BR112020019974A2

BR112020019974A2 - Composição e processo para a produção de um produto de leite fermentado compreendendo a aplicação de uma cepa de s. thermophilus deficiente em lactose, uma cepa de l. bulgaricus deficiente em lactose e uma cepa probiótica

Info

Publication number: BR112020019974A2
Application number: BR112020019974-5A
Authority: BR
Inventors: Mette Oehrstroem RUNGE; Sonja BLOCH; Hui Han
Original assignee: Chr. Hansen A/S
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-01-05
Also published as: AU2019259880A1; US20210161163A1; WO2019206754A8; CN112020303A; WO2019206754A1; EP3784042A1; MX2020011093A

Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição para a produção de um produto de leite fermentado apresentando um baixo grau de pós-acidificação durante o armazenamento, compreendendo: 1) uma cultura iniciadora de bactérias ácido-lácticas compreendendo pelo menos uma cepa de streptococcus thermophilus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e pelo menos uma cepa de lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e 2) uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em uma cepa de lactobacillus e uma cepa de bifidobacterium.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM

PRODUTO DE LEITE FERMENTADO COMPREENDENDO A APLICAÇÃO DE UMA CEPA DE S. THERMOPHILUS DEFICIENTE EM LACTOSE, UMA CEPA DE L. BULGARICUS DEFICIENTE EM LACTOSE E UMA CEPA PROBIÓTICA". CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a uma composição e um processo parar produzir um produto de leite fermentado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O EP-A1-2 957 180 descreve um método de produção de um produto de leite fermentado usando bactérias ácido-lácticas deficientes em lactose, em particular, cepas de Streptococcus thermophilus e cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus deficientes em lactose, que são capazes de metabolizar um carboidrato não lactose.

[0003] Em uma fermentação de leite usando uma cultura iniciadora contendo bactérias ácido-lácticas deficientes em lactose, um carboidrato não lactose, tal como sacarose, glicose ou galactose, é adicionado à base de leite no início da fermentação em uma quantidade medida de modo a se tornar exaurido no pH alvo e, portanto, resulta na interrupção do crescimento das bactérias ácido-lácticas e na interrupção da fermentação. Assim, a pós-acidificação durante o subsequente armazenamento é significativamente reduzida ou mesmo totalmente evitada.

[0004] No entanto, quando se deseja produzir produtos lácteos fermentados contendo sacarose adicionada para adoçar o produto, há o risco de se obter um grau inaceitável de pós-acidificação durante o armazenamento, em particular, em temperaturas elevadas.

[0005] As cepas probióticas, tais como as cepas de Lactobacillus rhamnosus LGG® depositada como ATCC53103, são amplamente utilizadas em produtos de leite fermentado. No entanto, em muitos produtos de leite fermentado, as cepas probióticas crescerão durante o armazenamento, em particular, em temperaturas elevadas, resultando em pós-acidificação indesejável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] O objetivo da presente invenção é fornecer uma composição para a produção de um produto de leite fermentado com propriedades pós-acidificação melhoradas.

[0007] O objetivo da presente invenção é obtido por uma composição para a produção de um produto de leite fermentado, que compreende: 1) uma cultura iniciadora de bactérias ácido-lácticas compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar o carboidrato não lactose, e 2) uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em cepa de Lactobacillus e uma cepa de Bifidobacterium.

[0008] A presente invenção baseia-se na surpreendente descoberta experimental de que, ao usar uma cultura iniciadora consistindo de cepas deficientes em lactose em combinação com a cepa probiótica, os problemas com relação à pós-acidificação associados tanto com a referida cultura iniciadora quanto com a referida cepa probiótica são fortemente reduzidos. Em particular, quando um carboidrato adoçante, tal como a sacarose, é adicionado ao produto de leite fermentado, o nível de pós-acidificação causado pela cultura iniciadora durante o armazenamento do produto de leite fermentado é fortemente reduzido. Além disso, o nível de pós-acidificação causado pela cepa probiótica durante o armazenamento do produto de leite fermentado é fortemente reduzido.

[0009] Além disso, na fermentação de uma base de leite para produzir um produto de leite fermentado, a composição da invenção tem um tempo de fermentação reduzido em comparação com uma composição correspondente que não contém nenhuma cepa probiótica.

[0010] A presente invenção refere-se ainda a um processo para a produção de um produto de leite fermentado, que compreende as etapas de: 1) adicionar uma cultura iniciadora de bactérias ácido- lácticas, compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose que é capaz de metabolizar o carboidrato não lactose, a uma base de leite, 2) fermentar a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado para obter um produto de leite fermentado, e 3) adicionar uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactobacillus e uma cepa de Bifidobacterium, ao processo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Bactérias ácido-lácticas deficientes em lactose

[0011] Os termos "deficiência no metabolismo da lactose" e "deficiente em lactose" são usados no contexto da presente invenção para caracterizar as LAB que perderam parcial ou completamente a capacidade de usar a lactose como fonte para o crescimento celular ou manutenção da viabilidade celular. As respectivas LAB são capazes de metabolizar um ou vários carboidratos selecionados de sacarose, galactose e/ou glicose ou outro carboidrato fermentável. Uma vez que esses carboidratos não estão naturalmente presentes no leite em quantidades suficientes para sustentar a fermentação por mutantes deficientes em lactose, é necessário adicionar esses carboidratos ao leite. As LAB deficientes e parcialmente deficientes em lactose podem ser caracterizadas como colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

[0012] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa deficiente em lactose é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose selecionado do grupo que consiste em sacarose, galactose e glicose, preferivelmente sacarose. Em uma modalidade particular da invenção, a cepa deficiente em lactose é capaz de metabolizar a galactose.

[0013] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose é selecionada do grupo que consiste em: (a) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28952; (ii) uma cepa derivada de DSM 28952, em que a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (b) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28953; (ii) uma cepa derivada de DSM 28953, em que a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal;

(c) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32599; (ii) uma cepa derivada de DSM 32599, em que a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; e (d) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32600; e (ii) uma cepa derivada de DSM 32600, em que a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

[0014] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose é selecionada do grupo que consiste em: (a) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28952; (ii) uma cepa derivada de DSM 28952, em que a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; e (b) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28953; e (ii) uma cepa derivada de DSM 28953, em que a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

[0015] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose é selecionada do grupo que consiste em: (c) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32599; (ii) uma cepa derivada de DSM 32599, em que a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; e (d) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32600; e (ii) uma cepa derivada de DSM 32600, em que a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

[0016] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose é selecionada do grupo que consiste em: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28910; e (ii) uma cepa derivada de DSM 28910, em que a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal. Cepa probiótica

[0017] O termo "bactérias probióticas" refere-se a bactérias viáveis que são administradas em quantidades adequadas a um consumidor com a finalidade de alcançar um efeito promotor de saúde no consumidor. As bactérias probióticas são capazes de sobreviver às condições do trato gastrointestinal após a ingestão e colonizar o intestino do consumidor. Em uma modalidade particular da invenção, a cepa probiótica, de acordo com a presente invenção, é selecionada do grupo que consiste em bactérias do gênero Lactobacillus, tais como Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri e Lactobacillus johnsonii, do gênero Bifidobacterium, tais como a Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium pseudocatenulatum e Bifidobacterium infantis, e similares.

