ITMI20061841A1 - Colture liquide microbiche ad elevata stabilita' ed attivita' fermentativa - Google Patents

Description

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Albo Prdt,

DESCRIZIONE

Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo

“COLTURE LIQUIDE MICROBICHE AD ELEVATA STABILITA' ED ATTIVITÀ FERMENTATIVA"

A nome : MOFIN S . R . L . , società di nazionalità italiana con sede a NOVARA

Mandatari: Ing. Giuseppe Righetti iscritto all'Albo con il n. 7 BM, Ing. Carlo Raoul Ghioni iscritto all'Albo con il n. 280 BM, Ing. Martino Salvadori iscritto all'Albo con il n. 438 BM, Fabrizio Tansini iscritto all'Albo con il n. 697 BM, Ing. Gianmarco Ponzellìni iscritto all'Albo con il n. 901 BM, Dott. Roberto Margotti iscritto all'Albo con il n. 938 B, Ing. Matteo Baroni iscritto all'Albo con il n. 1064 BM, Dott. Marco Benedetto iscritto all'Albo con il n. 1089 B, Ing. Marco Brasca iscritto all'Albo con il n. 1094 B e Ing. Luigi Tarabbia iscritto all'Albo con il n. 1005 BM, della BUGNION S.p.A. domiciliati presso quest'ultima in MILANO - Viale Lancetti 17.

Depositato il: al n.:

La presente invenzione ha per oggetto una coltura

Alba 8B

lìquida microbica, preferibilmente ad inoculo diretto, caratterizzata da un numero di cellule microbiche per unità di volume di coltura superiore a quello delle analoghe colture lìquide 5 note/tradizionali e da un'aumentata stabilità ed attività fermentativa rispetto alle medesime. Detta coltura è, preferìbilmente, una coltura liquida starter .

Con il termine colture starter si intendono colture io batteriche comprendenti opportuni microorganismi che vengono aggiunti a numerosi alimenti per migliorarne le qualità alimentari (ad esempio, nutritive, igienico-sanitarie, organolettiche).

Le colture starter ad oggi note {ottenute con metodi 15 tradizionali, comunemente utilizzati nelle tecnologie di fermentazione) sono commercialmente disponibili in una varietà di forme: colture liquide, colture essiccate (di solito per spray- dry ing) , colture congelate, colture liofilizzate.

:o II procedimento per l'ottenimento della biomassa microbica da impiegare come starter prevede lo sviluppo della coltura batterica all'interno di un bioreattore, o fermentatore.

La modalità di crescita dei microrganismi nel

25 bioreattore più sfruttata a livello industriale è 21Μ0294.Ι2.ΠΓ9 Doti arguti]

Albo

quella cosiddetta in batch (a sistema chiuso); solo in alcuni casi, è utilizzata una modalità di crescita in continuo.

Nella modalità di coltura in batch i microrganismi vengono inoculati, sotto forma di coltura madre, in un determinato volume di terreno colturale liquido (variabile a seconda del bioreattore utilizzato), pre-trattato termicamente a 85°C-122°C per circa 15-40 minuti. Detto terreno colturale è costituito da svariate materie prime selezionate, a seconda del microrganismo che si desidera sviluppare, tra: acqua, fonti di azoto e/o di carbonio, sali minerali e attivatori di crescita, additivi.

Nei tempi successivi all' inoculo, effettuato alla temperatura ottimale di crescita della/e specie da riprodurre, le cellule del/i microrganismo/i entrano in una fase di crescita esponenziale, dopo un periodo iniziale di latenza necessario per la sintesi di nuovi enzimi e/o coenzimi. Al procedere di detta fase di crescita, le sostanze nutritive vengono consumate ed i prodotti della crescita (biomassa, metaboliti) si accumulano progressivamente. L'ambiente nutritivo all'interno del bioreattore è, perciò, soggetto a continue variazioni, che a loro volta provocano cambiamenti nel metabolismo cellulare.

La fase esponenziale di crescita dì cui sopra, dopo qualche tempo, ha termine e le cellule smettono di duplicarsi, essenzialmente per due ragioni:

esaurimento di uno o più nutrienti essenziali presenti nel terreno colturale e/o

- accumulo, fino a raggiungere livelli inibitori, di sostanze {metaboliti) generate dal metabolismo dei microrganismi stessi.

Detti metaboliti consistono, soprattutto, di acidi organici, come acido lattico e acetico, prodotti dalla fermentazione degli zuccheri. L'effetto principale consiste prevalentemente nell'abbassamento progressivo del pH del terreno/medium colturale. L'aumento della concentrazione idrogenionìca interessa dapprima il brodo colturale di crescita e successivamente, in seguito all'attraversamento della membrana cellulare, anche il citoplasma batterico. Inizialmente, la cellula compensa l'ingresso degli ioni idrogeno mediante una pompa idrogenionìca deputata alla secrezione degli ioni H<+>presenti nel citoplasma. Tuttavia, quando il pH cellulare diventa eccessivamente basso, la pompa idrogenionìca perde efficacia e la concentrazione idrogenionìca intracellulare tende ad aumentare.

Le conseguenze di questo fenomeno sono essenzialmente 21.M0294.12.IT9

due. Da un lato, risulta ostacolata l'ulteriore crescita cellulare e, dall'altro, diminuisce anche la vitalità della biomassa stessa, diminuendo, di conseguenza, l'attività fermentativa in sede di applicazione futura {ad esempio, durante la caseificazione) . La popolazione microbica raggiunge così la cosiddetta fase stazionaria, durante la quale non vi è né un incremento, né un decremento netto del numero di cellule.

Una coltura ottenuta con una modalità di produzione in batch, ha una conservabi1ita piuttosto limitata, dipendente dalle condizioni di conservazione e dallo stato fisiologico della biomassa al termine del processo di produzione. La refrigerazione rapida al termine dell'incubazione può permettere di conservare lo starter anche per 3-4 giorni senza perdite significative di vitalità ed attività.

La carica microbica per unità di volume di coltura (o concentrazione cellulare finale del/i microrganismo/i della coltura) che caratterizza le colture liquide starter ad oggi note, arriva, al massimo, a 0,5-1 miliardo di cellule/ml di coltura (espressa come CFU/ml, Colony Forming Unit/ml, cioè 0,5«10<S>-1*10<9>CFU/ml) ma, frequentemente, non supera i 200 milioni di cellule/ml di coltura (2*IO<8>CFU/ml).

La fase finale della preparazione di una coltura liquida starter consiste nel confezionamento, in adeguati ambienti sterili, di opportuni volumi di coltura (in genere 50 litri) contenente: acqua, la biomassa microbica, i metaboliti prodotti da detta biomassa durante la fase di crescita e gradualmente accumulatisi nel terreno colturale e residui dei componenti del terreno colturale.

Dette colture liquide starter vengono conservate ad una temperatura compresa da 3°C a 10°C, preferibilmente, da 3°C a 5°C. Pertanto, anche la distribuzione delle colture liquide starter deve, necessariamente, avvalersi della catena del freddo, con incidenze non trascurabili sul costo del prodotto finito .

