KR101773994B1 - 엑소다당류의 과발현에 의하여 식품을 조직화하기 위하여 갈락토키나아제 발현을 변형시킨 젖산균 - Google Patents

엑소다당류의 과발현에 의하여 식품을 조직화하기 위하여 갈락토키나아제 발현을 변형시킨 젖산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조직화 (texturizing) 성질이 있는 세균의 세포, 이 세포를 포함하는 스타터 배지 및 상기 스타터 배지에 의하여 발효시킨 유제품에 관한 것이다.

Description

엑소다당류의 과발현에 의하여 식품을 조직화하기 위하여 갈락토키나아제 발현을 변형시킨 젖산균 {LACTIC BACTERIUM WITH MODIFIED GALACTOKINASE EXPRESSION FOR TEXTURIZING FOOD PRODUCTS BY OVEREXPRESSION OF EXOPOLYSACCHARIDE}
본 발명은 조직화 성질을 가지는 균 세포, 이 세포를 포함하는 스타터 컬쳐 (starter culture) 및 이 스타터 컬쳐로 발효시킨 유제품에 관한 것이다.
식품 산업에서는 식품의 맛 및 조직감 (texture)의 개선 뿐 아니라 이들 식품의 유통 기한을 연장시키기 위하여 다수의 균, 특히 젖산균이 이용된다. 유업계의 경우, 젖산균은 우유의 산성화 (발효에 의한 것)를 유발시킬 뿐 아니라 그 젖산균이 들어있는 제품을 조직화하는 데 집중적으로 이용된다.
식품 산업에서 이용되는 젖산균 중에서, 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 락토코쿠스 (Lactococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 페디오코쿠스 (Pediococcus) 및 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속을 들 수 있다. 스트렙토코쿠스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 종의 젖산균은 식품, 특히 발효 제품의 생산에 단독으로 또는 다른 균과의 조합 형태로 널리 이용된다. 이들은 발효유, 예컨대 요거트의 제조용으로 사용되는 발효체 제제에 특히 이용된다. 이들 중 어떠한 것들은 발효 제품의 조직화 전개에 지배적 역할을 한다. 이러한 특성은 다당류의 생성과 밀접하게 관련되어 있다. 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주 중에서, 조직화 균주와 비조직화 균주를 구별하는 것이 가능하다.
산업상의 요건을 충족시키기 위하여, 젖산균, 특히 스트렙토코쿠스 써모필러스의 신규한 조직화 균주를 제안할 필요가 생기게 되었다.
WO2007095958A1는 조직화 성질을 가지는 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 기재하고 있다. 도 1에서는, 조직화 성질이 가장 우수한 균주인 CHCC8833 (DSM17876)는 전단 응력 값이 약 59 Pa임을 알 수 있다.
문헌 [J Dairy Sci. 92 : 477-482 (2009)]은 GalK 활성을 증대시킴으로써 유전자 조작을 통하여 로피 (ropy) 스트렙토코쿠스 써모필러스에 의한 EPS의 생성을 증가시키는 것이 가능하다는 것을 보여주는 연구를 기재하고 있다. 결론적으로, 요거트 제조에 있어서 그러한 균주를 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus)와 함께 조합하여 사용할 경우, 재조합 균주의 EPS 과생성은 유의하지 않다.
그러므로, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 식품, 특히 조직화 젖산균 균주 (예컨대, 스트렙토코쿠스 써모필러스)가 락토바실러스 종의 균주와 함께 사용되는 식품을 조직화하는 데 양호한 성질을 가지는 젖산균 균주를 제공하려는 것이다.
발명의 요약
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 GalK (갈락토키나아제) 유전자에 돌연 변이를 일으킨 젖산균이 특히 락토바실러스 균과 함께 우유를 발효시키는 데 사용되는 경우, 야생형 균주 (모균주)에 비하여 발효유의 점도를 높인다는 사실을 발견하게 되었다.
이러한 놀라운 발견에 따라, 본 발명은 GalK 유전자에 돌연 변이가 일어난 신규한 초조직화 (supertexturizing) 젖산균 균주, 예컨대 S. 써모필러스 균주와 이들 균주를 제조하는 방법 및 이들 균주를 이용하여 제조된 발효유 제품에 관한 것이다.
상세한 설명
제1 관점에 있어서, 본 발명은 젖산균 [모균주에 비하여 발효유 중에 더 높은 점도를 발생시키는 균 또는 예컨대 발효유 중에 약 70 Pa 초과의 점도 (예컨대, 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력 측정치가 71 Pa 초과 또는 73 Pa 초과)를 발생시키는 균]을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
a) 젖산균 균주 (모균주)를 제공하는 단계와,
b) 상기 균주의 GalK 유전자에 돌연 변이를 도입하는 단계
를 포함한다.
그러므로, 제1 관점의 실시 상태들은 다음과 같다.
