JPWO2009150897A1 - 発酵乳の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2008年6月11日に、日本に出願された特願2008−152949号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌発酵乳等の生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)である前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株及び/又はビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15700株である前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳を提供するものである。
具体的には、ラクトコッカス・ラクチス由来のPrtP酵素として、NCBI(National center for Biotechnology Information)にアクセッション番号AY542690、AY542691等として遺伝子配列が登録されているPrtP酵素等が挙げられる。
1.ラクトコッカス・ラクチスの菌株のPrtP酵素保有性の検出
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676T(ATCC19257T)株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスATCC−9625株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスNBRC12007(NCDO 497)株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株、及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20128株が、PrtP酵素を保有しているか否かを確認した。
具体的には、ラクトース及びグルコースを0.5%添加したDifco(登録商標)M17 Broth(Becton,Dickinson社製)に、各菌株を3%接種し、30℃で16時間培養した。遠心分離により菌体を得、DNeasy Blood and Tissue kit(QIAGEN社製)を用いてDNAを抽出し、PCR法によりPrtP遺伝子の保有性を確認した。PCRは参考文献(Journal of Appieid Microbiology、2006年、第100巻、第1307〜1317ページ。)に記載の手法に準じて行った。プライマーは、フォワードプライマーGBf(GCAAATACGGTGACGGCTGCGA)及びリバースプライマーGB2r(TGAGCATTATAATAGGTCTTCTTCC)のプライマーセット、もしくはフォワードプライマーGHf(CAAATACGGTGACGGCTGCTAA)及びリバースプライマーGH2r(TAGCATTATAATAGGTCTTCGTCA)のプライマーセットを用いた。
まず、ラクトースおよびグルコースを0.5%添加したDifco(登録商標) M17 Broth(Becton,Dickinson社製)に、各菌株を3%接種し、30℃で16時間培養した。遠心分離により集菌し、洗浄後、元の培養液と同量の後述組成の乳性培地に懸濁し、シードカルチャーを得た。
次に、1%(W/W)グルコース、10%(W/W)還元脱脂粉乳を含む乳性培地を、95℃で30分間殺菌し、前記各菌株のシードカルチャーを3%接種し、30℃で16時間培養した。得られた培養液を急冷し、凝固状況、pH、及び含有される乳酸菌数を測定した。乳酸菌数の測定は、市販されているBCP加プレートカウント寒天培地(栄研器材社製)平板で行った。
まず、後記実施例1に記載の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を調製した。
また、ラクトースおよびグルコースを0.5%添加したDifco(登録商標) M17 Broth(Becton,Dickinson社製)に、ラクトコッカス・ラクチス各菌株を3%接種し、30℃で16時間培養した。遠心分離により集菌し、洗浄後、元の培養液と同量の後述組成の乳性培地に懸濁し、シードカルチャーを得た。
1%グルコース(W/W)、10%(W/W)還元脱脂粉乳を含む乳性培地を、90℃で10分間殺菌し、前記のように調製したラクトコッカス・ラクチスの各菌株のシードカルチャー1%と、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー1%を接種し、37℃で16時間培養して発酵乳を得た。前記発酵乳を急冷し、pH及び含有されるビフィズス菌数を測定した。測定結果を表2に示す。なお、ビフィズス菌数の測定は、TOSプロピオン酸寒天培地(ヤクルト薬品工業社製)平板で行った。
すなわち、PrtP酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスは、PrtP酵素遺伝子を有さないものと比べて、ビフィズス菌に対する増殖促進性が優れていること、PrtP酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスをビフィズス菌と混合培養することにより、ビフィズス菌の増殖促進効果が得られることが明らかである。
まず、上記3記載の方法で、PrtP酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676T株およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株のシードカルチャーを調製した。
次に、後記実施例1に記載の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャーを調製した。
また、0.2%(W/W)酵母エキス(Difco社製)入り10%(W/W)還元脱脂粉乳培地1000mLを90℃で30分間殺菌し、特許文献2記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株のカルチャーを30mL接種し、30℃で16時間培養して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株のカルチャーを調製した。
これとは別に、10%(W/W)還元脱脂粉乳培地を90℃で10分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676T株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株または、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株のカルチャー1%と、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー1%を接種し、37℃で16時間培養して発酵乳を得た。前記発酵乳を急冷し、pH及び含有されるビフィズス菌数を測定した。