Nella preparazione di colture disidratate (colture essiccate o liofilizzate) o congelate sono richiesti ulteriori passaggi, cioè:

- la separazione della biomassa microbica dal terreno colturale, mediante un opportuno processo di isolamento (solitamente, basato sull'impiego di passaggi di centrifugazione o di filtrazione);

lavaggio della biomassa stessa in un opportuno volume di un mezzo liquido, preferibilmente isotonico, per allontanare i residui del terreno 2 LM0294.I2.IT 9 uns AI

colturale;

riconcentrazione mediante filtrazione o centrifugazione ;

- disidratazione (solitamente per liofilizzazione) o 5 congelamento, previa aggiunta di opportuni crioprotettorì .

Le colture disidratate possono essere conservate anche a temperatura ambiente per periodi prolungati, e, di conseguenza, la loro distribuzione è più io semplice. Lo stoccaggio e la distribuzione di dette colture in condizioni refrigerate è, comunque, pur sempre preferibile, perché ne prolunga ulteriormente la vitalità.

L'impiego di colture liquide starter possiede il ìs notevole vantaggio di conferire al prodotto finale {ad esempio, lattiero-caseario) caratteristiche organolettiche migliori rispetto a quelle che è possibile ottenere con l'impiego di colture congelate o disidratate. La preparazione dì tipologie di 0 colture starter diverse da quelle liquide prevede, infatti, l'eliminazione dalla biomassa microbica dei metaboliti presenti nel terreno colturale. Detti metaboliti, tuttavia, contribuiscono in maniera significativa allo sviluppo dell'aroma e, più in 5 generale, delle caratteristiche organolettiche

complessive del prodotto finito: pertanto, la loro presenza nello starter risulta preferibile.

Le colture liquide starter note possono essere applicate mediante inoculo diretto delle materie prime da trasformare, oppure necessitano di alcuni passaggi intermedi di amplificazione della coltura stessa per aumentarne la popolazione batterica {inoculo semi-diretto). La maggior parte delle colture liquide starter rientra nella seconda categoria e richiede, pertanto, da 1 a 4 passaggi di riproduzione microbica. Detta operazione richiede conoscenze e attrezzature adeguate per evitare possibili contaminazioni con inquinanti o fagi, squilibri della composizione e/o perdita di attività biologica della coltura stessa.

Pertanto, l'utilizzo di colture liquide starter ad inoculo diretto si propone, in linea di principio, come vantaggioso rispetto alle colture ad inoculo semi-diretto, che richiedono tempi più lunghi ed apparecchiature supplementari per poter effettuare la fase di amplificazione della coltura stessa.

Nel settore lattiero-caseario, ad esempio, la quantità di coltura liquida starter necessaria varia da un prodotto lattiero-caseario all'altro, in relazione all'inoculo previsto per ciascun tipo di 21 M0294.12.IT.9 Doti. Ri gòtti Albo 18 B

caseificazione ed alla densità cellulare della coltura.

In generale, con l'inoculo si tende ad ottenere nel latte una concentrazione di cellule vitali di almeno 5 10-25 milioni di cellule/ml (1·10<7>-2,5*10<7>CFU/ml).

Dal momento che una coltura starter commerciale/tradizionale contiene al massimo 0,5·10<9>-1·IO<9>CFU/ml, 1'inoculo rappresenta, in volume, da 1% a 5% del volume complessivo del latte. Perciò, io saranno necessari 10-50 litri di coltura starter di tipo tradizionale per inoculare 1000 litri di latte e realizzare poi l'attività fermentativa necessaria, misurabile dall'abbassamento del pH del latte stesso in funzione del tempo.

is L'esempio precedente ha illustrato come i volumi in gioco siano considerevoli e, pertanto, di difficile gestione, soprattutto in relazione alla rete distributiva .

Inoltre, la ridotta conservabilità (4-5 giorni al 20 massimo, quando la temperatura di conservazione della coltura è compresa da 3 °C a 5°C) delle colture liquide starter note ne pregiudica la possibilità di sopportare tempi di trasporto più lunghi, limitandone, perciò, 1'impiego alle regioni più

25 vicine al centro produttore. La gestione delle -

IO

Ι Μ0294.12 ΓΤ 9 -Don arami Albo 1 938 B

colture liquide starter note, soprattutto di quelle ad inoculo diretto, comporta, nel suo insieme, seri problemi logistici a causa dei loro notevoli volumi e della ridotta conservabìlità.

Per le ragioni sopra citate, le colture liquide starter note, sono state quasi universalmente sostituite dalle colture disidratate e dalle colture congelate- Tuttavia, i prodotti lattiero-caseari ottenuti con dette colture possiedono caratteristiche organolettiche complessive meno valide rispetto ai prodotti preparati con l'impiego di colture starter liquide .

Resta, pertanto, viva la necessità di poter disporre di colture starter che possiedano, allo stesso tempo, le caratteristiche favorevoli delle colture liquide starter (con particolare riferimento alle migliori proprietà organolettiche dei prodotti da esse ottenuti), come pure la maggiore facilità gestionale complessiva che caratterizza le colture congelate o disidratate.

Colture liquide starter aventi le caratteristiche sopra menzionate non sono, a tutt'oggi, note.

Scopo della presente invenzione è quello di dare una adeguata risposta alla necessità sopra evidenziata. Questo scopo ed altri ancora, che risulteranno chiari

1 !

2Ι.Μ0294.1ΖΓΓ.9 "BotiR

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dalla descrizione dettagliata che segue, sono stati raggiunti dalla Richiedente, la quale ha inaspettatamente trovato che, controllando opportunamente il pH del terreno colturale durante la 5 fase di produzione della biomassa, è possibile realizzare una coltura liquida starter finale caratterizzata da un arricchimento del numero di cellule rispetto a quello delle colture liquide starter tradizionali.

io Forma, quindi, un oggetto della presente invenzione la coltura liquida starter di cui sopra, come riportato nella unita rivendicazione indipendente. Forma un altro oggetto della presente invenzione un metodo per produrre detta coltura liquida starter, le 15 cui caratteristiche sono riportate nella unita rivendicazione indipendente.

Forma poi un altro oggetto della presente invenzione l'uso della coltura liquida starter di cui sopra per la preparazione di prodotti dell'industria 20 alimentare, come riportato nella unita rivendicazione indipendente

Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso di detta coltura liquida starter nel settore lattiero-caseario .

a Forme di realizzazione preferite della presente 21.Μ0294Ι2.ΓΓ.9 Dutt arguii)

938 B

invenzione sono riportate nelle unite rivendicazioni dipendenti .

Nel contesto della presente invenzione, con il termine conservabilità di una coltura liquida starter si intende l'intervallo di tempo entro cui la concentrazione di cellule microbiche vitali presenti in detta coltura si mantiene pressocché costante.

Con il termine concentrazione cellulare si intende il numero di cellule microbiche vitali {misurato in termini di unità formanti colonia, colony- forming units o CFU) per unità di volume di coltura.