- 모균주에 비하여 발효유 중에 더 높은 점도를 발생시키는 젖산균 (예컨대, 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력으로서 측정)을 제조하는 방법으로서, 이 방법은
a) 젖산균 균주 (모균주)를 제공하는 단계와,
b) 상기 균주의 GalK 유전자에 돌연 변이를 도입하는 단계
를 포함한다.
- 발효유 중에 약 70 Pa 초과의 점도를 발생시키는 젖산균 (예컨대, 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력 측정 값이 71 Pa 초과 또는 73 Pa 초과)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
a) 젖산균 균주 (모균주)를 제공하는 단계와,
b) 상기 균주의 GalK 유전자에 돌연 변이를 도입하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 점도는 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력의 측정 및/또는 이하 설명하는 실험으로 측정된다. 그러므로, 본 발명의 제1 관점의 양호한 실시 상태는 발효유 중에 약 70 Pa를 초과하는 점도 (37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력으로서 측정)를 발생시키는 젖산균을 제조하는 방법으로서, 이 방법은
a) 젖산균 균주 (모균주)를 제공하는 단계와,
b) 상기 균주의 GalK 유전자에 돌연 변이를 도입하는 단계
를 포함한다.
상기 본 발명의 방법은,
c1) 조직감을 생성하는 돌연 변이체 균주, 예컨대 모균주보다 더 많은 조직감을 생성하거나, 또는 우유 기질의 점도를 증대시키는 균주를 스크리닝하는 단계와,
c2) Gal+ 표현형을 가지는 돌연 변이체 균주, 예컨대 모균주에 비하여 갈락토오스 분해 활성/발효 활성이 증가된 균주를 스크리닝하는 단계
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 추가 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 돌연 변이는 상기 유전자의 프로모터 영역, 예컨대 상기 유전자의 -10 영역 (프리브노 박스)에 도입될 수 있다.
본 발명의 방법의 한 가지 흥미로운 실시 상태에 있어서, 이 돌연 변이 결과로 야생형의 -10 영역 (TACGAT)의 C 및 G 중 1개 또는 2개가 모두 A 및 T로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드로 교체되게 된다.
상기 돌연 변이 결과로 야생형의 -10 영역 (TACGAT)의 C는 A 및 T로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드로 교체될 수도 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 돌연 변이 결과로 야생형의 -10 영역 (TACGAT)의 C는 T로 교체되고 및/또는 상기 돌연 변이 결과로 -10 영역은 뉴클레오티드 서열 TATGAT, TATTAT 또는 TACTAT를 갖게 된다.
상기 돌연 변이는 유전 공학 기술의 사용 및/또는 돌연 변이 생성 기술 (mutagenesis)의 사용, 예컨대 방사선 조사 또는 화학 물질 처리에 의하여 도입되어도 좋고, 필요에 따라 GalK 유전자의 돌연 변이를 확인하기 위한 GalK 유전자 분석이 수반될 수 있다.
상기 균 (모균주)은 스트렙토코쿠스, 락토코쿠스, 락토바실러스, 류코노스톡, 페디오코쿠스 및 비피도박테리움으로 이루어지는 군에 속하는 속으로부터 선택될 수 있다. 흥미로운 균은 스트렙토코쿠스 써모필러스 종에 속한다.
또 하나의 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 얻을 수 있는 젖산균에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력으로서 측정되는 발효유 중에 약 70 Pa 초과의 점도 (예컨대, 71 Pa 초과 또는 73 Pa 초과)를 발생시키는 젖산균; GalK 유전자의 -10 영역 (야생형 -10 영역 (TACGAT)과 비교)에 돌연 변이가 일어나는데, 여기서 상기 돌연 변이 결과로 뉴클레오티드 서열 TATGAT, TATTAT 또는 TACTAT를 가진 -10 영역을 형성하는 젖산균; GalK 유전자의 -10 영역에 돌연 변이를 일으키는데, 상기 돌연 변이 결과로 야생형 -10 영역 (TACGAT)의 C는 A 및 T로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드로 교체된 것인 젖산균에 관한 것이다. 흥미로운 실시 상태에 있어서, 상기 돌연 변이 결과로 야생형 -10 영역 (TACGAT)의 C는 T로 교체되게 된다.
흥미로운 실시 상태에 있어서, 본 발명의 젖산균은 SEQ ID NO: 5 또는 그의 프로모터 영역, 예컨대 -35 영역 및 -10 영역을 포함한다. 상기 젖산균은 스트렙토코쿠스 써모필러스 종에 속하는 것이 좋다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명은 CHCC11379 (DSM 22884), CHCC11342, CHCC11976과 이들 중 임의의 것의 돌연 변이체 (mutant) 및 변이체 (variant)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트렙토코쿠스 써모필러스 종에 속하는 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 명세서에서 언급되는 모든 신규한 균주들과 그들의 돌연 변이체 및 변이체들에 관한 것이다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 젖산균, 예컨대 CHCC11379 균주에 속하는 균을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 상기 균을 lOexplO CFU (cell forming units; 세포 형성 단위) 이상 함유하는 것이 좋다.