[0018] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa probiótica de Lactobacillus é selecionada do grupo que consiste em Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri e Lactobacillus johnsonii.

[0019] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa probiótica de Lactobacillus é selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactobacillus rhamnosus e uma cepa de Lactobacillus paracasei.

[0020] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa probiótica é a cepa de Lactobacillus rhamnosus LGG® depositada como ATCC53103.

[0021] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa probiótica é a cepa de Lactobacillus paracasei CRL 431 depositada como ATCC 55544.

[0022] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa probiótica de Bifidobacterium é selecionada do grupo que consiste em Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium pseudocatenulatum e Bifidobacterium infantis.

[0023] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa probiótica de Bifidobacterium é Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 depositada como DSM15954. Composição da invenção

[0024] Em uma modalidade particular, a composição contém duas ou mais cepas de Streptococcus thermophilus deficientes em lactose e uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose.

[0025] Em uma modalidade particular da composição, o carboidrato não lactose é selecionado do grupo que consiste em sacarose, galactose e glicose.

[0026] Em uma modalidade particular da presente invenção, a composição compreende de 104 a 1012 UFC (unidades formadoras de colônia)/g da cepa de Streptococcus thermophilus, tal como de 105 a

1011 UFC/g, tal como de 106 a 1010 UFC/g, ou tal como de 107 a 109 UFC/g da cepa de Streptococcus thermophilus.

[0027] Em uma modalidade particular, a composição compreende ainda de 104 a 1012 UFC/g da cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, tal como de 105 a 1011 UFC/g, tal como de 106 a 1010 UFC/g, ou tal como de 107 a 109 UFC/g da cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

[0028] Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus e outras bactérias ácido-lácticas são comumente utilizadas como culturas iniciadoras, atendendo a fins tecnológicos na produção de diversos alimentos, tais como na indústria de laticínios, como produtos lácteos fermentados. Assim, em outra modalidade preferida, a composição é adequada como uma cultura iniciadora.

[0029] As culturas iniciadoras podem ser fornecidas como culturas iniciadoras congeladas ou secas, além das culturas iniciadoras líquidas. Assim, em ainda outra modalidade preferida, a composição está na forma congelada, liofilizada ou líquida.

[0030] Como descrito no WO 2005/003327, é benéfico adicionar certos agentes crioprotetores a uma cultura iniciadora. Assim, uma composição de cultura iniciadora de acordo com a presente invenção pode compreender um ou mais agente(s) crioprotetor(es) selecionado(s) do grupo que consiste em inosina-5'-monofosfato (IMP), adenosina-5'-monofosfato (AMP), guanosina-5'-monofosfato (GMP), uranosina-5'-monofosfato (UMP), citidina-5'-monofosfato (CMP), adenina, guanina, uracila, citosina, adenosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina, hipoxantina, orotidina, timidina, inosina e um derivado de qualquer um desses compostos. Processo da invenção

[0031] A presente invenção refere-se ainda a um processo para a produção de um produto de leite fermentado, que compreende as etapas de: 1) adicionar uma cultura iniciadora de bactérias ácido- lácticas, compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, a uma base de leite, 2) fermentar a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado para obter um produto de leite fermentado, e 3) adicionar uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactobacillus e uma cepa de Bifidobacterium, ao processo.

[0032] Em uma modalidade particular da invenção, as cepas deficientes em lactose são capazes de metabolizar um carboidrato não lactose selecionado do grupo que consiste em sacarose, galactose e glicose, preferivelmente sacarose.

[0033] Em uma modalidade particular da invenção, o carboidrato não lactose é adicionado à base de leite no início da etapa de fermentação.

[0034] Em uma modalidade particular da invenção, a etapa de fermentação é encerrada por um método selecionado do grupo que consiste em 1) acidificação do leite fermentado, que torna pelo menos uma cepa da cultura iniciadora incapaz de se desenvolver, 2) tratamento de resfriamento, e 3) depleção do carboidrato não lactose.

[0035] Preferivelmente, o carboidrato não lactose é adicionado à base de leite em uma quantidade medida de modo a se tornar exaurido e, portanto, resulta na interrupção do crescimento de bactérias ácido- lácticas e na interrupção da fermentação. Preferivelmente, o carboidrato não lactose é adicionado à base de leite em uma quantidade medida de modo a se tornar exaurido no pH alvo e, portanto, resulta na interrupção do crescimento de bactérias ácido-lácticas e na interrupção da fermentação.

[0036] A quantidade de carboidrato não lactose a ser adicionada à base de leite depende de vários parâmetros, incluindo as cepas de bactérias ácido-lácticas usadas na cultura iniciadora, a composição da base de leite, a temperatura de fermentação, e o pH alvo desejado. A quantidade de carboidrato não lactose a ser adicionada à base de leite pode ser determinada por experimentação e está dentro das habilidades de uma pessoa versada realizando tal experimentação.

[0037] Em uma modalidade particular da invenção, o pH alvo está entre 3,2 e 4,8, preferivelmente entre 3,6 e 4,6, mais preferivelmente entre 3,8 e 4,5, e muitíssimo preferivelmente entre 4,0 e 4,4.

[0038] Em uma modalidade particular da invenção, a temperatura de fermentação está entre 35⁰C e 45⁰C, preferivelmente entre 37⁰C e 43⁰C, e mais preferivelmente entre 40⁰C e 43⁰C.

[0039] Em uma modalidade particular da invenção, o produto de leite fermentado não é submetido a uma etapa de resfriamento após o final da etapa de fermentação e antes do acondicionamento.

[0040] Em uma modalidade particular da invenção, o produto de leite fermentado é acondicionado a uma temperatura entre 15 e 45 °C.

[0041] Em uma modalidade particular da invenção, a quantidade de carboidrato não lactose adicionada é de 1 mg/g a 30 mg/g, preferivelmente de 2 mg/g a 20 mg/g, e mais preferivelmente de 3 mg/g a 10 mg/g de base de leite.

[0042] Em uma modalidade particular da invenção, a quantidade de carboidrato não lactose adicionado é de 0,1 % a 10 %, preferivelmente de 0,2 % a 8 %, preferivelmente de 0,3 % a 2 %, preferivelmente de 0,4% a 1,5 %, e mais preferivelmente de 0,5 % a 1,2 %, em que a % é em (p/p) com base na base de leite.

[0043] Em uma modalidade preferida da invenção, a base de leite no início da etapa de fermentação tem um teor de lactose entre 30,0 mg/ml e 70 mg/ml, preferivelmente entre 35 mg/ml e 65 mg/ml, mais preferivelmente entre 40 mg/ml e 60 mg/ml, e muitíssimo preferivelmente entre 50 mg/ml e 60 mg/ml.