La determinazione della concentrazione cellulare viene effettuata mediante una o più conte vitali, generalmente in piastra. Tale metodo consiste nel determinare il numero di cellule, presenti in un terreno di fermentazione, capaci di formare colonie in piastre da laboratorio contenenti un opportuno volume (generalmente 10 mi) di un terreno agarizzato. L'attività fermentativa di una coltura liquida starter viene determinata misurando la diminuzione, col tempo, del pH di un preciso volume di un liquido opportuno, preferibilmente un latte, in seguito all'inoculo con un determinato volume di detta coltura .

La conservabilità di una coltura liquida starter è 21M0294.12.IT.9 Doni Margotti Albo 93£ B

legata al mantenimento nel tempo dell'attività fermentativa di detta coltura e dipende dallo stato fisiologico medio della popolazione batterica al momento della preparazione. Una coltura liquida starter può essere definita valida/efficace finché la sua capacità di abbassare il pH di un volume di un liquido opportuno, generalmente un latte, si mantiene pressoché invariata nel tempo.

Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione sono evidenziati nella descrizione dettagliata che segue; inoltre, sono ulteriormente illustrate, a titolo di esempio, anche nelle allegate Tavole 1-4 e nelle allegate Tabelle 1-4, correlate a dette tavole, in cui:

- la Tavola 1 riporta in grafico, l'andamento nel tempo del pH di una coltura liquida starter nota (identificata come "non arricchita") e di quello di una coltura liquida starter secondo la presente invenzione (identificata come "arricchita"), sia durante la fase di produzione, sia durante la fase di conservazione di dette colture; le misurazioni sono state effettuate, rispettivamente, fino a 6 giorni dal confezionamento, per la coltura tradizionale, e fino a 15 giorni dal confezionamento, per la coltura arricchita; la fase di conservazione di entrambe le 21 M0294 12.IT.9 Dot

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colture avviene ad una temperatura mediamente compresa da 4°C a 5°C;

- la Tavola 2 riporta i valori delle concentrazioni cellulari, rispettivamente, di una coltura liquida starter tradizionale (non arricchita) e di una coltura liquida starter secondo l'invenzione (arricchita), ottenute tramite i rispettivi metodi di produzione,· detti valori di concentrazione sono espressi in CFU/ml (il termine nE+p in ordinata, corrisponde a η·10<ρ>CFU/ml);

la Tavola 3 riporta in grafico l'attività fermentativa di una coltura liquida starter non arricchita e, rispettivamente, quella di una coltura liquida starter arricchita secondo l'invenzione; dette attività sono espresse riportando l'andamento nel tempo dell'abbassamento del pH di un latte inoculato con dette colture; la coltura liquida starter non arricchita è stata inoculata al 5% in volume (V/V), mentre la coltura liquida starter arricchita è stata inoculata allo 0,5% in volume, cioè 10 volte inferiore; il grafico evidenzia chiaramente che la coltura liquida starter arricchita secondo la presente invenzione mostra la stessa attività fermentativa, rispetto alla coltura nota non arricchita, ad una dose più bassa di 10 volte 21.M0294.12.1T.9 Don

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(quindi, a parità di dose, è caratterizzata da un'attività fermentativa 10 volte superiore);

- la Tavola 4 riporta la conservabilità (espressa in giorni) di una coltura liquida starter non arricchita e, rispettivamente, quella di una coltura liquida starter arricchita secondo l'invenzione; la conservabilità è stata valutata mediante la misurazione a tempi successivi dell'attività fermentativa della coltura;

- la Tabella 1 riporta i valori di pH relativi alle varie fasi di produzione e di conservazione che hanno dato origine ai grafici della Tavola 1;

- la Tabella 2 riporta i valori di concentrazione cellulare, espressi come CFU/ml, che hanno dato origine all'istogramma della Tavola 2;

- la Tabella 3 riporta i valori di pH che hanno dato origine alla Tavola 3;

la Tabella 4 riporta i dati di stabilità delle colture, durante la conservazione ad una temperatura compresa da 3°C a 5°C, che hanno dato origine alla Tavola 4.

La presente invenzione è diretta ad una coltura liquida starter ("arricchita") comprendente almeno un microrganismo fisiologicamente compatibile con l'organismo umano e/o animale, caratterizzata dal 2I.M0294.I2.IT.9 arguii ì Albo 938 B

fatto che la concentrazione cellulare di detto microrganismo in detta coltura (indicata anche con il termine "carica microbica'') è superiore a quella massima delle colture liquide starter note.

In una realizzazione dell'invenzione, detto microrganismo è scelto tra ceppi batterici aventi valenza probiotica.

La concentrazione cellulare di detta coltura liquida starter secondo la presente invenzione è, di norma, >1,5 volte rispetto a quella delle colture liquide starter note.

In una realizzazione dell'invenzione, detta coltura liquida ha una concentrazione cellulare ≥2,5 volte la concentrazione delle colture liquide starter note; preferibilmente, detta concentrazione è ≥6 volte quella delle colture liquide starter note.

Più preferibilmente, detta concentrazione è ≥10 volte quella delle colture liquide starter note.

La coltura liquida starter secondo la presente invenzione è, quindi, caratterizzata da una concentrazione cellulare >10<9>CFO/ml di coltura; preferibilmente, >1,5·IO<9>CFU/ml di coltura.

In una realizzazione preferita dell'invenzione, la coltura liquida starter di cui sopra è caratterizzata da una concentrazione cellulare >2,5·IO<9>CFU/ml di

coltura; preferibilmente, ≥6·10<9>CFU/ml. Più preferibilmente, detta concentrazione è ≥10<10>CFU/ml.

Del tutto inaspettatamente, la coltura liquida starter secondo la presente invenzione si è mostrata caratterizzata anche da un'eccellente conservabìlità. La coltura liquida starter secondo la presente invenzione è caratterizzata da una conservabìlità superiore a quella delle colture liquide starter note.

In una realizzazione preferita dell'invenzione, la coltura liquida starter di cui sopra ha una conservabìlità ≥l,S volte la conservabìlità delle colture liquide starter note; preferibilmente, detta conservabìlità è >2,5 volte. Più preferibilmente, detta conservabìlità è ≥4 volte la conservabìlità delle colture liquide starter note.

La coltura liquida starter secondo la presente invenzione è, quindi, caratterizzata da una conservabìlità ≥6 giorni, ad una temperatura di conservazione mediamente compresa da 3°C a 5°C.

In una realizzazione preferita dell'invenzione, detta coltura liquida starter ha una conservabìlità >7,5 giorni; preferibilmente, detta conservabìlità è ≥10 giorni. Più preferibilmente, detta conservabìlità è ≥13 giorni.

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La conservabilità è sempre valutata con riferimento ad una temperatura di conservazione mediamente compresa da 3°C a 5°C.

Vantaggiosamente, la coltura lìquida starter secondo la presente invenzione possiede un'attività fermentativa superiore a quelle delle colture liquide starter note.