상기 조성물은 혼합물 또는 키트-오브-파츠 (kit-of-parts)로서,
- 락토바실러스 종에 속하는 균주, 예컨대 L. 불가리쿠스 또는 L. 페르멘툼 (L. fermentum) 균주와,
- 본 발명의 젖산균 균주, 예컨대 스트렙토코쿠스 써모필러스 종에 속하는 균주
를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 락토바실러스 종에 속하는 균주는 다당류 (예컨대, 헤테로 다당류, 호모 다당류) 및/또는 프럭토실 전달효소를 생성하는 락토바실러스 종에 속하는 균주인 것이 좋다.
상기 조성물은 락토바실러스 종에 속하는 균주 lOexplO CFU 이상 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 종에 속하는 균주 lOexplO CFU 이상을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 좋기로는 스타터 컬쳐로서 사용될 수 있으며, 냉동형, 동결 건조형 또는 액상형이다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 우유 기질 (예컨대, 소의 젖)을 본 발명의 젖산균, 균주 또는 조성물을 사용하여 발효시키는 단계를 포함하는, 발효유 제품/유제품을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 상기 우유 기질을 L. 불가리쿠스 또는 L. 페르멘툼 균주와 같은 락토바실러스 종에 속하는 균주, 예컨대 LB18, CHCC10019 (DSM19252), DSM22584, 또는 CHCC3984 (DSM19251)와 이들 균주 중 임의의 것의 돌연 변이체 및 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주로 발효시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 우유 기질은 락토바실러스 종에 속하는 균주를 사용한 발효 전, 발효 도중, 발효 후에, 전술한 임의의 균주 또는 균, 예컨대 스트렙토코쿠스 써모필러스 종에 속하는 균주를 사용하여 발효시킬 수 있다.
상기 방법은 발효 전, 발효 도중, 발효 후에, 상기 우유 기질에 효소, 예컨대 단백질을 가교시킬 수 있는 효소, 트랜스글루타미나아제, 아스파르긴산 단백질 분해 효소, 키모신 및 리넷 (rennet)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 얻을 수 있는 유제품, 예컨대 발효유 제품 (예컨대, 요거트 또는 버터 우유) 또는 치즈 (예컨대, 생치즈 또는 파스타 필라타 (pasta filata))에 관한 것이다. 상기 발효유 제품은, 예컨대 스터드 타입 (stirred-type) 제품 또는 세트 타입 (set-type) 제품일 수 있다.
상기 유제품은 필요에 따라 과일 농축액, 시럽, 프로바이오틱균 배지 (culture), 색소, 농후제, 향미제 및 보존제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분을 포함할 수 있고; 또는 필요에 따라 스터드 타입 제품, 세트 타입 제품 또는 음용형(飮用型) 제품 형식일 수 있다.
또한, 본 발명은 우유 기질 (예컨대, 소의 젖)을 본 발명의 젖산균 (예컨대, 스트렙토코쿠스 써모필러스 종에 속하는 균주, DSM 22884 등)과 락토바실러스 불가리쿠스 및 락토바실러스 페르멘툼 (예컨대, CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251) 및 CHCC2008 (DSM22584))으로부터 선택되는 종에 속하는 젖산균을 사용하여 발효시킴으로써 제조되는 유제품에 관한 것이다.
흥미롭게도, 본 발명의 유제품은, 예컨대 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력으로서 측정된 점도가 100 Pa을 초과 (예컨대, 102 초과 또는 104 Pa 초과)한다. 본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 균 세포만을 생장시킴으로써 100 Pa 초과의 점도를 얻을 수 있으나, 화합물, 예컨대 젤라틴, 카라기난 등을 첨가함으로써 더 높은 점도 값을 얻을 수 있다.
정의
본 명세서에서 사용되는 "젖산균"이라는 용어는 그람-양성의, 미호기성 또는 혐기성 균으로서 우세하게 생성되는 산으로서 젖산과 아세트산 및 프로피온산을 포함하는 산을 생성하며 당을 발효시킨다. 공업적으로 가장 유용한 젖산균은 락토코쿠스 종 (Lactococcus spp.), 스트렙토코쿠스 종 (Streptococcus spp.), 락토바실러스 종 (Lactobacillus spp.), 류코노스톡 종 (Leuconostoc spp.), 수도류코노스톡 종 (Pseudoleuconostoc spp.), 페디오코쿠스 종 (Pediococcus spp.), 브레비박테리움 종 (Brevibacterium spp.), 엔테로코쿠스 종 (Enterococcus spp.) 및 프로피오니박테리움 종 (Propionibacterium spp.)을 포함하는 "락토바실라레스" 목에서 발견된다. 또한, 엄격한 혐기성균의 군에 속하는 젖산 생성균인 비피도균, 즉 비피도박테리움 종 (Bifidobacterium spp.)은 일반적으로 젖산균의 군(群)에 포함된다. 이들은 단독으로 또는 다른 젖산균과 함께 조합하여 식품 배지로서 자주 사용된다. 젖산균, 예컨대 락토바실러스 종 및 스트렙토코쿠스 써모필러스는 보통 벌크 스타터 (bulk starter) 증식을 위한 냉동 또는 동결 건조 배지로서, 또는 소위 "다이렉트 배트 세트 (Direct Vat Set)" (DVS) 배지로서 유업계에 공급되고, 낙농 제품, 예컨대 발효유 제품 제조용의 발효관 또는 발효통으로 직접 접종된다. 이들 배지를 일반적으로 "스타터 배지" 또는 "스타터 (starter)"라고 부른다.