[0044] Em uma modalidade particular da invenção, o valor de pH do produto de leite fermentado é mantido dentro de uma faixa de 0,5 unidades de pH, quando armazenado após o término da fermentação por um período de pelo menos 7 dias a uma temperatura superior a 10⁰C.

[0045] Em uma modalidade particular da invenção, o valor de pH do produto de leite fermentado é mantido dentro de uma faixa de 0,5 unidades de pH, preferivelmente dentro de uma faixa de 0,4 unidades de pH, preferivelmente dentro de uma faixa de 0,3 unidades de pH, preferivelmente dentro de uma faixa de 0,2 unidades de pH, e mais preferivelmente dentro de uma faixa de 0,1 unidades de pH, quando armazenado após o término da fermentação por um período de pelo menos 7 dias a uma temperatura superior a 10 ⁰C.

[0046] Em uma modalidade particular da invenção, o valor de pH do produto de leite fermentado é mantido dentro de uma faixa de 0,5 unidades de pH, quando armazenado após o término da fermentação por um período de pelo menos 7 dias a uma temperatura superior a 4⁰C, preferivelmente superior a 6 ⁰C, preferivelmente superior a 8 ⁰C, preferivelmente superior a 10 ⁰C, preferivelmente superior a 12 ⁰C, preferivelmente superior a 14 ⁰C, preferivelmente superior a 16 ⁰C, preferivelmente superior a 18 ⁰C, preferivelmente superior a 20 ⁰C, preferivelmente superior a 22 ⁰C, preferivelmente superior a 24 ⁰C, preferivelmente superior a 26 ⁰C, preferivelmente superior a 28 ⁰C, e mais preferivelmente superior a 30 ⁰C.

[0047] Em uma modalidade particular da invenção, o valor de pH do produto de leite fermentado é mantido dentro de uma faixa de 0,5 unidades de pH, preferivelmente dentro de uma faixa de 0,4 unidades de pH, preferivelmente dentro de uma faixa de 0,3 unidades de pH, preferivelmente dentro de uma faixa de 0,2 unidades de pH, e mais preferivelmente dentro de uma faixa de 0,1 unidades de pH, quando armazenado após o término da fermentação por um período de pelo menos 7 dias a uma temperatura superior a 4 ⁰C, preferivelmente superior a 6 ⁰C, preferivelmente superior a 8 ⁰C, preferivelmente superior a 10 ⁰C, preferivelmente superior a 12 ⁰C, preferivelmente superior a 14⁰C, preferivelmente superior a 16 ⁰C, preferivelmente superior a 18⁰C, preferivelmente superior a 20⁰C, preferivelmente superior a 22⁰C, preferivelmente superior a 24⁰C, preferivelmente superior 26⁰C, preferivelmente superior a 28⁰C, e mais preferivelmente superior a 30⁰C.

[0048] A cepa probiótica pode ser adicionada ao processo em qualquer estágio da etapa de fermentação, incluindo (i) no início da fermentação, (ii) durante a fermentação, e (iii) no final da fermentação.

[0049] Em uma modalidade particular, a cepa probiótica é adicionada à base de leite no início da fermentação. Em uma modalidade particular alternativa, a cepa probiótica é adicionada à base de leite durante a fermentação. Em outra modalidade particular alternativa, a cepa probiótica é adicionada ao produto de leite fermentado no final da fermentação.

[0050] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa probiótica é adicionada em uma dose de inoculação de pelo menos 1,0exp06 UFC/g, preferivelmente pelo menos 1,0exp07 UFC/g, mais preferivelmente pelo menos 1,0exp08 UFC/g.

[0051] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa probiótica é uma cepa de Lactobacillus rhamnosus LGG® depositada como ATCC53103, e a cepa probiótica é adicionada em uma dose de inoculação de pelo menos 1,0exp06 UFC/g, preferivelmente de pelo menos 1,0exp07 UFC/g, mais preferivelmente de pelo menos 1,0exp08 UFC/g.

[0052] Foi surpreendentemente constatado que quanto maior a dose de inoculação da cepa probiótica, por exemplo, LGG®, observa- se uma menor pós-acidificação durante um período de armazenamento de, por exemplo, 56 dias à temperatura ambiente, por exemplo, 25 ˚C. Em particular, quando é usada uma dose de inoculação LGG® de 1,0exp08 UFC/g, a pós-acidificação é completamente evitada.

[0053] Em uma modalidade particular da invenção, a quantidade de carboidrato não lactose adicionada é de 1 mg/g a 30 mg/g, preferivelmente de 2 mg/g a 20 mg/g, e mais preferivelmente de 3 mg/g a 10 mg/g de base de leite.

[0054] Em uma modalidade particular da invenção, a quantidade de carboidrato não lactose adicionada é de 0,1 % a 10 %, preferivelmente de 0,2 % a 8 %, preferivelmente de 0,3 % a 2 %, preferivelmente de 0,4% a 1,5 %, e mais preferivelmente de 0,5 % a 1,2 %, em que a % é em (p/p) com base na base de leite.

[0055] Em uma modalidade particular, um adoçante é adicionado ao processo a fim de produzir um produto adoçado. O adoçante pode ser adicionado ao processo em qualquer estágio da etapa de fermentação, incluindo (i) no início da fermentação, (ii) durante a fermentação, e (iii) no final da fermentação.

[0056] Em uma modalidade preferida da invenção, o substrato de leite utilizado para a fermentação com a cultura iniciadora contém um adoçante. Preferivelmente, o adoçante é selecionado do grupo que consiste em um açúcar artificial; um Adoçante Natural de Alta Intensidade; e um xarope de açúcar, um purê, um suco, e um néctar obtidos de uma fonte selecionada do grupo que consiste em uma fruta, um vegetal e um grão. Preferivelmente, o xarope de açúcar é selecionado do grupo que consiste em xarope de ácer, xarope de milho, xarope de glicose, um xarope de milho rico em frutose, e xarope dourado.

[0057] Em relação à presente invenção, o termo "adoçante" significa um sacarídeo natural selecionado do grupo que consiste em frutose, glicose, sacarose e suas misturas, um açúcar artificial ou um Adoçante Natural de Alta Intensidade.

[0058] Preferivelmente, o Adoçante Natural de Alta Intensidade é um glicosídeo de esteviol, incl. stevia. Preferivelmente, o açúcar artificial é um Adoçante Artificial de Alta Intensidade selecionado do grupo que consiste em aspartame, sucralose, neotame, acessulfame de potássio, sacarina, Advantame e ciclamatos.