一方、10%(W/W)還元脱脂粉乳培地を90℃で10分間殺菌し、上記のように調整したビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー1%と、特許文献1記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物「EZAL MA14」(Rhodia社製)2%を接種し、37℃でpHが4.6になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。なお、「EZAL MA14」は、特許文献1に記載の「EZAL MR014」(Rhodia社製)に相当する混合物である。
すなわち、特許文献1記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスを、ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、混合培養した場合には、ビフィズス菌の生育促進及び発酵時間の短縮という効果を十分に得ることができないことが明らかである。
また、特許文献2記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株を用いた発酵乳では、16時間発酵を行ってもpHが5.0以上で凝固せず、発酵乳にならなかった。発酵終了後のビフィズス菌数は1×108CFU/g以下であり、本発明のPrtP酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス菌株と比較して、ビフィズス菌の増殖促進作用は顕著に弱かった。
これらの結果から、PrtP酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスであるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676T株およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株は、ビフィドバクテリウム属菌に対して増殖促進作用に優れることが明らかになった。
10%(W/W)還元脱脂粉乳培地1000mLを90℃で30分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676T株のシードカルチャーを30mL接種し、25℃で16時間培養した。一方、0.2%(W/W)酵母エキス入り11%(W/W)脱脂粉乳培地1000mLを90℃で30分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを100mL接種し、37℃で6時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪0.5%(W/W)、無脂乳固形分8.0%(W/W)、蔗糖8.0%(W/W)、ペクチン0.2%(W/W)からなるベース50Lを、90℃で10分間殺菌し、40℃に冷却した。前記殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676Tのカルチャー50mLとビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー株500mLを接種し、37℃で16時間培養して発酵乳を得た。前記発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を15MPaの圧力で均質化し、200mL容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度0.7%、pH4.6、5.0×108CFU/gのビフィズス菌を含有していた。この前記ドリンクヨーグルトを10℃で14日間保存した時のビフィズス菌数は2.5×108CFU/gであり、生残率は50%であった。
1%グルコース入り10%(W/W)還元脱脂粉乳培地1000mLを90℃で30分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株のシードカルチャーを30mL接種し、25℃で16時間培養した。一方、0.2%(W/W)酵母エキス入り11%(W/W)脱脂粉乳培地1000mLを90℃で30分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ATCC15700株のシードカルチャーを100mL接種し、37℃で16時間培養した。また、10%(W/W)還元脱脂粉乳培地1500mLを90℃で30分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルス(ハンゼン社製)とラクトバチルス・ブルガリクス(ハンゼン社製)の混合カルチャー50mLを接種し、37℃で5時間培養した。
これとは別に、乳脂肪3.0%(W/W)、無脂乳固形分9.0%(W/W)からなる生乳50Lを70℃に加温し、15MPaの圧力で均質化した後、90℃で10分間殺菌し、40℃に冷却した。前記殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株のカルチャー500mL、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ATCC15700株のカルチャー500mL、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー5mLを接種し、500mL容の樹脂容器に充填し、密封し、37℃で6時間培養した後、直ちに冷却した。得られた発酵乳は乳酸酸度0.7%、pH4.6であり、4.8×108CFU/gのビフィズス菌を含有していた。この前記発酵乳を10℃で14日間保存した時のビフィズス菌数は1.8×108CFU/gであり、生残率は38%であった。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)である前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株及び/又はビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインATCC15700株である前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳を提供するものである。
Claims (4)
- 細胞壁局在性タンパク質分解酵素(cell wall−enveloped proteinase、PrtP)を有するラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)と、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法。
- 前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)である請求項1記載の発酵乳の製造方法。
- 前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株及び/又はビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15700株である請求項2又は3記載の発酵乳の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳。
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