JP2006520590A

JP2006520590A - 食感を改良する乳酸菌

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Publication number: JP2006520590A
Application number: JP2006505724A
Authority: JP
Inventors: ホルヴァートフィリペ; マヌーリエリーズ; ユペールソニア; フレモークリストフ
Original assignee: ダニスコ・フランス
Priority date: 2003-03-17
Filing date: 2004-03-12
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2024-03-12
Also published as: RU2005131964A; CN1761752A; DK1604025T3; NZ542597A; DK1604025T4; CN102409004A; WO2004085607A2; WO2004085607A3; DE602004022028D1; ES2329470T5; EP1604025A2; US7582743B2; FR2852604A1; EP1604025B2; EP1604025B1; FR2852604B1; RU2376367C2; JP4669835B2; AR043607A1; ES2329470T3

Abstract

【課題】食品の食感を改良するために良好な特性を有する乳酸菌の株を提供すること。
【解決手段】本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む乳酸菌の新規の株、ならびに当該株を生産するための方法に関する。本発明はまた、配列番号１〜８の配列および核酸、その配列を含むベクターおよびプラスミドにも関するものである。本発明はさらに、当該株を含有する食品、特に乳製品に関する。

Description

本発明の目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む乳酸菌の株、ならびにこれらの株を作るための方法である。さらには、本発明は、上記の株を含む、および／または上記の株で生産された食品に関する。

食品産業では、食物の風味および食感を改良するためや、さらにはこれら食物の賞味期限を伸ばすために、多数の細菌、特に発酵酵素（ferments）の形や、特に乳酸菌が使用される。乳業の場合、（発酵による）ミルクの酸性化をもたらすためや、またそれらが取り込まれた製品の食感を改良するためにも、乳酸菌が重点的（intensively）に使用される。

食品産業において使用される乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）およびビフィズス菌（Bifidobacterium）属を挙げることができる。

サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）種の乳酸菌は、単独または他の細菌と組み合わせて、食品、特に発酵製品の生産のために広範に使用される。それらは特に、発酵乳、例えばヨーグルトの生産のために使用される発酵酵素の調製に使用される。それらのうち特定のものは、発酵製品の食感の改良に主要な役割を果たす。この特徴は、多糖の産生と密接に関連している。サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株は、食感を改良すると食感を改良しない株に分けることができる。

食感を改良するサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株は、例示した条件の下、約３５Ｐａ・ｓを上回る粘度、約２０００Ｐａ／ｓ未満の揺変性領域、および約１４Ｐａ未満の降伏点を有する発酵乳を生成する株を意味する。サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株は、例示した条件の下、約５０Ｐａ・ｓを上回る粘度、約１０００Ｐａ／ｓ未満の揺変性領域、および約１０Ｐａ未満の降伏点を有する発酵乳を生成し、強く食感を改良するものと定義することができる。

産業界の要求に応じて、食感を改良する新規の乳酸菌の株、特にサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株の提供が必要になってきている。

従って、本発明が解決しようとする課題は、食品の食感を改良するために良好な特性を有する乳酸菌の株を提供することにある。

この目的のため、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む乳酸菌の株を提供する。

本発明はまた、ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに、２００３年２月２６日に受託番号Ｉ−２９８０にて寄託されたサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の新規の株も提供する。

本発明の目的は、さらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列、およびこれらのヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む核酸である。

本発明の他の目的は、また、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列の少なくとも１つ、およびヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む核酸を含む、プラスミド、クローニングおよび／または発現ベクターである。

本発明にはまた、前記のプラスミドまたはベクターによって形質転換された宿主細菌も包含される。

本発明はまた、前記の株を作るための方法にも関するものであり、これらの株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含むプラスミドもしくはベクターを使用して、またはこれらヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む核酸を含むベクターで形質転換することによって得られることを特徴とする。

本発明はまた、前記の株の少なくとも１つを含むか、または本発明の方法によって得られる少なくとも１つの株を含む細菌組成物も提供する。

最後に本発明は、少なくとも１つの本発明の株、または本発明の方法によって得られる少なくとも１つの株、または本発明の細菌組成物を含む、食物または医薬組成物に関する。

本発明は、それが取り込まれる媒体の食感を改良するという点で、多くの利点を有している。特に、例えば発酵乳から、濃厚、粘性、被覆性、糸引き性、且つ耐撹拌性であり、顆粒性ではないゲルを得ることを可能とする。