[0059] A maioria dos produtos de leite fermentado comerciais contém um adoçante adicionado, tal como um xarope de açúcar ou purê de frutas. A adição de adoçante juntamente com os outros ingredientes à base de leite tem a vantagem de que uma etapa adicional e separada de adição do adoçante pode ser evitada. Além disso, quando o adoçante é adicionado ao produto de leite fermentado após a etapa de fermentação, o adoçante deve ser tratado termicamente ou esterilizado e, além disso, deve ser adicionado ao produto de leite fermentado em uma etapa asséptica, que é cara e difícil de realizar. Portanto, a adição de adoçante antes da etapa de fermentação é preferida.

[0060] Em uma modalidade particular da invenção, o adoçante é sacarose. Em uma modalidade particular da invenção, a sacarose é adicionada em uma quantidade de 2 % (p/p) a 12 % (p/p), preferivelmente de 4 % (p/p) a 11 % (p/p), mais preferivelmente de 5 % (p/p) a 10 % (p/p), ainda mais preferivelmente de 6 % (p/p) a 9 % (p/p), e muitíssimo preferivelmente de 7 % (p/p) a 8 % (p/p).

[0061] Em uma modalidade preferida da invenção, a base de leite no início da etapa de fermentação tem um teor de lactose entre 30,0 mg/ml e 70 mg/ml, preferivelmente entre 35 mg/ml e 65 mg/ml, mais preferivelmente entre 40 mg/ml e 60 mg/ml, e muitíssimo preferivelmente entre 50 mg/ml e 60 mg/ml. Produto de leite fermentado

[0062] A presente invenção refere-se ainda a um produto de leite fermentado produzido pelo processo da invenção.

[0063] Em uma modalidade particular da invenção, o produto de leite fermentado é um produto que pode ser produzido usando uma cultura iniciadora de cepa de bactérias ácido-lácticas compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus deficiente em lactose.

[0064] Em uma modalidade particular da invenção, o produto de leite fermentado é selecionado do grupo que consiste em iogurte, queijo cremoso, leite azedo, creme de leite, leitelho, soro de leite fermentado, leite cultivado, Smetana (creme de leite da Europa Central), Kefir (bebida láctea ácida), iogurte líquido e Yakult. De preferência, o iogurte é selecionado do grupo que consiste em iogurte curado, iogurte mesclado e iogurte líquido.

[0065] Em uma modalidade preferida da invenção, o produto de leite fermentado contém um outro produto alimentar selecionado do grupo que consiste em bebidas de frutas, produtos de cereais, produtos de cereais fermentados, produtos de cereais quimicamente acidificados, produtos de leite de soja, produtos fermentados de leite de soja, e quaisquer suas misturas.

[0066] O produto de leite fermentado contém tipicamente proteínas em um nível de 2,0 % em peso a 3,5 % em peso. O produto de leite fermentado também pode ser um produto com baixo teor de proteínas, com o nível de proteínas entre 1,0 % em peso e 2,0 % em peso. Alternativamente, o produto de leite fermentado pode ser um produto com alto teor de proteínas, com o nível de proteínas acima de 3,5 % em peso. Uso da invenção

[0067] A presente invenção refere-se ainda ao uso em um processo para a produção de um produto de leite fermentado, que compreende as etapas de: 1) adicionar uma cultura iniciadora de bactérias ácido- lácticas, compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, a uma base de leite, 2) fermentar a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado para obter um produto de leite fermentado, e 3) adicionar uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactobacillus e uma cepa de Bifidobacterium, ao processo, de uma composição compreendendo 1) uma cultura iniciadora de bactérias ácido-lácticas compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar o carboidrato não lactose, e 2) uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em cepa de Lactobacillus e uma cepa de Bifidobacterium.

[0068] Uma modalidade particular da invenção refere-se ao uso para reduzir a pós-acidificação do produto de leite fermentado durante o armazenamento após o término da fermentação, em comparação ao uso de uma correspondente cultura iniciadora sem cepa probiótica.

[0069] Uma modalidade particular da invenção refere-se ao uso para manter o valor de pH do produto de leite fermentado dentro de uma faixa de 0,5 unidades de pH, quando armazenado após o término da fermentação por um período de pelo menos 7 dias a uma temperatura superior a 10⁰C. Definições

[0070] Em relação à presente invenção, as seguintes definições se aplicam:

[0071] A expressão "bactérias ácido-lácticas" ("LAB") designa bactérias gram-positivas, microaerofílicas ou anaeróbias, que fermentam açúcares com a produção de ácidos, incluindo ácido láctico como o ácido predominantemente produzido, ácido acético e ácido propiônico. As bactérias ácido-lácticas industrialmente mais úteis são encontradas na ordem "Lactobacillales", que inclui Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. e Propionibacterium spp. Estas são frequentemente usadas como culturas alimentares sozinhas ou em combinação com outras bactérias ácido-lácticas.

[0072] As bactérias ácido-lácticas, incluindo as bactérias da espécie Lactobacillus sp. e Lactococcus sp., são normalmente fornecidas à indústria de laticínios como culturas congeladas ou liofilizadas para propagação iniciadora em massa, ou como as chamadas culturas "Direct Vat Set" (DVS), destinadas à inoculação direta em um tanque ou cuba de fermentação para a produção de um produto lácteo, tal como um produto de leite fermentado ou um queijo. Essas culturas bacterianas de ácido láctico são geralmente referidas como "culturas iniciadoras" ou "starters". Tipicamente, uma cultura iniciadora para iogurte compreende Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, e na maioria dos países um iogurte é definido pela legislação como um produto de leite fermentado produzido usando uma cultura iniciadora que compreende as duas referidas cepas.

[0073] A expressão "cultura iniciadora" inclui uma cultura iniciadora na forma de uma mistura de todas as três cepas da composição, isto é, a cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose, a cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose, e a cepa probiótica, bem como uma cultura iniciadora compreendendo uma mistura das duas cepas de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, em que a cepa probiótica está em uma forma separada, permitindo a adição da cepa probiótica ao processo separadamente da adição das referidas duas outras cepas.

[0074] O termo "leite" deve ser entendido como a secreção láctea obtida pela ordenha de qualquer mamífero, como vacas, ovelhas, cabras, búfalos ou camelos. Em uma modalidade preferida, o leite é leite de vaca. O termo leite também inclui proteína/soluções de gordura feitas de materiais vegetais, por exemplo, leite de soja.

[0075] O termo "base de leite" pode ser qualquer material de leite cru e/ou processado que possa ser submetido à fermentação de acordo com o método da invenção. Assim, as bases de leite úteis incluem, mas não estão limitadas a, soluções/-suspensões de qualquer leite ou produtos semelhantes ao leite compreendendo proteínas, tais como leite integral ou com baixo teor de gordura, leite desnatado, leitelho, leite em pó reconstituído, leite condensado, leite em pó, soro de leite, permeado de soro de leite, lactose, líquido-mãe da cristalização de lactose, concentrado de proteína de soro de leite, ou creme. Naturalmente, a base de leite pode ser originária de qualquer mamífero, por exemplo, ser de leite de mamífero substancialmente puro ou leite em pó reconstituído.