Detta attività fermentativa è mediamente risultata di almeno 2 volte superiore rispetto a quella delle colture liquide starter note.

In una realizzazione preferita dell'invenzione, detta coltura liquida starter ha una attività fermentativa compresa da 4 a 35 volte l'attività fermentativa delle colture liquide starter note; preferibilmente, detta attività è compresa da 8 a 30 volte. Più preferibilmente, detta attività fermentativa è compresa da 12 a 25 volte l'attività delle colture liquide starter note.

La coltura liquida starter in accordo con la presente invenzione è preferibilmente una coltura ad inoculo diretto.

Il metodo per l'ottenimento di una coltura liquida starter arricchita secondo la presente invenzione comprende almeno una fase consistente nel controllare il pH del terreno colturale. Detta fase di controllo

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del pH può essere applicata tanto ad una modalità dì crescita della biomassa microbica in batch che in continuo.

Durante detta fase di controllo, il pH viene mantenuto, di norma, in un intervallo compreso da 4,5 a 7,0; preferibilmente, detto intervallo di pH è compreso da 5,5 a 6,5; più preferibilmente, da 5,6 a 6,2.

In una realizzazione preferita, il pH è compreso da 5,7 a 6,0.

Per realizzare il controllo di pH sopra descritto la Richiedente ha trovato utile aggiungere al terreno colturale dì crescita dei microorganismi almeno una base od una opportuna miscela di basi.

Preferìbilmente, detta almeno una base viene addizionata al terreno colturale di crescita dei microrganismi in modo progressivo, così da assicurare il mantenimento del pH entro i valori sopra indicati per il tempo necessario ad ottenere il desiderato grado di crescita del/i microrganismo/i.

La base è scelta dal gruppo comprendente; ione carbonato, nelle forme mono- e/o bi-basiche, ammoniaca, idrossidi, ad esempio, d'ammonio, di sodio, di potassio ed altri, ione fosfato, nelle forme mono- e/o bi- e/o e tri-basiche, ione solfato, 2IM029412IT.9 DonRo

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nelle forme mono- e/o bi-basiche, ione citrato, ione tartrato, altre basi fisiologicamente compatibili con i microrganismi della coltura, e/o miscele delle stesse.

In una realizzazione preferita la base utilizzata per il mantenimento di valori pressoché costanti di pH del terreno colturale è lo ione carbonato, nelle forme mono e/o bi-basiche; detto ione carbonato è derivato da qualunque opportuna fonte dello stesso: preferibilmente, dalla dissoluzione del carbonato di calcio.

In un'altra realizzazione preferita, la base utilizzata è l'ammoniaca e/o l'idrossido d'ammonio. La base neutralizza gli ioni idrogeno derivanti dalla dissociazione degli acidi organici che si formano durante la fermentazione dei diversi substrati organici ad opera della biomassa microbica.

Detta fase di controllo del pH del terreno colturale viene, preferibilmente, avviata in modo automatico quando il terreno colturale raggiunge una prefissata soglia di pH, dopo un intervallo di tempo dipendente dal tipo di microrganismo in crescita e dalle condizioni colturali impiegate.

La durata della fase di controllo del pH (cioè, il tempo durante il quale detta almeno una base viene 2LM0294 I2.n4 Doti oh rguni - Al 38 B

aggiunta progressivamente al terreno colturale) viene protratta per un tempo generalmente pari a quello necessario al microrganismo per subire da 2 a 5 divisioni cellulari, o duplicazioni cellulari, durante la fase esponenziale di crescita. Il tempo necessario al verificarsi di una duplicazione cellulare varia a seconda del tipo di microrganismo e delle condizioni di coltura adottate per detto microrganismo. Detto tempo di duplicazione viene determinato a priori per ogni singolo microrganismo tramite metodi noti, comunemente impiegati da tutti i tecnici del settore.

Terminata la suddetta fase di controllo del pH, il pH medesimo viene lasciato scendere spontaneamente e gradualmente per un tempo compreso da 0,5 volte a 1 volta il tempo necessario al/i microrganismo/ì per subire una duplicazione cellulare. Il valore finale di pH ottenuto è variabile da specie a specie.

Il pH finale della coltura liquida starter così ottenuta è generalmente compreso da 4,7 a 5,6; preferibilmente, è compreso da 5,0 a 5,2,

A questo punto, la coltura finale contenente l'acqua, la biomassa microbica, i metaboliti prodotti da detta biomassa durante la fase di crescita e gli eventuali residui dei componenti del terreno colturale, viene 1.Μ029412.ΓΓ.9 ttfj#tj<'>t ar;

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raffreddata ad una temperatura compresa da 4°C a 8°C a dare il prodotto finito, cioè la coltura liquida starter arricchita secondo la presente invenzione. La coltura liquida starter arricchita così ottenuta, viene direttamente confezionata e conservata a 3-5°C, in attesa di essere inviata all'impiego commerciale bìotecnologico per la quale è stata prodotta.

Con il metodo di controllo del pH del mezzo colturale sopra descritto, è stato possibile ottenere vantaggiosamente, in modo riproducibile, un maggiore sviluppo della biomassa nell'ambiente del bioreattore, una maggiore vitalità, una maggiore conservabilità, un'aumentata attività fermentativa della biomassa stessa.

Altrettanto vantaggiosamente, la coltura starter ottenuta con il metodo della presente invenzione è risultata sostanzialmente priva di zuccheri residui. Infatti, si è trovato che, durante la fase esponenziale di crescita secondo il metodo della presente invenzione, viene realizzato uno sfruttamento pressoché completo delle fonti di carbonio e/o di energia (in particolare, degli zuccheri) presenti come materie prime costituenti il terreno colturale. Tale situazione consente di ridurre notevolmente (se non di eliminare

completamente) la fase, cosiddetta di postacidificazione, che nelle colture starter note si verifica spontaneamente successivamente al confezionamento della coltura, proprio a causa della presenza di quantità residue significative di detti zuccheri. Detta fase di post-acidificazione influenza negativamente la stabilità del prodotto finito, a causa dell'utilizzo degli zuccheri residui da parte della biomassa, con conseguente ulteriore produzione di acidi organici ed ulteriore abbassamento del pH della coltura liquida starter.

La post-acidificazione, che avviene inevitabilmente nelle colture liquide starter note, abbassa, quindi, il pH della coltura fino a valori (variabili da specie a specie microbica) compresi da 4,0 a 4,6, talora anche inferiori a 3,8, in tal modo influendo negativamente sulla vitalità e sulla conservabilità della coltura stessa.

L'inaspettata eliminazione sostanziale della fase di post acidificazione si è rivelata come uno dei possibili fattori che contribuiscono al miglioramento della stabilità del prodotto finale.