本発明における他の利点および特徴は、以下の記載と、単に例示を目的として示した本発明を限定するものではない実施例から明らかになるであろう。

本発明は第１に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む乳酸菌の株に関する。

乳酸菌は、グラム陽性門（Firmicutes）に属するグラム陽性の原核生物である。それらは、ヘテロトロピック且つ化学有機栄養性であり、一般的に嫌気性または耐気性であって、それらの代謝はホモまたはヘテロ発酵性となり得る。乳酸菌は、本質的に糖基質の発酵によって乳酸を産生する。乳酸菌はカタラーゼを欠き、エアロコッカス属（Aerococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、オエノコッカス属（Oenococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、テトラゲノコッカス属（Tetragenococcus）、バゴコッカス属（Vagococcus）およびウェイッセラ属（Weissella）については球菌の形態で、またはラクトバチルス属（Lactobacillus）およびカルノバクテリウム属（Carnobacterium）については桿体の形態で、細菌の異種群を構成する。乳酸菌の名は、ビフィズス菌属（Bifidobacterium）などの他の関連細菌にも及ぶことが多い。

本発明に好適な乳酸菌の株としては、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）およびビフィズス菌属（Bifidobacterium）を挙げることができる。

本発明において好ましい乳酸菌の株は、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）である。

サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）は、ミルク内に天然に存在する種であり、ミルクの酸性化および食感を改良することを可能とするので、食物産業、特に乳製品産業において広く使用される。これは、ホモ発酵の好熱性細菌である。

本発明は、ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに、２００３年２月２６日に受託番号Ｉ−２９８０にて寄託されたサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株に関する。

本発明の目的はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列でもある。

配列番号２から配列番号８のヌクレオチド配列は、多糖（ＰＳ）の合成に関与する約１４，３５０塩基対のオペロンの一部を形成している。このオペロンは、配列番号１の配列に含まれている。これは、本発明において、配列番号２〜配列番号８の配列が配列番号１の配列に含まれることを意味している。

本発明におけるオペロンの構造は、決定されている（図１参照）。ｄｅｏＤ（オペロンＰＳの上流）とｏｒｆ１４．９（下流）の遺伝子の間に、ｅｐｓ９３Ａ、ｅｐｓ１３Ｂ、ｅｐｓ１３Ｃ、ｅｐｓ１３Ｄ、ｅｐｓ１３Ｅ、ｅｐｓ１３Ｆ、ｅｐｓ１３Ｇ、ｅｐｓｌ３Ｈ、ｅｐｓ１３Ｉ、ｅｐｓ１３Ｊ、ｅｐｓ１３Ｋ、ｅｐｓ１３Ｌ、ｅｐｓ１３Ｍ、ｅｐｓｌ３Ｎ、ｅｐｓｆ３０、ｅｐｓｌ３ＰおよびＩＳ１１９３と特定される１７のＯＲＦ（読み取り枠）が同定されている。「センス」鎖に位置する最初の１６のＯＲＦは、細胞外多糖または莢膜多糖の生産に関わるポリペプチドを潜在的にコードしており、「アンチセンス」鎖に位置する１７番目のＯＲＦは、ＩＳ１１９３（挿入配列）のファミリーに属する機能性トランスポザーゼを潜在的にコードしている。

各ＯＲＦを命名して位置付けすることが可能である。各ＯＲＦの名称を以下に示し、第２番目にそれに由来するタンパク質の推定機能を、そして最後の第３番目にこのＯＲＦを含む領域の位置を（配列表に示すような配列番号１の配列と関連付けて）示す。
− ｅｐｓ１３Ａ：転写制御因子（３４２．．１８０２）
− ｅｐｓ１３Ｂ：多糖の重合（鎖長制御）および／またはエクスポート（１８０３．．２５３４）
− ｅｐｓ１３Ｃ：多糖の重合（鎖長制御）および／またはエクスポート（２５４３．．３２３５）
− ｅｐｓ１３Ｄ：多糖の重合（鎖長制御）および／またはエクスポート（３２４５．．３９８５）
− ｅｐｓ１３Ｅ：ウンデカプレニル−ホスフェートグリコシルトランスフェラーゼ（４０４２．．５４０９）
− ｅｐｓ１３Ｆ：ウンデカプレニル−ホスフェートグリコシルトランスフェラーゼ（５６１１．．６１９５）
− ｅｐｓ１３Ｇ：ウンデカプレニル−ホスフェートグリコシルトランスフェラーゼ（６２５１．．６６３４）
− ｅｐｓ１３Ｈ：ベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（６６４３．．７０９２）
− ｅｐｓ１３１：ベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（７０９２．．７６０７）
− ｅｐｓ１３Ｊ：ラムノシルトランスフェラーゼ（７５９７．．８４９３）
− ｅｐｓ１３Ｋ：グリコシルトランスフェラーゼ（８７６３．．９７９７）
− ｅｐｓ１３Ｌ：反復単位ポリメラーゼ（９８２７．．１０９６９）
− ｅｐｓｌ３Ｍ：反復単位ポリメラーゼ（１０９８４．．１１７９３）
− ｅｐｓ１３Ｎ：グリコシルトランスフェラーゼ（１１８４４．．１２５７８）
− ｅｐｓ１３０：グリコシルトランスフェラーゼ（１２６３３．．１３０１６）
− ｅｐｓ１３Ｐ：膜貫通トランスポーター（１３０４９．．１４４８２）
− ＩＳ１１９３：トランスポザーゼ（補体（１４６１４．．１５８７０））。