[0076] Antes da fermentação, a base de leite pode ser homogeneizada e pasteurizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[0077] "Homogeneização", conforme aqui utilizada, significa mistura intensiva para obter uma suspensão ou emulsão solúvel. Se a homogeneização for realizada antes da fermentação, ela pode ser realizada de forma a quebrar a gordura do leite em tamanhos menores, de modo que não se separe mais do leite. Isso pode ser realizado forçando o leite em alta pressão através de pequenos orifícios.

[0078] "Pasteurização", tal como aqui utilizada, significa o tratamento da base de leite para reduzir ou eliminar a presença de organismos vivos, tais como microrganismos. Preferivelmente, a pasteurização é obtida mantendo uma temperatura especificada por um período de tempo determinado. A temperatura especificada é geralmente atingida por aquecimento. A temperatura e a duração podem ser selecionadas para matar ou inativar certas bactérias, tais como bactérias nocivas. Uma etapa de resfriamento rápido pode ocorrer.

[0079] "Fermentação", nos métodos da presente invenção, significa a conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos através da ação de um microrganismo. Preferivelmente, a fermentação nos métodos da invenção compreende a conversão de lactose em ácido láctico.

[0080] Os processos de fermentação a serem usados na produção de produtos lácteos são bem conhecidos e a pessoa versada na técnica saberá como selecionar as condições de processo adequadas, tais como temperatura, oxigênio, quantidade e características do(s) microrganismo(s) e tempo de processamento. Naturalmente, as condições de fermentação são selecionadas de modo a apoiar a realização da presente invenção, isto é, para obter um produto lácteo na forma sólida (tal como um queijo) ou líquida (tal como um produto de leite fermentado).

[0081] A expressão "produto de leite fermentado" significa um alimento ou produto alimentar em que a preparação do alimento ou produto alimentar envolve a fermentação de uma base de leite com uma bactéria ácido-láctica. "Produto de leite fermentado", conforme usado aqui, inclui, porém não está limitado a produtos, tais como produtos de leite fermentado termofílicos, por exemplo, iogurte, produtos de leite fermentado mesófilos, por exemplo, creme de leite e leitelho, bem como soro de leite fermentado.

[0082] O termo "termófilo" aqui se refere a microrganismos que se desenvolvem melhor em temperaturas acima de 35°C. As bactérias termofílicas industrialmente mais úteis incluem Streptococcus spp. e Lactobacillus spp. O termo "fermentação termofílica" aqui se refere à fermentação a uma temperatura acima de cerca de 35°C, tal como entre cerca de 35°C a cerca de 45°C. O termo "produto de leite fermentado termofílico" refere-se a produtos lácteos fermentados preparados por fermentação termofílica de uma cultura iniciadora termofílica e inclui tais produtos de leite fermentado como iogurte curado, iogurte mesclado e iogurte líquido, por exemplo, Yakult.

[0083] O termo "mesófilo" aqui se refere a microrganismos que se desenvolvem melhor em temperaturas moderadas (15°C-35°C). As bactérias mesófilas industrialmente mais úteis incluem Lactococcus spp. e Leuconostoc spp. O termo "fermentação mesofílica" aqui se refere à fermentação a uma temperatura entre cerca de 22°C e cerca de 35°C. O termo "produto de leite fermentado mesofílico" refere-se a produtos de leite fermentado preparados por fermentação mesofílica de uma cultura iniciadora mesofílica e inclui tais produtos de leite fermentados como leitelho, leite azedo, leite cultivado, Smetana, creme de leite, creme espesso, creme de leite cultivado, ymer, soro de leite fermentado, Kefir, Yakult e queijos frescos, tais como Quark, tvarog e queijo cremoso.

[0084] O termo "carboidrato não lactose" significa qualquer carboidrato que não seja a lactose, e que uma bactéria ácido-láctica deficiente em lactose usada no processo da invenção seja capaz de metabolizar.

[0085] O termo "depleção", em relação ao carboidrato não lactose, significa que a concentração de carboidrato não lactose é zero ou tão baixa que a cultura iniciadora não é mais capaz de crescer.

[0086] A expressão "no início da etapa de fermentação" significa um pouco antes, ao mesmo tempo, ou um pouco após a adição da cultura iniciadora à base de leite. Aqui, o termo "um pouco" significa menos de 30 minutos.

[0087] A expressão "durante a etapa de fermentação" significa em qualquer momento durante a fermentação, após o início, e antes do final da fermentação.

[0088] A expressão "no final da etapa de fermentação" significa um pouco antes, ao mesmo tempo, ou um pouco após o pH alvo ser alcançado. Aqui, o termo "um pouco" significa menos de 30 minutos.

[0089] O termo "pH alvo" significa o pH no qual a etapa de fermentação termina. Dependendo de vários parâmetros do processo, a etapa de fermentação é encerrada por um método selecionado do grupo que consiste em 1) acidificação do leite fermentado, tornando pelo menos uma cepa da cultura iniciadora incapaz de crescer, 2) tratamento de resfriamento, e 3) depleção do carboidrato não lactose.

[0090] No presente contexto, o termo "cepa mutante" deve ser entendido como cepas derivadas, ou cepas que podem ser derivadas, de uma cepa (ou sua cepa mãe) da invenção por meio de, por exemplo, engenharia genética, radiação e/ou tratamento químico. As "cepas derivadas" também podem ser mutantes ocorrendo espontaneamente. É preferível que as "cepas derivadas" sejam mutantes funcionalmente equivalentes, por exemplo, mutantes que têm substancialmente as mesmas propriedades ou propriedades melhoradas como sua cepa mãe. Especialmente, o termo "cepas mutantes" se refere a cepas obtidas submetendo uma cepa da invenção a qualquer tratamento de mutagenização convencionalmente usado, incluindo o tratamento com um agente mutagênico químico, tal como etano metano sulfonato (EMS) ou N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV, ou com um mutante de ocorrência espontânea. Um mutante pode ter sido submetido a vários tratamentos de mutagenização (um único tratamento deve ser entendido como uma etapa de mutagenização seguida por uma etapa de rastreamento/seleção), mas atualmente é preferido que não mais do que 20, ou não mais do que 10, ou não mais do que 5 tratamentos (ou etapas de rastreamento/seleção) sejam realizados. Em um mutante atualmente preferido, menos de 1 %, menos de 0,1 %, menos de 0,01%, menos de 0,001 %, ou mesmo menos de 0,0001 % dos nucleotídeos no genoma bacteriano foram substituídos por outro nucleotídeo, ou deletados, em comparação à cepa mãe.

DEPÓSITOS E SOLUÇÃO ESPECIALIZADA

[0091] O Requerente solicita que uma amostra do microrganismo depositado seja disponibilizada apenas a um especialista por ele aprovado.

[0092] Cepa de Streptococcus thermophilus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28952.

[0093] Cepa de Streptococcus thermophilus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28953.