Come esempio, assolutamente non limitante, di realizzazione, viene di seguito illustrato un metodo avente valenza generale per la preparazione di una 21.Μ0294.12.ΓΓ9 ιβRiha

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coltura liquida starter arricchita, in cui detto metodo preferenzialmente comprende le seguenti fasi: a) bonificare il bioreattore mediante vapore fluente; preferibilmente, per 30 minuti;

b) sottoporre a trattamento termico il terreno colturale, all'interno del reattore; preferibilmente, a 85C°-90°C per 20-30 minuti;

c) raffreddare il terreno colturale fino alla temperatura di inoculo del microrganismo usato;

d) inoculare il terreno di cui alla fase c) con una quantità efficace di coltura madre di almeno un microrganismo batterico, o di una miscela di microorganismi ;

e) attendere l'inizio della fermentazione e dell'ingresso della biomassa batterica nella fase esponenziale di crescita, per un tempo dipendente dal tipo/i di microrganismo/i impiegato/i;

f) controllare il pH del terreno colturale, mantenendolo in un intervallo compreso da 5,7 a 6,0, tramite aggiunte progressive di idrossìdo d'ammonio e/o carbonato, preferibilmente, per il tempo necessario al verificarsi di 2-5 duplicazioni cellulari del/i microrganismo/i,-g) lasciare scendere spontaneamente il pH del terreno colturale fino ad un valore compreso da 5,0 a 5,2; 21.Μ0294.12ΓΓ.9 “va ,ο

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preferìbilmente, in un intervallo di tempo sufficiente al verificarsi di un'ulteriore duplicazione cellulare;

h) raffreddare la coltura di cui alla fase g), fino 5 ad una temperatura compresa da 4°C a 8°C;

i) confezionare detta coltura di cui alla fase h) in condizioni di sterilità.

In una realizzazione preferita, il terreno colturale di cui alla fase b) comprende (quantità relative ad ÌO un litro di terreno colturale): peptoni di caseina, lOg ; estratto di carne, 5g; estratto di lievito, 10g; MgS04, 20Omg; destrosio, 20g; Tween 80, ImL; acqua quanto basta a raggiungere IL di terreno colturale finale .

15 In casi particolari, il trattamento termico del terreno colturale di cui alla fase b) può essere effettuato a 121C° per 15 min.

La temperatura di inoculo di cui alla fase c) può assumere valori mediamente compresi da 18C° a 47C°, a 0 seconda del microrganismo impiegato, delle relative condizioni di crescita richieste dal medesimo e dal quantitativo di inoculo utilizzato.

Ad esempio, per i microorganismi mesofìli , la temperatura è, preferibilmente, compresa da circa

25 18°C a circa 32°C; per microorganismi termofili, la

Albo

temperatura è, preferibilmente, compresa da circa 37°C a circa 45°C.

La percentuale di inoculo (V/v) di cui al punto d) può variare mediamente da 0,5% a 10%, a seconda del/i microrganismo/i da coltivare, delle caratteristiche del terreno colturale, delle condizioni di sviluppo della biomassa microbica.

Detto inoculo è realizzato tramite la preparazione, in apposito bioreattore, con metodi noti, di una coltura "madre" del/i microorganismi/i desiderati.

Detta coltura madre viene a sua volta preparata a partire da un campione, derivante da una banca di cellule, per successive sub coltivazioni, o amplificazioni, in volumi di terreno progressivamente crescenti.

Detta coltura madre può essere utilizzata anche in forma disidratata, nel caso in cui si lavori con volumi di terreno di fermentazione mediamente minori di circa 10000 L. In questo caso, l'inoculo è, preferibilmente, tale da fornire mediamente 10-25·10<6>CFU/ml al terreno colturale inoculato.

La coltura madre così ottenuta viene successivamente inoculata e fatta sviluppare nel terreno colturale sopra descritto.

Preferibilmente, a livello del bioreattore si 2 LM0294.I2.IT .9 Don.

adottano accorgimenti atti ad evitare il più possibile i rischi di contaminazione: l'aria in ingresso nella camera di fermentazione viene filtrata attraverso filtri sterili; la camera stessa è $ sterilizzata con vapore ad alta temperatura tra una produzione e l'altra; gli elettrodi utilizzati per il controllo del pH ed i sensori di temperatura vengono anch'essi sterilizzati; la produzione della biomassa avviene in condizioni di sovrapressione di aria oÌOazoto sterili.

In una realizzazione particolarmente preferita, il confezionamento primario della coltura liquida starter arricchita, sopra descritta, mira anch'esso a ridurre, in modo pressoché completo, i rischi di i5 contaminazione del prodotto, ed avviene in specifici ambienti sotto un flusso laminare di aria sterile. Il confezionamento viene, preferibilmente, effettuato in sacchetti da 3 a 5 litri in polietilene e alluminio, che vengono riempiti mediante pompa 20 peristaltica e tubi di silicone autoclavabili, quindi sterilizzati e direttamente collegati al bioreattore. La saldatura dei sacchetti avviene anch'essa in condizioni di sterilità. La conservazione della coltura liquida starter della presente invenzione,25nei tempi successivi al confezionamento, ne prevede

il mantenimento preferenziale ad una temperatura di 0-10°C; più preferibilmente, di 3-5°C,

In una realizzazione preferita, la coltura liquida starter secondo l'invenzione comprende almeno un ceppo microbico Co una miscela di più ceppi microbici) scelto dal gruppo comprendente i generi: Lactobaci 1 lus , Bìfidobacterium , Lactococcus , Pedìococcus, Leuconostoc , Streptococcus , Bacillus , Propionibac ter rum, Saccharomyces, Enterococcus , Staphylococcus .

Preferìbilmente, del genere Lactobaci 1 lus hanno trovato impiego le specie: L. pentosus, L . piantarceli, L. casei, L, caseì ssp. paracasei, L. casei ssp, rhamnosus , L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. fermentimi, L. passeri .

Preferibilmente, del genere Bìfidobacterium hanno trovato impiego le specie: B. longum, B. breve, B. lactis, B, adolescentìs , B. pseudocatenulatum, B. catenulatum.

Preferibilmente, del genere Lactococcus hanno trovato impiego le specie: L. lactis e L. lactis ssp. lactis . Preferibilmente, del genere Streptococcus ha trovato impiego la specie S. thermophilus .

Preferibilmente, del genere Staphylococcus ha trovato impiego la specie S. xylosus .

Tra le specie batteriche sopra citate,

particolarmente preferiti si sono dimostrati, ad

esempio, i ceppi batterici riportati nella seguente

Tabella 5 .