本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む核酸に関するものである。本発明において前記の配列の少なくとも１つを含む核酸が意味するのは、その翻訳産物が、配列番号１〜配列番号８の配列において同定されるＯＲＦに由来するポリペプチド配列の少なくとも１つと有意な配列の類似性を有する（残基の位置の間で最大に一致するように配列をアラインメントした後の同一残基のパーセンテージが８０％以上）、少なくとも１つのＯＲＦを含む核酸である。

配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列は、当業者にとって周知の遺伝子操作、特に組換えＤＮＡ技術によってベクターに挿入することができる。

本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列または上記定義の核酸を含むクローニングベクター、および／または発現ベクターにも関する。

本発明にかかる好ましいベクターはプラスミドである。これは複製型プラスミドまたは組込み型プラスミドであり得る。

これらのベクターおよび／またはプラスミドから始めて、これらベクターおよび／またはプラスミドが細菌の中に含まれるように、細菌を形質転換することが可能である。この形質転換は、当業者にとって標準的な方法の、エレクトロポレーション技術、または接合法によって行うことができる。

本発明はまた、上記のプラスミドまたはベクターによって形質転換された宿主細菌にも関するものである。

好ましくは、形質転換される細菌は乳酸菌である。特にそれらは、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）およびビフィズス菌（Bifidobacterium）属から選択され得る乳酸菌である。

本発明にかかる好ましい乳酸菌の株は、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）である。

本発明はまた、本発明にかかる株または形質転換された宿主細菌を作るための方法にも関するものであって、宿主細菌が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むベクターを使用して、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む核酸で形質転換されることによって得られることを特徴とする。

本発明の方法において好ましいベクターは、プラスミドである。

本発明の方法において、好適には、形質転換の後に、少なくとも１つの組換え現象により、形質転換された宿主細菌または株の、ゲノムへの挿入が行われる。

本発明はまた、本発明の少なくとも１つの株、または本発明の方法によって得られた少なくとも１つの株、または本発明によって形質転換された少なくとも１つの細菌を含む細菌組成物にも関する。

細菌組成物とは、異なる株、特に発酵酵素または酵母の混合物を意味する。

本発明にかかる好ましい株の混合物は、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）と他のサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）との混合物、またはサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）とデルブリッキ菌（Lactobacillus delbrueckii）亜種ブルガリア菌（bulgaricus）との混合物、またはサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）と他のラクトバチルス属（Lactobacillus）および／またはビフィズス菌属（Bifidobacterium）との混合物、またはサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）とラクトコッカス属（Lactococcus）との混合物、またはサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）と他の乳酸菌の株および／または酵母との混合物である。

本発明はまた、食品または食物成分を生産するための、本発明にかかる株の使用方法、本発明の方法によって得られる株の使用方法、または本発明の細菌組成物の使用方法にも関するものである。

本発明にかかる好ましい食品または食物成分としては、乳製品、肉製品、穀物製品、飲料、発泡物（ｆｏａｍ）または粉末を挙げることができる。

本発明はまた、本発明の少なくとも１つの株、または本発明の方法によって得られた少なくとも１つの株、または本発明の細菌組成物を含む食物または医薬組成物にも関する。

本発明の目的はまた、本発明の少なくとも１つの株、または本発明の方法によって得られた少なくとも１つの株、または本発明の細菌組成物を含む乳製品でもある。

乳製品の生産の場合、後者は当該技術分野において繁用される方法によって、特に本発明にかかる株を組み込むことにより乳製品を発酵させることによって行われる。

本発明にかかる乳製品としては、発酵乳、ヨーグルト、成熟クリーム、チーズ、フロマージュフレ、ミルク飲料、濃縮乳製品（ｄａｉｒｙｐｒｏｄｕｃｔｒｅｔｅｎｔａｔｅ）、プロセスチーズ、クリームデザート、カッテージチーズまたは乳児用ミルクを挙げることができる。