[0094] Cepa de Streptococcus thermophilus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32599.

[0095] Cepa de Streptococcus thermophilus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32600.

[0096] Cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28910;

[0097] Cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg. 1b, D-38124 Braunschweig, em 30/09/2003 sob o número de acesso DSM 15954;

[0098] Os depósitos foram feitos de acordo com o tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para fins de procedimento de patente.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Pós-acidificação de iogurte em temperatura elevada usando culturas deficientes em lactose e positivas para lactose em combinação com probióticos

[0099] O objetivo deste experimento é comparar o efeito que a adição das culturas probióticas LGG e BB-12 tem em relação à pós- acidificação durante o armazenamento de longo prazo à temperatura ambiente para uma cultura deficiente em lactose da invenção e uma cultura positiva para lactose comparativa. Culturas iniciadoras

[0100] Acidifix: Cultura deficiente em lactose, contendo cepas de Streptococcus thermophilus deficientes em lactose e cepas de

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficientes em lactose. Cepa comercial YoFlex Acidifix 1.0 da Chr. Hansen A/S.

[0101] Premium: Cultura comercial positiva para lactose contendo cepas de Streptococcus thermophilus deficientes em lactose e cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus positivas para lactose. Cepa comercial YoFlex Premium 1.0 da Chr. Hansen A/S. Culturas probióticas

[0102] LGG: cepa de Lactobacillus rhamnosus LGG® depositada como ATCC53103

[0103] BB-12: Cepas de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB- 12 depositada como DSM 15954. Composições da cultura Tabela 1 Sacarose (%) Acidifix Ref, 0,75 % Acidifix Ref, com sacarose antes 7,00 % Acidifix Ref, com sacarose após 7,00 % Acidifix LGG 0,75 % Acidifix LGG com sacarose antes 7,00 % Acidifix LGG com sacarose após 7,00 % Acidifx BB-12 0,75 % Acidifix BB-12 sacarose antes 7,00 % Acidifix BB-12 sacarose após 7,00 % Premium Ref, 0% Premium Ref, com sacarose antes 7,00 % Premium Ref, com sacarose após 7,00 % Premium LGG 0% Premium LGG com sacarose antes 7,00 % Premium LGG com sacarose após 7,00 % Bases de leite Tabela 2: Composição das bases de leite

Quantidade Proteína Carboidrato Gordura 3,5 % leite 2550,0 g 3,8 % 4,7 % 3,5 % Água 450 g 0,0 % 0,0 % 0,0 % Sacarose 225 g 0,0 % 100,0 % 0,0 % Base de Leite 7% 3225 g 3,00 % 10,70 % 2,75 % sacarose antes 3,5 % leite 2650 g 3,8 % 4,7 % 3,5 % Água 380 g 0,0 % 0,0 % 0,0 % Sacarose * 22,9 g 0,0 % 100,0 % 0,0 % Base de Leite 7% 3053 g 3,30 % 4,84 % 3,02 % sacarose após (0,75% sacarose adicionada antes) 3,5 % leite 2650 g 3,8 % 4,7 % 3,5 % Água 400 g 0,0 % 0,0 % 0,0 % Sacarose * 0g 0,0 % 100,0 % 0,0 % Base de Leite para 3050 g 3,30 % 4,09 % 3,02 % Premium (sem sacarose) *100 g de solução de sacarose (66 %) são adicionados por 1 L de leite fermentado. Procedimento

[0104] A fermentação do leite foi realizada em tanques fermentadores de 3 L a uma temperatura de 43⁰C até atingir um pH final de 4,55 para a produção de iogurte. O iogurte foi então resfriado em uma Unidade de Pós-Tratamento (UPT) a 25⁰C e 2 bar, e transferido para copos de 100 ml, que são armazenados a 25⁰C. Para cada iogurte com 0,75% de sacarose adicionados antes da fermentação, foram armazenadas as amostras sem açúcar adicionado após a fermentação e as amostras com açúcar adicionado após a fermentação (para atingir um total de 7% de sacarose). Medições

[0105] Foram medidos os tempos para atingir o pH final, a pós- acidificação e as contagens de células para cepas probióticas. Resultados Tempo para atingir o pH final Tabela 3 Sacarose pH no final Tempo Redução de tempo em base da para o pH (horas (h) e minutos de leite fermenta- final (min.)) (%) ção Acidifix Ref. 0,75 % 4,55 6 h 30 min. Acidifix Ref. com 7,00 % 4,55 4 h 50 min. 1 h 40 min. em sacarose antes comparação com baixo teor de sacarose Acidifix LGG 0,75 % 4,55 5 h 30 min. 1 h em comparação com nenhum LGG Acidifix LGG com 7,00 % 4,55 4 h 30 min. 20 min. em sacarose antes comparação com nenhum LGG. 1 h em comparação com baixo teor de sacarose Acidifx BB-12 0,75 % 4,54 6 h 00 min. 30 min. em comparação com nenhum BB-12 Acidifix BB-12 7,00 % 4,55 4 h 30 min. 20 min. em sacarose antes comparação com nenhum BB-12. 1 h 30 min. em comparação com baixo teor de sacarose Premium Ref. 0% 4,54 5 h 30 min. Premium Ref. 7,00 % 4,53 5 h 00 min. 30 min. em com sacarose comparação com antes nenhuma sacarose Premium LGG 0% 4,55 5 h 15 min. 15 min. em comparação com nenhum LGG Premium LGG 7,00 % 4,55 4 h 45 min. 15 min. em com sacarose comparação com antes nenhum LGG. 30 min. em comparação com nenhuma sacarose

[0106] A partir da Tabela 3, observa-se o seguinte: Quanto ao Acidifix (baixo teor de sacarose) LGG e BB-12, reduzem o tempo de fermentação em 1 h e 30 min., respectivamente. Quanto ao Acidifix (7 % de sacarose) LGG e BB-12, ambos reduzem o tempo de fermentação em 20 min. Quanto ao Premium (sem sacarose) LGG reduz o tempo de fermentação em 15 min. Quanto ao Premium (sacarose 7%) LGG reduz o tempo de fermentação em 15 min.