TABELLA 5

Numero di Data dì

Nome Depositante deposito deposito Streptococcus

LMG P-18383 5.05.1998 ANIDRAL S.R.L. thermophilus

streptococcus

LMG P-18384 5.05.1998 ANIDRAL S.R.L. thermophi 2 us

Laboratorio Laccataci llus Microbiologico

LMG P-21019 16 . 10.2001

pentosus Grana Provolone SRL Laboratorio Lactobacìllus Microbiologico

LMG P-21020 16.10.2001

plantarum Grana Provolone SRL Laboratorio Lactobacìllus Microbiologico

LMG P-21021 16.10.2001

plantarum Grana Provolone SRL Laboratorio LactobaciU us Microbiologico

LMG P-21022 16.10.2001

plantarum Grana Provolone SRL Laboratorio Lactobacìllus Microbiologico

LMG P-21023 16.10.2001

plantarum Grana Provolone SRL

5 Lactococcus lactis

LMG P-21388 31.01.2002 MOFIN S.R.L. ssp . lactis

tM0294.12.IT,9 Doti ben

delbrueckii ssp. DSM 16606 20.07.2004 ANIDRAL S.R.L. bui cari cus

Lactobacillus

delbrueckii ssp. DSM 16607 20.07.2004 ANIDRAL S.R.L, bulgaricus

Streptococcus

DSM 16590 20 .07.2004 ANIDRAL S.R.L. thermophilus

Streptococcus

DSM 16591 20.07 .2004 ANIDRAL S.R.L. thermophilus

Streptococcus

DSM 16592 20.07.2004 ANIDRAL S.R.L. thermophilus

Streptococcus

DSM 16593 20.07.2004 ANIDRAL S.R.L. thermophilus

DSM 18297 24 .05.2006 ANIDRAL S.R.L. fermen curo

3 Streptococcus DSM 18625 TT. 09 .2006 MOFIN S . R . L7 thermophil us

Tra i ceppi batterici riportati in Tabella 5 , quelli compresi dal numero 51 al numero 63, appartenenti al genere Streptococcus, specie t herwophilus , sono nuovi e sono stati depositati al DSM2 ("-Deutsche Sammlung von Mi kroorgani smen und Zellkul turen GmbH" : 21.M0294.12.iT.ii tt Rob

Albo 938 B

Inhof f enstr . 7B , D- 38124 Braunschweig, Germany) in data 13 . 09.2006 , rispettivamente, con i numeri di accesso : DSM 18613 ; DSM 18614 ; DSM 18615 ; DSM 18616 ; DSM 18617 ; DSM 18618 ; DSM 18619 ; DSM 18620 ; DSM 18621 ; DSM 18622 ; DSM 18623 ; DSM 18624 ; DSM 18625.

Come tali, detti ceppi fanno parte della presente invenzione, come riportato nella rivendicazione indipendente allegata.

Caratterizzazione dei nuovi ceppi,

I nuovi ceppi di Tabella 5 {quelli compresi dal numero 51 al numero 63) sono stati isolati da diversi campioni di latte vaccino e di lattoinnesti naturali, dopo opportuni trattamenti secondo quanto comunemente previsto dalla tecnica nota del settore.

Metodo di coltivazione:

medium M17 broth secondo Terzaghi (Merck ref.

1.15029);

sterilizzazione: 15 min a 121°C;

pH prima della sterilizzazione = 7,35 ± 0,5;

pH dopo sterilizzazione = 7,01 ± 0,5;

incubazione: 4h a 44°C;

conservazione: -25°C;

test di vitalità: curva di acidificazione in latte a 44°C.

Descrizione :

2ΙΜ0294.12.ΓΓ.9 DOE arguti!

Albo 938 B

si presentano come cellule sferiche in catene corte; anaerobi facoltativi; gram positivi; catalasi negativi; non crescono a 10°C con bile al 40% e NaCl al 6,5%; crescita a 45°C; non danno origine a βemolisi; idrolizzano arginina ed esculina; producono acido L-lattico; pH finale dopo crescita in un terreno contenente glucosio come fonte di energia = 4,0-4,5; pH finale dopo crescita nel latte = 4,3-4,5. Per quanto riguarda i ceppi noti riportati in Tabella 5, i medesimi sono stati isolati (a seconda del tipo di ceppo), preferibilmente, da campioni di latte animale secondo tecniche note nel settore; oppure (in particolare per quanto si riferisce ai ceppi probiotici) , sono stati isolati, preferìbilmente, da materiale fecale umano secondo tecniche note nel settore (eventualmente, anche ricorrendo a tecniche di brushing intestinale).

Ad esempio, i ceppi appartenenti al genere Streptococcus , specie thermophi 1 us, indicati ai numeri 1,2,17,18,24-27,36-38 di Tabella 5, hanno le stesse caratteristiche di quelli sopra menzionati. I ceppi appartenenti al genere Bifi doba cterium (indicati ai numeri 10-12,19,20,28-32,34,47-50 di Tabella 5)sono caratterizzati da:

crescita in Trypticase-phytone-yeast extract medium 2].M029412,IT,9 Doti miti 8B

(TPY) a 37°C;

si presentano come bastoncelli di varie forme; gram positivi; non veloci nella produzione dì acidi; non formano spore; non mobili; anaerobici; degradano il glucosio esclusivamente tramite lo shunt del fruttosio-6-fosfato.

In particolare, i ceppi indicati ai numeri 28-32 di Tabella 5 sono caratterizzati dal fatto di essere produttori di acido folico.

II ceppo appartenente al genere Lactobacillus specie case! ssp. rhairmosus (indicato al numero 21 dì Tabella 5) è caratterizzato da:

crescita in brodo colturale MRS (DIFCO, ref. 288130} a 37°C;

si presenta come bastoncelli, spesso con le estremità quadrate e tendente a formare catene; eterofermentante facoltativo; produce acido L-lattico; in grado di crescere a temperature comprese da 15°C a 45°C; ha una resistenza naturale alla vancomicina .

I ceppi appartenenti al genere Lactobacillus specie delbrueckii ssp. bulgaricus {indicati ai numeri 22,23 di Tabella 5) sono caratterizzati da:

crescita in brodo colturale MRS {DIFCO, ref. 288130) a 37°C;

21.M0294.12.IT.9 arguiti 938 B

sì presentano come bastoncelli con le estremità arrotondate, singoli ed in catene corte; crescono bene a 45°C; non generano spore; gram positivi; omofermentanti obbligatori; producono acido D-lattico; fermentano solo fruttosio, glucosio e lattosio.

I ceppi appartenenti al genere Lactobacìllus, specie plantarum (indicati ai numeri 4-7,13,16,35, dì Tabella 5) sono caratterizzati da:

crescita in brodo colturale MRS (DIFCO, ref. 288130) a 30<0>C;

si presentano come bastoncelli corti, singoli ed in catene corte; crescono bene a 30<0>C; non generano spore; gram positivi; eterofermentanti facoltativi. I ceppi appartenenti al genere Lactobacìllus specie fermentimi (indicati ai numeri 39-42 di Tabella 5) sono caratterizzati da:

origine: da brushing intestinale;

crescita in brodo colturale MRS (DIFCO, ref. 288130) a 37°C;

si presentano come bastoncelli corti; crescono bene tra 37°C e 45°C ,- eterofermentanti obbligati; producono acido DL-lattico.

I ceppi appartenenti al genere Lactobacìllus specie gas seri (indicati ai numeri 43-46 di Tabella 5) sono

caratterizzati da:

origine: da brushing intestinale;

crescita in brodo colturale MRS (DIFCO, ref. 288130) a 37<0>C;

si presentano come bastoncelli con le estremità arrotondate, singoli ed in catene,* crescono bene tra 37°C e 45<0>C; omoferraentanti obbligati; producono acido DL-lattico.