"우유"라는 용어는, 예컨대 소, 양, 염소, 버팔로 또는 낙타 등의 임의의 포유 동물을 착유하여 얻는 젖 분비액이라고 이해하여야 한다. 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 우유는 소의 젖이다. 또한, 우유라는 용어는 식물 재료, 예컨대 두유로 제조된 단백질/지방 용액도 역시 포함한다.
"우유 기질"이라는 용어는 본 발명의 방법에 따른 발효를 거칠 수 있는 임의의 원유 및/또는 가공유일 수 있다. 그러므로, 유용한 우유 기질로서는 단백질을 함유하는 임의의 우유 또는 유사 우유 제품의 용액/현탁액, 예컨대 전지 우유 또는 저지방 우유, 무지방 우유, 버터 우유, 재구성 분유, 연유, 분유, 유청, 유청 막투과액 (whey permeate), 젖당, 젖당의 결정화 모액, 유청 단백질 농축액 또는 크림을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 명백히, 상기 우유 기질은 임의의 포유 동물로부터 유래한 것, 예컨대 실질적으로 순수한 포유류의 젖 또는 재구성 분유일 수 있다.
발효 전에, 상기 우유 기질은 이 기술 분야에 알려져 있는 방법에 따라 균질화 및 살균 처리될 수 있다.
"균질화"라는 용어는 격렬하게 혼합하여 용해성 현탁액 또는 에멀전을 얻는 것을 의미한다. 발효 전에 균질화가 수행되는 경우, 우유 지방을 작은 크기로 분쇄함으로써 우유 지방이 더 이상 우유로부터 분리되지 않도록 상기 균질화를 수행할 수 있다. 이는 작은 오리피스를 통하여 우유에 고압의 힘을 가함으로써 달성될 수 있다.
"살균 (pasteurizing)"이라는 용어는 우유 기질을 처리하여 살아있는 생물체, 예컨대 미생물의 존재를 저감시키거나 제거하는 것을 의미한다. 살균은 특정 시간 동안 특정 온도를 유지하여 행하는 것이 좋다. 특정 온도는 보통 가열로 이루어진다. 상기 온도와 시간은 특정의 균, 예컨대 유해균을 죽이거나 불활화시키기 위하여 선택될 수 있다. 급속 냉각 과정이 수반될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 "발효"는 미생물의 작용을 통하여 탄수화물을 알코올 또는 산으로 전환시키는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 있어서 발효는 젖당의 젖산으로의 전환으로 이루어지는 것이 좋다.
발효유 제품의 제조에 이용되는 발효 공정은 잘 알려져 있고, 이 기술 분야의 숙련자라면 온도, 산소, 탄수화물의 첨가 및 미생물의 양과 특성 및 공정 시간 등의 적절한 공정 조건을 선택하는 방법을 알게 될 것이다. 명백히, 발효 조건은 본 발명의 목적, 즉 고형 또는 액상형 유제품 (발효유 제품)을 얻기 위한 목적을 뒷받침하기 위하여 선택된다.
"스터드 타입 제품"이라는 용어는 특히 발효 후 기계적인 처리를 거친 결과, 발효 단계에서 형성된 응고물의 해체 및 액화가 이루어진 발효유 제품을 말한다. 기계적 처리는 통상적으로 겔을 휘젓기, 펌핑, 여과 또는 균질화하거나, 다른 성분들과 함께 혼합함으로써 얻어지지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 스터드 타입 제품은 통상적으로 무지유(無脂乳) 고형분 함량이 9 내지 15%이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"세트 타입 제품"이라는 용어는, 예컨대 스타터 배지를 접종하는 접종 단계 후 패키지한 다음, 그 패키지 내에서 발효시킨 우유에 기초한 제품을 포함한다.