好ましくは、本発明の乳製品は、動物および／または植物を起源とするミルクを含む。

動物を起源とするミルクとしては、ウシ、ヒツジ、ヤギまたはバッファローのミルクを挙げることができる。

植物を起源とするミルクとしては、本発明に従って使用することができる、植物を起源とする発酵可能な物質、特に大豆、米または麦芽を起源とするものを挙げることができる。

具体的であるが本発明を限定するものではない実施例を以下に記載する。

＜サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）ＣＮＣＭＩ−２９８０のＰＳオペロンの配列決定＞
サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）株のＣＮＣＭＩ−２９８０のＰＳオペロンを保有するＤＮＡ断片を、当該株から抽出したゲノムＤＮＡより、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅によって得た。増幅は、ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃａｍｂｒｅｘ）ならびに以下のプライマー：5’-GGGTGAACGTATCTCAGTAATGGGGACTGG-3’および5’-CCTGAGTTATGCGACGATTACTTGGCTG-3’を使用し、マスターサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で行なった。この増幅の実験条件は以下のとおりである：変性（９８℃、３０秒間）、およびハイブリダイゼーション−伸長（６８℃、１５分間）を交互に１４サイクル、その後、変性（９８℃、３０秒間）変性、およびハイブリダイゼーション−伸長（６８℃、１５分間）をサイクルあたり１５秒間の増殖期を入れて交互に１６サイクル、その後、伸長サイクル（７２℃で１０分間）を行った。ＰＣＲ産物は、断片クローニングアプローチによって配列決定した。

＜既知のサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）と比較した、本発明の株の分子の特徴付け＞
［ＰＳオペロンの配列決定］
サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）株のＣＮＣＭＩ−２９８０のＰＳオペロンの配列を、精製したＣＮＣＭＩ−２９８０のゲノム鋳型の存在下に、文献に記載されたサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）のＰＳオペロンを概ね構成している保存遺伝子（ｐｒｅｓｅｒｖｅｄｇｅｎｅ）の２つの特異的プライマー（プリン−ヌクレオチドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤおよび機能未知のｏｒｆ１４．９）を使用したＰＣＲによって、合成された約１７，１００塩基対のＤＮＡ断片から得た。配列番号１の配列に一致する、遺伝子ｄｅｏＤとｏｒｆ１４．９との間に含まれる配列を、配列表にて示している。

［ＰＳオペロンの遺伝子構成］
図１は、そのヌクレオチド配列の解析によって確証されたＣＮＣＭＩ−２９８０株のＰＳオペロンの遺伝子構造、さらに他の７つのサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）株のＰＳオペロンの構造を概略的に示す。株名およびＧＥＮＢＡＮＫ受入番号（括弧内）により識別される異なる構造について、矢印は開始コドンから終止コドンまでの遺伝子の位置、サイズおよび方向を表す。矢印の中の色および／または単位の意味は、図１の凡例によって示される。

［文献との比較］
ＣＮＣＭＩ−２９８０株のＰＳオペロンの構造上の分析により、これが既知のＰＳオペロンに類似した全体的な構成（図１参照）を備えることが示された。つまり、ＰＳオペロンの転写の制御に潜在的に関与する最初のＯＲＦと、その後におそらくＰＳの反復単位の重合および／またはＰＳのエクスポートの制御に関わる３つのＯＲＦと、その後に反復単位の構築を確実にするグリコシルトランスフェラーゼおよびポリメラーゼをコードする１１のＯＲＦと、その後にプラスミド膜を通る反復単位の輸送に潜在的に関わる１つのＯＲＦとを有することが示される。

ＣＮＣＭＩ−２９８０株のＰＳオペロンの遺伝子の周囲も、他の既知ＰＳオペロンの遺伝子と類似しており、つまり上流のＯＲＦのｄｅｏＤはプリン−ヌクレオチドホスホリラーゼをコードし、また下流のＯＲＦのＩＳ１１９３およびｏｒｆ１４．９は反対方向にトランスポザーゼ（ＩＳ１１９３挿入配列のファミリーに属する、可動遺伝因子）および未知機能のタンパク質をそれぞれコードしている。