[0107] Em conclusão, quanto à cultura Acidifix, LGG reduz o tempo de fermentação significativamente mais do que o LGG reduz o tempo de fermentação da cultura Premium. Pós-acidificação Tabela 4 Sacarose (%) pH Dia 7, 25 ⁰C Acidifix Ref. 0,75 % 4,37 Acidifix Ref. com sacarose antes 7,00 % 4,34 Acidifix Ref. com sacarose após 7,00 % 4,34 Acidifix LGG 0,75 % 4,27 Acidifix LGG com sacarose antes 7,00 % 4,16 Acidifix LGG com sacarose após 7,00 % 4,20 Acidifx BB-12 0,75 % 4,38 Acidifix BB-12 sacarose antes 7,00 % 4,35 Acidifix BB-12 sacarose após 7,00 % 4,36 Premium Ref. 0% 4,29 Premium Ref. com sacarose antes 7,00 % 4,19 Premium Ref. com sacarose após 7,00 % 4,26 Premium LGG 0% 4,00 Premium LGG com sacarose antes 7,00 % 3,96 Premium LGG com sacarose após 7,00 % 3,99

Tabela 5 Diferença de pH no Dia 7, entre 25⁰C Acidifix Premium Cultura Ref. e Cultura com sacarose antes 0,03 0,10 Cultura Ref. e Cultura com sacarose após 0,03 0,03 Cultura Ref. e Cultura LGG 0,10 0,29 Cultura Ref. e Cultura BB-12 +0,01 ND Cultura Ref. sacarose antes e Cultura LGG 0,18 0,23 sacarose antes Cultura Ref. sacarose após e Cultura LGG 0,14 0,27 sacarose após Cultura Ref. sacarose antes e Cultura BB-12 +0,01 ND sacarose antes Cultura Ref. sacarose após e Cultura BB-12 +0,02 ND sacarose após

[0108] Como observa-se na Tabela 5, o efeito da adição de LGG na pós-acidificação é significativamente menor para a cultura Acidifix do que para a cultura Premium no Dia 7, a 25⁰C. Além disso, quanto à combinação de cultura Acidifix e BB-12, a adição de BB-12 não tem nenhum efeito na pós-acidificação.

[0109] Além disso, quanto à combinação de cultura Acidifix e LGG, o efeito da adição de sacarose antes da fermentação é apenas marginalmente maior do que ao adicionar sacarose após a fermentação, e o efeito é menor do que em relação à combinação de cultura Premium e LGG. Isso mostra que, ao usar uma combinação da cultura Acidifix e LGG, realmente é possível adicionar sacarose em uma quantidade altamente excessiva antes da fermentação e ainda manter um nível baixo aceitável de pós-acidificação durante o armazenamento. O mesmo é verdadeiro para a combinação de cultura Acidifix e BB-12. Contagens de células probióticas

Tabela 6 LGG (UFC/ml) BB-12 (UFC/ml) Acidifix LGG 2,5E08 Acidifix LGG com sacarose antes 2,7E08 Acidifix LGG com sacarose após 1,8E08 Acidifx BB-12 1,6E07 Acidifix BB-12 sacarose antes 1,8E07 Acidifix BB-12 sacarose após 1,3E07 Premium LGG 3,6E08 Premium LGG com sacarose antes 3,3E08 Premium LGG com sacarose após 1,9E08 EXEMPLO 2 Pós-acidificação de iogurte usando culturas deficientes em lactose e positivas para lactose em combinação com probióticos

[0110] O objetivo deste experimento é comparar o efeito que a adição da cultura probiótica LGG tem em relação à pós-acidificação durante o armazenamento de longo prazo em temperaturas refrigerada e ambiente para uma cultura deficiente em lactose da invenção e uma cultura positiva para lactose comparativa. Base de leite Tabela 7: Composição da base de leite Quanti Proteín Carboidrat Gordur Sacarose dade a o a 3,5 % leite 3500 g 3,4 % 4,7 % 3,5 % Água 200 g 0,0 % 0,0 % 0,0 % Sacarose 278 g 0,0 % 100,0 % 0,0 % Base de Leite 7 % 3978 g 2,99 % 11,12 % 3,08 % 6,99 % sacarose

Culturas iniciadoras

[0111] Acidifix: Cultura deficiente em lactose contendo cepas de Streptococcus thermophilus deficientes em lactose e cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus deficientes em lactose. Cepa comercial YoFlex Acidifix 1.0 da Chr. Hansen A/S.

[0112] Premium: cultura comercial positiva para lactose contendo cepas de Streptococcus thermophilus deficientes em lactose e cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Cepa comercial YoFlex Premium 1.0 da Chr. Hansen A/S. Culturas probióticas

[0113] LGG: cepa de Lactobacillus rhamnosus LGG® depositada como ATCC53103 Composições da cultura Tabela 8 Acidifix Premium Acidifix + LGG Premium + LGG Procedimento

[0114] A fermentação do leite foi realizada em tanques fermentadores de 3 L a uma temperatura de 43 ⁰C até atingir um pH final de 4,55 para a produção de iogurte. O iogurte foi, em seguida, resfriado em uma Unidade de Pós-Tratamento (UPT) a 4 ⁰C e 2 bar, e transferido para copos de 120 ml, que são armazenados a 4 ⁰C e 25 ⁰C. Medições

[0115] Foram medidas a pós-acidificação e as contagens de células para cepas probióticas. Resultados Pós-acidificação

Tabela 9 pH Dia 14, 4 ⁰C pH Dia 14, 21⁰C Acidifix 4,52 4,15 Premium 4,36 4,02 Acidifix + LGG 4,49 4,15 Premium + LGG 4,08 3,97 Tabela 10 Diferença no pH pH Dia 14, 4⁰C pH Dia 14, 21⁰C entre Acidifix e Acidifix 0,03 0,00 +LGG Premium e 0,28 0,05 Premium + LGG

[0116] Como aparecerá na Tabela 10, o efeito da adição de LGG na pós-acidificação é significativamente menor para a cultura Acidifix do que para a cultura Premium a 4⁰C e 21⁰C. Contagens de células probióticas LGG (UFC/g) LGG (UFC/g) Dia 14, 4⁰C Dia 14, 21⁰C Acidifix + LGG 2,3E07 2,6E08 Premium + LGG 2,7E07 2,7E08 EXEMPLO 3 Pós-acidificação de iogurte em temperatura elevada usando culturas deficientes em lactose em combinação com probióticos em diferentes doses de inoculação

[0117] O objetivo deste experimento é comparar o efeito que a adição de diferentes doses de inoculação da cultura de probióticos LGG tem em relação à pós-acidificação durante o armazenamento de longo prazo à temperatura ambiente para uma cultura deficiente em lactose da invenção. Tabela 12: Composição da base de leite Quantidade Proteína Carboi- Gordura Sacarose (g) (%) drato (%) (%) 3,4 % leite 11910 3,0 4,6 3,4 % Água 0,0 0,0 0,0 0,0 Sacarose 90 0,0 100 0,0 Base de Leite 12000 2,98 4,56 3,37 0,75 % 0,75 % sacarose Culturas iniciadoras

[0118] Acidifix: Cultura deficiente em lactose contendo cepas de Streptococcus thermophilus deficientes em lactose e cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus deficientes em lactose. Cepa comercial YoFlex Acidifix 1.0 da Chr. Hansen A/S. Culturas probióticas

[0119] LGG: cepa de Lactobacillus rhamnosus LGG® depositada como ATCC53103 Composições da cultura Tabela 13 Acidifix Acidifix + LGG (10exp06 UFC/g) Acidifix + LGG (10exp07 UFC/g) Acidifix + LGG (10exp08 UFC/g) Procedimento