본 발명에 있어서, "돌연 변이체"라는 용어는, 본 발명의 균주로부터, 예컨대 유전 공학, 방사선 및/또는 화학적 처리의 방법에 의하여 유래한 균주라고 이해하여야 한다. 상기 돌연 변이체는 모균주와 기능적으로 균등한 돌연 변이체, 예컨대 실질적으로 동일하거나, 또는 (예컨대, 조직감, 전단 응력, 점도, 겔 강도, 구강 코팅도, 향미, 후산 발효도 (post acidification), 산성화 속도 및/또는 파지 인성 (phage robustness)에 관한) 성질이 개선된 돌연 변이체인 것이 좋다. 이러한 돌연 변이체는 본 발명의 일부이다. 특히, "돌연 변이체"라는 용어는 본 발명의 균주를 에탄 메탄 술포네이트 (EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘 (NTG) 등의 화학적 뮤타젠 처리, UV광 처리를 비롯한 종래에 사용되는 임의의 돌연 변이화 처리를 거치게 하여 얻은 균주 또는 자생적인 돌연 변이체를 말한다. 돌연 변이체는 수회의 돌연 변이화 처리 (하나의 처리는 스크리닝/선별 단계가 이어지는 1회의 돌연 변이화 단계로 이해되어야 한다)를 거친 것일 수 있으나, 본 발명에서는 20회 이하, 또는 10회 이하, 또는 5회 이하의 처리 (또는 스크리닝/선별 단계)를 수행하는 것이 좋다. 본 발명에서 양호한 돌연 변이체에 있어서, 균 게놈 중의 5% 미만, 또는 1% 미만 또는 심지어 0.1% 미만의 뉴클레오티드가 모균주에 비하여 또 다른 뉴클레오티드로 이동 또는 결실된다. 본 발명에 있어서, "변이체"라는 용어는 본 발명의 균주와 기능적으로 균등한 균주, 예컨대 실질적으로 동일하거나, 또는 (예컨대, 조직감, 전단 응력, 점도, 겔 강도, 구강 코팅도, 향미, 후산 발효도, 산성화 속도 및/또는 파지 인성에 관하여) 성질이 개선된 균주라고 이해하여야 한다. 적절한 스크리닝 기법을 이용하여 확인될 수 있는 이러한 변이체들은 본 발명의 일부이다.
본 발명에 있어서, "조직감"은 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력으로서 측정되는 것이다. 조직감 분석을 위하여 사용되는 실험은 다음과 같다.
접종 이튿날, 발효유를 13℃로 되게 하고 시료가 균질화할 때까지 구멍뚫린 원판에 부착된 막대로 부드럽게 교반하였다. 시료의 유동 특성을 C25 동축 측정 장치가 갖추어진 레오미터 (StressTech, Rheologica Instruments, Sweden)로 평가하였다. 점도 측정 시험은 전단율을 0.27 내지 300 1/s로 변화시키면서 21 단계로 이루어졌다. 전단율을 증가시킨 다음 감소시키고, 전단 응력과 겉보기 점도의 상향 및 하향 곡선을 기록하였다. 지연 시간 및 누적 시간은 각각 5 초 및 10 초이었다.
본 발명의 설명과 관련하여 (특히 후술하는 청구 범위와 관련하여), "a"와 "an" 및 "the"와 이에 유사한 낱말의 사용은 본 발명에서 달리 표시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 양자 모두를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. "포함하는 (comprising)", "가지는 (having)", "비롯한 (including)" 및 "함유하는 (containing)" 이라는 용어들은 달리 표시되지 않는 한, 개방형 (open-ended) 용어 (즉, "포함하지만 이에 한정되지는 아니하는"을 의미)로 이해되어야 한다.
본 발명에 있어서, 수치 범위에 관한 언급은 달리 명시하지 않는 한, 그 범위에 속하는 별도의 각 값을 개별적으로 나타내는 약기(略記) 방식으로서 사용하고자 하는 것일 뿐이며, 별도의 각 값은 이것이 마치 본 명세서에서 개별적으로 설명되어 있는 것처럼 본 명세서에 포함된다. 달리 명시하거나 문맥상 명백히 반대되는 경우가 아닌 한, 본 명세서에 설명된 방법들은 모두 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 발명에 제시된 임의의 실시예 및 모든 실시예, 또는 예를 들고자 한 용어 (예컨대, “...과 같은”)의 사용은, 단지 본 발명을 더 분명히 나타내기 위한 목적일 뿐이며, 달리 필요하지 않는 한 본 발명의 범위에 대한 한정을 가하지 않는다. 본 명세서 중의 어떠한 언어도, 어떤 청구되지 않은 사항을 본 발명의 실시에 필수적인 것을 나타낸다고 해석되어서는 아니된다.
도 1은 스트레스테크 레오미터로 측정된 CHCC11379의 전단 응력을 나타낸다. 43℃에서 철야 생장시킨 후 CHCC11379로 응고시킨 우유에서의 조직감 개선 (전단 응력)을 보여주는 결과. 조직감은 "발효유에서의 조직감 분석"에 기재된 바와 같이 스트레스테크 레오미터를 사용하여 파스칼 (Pa)로 측정된 전단 응력 평가에 의하여 정량되었다.