しかしながら、ＣＮＣＭＩ−２９８０株のオペロンのＯＲＦと公用データベース（ＧＥＮＢＡＮＫ）で入手可能なものによって潜在的にコードされるタンパク質の間で行われた配列の比較により、ＣＮＣＭＩ−２９８０株のＰＳオペロンの遺伝子の内容は遠位部分において新規であることが示されている。

サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）、およびさらに一般的に現在知られている連鎖球菌のＰＳオペロンの近位部分は、ｅｐｓＡ（またはｃｐｓＡ、またはｃａｐＡ、またはｗｚｇ）、ｅｐｓＢ（またはｃｐｓＢ、またはｃａｐＢ、またはｗｚｈ）、ｅｐｓＣ（またはｃｐｓＣ、またはｃｐａＣ、またはｗｚｄ）およびｅｐｓＤ（またはｃｐｓＤ、またはｃａｐＤ、またはｗｚｅ）と称される４つのＯＲＦを含み、４つのＯＲＦの各々に対し、それに由来するポリペプチド産物は、株間で有意な配列の類似性を有している。このレベルで、ＣＮＣＭＩ−２９８０株のＰＳオペロンのＯＲＦであるｅｐｓ１３Ａ、ｅｐｓ１３Ｂ、ｅｐｓ１３Ｃおよびｅｐｓ１３Ｄａに由来するポリペプチド産物は、他のオペロン由来の産物と識別できない（一致するアミノ酸のパーセンテージが９４％以上）。

サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）における既知のＰＳオペロンのほとんどが、ＯＲＦｅｐｓＤ、ＯＲＦｅｐｓＥ（またはｃｐｓＥ、またはｃａｐＥ、またはｗｃｈＡ）の直後に存在する。この場合も、異なる既知の配列に由来する相同性ポリペプチド産物間での配列の類似性が有意であり、ＣＮＣＭＩ−２９８０株のＯＲＦｅｐｓ１３Ｅの翻訳産物は他の株に由来するその相同体に強く類似している。

ＣＮＣＭＩ−２９８０株のＰＳオペロンの以下の４つのＯＲＦ（ｅｐｓ１３Ｆ、ｅｐｓ１３Ｇ、ｅｐｓ１３Ｈおよびｅｐｓ１３Ｉ）の構成は、既に記載したが、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）のＰＳオペロンの異なる既知の構造の中では珍しい。この構成は、不完全な場合があるがＩＰ６７５７株（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＪ２８９８６１）、「ＶＩＩ型」（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＦ４５４４９８）および「ＩＩＩ型」（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＹ０５７９１５）において見出される。

オペロンの遠位部分において、ｅｐｓ１３Ｊ、ｅｐｓ１３Ｋ、ｅｐｓ１３Ｌ、ｅｐｓ１３Ｍ、ｅｐｓ１３Ｎ、ｅｐｓ１３Ｏおよびｅｐｓ１３Ｐの７つのＯＲＦは、ＣＮＣＭＩ−２９８０株のＰＳオペロンにおいて新規且つ特異的である。わずかではあるが、タンパク質レベルでのそれら配列の類似性、または特定の場合にあっては特異的なタンパク質単位の存在によって、これらのＯＲＦの産物に対して推定される機能、すなわち、ＯＲＦｅｐｓ１３Ｊ〜ｅｐｓ１３Ｏの産物に対しては潜在的なグリコシルトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ活性を、ＯＲＦｅｐｓ１３Ｐの産物に対してはＰＳの膜貫通輸送活性を推定される機能として割り当てることが可能になる。

＜サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）株のＣＮＣＭＩ−２９８０の比較レオロジー試験＞
使用したサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株、ＣＮＣＭＩ−２４２３、ＣＮＣＭＩ−２４２９、ＣＮＣＭＩ−２４３２、ＣＮＣＭＩ−２９７８およびＣＮＣＭＩ−２９７９は、Ｒｈｏｄｉａフードコレクションからの株である。これらの株のほとんどは、発酵乳またはヨーグルトの工業生産のために使用され、また食感を改良する特徴が認知されている。これらの株は文献に報告されている株の代表である。これらの株を以下、ＣＮＣＭＩ−２９８０株と比較して試験し、農業食品にて現在使用されている食感を改良する株の代表として考える。

サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株ＲＤ７３６およびＲＤ６７６は、食感を改良する能力が低いと評判の、Ｒｈｏｄｉａフード産業の株である。これらの株が生産することのできる多糖や、これらの株のＰＳオペロンは不明である。これらの株を以下、ＣＮＣＭＩ−２９８０株と比較して試験し、食感を改良しない株の代表として検討する