Il ceppo appartenente al genere Staphylococcus , specie xylosus (indicato al numero 33 di Tabella 5) è caratterizzato da:

crescita in brodo colturale MI7 secondo Terzaghi (Merck ref. 15029) a 37°C;

si presenta come sfere di diametro 0 = 0.8-1,2μιη; come celle singole, doppie o tetradi; anaerobico facoltativo; crescita ottimale in condizioni aerobiche a 25-35°C; crescita buona a concentrazioni di NaCl fino a 10%; produttore di catalasi; riduce i nitrati ed ha attività di fosfatasi alcalina.

Gli altri ceppi di Tabella 5 hanno mostrato di possedere caratteristiche analoghe, rispettivamente, a quelle dei ceppi appartenenti al medesimo genere. La coltura liquida oggetto della presente invenzione viene vantaggiosamente utilizzata come starter per la preparazione di prodotti dell'industria alimentare 2I.MG29412.IT.9 Don,

ΆΙΙ

(ad esempio, prodotti lattiero- caseari , quali, formaggi, yogurt, latti fermentati; pane, prodotti da forno, salumi e insaccati in genere, bevande alcoliche) .

In una realizzazione preferita, detta coltura liquida starter viene utilizzata per la preparazione di prodotti dell'industria lattiero-casearia; i prodotti lattiero-caseari ottenuti possiedono almeno tutte le caratteristiche organolettiche ottenìbili con le colture liquide starter note.

L'inoculo del latte in caldaia con una coltura liquida starter arricchita è mediamente inferiore a 1% in volume (V/V) rispetto al volume totale del latte da trattare; preferibilmente, detto inoculo è compreso da 0,2% a 0,8% (V/V) rispetto al latte; più preferìbilmente, è compreso da 0,3% a 0,6% (V/V); vantaggiosamente, è ≤0,5% (V/V) .

Pertanto, a parità di volume di latte da inoculare, è sufficiente l'utilizzo di un volume più ridotto di coltura liquida starter arricchita. Per l'inoculo di 1000 litri di latte, ad esempio, saranno vantaggiosamente sufficienti da 3 a 6 litri di coltura starter secondo la presente invenzione, invece dei 10-50 litri richiesti per 1'inoculo dello stesso quantitativo di latte con una coltura liquida 21 Μ0294.12.ΓΤ.9 Doti Riibi

Albo3⁄4S B

starter nota. Tale volume di coltura liquida starter arricchita corrisponde, in termini di resa fermentativa, misurabile dall'abbassamento dei valori di pH del latte in funzione del tempo, a 10-50 litri 5 di una coltura liquida starter commerciale nota.

La maggiore conservabilità della coltura liquida starter arricchita consente di ridurre la frequenza con cui detta coltura viene distribuita ai caseifici, oltre che di coprire complessivamente distanze e io tempi di trasporto maggiori senza perdita dell'attività fermentativa, qualitativa e quantitativa, necessaria a garantire le caratteristiche di aspetto, di gusto e di aroma del prodotto finale della caseificazione,

ìs A titolo di esempio, assolutamente non limitativo, viene qui di seguito riportata la preparazione di alcune colture liquide starter particolarmente preferite dell'invenzione.

Esempio 1 - Coltura liquida starter comprendente il 20 ceppo batterico Streptococcus thermophi 1 us DSM 18613.

Seguendo la procedura del metodo di preparazione generale descritto in precedenza, usando come base una soluzione di idrossido d'ammonio al 25%, stati ottenuti, con lavorazione in batch, 10.000 1 di 25 coltura liquida starter, per uso lattiero caseario, 21.M0294.I2JT 9 Don Rob rtìuttl A

avente una concentrazione cellulare finale di Streptococcus thermophilus DSM 18613 equivalente a 7,2.10<s>CFU/ml di coltura.

Detta coltura, conservata ad una temperatura compresa da 3°C a 5°C si è mostrata stabile per più dì 12gg. Seguendo lo stesso metodo di preparazione, sono state preparate anche colture liquide starter comprendenti, rispettivamente, un ceppo batterico scelto tra; a) Lactobaci llus delbrueckii ssp. bulgari cus DSM 16606;

b) Lactobacillus cassi ssp. rhamnosus DSM 16605;

c) Lactobacillus plantarum LMG P-21020;

d) Lactococcus lactis ssp. lactis LMG P-21388; f)Bifidobacterium longum LMG P-21382;

Dette colture, conservate ad una temperatura compresa da 2°C a 4°C, si sono mostrate stabili per più di 12gg. La concentrazione cellulare delle colture è risultata compresa da 3«IO<9>a 10*IO<9>CFU/ml di terreno colturale .

Esempio 2 - Coltura lìquida starter comprendente la miscela dei ceppi batterici; Streptococcus thermophilus DSM 16506; Lactobaci 1 lus delbrueckii ssp. bulgaricus DSM 16606.

Seguendo la procedura del metodo di preparazione generale descrìtto in precedenza, un terreno 21M02W12.IT.9 Don

ϊ-%938B

colturale così composto (quantità relative ad un litro di terreno colturale): peptone di riso, 10g; estratto di lievito, 10g; idrolizzato di lievito, lOg; destrosio, 20g; MgS04, 200mg; K2HP04, 7,975g; NaH2P04, 1,437g; MgS04«7H20, SOmg; Tween 80, Imi, è stato inoculato con colture madri di Streptococcus thermophilus DSM 16506 e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus DSM 16606 in un rapporto reciproco di concentrazione cellulare uguale a 1:1.

Durante la crescita della biomassa, il pH viene controllato, secondo quanto descritto in precedenza, tramite aggiunta di carbonato di calcio.

Sono stati ottenuti, con lavorazione in batch, 8.000 litri di coltura liquida starter, per uso iattierocaseario, avente una concentrazione cellulare finale di Streptococcus thermophilus DSM 16506 equivalente a 5,6*10<9>CFU/ml di coltura e di Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus DSM 16606 equivalente a 1,5·10<9>CFU/ml di coltura.

Detta coltura, conservata ad una temperatura compresa da 3°C a 5°C, si è mostrata stabile per più di 12gg.

