuídas e as curvas ascendentes e descendentes de tensão de cisalhamento e viscosidade aparente foram anotadas.
[0062] Tempos de retardo e integração foram 5s e 10s, respectivamente. Para ainda análises, tensão de cisalhamento em 300s-1 foi escolhida. Os resultados de reômetro mostraram que CHCC11379 teve uma tensão de cisalhamento que foi aperfeiçoada por 10% comparada a CHCC6008 (valor de tensão de cisalhamento
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16/18 de 74,0 Pa (Pascal) para CHCC11379 comparado com 67,5 Pa para linhagem mãe CHCC6008, verfig. 1).
Análise de textura em leite [0063] Em um outro experimento CHCC11379 foi usada como uma parte de uma cultura de iogurte onde linhagens de S. thermophilus são co-cultivadas em leite desnatado a 43°C junto com uma linhagem da espécie Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Quando a única diferença na produção de iogurte foi o uso de HCC11379 ao invés de CHCC6008 tipo selvagem a tensão de cisalhamento também foi aumentada por 10% (105,0 Pa para a cultura de iogurte contendo CHCC11379 comparado a 94,7 Pa para a cultura de iogurte contendo CHCC6008).
Sequenciamento da região promotora galk de CHCC11379 [0064] Para revelar o tipo de mutação para o mutante positivo gal de CHCC11379 o início do gene galk (codificando a galacto cinase de
S. thermophilus) foi sequenciado. Para CHCC11379 uma mutação na região do promotor de galK foi identificada (ver abaixo). A respectiva mutação mais provavelmente conduzirá a uma atividade promotora mais forte comparada à linhagem mãe 6008, explicando o fenótipo positivo - gal observado. Isto é baseado no fato de quem a sequência consenso para a caixa promotora -10 é “TATAAT”, e que uma mutação em nucleotídeo 3 da caixa (região) -10 para CHCC6008 (“TACGAT”) conduz a uma caixa -10 com uma maior similaridade à sequência consenso em CHCC11379 (“TATGAT”).
CHCC11379
CHCC6008
AY704368
Consensus
AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTATGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC
AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC
AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC
AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC -35 -10 RBS
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8 [0065] A região promotora do gene galK de CHCC11379. A mutação ponto dentro de promotor galK de CHCC11379 é indicada com código de cor cinza. A sequência galK publicada de S.
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17/18 thermophilus ST111 (Genbank accession no. AY704368) é indicada para comparação. -35: região promotora -35; -10: região promotora 10; RBS: sítio de ligação de ribossoma.
[0066] Modalidades preferidas desta invenção são aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido para os inventores para modalidade da invenção. Variações daquelas modalidades preferidas podem tornar-se aparentes para aqueles versados na técnica com a leitura da descrição anterior. Os inventores esperam que aqueles versados na técnica empreguem tais variações quando apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outro modo que não como especificamente aqui descrito. Da mesma maneira, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes da matéria objeto recitada nas reivindicações apostas como permitido por lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as suas variações possíveis é abrangida pela invenção a menos que de outro modo aqui indicado ou claramente de outro modo contradito pelo contexto.
Depósitos e Solução Especialista [0067] A linhagem de Streptococcus themophilus CHCC11379 foi depositada em DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany) sob o número de acesso DSM22884, em 26 de agosto de 2009. Uma amostra do Streptococcus thermophilus (ST) linhagem ST6008 (também chamada CHCC6008) foi depositada em DSMZ sob o número de acesso DSM 18111 com uma data de depósito de 29 de março de 2006. CHCC11342 (DSM 22932) e CHCC11976 (DSM 22934) foram depositados em 8 de setembro de 2009 em DSMZ. [0068] Ainda depósitos em DSMZ:
[0069] CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251): data de depósito 3 de abril de 2007, CHCC2008 (DSM22584): data de
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18/18 depósito 19 de maio de 2009.
[0070] Os depósitos foram feitos sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para os propósitos de procedimento de patente.
[0071] As requerentes solicitam que uma amostra dos microrganismos depositados deve ser feita disponível somente para um especialista aprovado pela requerente.
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[0072] Todas as referências citadas neste documento de patente são pelo que aqui incorporadas por referência.

Claims (5)

1/2
REIVINDICAÇÕES
1. Método para fabricação de uma bactéria do ácido lático, caracterizado pelo fato de que consiste em:
a) provimento de uma linhagem bacteriana de ácido lático como a linhagem mãe;
b) introdução de uma mutação na região promotora do gene GalK da linhagem; e
c) triagem para uma linhagem mutante que gera maior viscosidade em leite fermentado comparado com a linhagem mãe medido como tensão de cisalhamento após 12 horas de crescimento a 37° C;
em que a bactéria do ácido lático é uma bactéria que pertence à espécie Streptococcus thermophilus.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação resulta na substituição de uma ou ambas de C e G na região -10 do tipo selvagem que apresenta a sequência de nucleotídeos TACGAT (SEQ ID NO: 1) com um nucleotídeo selecionado independentemente a partir do grupo consistindo em A e
T.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a mutação resulta em uma região -10 que tem a sequência de nucleotídeos TATGAT (SEQ ID NO: 2), TATTAT (SEQ ID NO: 3), ou TACTAT (SEQ ID NO: 4).
4. Bactéria do ácido lático que carreia uma mutação na região -10 do gene GalK, caracterizada pelo fato de que a mutação resulta em uma região -10 que apresenta a sequência de nucleotídeo TATTAT (SEQ ID NO: 3) ou TACTAT (SEQ ID NO: 4).
5. Bactéria do ácido lático que pertence à espécie Streptococcus thermophilus, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo consistindo em: CHCC11379
Petição 870180167492, de 26/12/2018, pág. 11/16
2/2 (depositada no DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - sob número de acesso DSM 22884), CHCC11342 (depositada no DSMZ sob número de acesso DSM22932) e CHCC11976 (depositada no DSMZ sob número de acesso DSM 22934).
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