使用した発酵乳は、１００ｍｌのＵＨＴ脱脂乳（ＬｅＰｅｔｉｔＶｅｎｄｅｅｎ（商標登録））に３％（重量／体積）の脱脂粉乳を補充することによって得られる。溶液の無菌性は、９０℃で１０分間の殺菌を行うことによって得られ、この温度はミルクの中心にて測定される。こうして得られた発酵担体に、１０Ｅ＋６ｃｆｕ／ｍｌ（コロニー形成単位／ｍｌ）の割合で被検株を接種し、次いでｐＨ４．６が得られるまで４３℃でインキュベートする。ｐＨのモニタリングは、継続的に記録する。こうして得られる発酵乳は、分析まで６℃で通風オーブン内に入れておく。

２つの型のレオロジー測定、すなわち、粘度および流動の測定を行う。粘度の測定は、発酵乳を６℃で１日、７日、１４日および２８日間保存した後に、８℃で行なう。使用した装置は、Ｈｅｌｉｐａｔｈスタンド（Brookfield Engineering Laboratories社）に設置した、ＲＶＦ型のＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（商標登録）粘度計（ＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）である。粘度計にはＣ型の針を取り付け、この針に付する振動速度は１０ｒｐｍとする。流動の測定は、発酵乳を６℃で１４日間保存した後に、予め撹拌したものについて８℃で行なう。使用した装置は、同軸シリンダー（半径１＝１５ｍｍ、半径２＝１３．８３ｍｍ、高さ＝３２ｍｍ、エアギャップ＝２ｍｍ）を取り付けたＡＲ１０００−Ｎレオメータ（ＴＡＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）である。上昇セグメントについては、継続的な流れで付される応力は線形モードに従って１分間の間に０から６０Ｐａに変動させられる。下降セグメントについては、継続的な流れで付される応力は線形モードに従って１分間の間に６０から０Ｐａに変動させられる。考慮される数値は、揺変性領域および降伏点であり、降伏点がＣａｓｓｏｎモデルに従って計算される。

サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）株のＣＮＣＭＩ−２９８０で得られた発酵乳の粘度を、６℃で１日、７日、１４日および２８日間保存した後に測定した（表１）。１日間保存した後に測定した粘度の数値は、５３．３Ｐａ・ｓである。この数値は時間が経ってもほとんど変動せず、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株ＣＮＣＭＩ−２９８０で得られた発酵乳の安定性を示すものであった。これに比べて（表１）、食感を改良する能力が低いと評判のＲＤ７３６およびＲＤ６７６株で生産された発酵乳について測定した粘度は、２６から３０Ｐａ・ｓの間に含まれている。他の被検株は、ＣＮＣＭＩ−２９８０株で得られたものよりも低い粘度を有する発酵乳を生産する。４０Ｐａ・ｓのオーダーの粘度を生じさせる株の第一群（ＣＮＣＭＩ−２９７９、ＣＮＣＭＩ−２４２３およびＣＮＣＭＩ−２４３２）と、ＣＮＣＭＩ−２９８０が属する、５０Ｐａ・ｓのオーダーの粘度を生じさせる第二群とに識別することが可能である。

流動の測定により、発酵乳の流体力学的概要にとって重要な２つの流体力学的記述子（降伏点および揺変性領域）を規定することが可能になった（表２）。ＣＮＣＭＩ−２９８０株で得られた発酵乳については、平均値は降伏点および揺変性領がそれぞれ、５．８９Ｐａおよび４８８Ｐａ／ｓであった。これらの数値は、食感を改良する能力が低いと評判の株（ＲＤ６７６およびＲＤ７３６）で得られた発酵乳から得られた数値と有意に異なっている。例えば、ＲＤ６７６株で得られた発酵乳において、これらの平均値はそれぞれ、１７．０１Ｐａおよび１７０８３Ｐａ／ｓである。食感を改良すると評判の株の場合、降伏点および揺変性領域の値はＣＮＣＭＩ−２９８０株で得られた値により近いが、有意に大きく、ＣＮＣＭＩ−２９８０株よりも高い食感を改良する能力を示している。