실시예
실시예 1 스트렙토코쿠스 균주의 갈락토오스 양성(陽性) 돌연 변이체의 제조
갈락토오스 발효 균주의 단리
돌연 변이체들은 S. 써모필러스 균주 CHCC6008 (=ST6008, DSM18111)의 갈락토오스 발효 돌연 변이체로서 단리하였다. 상기 돌연 변이체 단리 단계 전에, 상기 CHCC6008 세포들은 어떠한 돌연 변이 유발 화합물에 의하거나 또는 UV광에 의해서도 돌연 변이를 일으키지 않았다. 그러므로, 단리된 균주들은 CHCC6008의 자발적 갈락토오스 양성 돌연 변이체와 유사하다.
돌연 변이체 단리 전에, CHCC6008를 2% 갈락토오스 함유 M17 아가 플레이트 (M17-gal 플레이트)에 스트리킹하였다. CHCC6008은 유일한 탄수화물원인 갈락토오스상에서는 생장하지 아니하였다.
이어서, 철야 배양한 CHCC6008의 배지를 M17-gal 플레이트에 도말(塗抹)하고 37℃에서 이틀간 생장시킨 후 수 개의 콜로니를 단리할 수 있었다. 수 개의 돌연 변이체를 M17-gal 플레이트상에서 정제하고, 유일한 탄수화물원인 2% 갈락토오스를 함유하는 M17 배양액에서 재시험하였다.
CHCC6008는 M17-gal 배양액의 pH를 유의하게 감소시키지 않는 반면, 정제된 돌연 변이체 중의 하나인 CHCC11379는 37℃에서 10 시간 후 pH 5.3에 도달하였으며, 따라서 CHCC6008로부터 유래한 갈락토오스 발효 돌연 변이체로 간주되었다.
CHCC11342 및 CHCC11976 균주들을 동일한 방식으로 단리하였다.
유전 공학에 의한 돌연 변이체의 단리
갈락토오스 양성 돌연 변이체는 부위 특이적 돌연 변이법 (site directed mutagenesis)에 의해서도 역시 생성될 수 있다.
galK -10 프로모터 박스 내에 변이된 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 특정 DNA 단편을 PCR에 의하여 증폭시켰다. 원하는 돌연 변이를 일으킨 PCR 단편을 벡터 플라스미드에 클로닝하고, 그것으로 표적 S. 써모필러스 타겟 균주를 형질전환시켜, 상기 돌연 변이가 염색체에 도입되고 야생형 galK 프로모터 영역이 재조합에 의하여 교체되었다. 상기와 같이 균주들의 단리를 행하였다.
발효유에서의 조직감 분석
배양 이튿날, 발효유를 13℃로 되게 하고 시료가 균질화할 때까지 구멍뚫린 원판이 부착된 막대로 부드럽게 교반하였다. 시료의 유동 특성을 C25 동축 측정 장치가 갖추어진 레오미터 (StressTech, Rheologica Instruments, Sweden)로 평가하였다. 점도 측정 시험은 전단율을 0.27 내지 300 1/s로 변화시키면서 21 단계로 이루어졌다. 전단율을 증가시킨 다음 감소시키고, 전단 응력과 겉보기 점도의 상향 및 하향 곡선을 기록하였다. 지연 시간 및 누적 시간은 각각 5 초 및 10 초이었다. 추가 분석을 위하여, 300 s-1에서의 전단 응력을 선택하였다. 레오미터 결과는 CHCC6008에 비하여 CHCC11379의 전단 응력이 10% 향상되었음을 보여주었다 [CHCC11379의 전단 응력 값은 모균주 CHCC6008의 전단 응력 값인 67.5 Pa에 비하여 74.0 Pa (Pascals)이었다. 도 1 참조].
우유에서의 조직감 분석
또 다른 실험에서는, S. 써모필러스로부터의 균주가 43℃의 무지방유 중에서 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 종 (Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus)으로부터의 균주와 함께 공배양(公培養)된 요거트 배지의 일부로서, CHCC11379가 사용되었다. 요거트 생성시의 유일한 차이가 야생형 CHCC6008 대신에 CHCC11379를 사용하는 것일 경우, 전단 응력 역시 10% (CHCC6008를 함유하는 요거트 배지에 대하여 94.7 Pa인 것에 비하여 CHCC11379를 함유하는 요거트 배지에 대하여 105.0 Pa) 증가하였다.
CHCC11379 의 galK 프로모터 영역의 서열 분석
gal 양성 돌연 변이체 CHCC11379의 돌연 변이 타입을 밝히기 위하여, galK 유전자 (S. 써모필러스의 갈락토키나아제를 코딩)의 개시부를 서열 분석하였다.
CHCC11379에 대하여, galK 프로모터 영역에 있어서의 돌연 변이가 확인되었다 (이하 참고). 관찰된 gal-양성 표현형을 설명하자면, 각 돌연 변이는 모균주 6008에 비하여 더 강력한 프로모터 활성을 초래할 가능성이 있다. 이것은 -10 프로모터 박스의 공통 서열 (consensus sequence)이 "TATAAT"이고, CHCC6008의 -10 박스 (영역)("TACGAT")의 제3 뉴클레오티드의 돌연 변이가 CHCC11379의 공통 서열과 유사성이 높은 -10 박스 ("TATGAT")에 이르게 된다는 사실에 기초한다.