[0120] A fermentação do leite foi realizada em garrafas de tampa azul SCHOTT de 1 L a uma temperatura de 43 ⁰C. Quando a sacarose na amostra com Acidifix e sem LGG foi usada progressivamente (pH 4,39), a fermentação de todas as amostras foi interrompida. As garrafas foram agitadas para quebrar o coágulo e depois armazenadas a 4 ⁰C para resfriar. No dia seguinte, as amostras de iogurte foram transferidas assepticamente para copos de 120 ml, que foram armazenados a 25 ⁰C por 56 dias. Medições

[0121] Foram medidas a pós-acidificação e as contagens de células para cepas probióticas. Resultados Pós-acidificação Tabela 14 pH Acidifix Acidifix + Acidifix + Acidifix +

LGG LGG LGG (10exp06 (10exp07 (10exp08 UFC/g) UFC/g) UFC/g) 1 Dia 4,39 4,39 4,38 4,34 7 Dias 4,41 4,16 4,19 4,32 14 Dias 4,41 4,17 4,20 4,43 21 Dias 4,42 4,19 4,22 4,43 28 Dias 4,43 4,20 4,26 4,44 35 Dias 4,44 4,23 4,27 4,47 42 Dias 4,41 4,21 4,25 4,42 49 Dias 4,41 4,19 4,26 4,39 56 Dias 4,43 4,20 4,27 4,35 Contagens de células probióticas Tabela 15 Contagem de Acidifix Acidifix + Acidifix + Acidifix + células LGG LGG LGG LGG (UFC/g) (10exp06 (10exp07 (10exp08 UFC/g) UFC/g) UFC/g) 0 Dia 0,00E00 1,00E06 8,30E06 9,70E07 1 Dia 0,00E00 1,60E06 1,35E07 1,39E08 7 Dias 0,00E00 4,29E08 3,44E08 4,30E08

14 Dias 0,00E00 5,70E08 5,05E08 8,75E08 21 Dias 0,00E00 5,70E08 6,15E08 5,55E08 28 Dias 0,00E00 4,45E08 4,35E08 3,80E08 35 Dias 0,00E00 6,20E07 1,29E08 1,78E08 42 Dias 0,00E00 5,85E07 1,04E08 1,68E08 49 Dias 0,00E00 6,05E07 1,72E08 2,11E08 56 Dias 0,00E00 7,75E07 1,69E08 1,70E08

[0122] Como observa-se na Tabela 15, o nível da cultura LGG é mantido em um nível alto durante o período de armazenamento completo de 56 dias a 25˚C. Além disso, como será observado na Tabela 14, quanto maior a dose de inoculação de LGG, menor pós- acidificação durante o período de armazenamento de 56 dias é observada. Em particular, quando uma dose de inoculação de LGG de 1,0exp08 UFC/g é usada, a pós-acidificação é completamente evitada.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição para a produção de um produto de leite fermentado, caracterizada pelo fato de que compreende: 1) uma cultura iniciadora de bactérias ácido-lácticas compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar o carboidrato não lactose, e 2) uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em cepa de Lactobacillus e uma cepa de Bifidobacterium.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o carboidrato não lactose é selecionado do grupo que consiste em sacarose, galactose e glicose.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose é selecionada do grupo que consiste em: (a) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28952; (ii) uma cepa derivada de DSM 28952, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (b) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28953; (ii) uma cepa derivada de DSM 28953, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (c) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32599; (ii) uma cepa derivada de DSM 32599, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; e (d) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32600; e (ii) uma cepa derivada de DSM 32600, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus deficiente em lactose é selecionada do grupo que consiste em: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28910; e (ii) uma cepa derivada de DSM 28910, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa probiótica de Lactobacillus é selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactobacillus rhamnosus e uma cepa de Lactobacillus paracasei.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a cepa probiótica de Lactobacillus é selecionada do grupo que consiste na cepa de Lactobacillus rhamnosus LGG® depositada como ATCC53103 e cepa de Lactobacillus paracasei

CRL 431 depositada como ATCC 55544, e Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 depositada como DSM15954.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a cepa probiótica é a cepa de Lactobacillus rhamnosus LGG® depositada como ATCC53103.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa probiótica de Bifidobacterium é selecionada do grupo que consiste em Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium pseudocatenulatum e Bifidobacterium infantis.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a cepa probiótica de Bifidobacterium é Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 depositado como DSM15954.

10. Processo para a produção de um produto de leite fermentado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: 1) adicionar uma cultura iniciadora de bactérias ácido- lácticas compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar o carboidrato não lactose, a uma base de leite, 2) fermentar a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado para obter um produto de leite fermentado, e 3) adicionar uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactobacillus e uma cepa de Bifidobacterium,

ao processo.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a cepa probiótica é adicionada à base de leite no início da fermentação.

12. Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o carboidrato não lactose é selecionado do grupo que consiste em sacarose, galactose e glicose.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o carboidrato não lactose é adicionado à base de leite no início da etapa de fermentação.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o carboidrato não lactose é adicionado à base de leite em uma quantidade medida de modo a se tornar exaurido no pH alvo e, portanto, resulta na interrupção do crescimento das bactérias ácido-lácticas e na interrupção da fermentação.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que a cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose é selecionada do grupo que consiste em: (a) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28952; (ii) uma cepa derivada de DSM 28952, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (b) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28953; (ii) uma cepa derivada de DSM 28953, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (c) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32599; (ii) uma cepa derivada de DSM 32599, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; e (d) (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 22/08/2017 sob o número de acesso DSM 32600; e (ii) uma cepa derivada de DSM 32600, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que a cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus deficiente em lactose é selecionada do grupo que consiste em: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sam-mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12/06/2014 sob o número de acesso DSM 28910; e (ii) uma cepa derivada de DSM 28910, em que a cepa derivada é ainda definida como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a cepa probiótica é adicionada em uma dose de inoculação de pelo menos 1,0exp06 UFC/g, preferivelmente de pelo menos 1,0exp07 UFC/g, mais preferivelmente de pelo menos 1,0exp08 UFC/g.

18. Produto de leite fermentado, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 17.

19. Uso em um processo para a produção de um produto de leite fermentado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: 1) adicionar uma cultura iniciadora de bactérias ácido- lácticas, compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose que é capaz de metabolizar o carboidrato não lactose, a uma base de leite, 2) fermentar a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado para obter um produto de leite fermentado, e 3) adicionar uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactobacillus e uma cepa de Bifidobacterium, ao processo, de uma composição compreendendo 4) uma cultura iniciadora de bactérias ácido-lácticas compreendendo pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar o carboidrato não lactose, e 5) uma cepa probiótica, selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactobacillus e uma cepa de Bifidobacterium.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é para reduzir a pós-acidificação do produto de leite fermentado durante o armazenamento, após o término da fermentação, em comparação ao uso de uma correspondente cultura iniciadora sem cepa probiótica.