＜サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株ＣＮＣＭＩ−２９８０の官能性の特徴付け、参照株との比較＞
発酵乳を、６℃にて１４日間保存した後、官能試験によって評価した。至適な試験温度である１２℃に維持して、９名の審査員団により０〜６のポイントの非構造化均等スケールにて、その発酵乳の定量的記述解析を行なった。この官能プロファイル分析は、数日の間隔で繰り返して行った。事前に選択され訓練を受けた審査員が、スプーン上での食感の４つの記述子、つまり脆性、耐撹拌性、糸引き性、顆粒性、および口中での食感の４つの記述子、つまり溶け、粘性、濃厚さ、被覆性について評価を行なった。官能の差は、固定モデルと、その後各記述子につき５％のアルファ閾値を用いたＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ平均比較検定との、２つの因子での分散分析（ＡＮＯＶＡと称される）によって評価した。変数として官能の記述子と株とを個々に用いた主成分分析法（ＰＣＡ）が、作り出された空間を可視化するために実施された。上行階層的分類（ＡＨＣ）によって、ＰＣＡに基づき株の群を単離することが可能となった。これらの統計分析のために使用したソフトウェアはＦｉｚｚ（商標登録）（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ）、Ｓｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓ（商標登録）およびＵｎｉｗｉｎｐｌｕｓ（商標登録）である。

サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の株ＣＮＣＭＩ−２９８０で得られた発酵乳のデータを、他の参照株のデータと比較した。採用した食感の記述子に対して、異なる株で得られた平均値が表３に示され、そしてＡＮＯＶＡおよび平均比較検定から導き出される有意差が、表４ならびに図３および図４に示されている。

図３および図４は、表４で得られた結果のヒストグラムを示している。

全ての記述子につき、食感を改良しないと考えられる株であるＲＤ６７６およびＲＤ７３６は、他の株から有意に差別化される。食感を改良する株のうち、ＣＮＣＭＩ−２９８０株は、顆粒性を除いたすべての記述子について明瞭且つ有意に差別化されるが、顆粒性についてはＣＮＣＭＩ−２９７８およびＣＮＣＭＩ−２４２３の株と差別化することができない。

ＰＣＡによって、官能性の記述子に関する株の距離の関数として、株を位置付けることが可能になる。

図２におけるＰＣＡの図（ｄｅｓｉｇｎ）１−２は、９７．３％の空間が作り出されたことを表している。成分１は、官能の変数の２群を対比するものである。第一群は、耐撹拌性、口中での濃厚さ、口中での被覆性、スプーン上での糸引き性および口中での粘性の変数からなり、右側の成分１を占める。第二群は、口中での溶け、スプーン上での脆性およびスプーン上での顆粒性の変数からなり、左側の成分１を占める。変数の第一群と、第二群とは相関していない。これらの変数により、この図面における株の位置付けを分析することが可能となる。さらに、ＡＨＣ分析により、要因図１−２上の点在した円の形式で表される、異なる群の株を分類することが可能になる。

要因図は、異なる食感特性を提供する株のいくつかの群を対比するものである。これらの分析から、ＲＤ７３６およびＲＤ６７６の株がスプーン上での脆性および顆粒性の食感ならびに口中での溶けの食感の改良を発酵乳に行うということが明らかになる。同じように、これらの株は、他の群の株に比べて、口中での濃厚さ、粘性、または被覆性の食感も、スプーン上での耐撹拌性または糸引き性も生み出すことはないことが分かる。従って、これらの株は、食感が改良されていない発酵乳を生産する。これに対して、ＣＮＣＭＩ−２４２９、ＣＮＣＭＩ−２４３２およびＣＮＣＭＩ−２９７９の株は、平均的に食感が改良された発酵乳を生産し、ＣＮＣＭＩ−２４２３およびＣＮＣＭＩ−２９７８の株は食感が改良された発酵乳を生産し、そしてＣＮＣＭＩ−２９８０の株は高度に食感が改良された発酵乳を生産する。この分析によって、ＣＮＣＭＩ−２９８０の株は、すべての参照株に比べて、非常に際立って食感が改良された特徴的な発酵乳を提供することを示している。

＜サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）株のＣＮＣＭＩ−２９８０のファージに対する抵抗性の比較試験＞
バクテリオファージに対する株の感受性が、溶菌プラーク法によって証明される。被検株の培養液１００μｌと、被検バクテリオファージを含有する血清の適切な希釈液１００μｌとを使用して、ＣａＣｌ_２１０ｍＭを補充した過融解条件のＭ１７グルコース寒天培地（寒天０．６％重量／体積）５ｍｌに播種する。全体を、ＣａＣｌ_２１０ｍＭを補充した固化Ｍ１７グルコース寒天培地（寒天１．５％重量／体積）の表面に注ぐ。４２℃にて１６時間インキュベーションした後、バクテリオファージに対する株の感受性を、溶菌プラークの存在によって評価する。溶菌プラークが存在しないことは、被検バクテリオファージに対するこの株の抵抗性を表している。バクテリオファージに対する感受性スペクトラム（リソタイプとも称される）は、被検バクテリオファージに対する感受性および抵抗性のすべてによって構成される。