Figure 112012022636062-pct00001
CHCC11379로부터의 galK 유전자의 프로모터 영역. CHCC11379 galK 프로모터 내의 점 돌연 변이를 회색 코드로 표시하였다. S. 써모필러스 ST111의 공개된 galK 서열 (Genbank accession no. AY704368)을 대조용으로 표시하였다. -35: -35 프로모터 영역; -10: -10 프로모터 영역; RBS: 리보좀 결합 부위.
본 발명을 수행함에 있어서, 본 발명의 발명자들에게 알려져 있는 최상의 방식을 비롯한 본 발명의 양호한 실시 상태가 본 명세서에 기재되어 있다. 전술한 설명을 읽어보면, 이들 양호한 실시 상태에 대한 변형들은 이 기술 분야의 통상의 기술자들에게 명백하게 될 것이다. 본 발명의 발명자들은 숙련된 기술자들이 이들 변형을 적절히 채용할 것을 기대하며, 본 발명의 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 특정하게 기재된 것과는 달리 실시되도록 하고자 한다. 따라서, 본 발명은 준거법에 의하여 허용되는 바와 같이, 본 명세서에 첨부된 청구 범위에 기재된 주제의 모든 변경 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 달리 표시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 그 모든 가능한 변형에 있어서 전술한 요소들의 임의의 조합도 본 발명에 포함된다.
기탁 사항 및 전문가용 참조 사항
스트렙토코쿠스 써모필러스 균주 CHCC11379는 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)에 2009년 8월 26일자로 기탁 번호 DSM22884로 기탁되었다.
스트렙토코쿠스 써모필러스 (ST) 균주 ST6008 (CHCC6008로도 불림)의 시료는 DSMZ에 2006년 3월 29일자로 기탁 번호 DSM18111로 기탁되었다.
CHCC11342 (DSM 22932) 및 CHCC11976 (DSM 22934)은 2009년 9월 8일자로 DSMZ에 기탁되었다.
DSMZ에의 추가 기탁:
CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251): 기탁일 2007년 4월 3일
CHCC2008 (DSM22584): 기탁일 2009년 5월 19일
기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
본 출원인은 상기 기탁된 미생물 시료는 본 출원인에 의하여 허락된 전문가에게만 이용 가능할 것을 요구한다.
참고 문헌
Appl. Environ, Microbiol. 71, 7, p. 3659-67 (2005)
International Journal of Food Microbiology 113 (2007) 195-200
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Feb. 2002, p. 784-790
J Dairy Sci 92: 477-482 (2009)
WO2008/040734A1, WO2007/025097A2, US7241610B2, WO2007/144770A2,
WO2004/085607A, WO2008/148561A
본 특허 서류에 기재된 모든 참고 문헌들은 그 전부가 본 발명에 참고로 포함된다.
Figure 112012022636062-pct00002
Figure 112012022636062-pct00003
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22884 20090826 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM18111 20060323 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22932 20090908 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22934 20090908 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM19252 20070403 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM19251 20070403 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22584 20090519
SEQUENCE LISTING <110> Chr. Hansen A/S <120> Bacterium <130> P3652PC00 <150> DK 2009 00984 <151> 2009-09-01 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 1 tacgat 6 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 2 tatgat 6 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 3 tattat 6 <210> 4 <211> 6 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 4 tactat 6 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 5 aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt atgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 6 aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 7 aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 8 aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70

Claims (35)

  1. a) 모균주로서 젖산균 균주를 제공하는 단계,
    b) 상기 균주의 GalK 유전자에 돌연변이를 도입하는 단계, 및
    c) 상기 모균주보다 발효유에 더 높은 점도 또는 더 높은 조직감을 생성시키는 돌연변이 균주를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 상기 모균주와 비교하여 발효유에 더 높은 점도를 생성시키는 돌연변이 젖산균의 제조 방법으로서,
    상기 돌연변이 균주와 모균주는 동일한 종(species)에 속하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 점도는 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력으로서 측정되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 균주는 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력으로 측정 시 70 Pa을 초과하는 발효유 내 점도를 생성시키는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 상기 유전자의 프로모터 영역에 도입되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 상기 유전자의 -10 영역 (프리브노 박스)에 도입되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 결과로 야생형의 -10 영역 (TACGAT, SEQ ID NO:l)의 C 및 G 중 하나 또는 둘 모두가, A 및 T로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드로 교체되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 결과로 야생형의 -10 영역 (TACGAT, SEQ ID NO:l)의 C는, A 및 T로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드로 교체되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 결과로 야생형의 -10 영역 (TACGAT, SEQ ID NO:l)의 C는 T로 교체되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 결과로 -10 영역은 뉴클레오티드 서열 TATGAT (SEQ ID NO:2), TATTAT (SEQ ID NO:3) 또는 TACTAT (SEQ ID NO:4)를 함유하게 되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 유전 공학 기술을 사용하여 도입되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 돌연변이 생성법(mutagenesis)을 이용하여 도입되고, GalK 유전자의 돌연변이를 확인하기 위하여 필요에 따라 GalK 유전자 분석을 수반하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 균은 스트렙토코쿠스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 종에 속하는 것인 방법.