以下の表５は、本試験のために使用されるバクテリオファージおよびそれらの起源／増殖を定義している。これらはＲｈｏｄｉａフードコレクションに起源を有する株およびファージである。バクテリオファージは、食感を改良する参照株に対する感染性で選択した。

バクテリオファージに関連する課題についてＣＮＣＭＩ−２９８０株の産業上の利点を評価するために、ＣＮＣＭＩ−２９８０株のリソタイプを評価し、食感を改良する参照株のものと比較した。表６に、溶菌プラーク法によって確証された、これらの異なるファージに対する株の感受性（リソタイプ）を示す。６つの被検株は異なるリソタイプを有するようである。特に、ＣＮＣＭＩ−２９８０株は、他の食感を改良する被検株のものととは異なるリソタイプを有する。実際、ＣＮＣＭＩ−２９８０株は被検ファージによって感染され得なかった。

本発明にかかる株のＰＳオペロンの遺伝子構造を、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）の他の既知の株のＰＳオペロンと比較して示す図である。異なる被検株を用いて得られた発酵乳の官能試験データから得られた主成分分析法（ＰＣＡ）の要因デザイン１−２を示す図である。被検株の各々についてのスプーン上での食感の記述子について得られたスコアの平均値を示す図である。Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定の結果の解釈：同じ文字により関連付けられた株間の差は有意ではない。被検株の各々についての口中での食感の記述子について得られたスコアの平均値を示す図である。Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定の結果の解釈：同じ文字により関連付けられた株間の差は有意ではない。

Claims

配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む乳酸菌の株。
ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属およびビフィズス菌属から選択される請求項１記載の乳酸菌の株。
サーモフィルス種に属する請求項１または２記載の乳酸菌の株。
ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに、２００３年２月２６日に受託番号Ｉ−２９８０にて寄託されたサーモフィルスの株。
配列番号１のヌクレオチド配列。
配列番号２のヌクレオチド配列。
配列番号３のヌクレオチド配列。
配列番号４のヌクレオチド配列。
配列番号５のヌクレオチド配列。
配列番号６のヌクレオチド配列。
配列番号７のヌクレオチド配列。
配列番号８のヌクレオチド配列。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む核酸。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列、または請求項１３記載の核酸を含むクローニングベクターおよび／または発現ベクター。
プラスミドである請求項１４記載のベクター。
請求項１４または１５記載のベクターまたはプラスミドにより形質転換された宿主細菌。
乳酸菌である請求項１６記載の細菌。
ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属およびビフィズス菌属から選択される請求項１６または１７記載の細菌。
請求項１乃至４のいずれかに記載の株または請求項１６乃至１８のいずれかに記載の細菌を構築するための方法であって、該株または細菌が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列、または請求項１３記載の核酸を含むベクターを使用して形質転換することにより得られる方法。
前記形質転換の後に、少なくとも１つの組換え事象により、前記株または前記宿主細菌のゲノムへの挿入が行われる請求項１９記載の方法。
前記ベクターがプラスミドである請求項１９または２０記載の方法。
請求項１乃至４のいずれかに記載の少なくとも１つの株、または請求項１９乃至２１のいずれかに記載の方法によって得られる少なくとも１つの株、または請求項１６乃至１８のいずれかに記載の少なくとも１つの形質転換された細菌を含む細菌組成物。
請求項１乃至４のいずれかに記載の株、または請求項１９乃至２１のいずれかに記載の方法によって得られる株、または請求項２２記載の細菌組成物の、食品または食物成分を生産するための使用方法。
前記食品または食物成分が、乳製品、肉製品、穀物製品、飲料、発泡物または粉末である請求項２３記載の使用方法。
請求項１乃至４のいずれかに記載の少なくとも１つの株、または請求項１９乃至２１のいずれかに記載の方法によって得られる少なくとも１つの株、または請求項２２記載の細菌組成物を含む食物または医薬組成物。
請求項１乃至４のいずれかに記載の少なくとも１つの株、または請求項１９乃至２１のいずれかに記載の方法によって得られる少なくとも１つの株、または請求項２２記載の細菌組成物を含む乳製品。
発酵乳、ヨーグルト、成熟クリーム、チーズ、フロマージュフレ、ミルク飲料、濃縮乳製品、プロセスチーズ、クリームデザート、カッテージチーズまたは乳児用ミルクである請求項２６記載の乳製品。
動物および／または植物を起源とするミルクを含む請求項２６または２７記載の乳製品。