  13. GalK 유전자의 -10 영역에 돌연변이를 가지는 젖산균으로서, 상기 돌연변이 결과로 뉴클레오티드 서열 TACGAT (SEQ ID NO:1)을 갖는 야생형의 -10 영역 내의 C는 뉴클레오티드 A로 교체되는 것인 젖산균.
  14. GalK 유전자의 -10 영역에 돌연변이를 가지는 젖산균으로서, 상기 돌연변이 결과로 뉴클레오티드 서열 TACGAT (SEQ ID NO:1)을 갖는 야생형의 -10 영역 내의 G는 뉴클레오티드 T로 교체되는 것인 젖산균.
  15. GalK 유전자의 -10 영역에 돌연변이를 가지는 젖산균으로서, 상기 돌연변이 결과로 뉴클레오티드 서열 TACGAT (SEQ ID NO:1)을 갖는 야생형의 -10 영역 내의 C 및 G 둘 모두가, A 및 T로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드로 교체되는 것인 젖산균.
  16. GalK 유전자의 -10 영역 (야생형의 -10 영역 (TACGAT, SEQ ID NO:l)에 대비됨)에 돌연변이를 가지는 젖산균으로서, 상기 돌연변이 결과로 -10 영역은 뉴클레오티드 서열 TATTAT (SEQ ID NO:3) 또는 TACTAT (SEQ ID NO:4)를 함유하게 되는 것인 젖산균.
  17. GalK 유전자의 -10 영역에 돌연변이를 가지는 젖산균으로서, 상기 돌연변이 결과로 야생형의 -10 영역 (TACGAT, SEQ ID NO:l)의 C는 A로 교체되는 것인 젖산균.
  18. SEQ ID NO:5의 서열을 포함하는 젖산균.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 37℃에서 12 시간 생장 후의 전단 응력으로서 측정 시 70 Pa을 초과하는 발효유 내 점도를 생성시키는 것인 젖산균.
  20. 제13항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스트렙토코쿠스 써모필러스 종에 속하는 것인 젖산균.
  21. CHCC11379 (DSM 22884), CHCC11342 (DSM 22932) 및 CHCC11976 (DSM 22934)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트렙토코쿠스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 종에 속하는 균의 균주로서,
    균주 CHCC6008 (DSM 18111)과 비교하여 발효유에 더 높은 점도를 생성시키는 것인 균주.
  22. 제13항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 기재된 젖산균 또는 제21항에 기재된 젖산균 균주를 포함하는 조성물.
  23. 혼합물 또는 키트-오브-파츠 (kit-of-parts)로서,
    - 락토바실러스 (Lactobacillus) 종에 속하는 균주와,
    - 제13항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 기재된 젖산균의 균주 또는 제21항에 기재된 젖산균 균주
    를 포함하는 것인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 락토바실러스 종에 속하는 상기 균주는 다당류 및/또는 프럭토실 전달 효소를 생산하는 락토바실러스 종에 속하는 균주인 것인 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 락토바실러스 종에 속하는 균주 lOexplO CFU (cell forming units) 이상 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 종에 속하는 균주 lOexplO CFU 이상을 포함하는 것인 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 스타터 컬쳐(starter culture)로 사용될 수 있고, 냉동형, 동결 건조형 또는 액상형인 것인 조성물.
  27. 제13항 내지 제18항 중 어느 하나에 기재된 젖산균, 또는 제21항에 기재된 균주로 우유 기질을 발효시키는 단계를 포함하는 발효유 제품/유제품의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 락토바실러스 종에 속하는 균주로 상기 우유 기질을 발효시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 락토바실러스 종에 속하는 균주는 L. 불가리쿠스 (L. bulgaricus) 또는 L. 페르멘툼 (L. fermentum) 균주인 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 락토바실러스 종에 속하는 균주는 LB18, CHCC10019 (DSM19252), CHCC2008 (DSM22584) 및 CHCC3984 (DSM19251)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주인 것인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 우유 기질을 발효시키는 단계는,
    락토바실러스 종에 속하는 균주를 사용하여 발효시키기 전, 발효 도중, 또는 발효시킨 후에 수행되는 것인 방법.
  32. 제27항에 있어서, 발효 전, 발효 도중 및/또는 발효 후, 단백질을 가교시킬 수 있는 효소, 트랜스글루타미나아제, 아스파르긴산 단백질 분해 효소, 키모신 및 리넷 (rennet)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 상기 우유 기질에 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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