Claims (1)

1. 21.Μ0294.Ι2ΓΓ.9 Olì gfltti :8B RIVENDICAZIONI 1. Una coltura liquida starter comprendente almeno un microrganismo fisiologicamente compatibile, caratterizzata dal fatto che la concentrazione cellulare di detto microorganismo in detta coltura è >10<3>CFU/ml di terreno colturale. 2. La coltura liquida secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che la sua concentrazione cellulare è >1,5·IO<3>CFU/ml di terreno colturale, 3. La coltura liquida secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzata dal fatto che la sua concentrazione cellulare è >2,5·IO<9>CFU/ml di terreno colturale; preferibilmente, è >6·IO<9>CFU/ml di terreno colturale. 4. La coltura liquida secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, ulteriormente caratterizzata dal fatto che la sua conservabilità è ≥6 giorni, ad una temperatura di conservazione mediamente compresa da 3°C a 5°C. 5. La coltura liquida secondo la rivendicazione 4, caratterizzata dal fatto che la sua conservabilità è >7,5 giorni; preferibilmente, detta conservabilità è >10 giorni; più preferibilmente, è >13 giorni. 6. La coltura liquida secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, ulteriormente caratterizzata dal fatto che la sua attività 21M0294.J2.IT9 Doti ob Utl! A 938B fermentativa è almeno 2 volte superiore a quella delle colture liquide starter note. 7. La coltura liquida secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta coltura è una coltura ad inoculo diretto. 8. La coltura liquida secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un microrganismo è scelto dal gruppo di ceppi microbici comprendente i generi: Lactobacillus , Leuconostoc, Bifidobacterium, Lactococcus , Pediococcus, Streptococcus , Bacillus , Propionibacterium, Saccharomyces , Enterococcus , Staphylococcus . 9. La coltura liquida secondo la rivendicazione 8, in cui: - detti ceppi del genere Lactobacillus sono scelti dal gruppo comprendente le specie: L. pentosus , L. plantarum, L. casei , L, casei ssp. paracasei , L. casei ssp. rhamnosus, · L. acidophilus, L, delbrueckii ssp. bulgaricus , L. fermentimi , L. gasseri ; - detti ceppi del genere Bìfidobacterium sono scelti dal gruppo comprendente le specie: B. longum, B. breve, B. lactis, B. adolescentis , B. pseudocatenulatum , B. catenulatum; - detti ceppi del genere Lactococcus sono scelti dal gruppo comprendente le specie: L. lactis e L. lactis

   ssp, lactis; - detti ceppi del genere Streptococcus sono scelti dal gruppo comprendente la specie S. thermophilus ; - detti ceppi del genere Staphylococcus sono scelti dal gruppo comprendente la specie S. xylosus . 10. La coltura liquida secondo la rivendicazione 8 o 9 , in cui il ceppo batterico è scelto dal gruppo comprendente i ceppi elencati nella seguente Tabella -. Tabella 5 Numero di Data di jjo Nome Depositante deposito deposito

   La c Cobacii 1 us Microbiologico LMG P-21019 16.10.2001 pentosus Grana Provolone SRL

   Laboratorio Lactobacillus Microbiologico LMG P-21020 16.10.2001 pi antarum Grana Provolone SRL Laboratorio Lactobacillus Microbiologico LMG P-21021 16.10,2001 piantarmi Grana Provolone SRL

   Laboratorio Lactobacillus Microbiologico LMG P-21022 16.10.2001 piantarmi Grana Provolone SRL

   Laboratorio Lactobacillus Microbiologico LMG P-21023 16.10.2001 piantarmi Grana Provolone SRL

   M0294I2.IT.9 ttR Bifidobactérium LMG P-21384 31.01.2002 ANIDRAL S.R.L. lactis Lactobacillus plantarum LMG P-21385 31.01.2002 MOFIN S.R.L.

   Ι.Μ0294 Ι2.ΓΓ.9 ( Doti rguni Albo 38 B Streptococcus thermophi 1 us DSM 17845 21.12.2005 ANIDRA! S.R.L. Lactobacillus fermentimi DSM 18295 24.05.2006 ANIDRA! S.R.L.

   Streptococcus DSM 18625 13.09.2006 MOFIN S.R.L. thermophilus 11. Un metodo per la preparazione di una coltura 21M0294.I2.IT.9 Doti rgutu A 938 8 liquida secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto metodo comprende almeno una fase consistente nel controllare il pH del terreno colturale . 12. Il metodo secondo la rivendicazione 11, in cui, durante detta fase di controllo, il pH viene mantenuto in un intervallo compreso da 4,5 a 7,0; preferibilmente, detto intervallo è compreso da 5,5 a 6,5; più preferibilmente, da 5,6 a 6,2. 13. Il metodo secondo la rivendicazione 11 o 12, in cui il pH viene mantenuto in un intervallo compreso da 5,7 a 6,0. 14. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 13, in cui detta fase di controllo del pH viene effettuata tramite aggiunta al terreno colturale di crescita dei microorganismi di almeno una base, o dì una miscela di più basi. 15. Il metodo secondo la rivendicazione 14, in cui detta almeno una base è aggiunta in modo progressivo, così da assicurare il mantenimento del pH entro i valori indicati nelle rivendicazioni da 12 a 13 per il tempo necessario ad ottenere il desiderato grado di crescita del/i microrganismo/i. 16. Il metodo secondo la rivendicazione 15, in cui detto tempo di aggiunta di detta almeno una base è

   quello necessario al/i microrganismo/i per subire da 2 a 5 duplicazioni cellulari. 17. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 16, in cui detta almeno una base è scelta dal gruppo comprendente: ione carbonato, nelle forme mono- e/o bi -basiche, ammoniaca, idrossidì, ìdrossido d'ammonio, di sodio, di potassio, ione fosfato, nelle forme mono- e/o bie/o e tri-basiche, ione solfato, nelle forme monoe/o bi-basiche, ione citrato, ione tartrato, e/o basi fisiologicamente compatibili con i microrganismi della coltura, e/o miscele delle stesse. 18. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 17, in cui, alla fine di detta fase di controllo del pH, detto metodo comprende un'ulteriore fase in cui il pH viene lasciato scendere spontaneamente per un tempo compreso da 0,5 volte a 1 volta il tempo necessario al/i microrganismo/i per subire una duplicazione cellulare. 19. Il metodo secondo la rivendicazione 18, in cui il pH finale della coltura è compreso da 4,7 a 5,6; preferibilmente, è compreso da 5,0 a 5,2. 20. Il metodo secondo la rivendicazione 18 o 19, in cui, alla fine di detta fase dì discesa del pH, detto 21.M0294J2.ÌT9 Dall rgimi Albo metodo comprende un'ulteriore fase in cui la coltura così ottenuta viene raffreddata ad una temperatura compresa da 4°C a 8°C, a dare la coltura liquida starter desiderata. 21. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 20, comprendente le seguenti fasi: a) bonificare il bioreattore mediante vapore fluente; b) sottoporre a trattamento termico il terreno colturale all'interno del reattore; c) raffreddare il terreno colturale fino alla temperatura di inoculo del microrganismo usato; d) inoculare il terreno di cui alla fase c) con una quantità efficace di coltura madre di almeno un microrganismo batterico, o di una miscela di microorganismi ; e) attendere l'inizio della fermentazione e dell'ingresso della biomassa batterica nella fase esponenziale di crescita; f} controllare il pH del terreno colturale, mantenendolo in un intervallo compreso da 5,7 a 6,0, tramite aggiunte progressive di idrossido d’ammonio e/o carbonato, per il tempo necessario al verificarsi di 2-5 duplicazioni cellulari 2iM0294.i2.IT-9 Doti ϋΐΐι Wba 8 β del/x microrganismo/i; g<}>lasciare scendere spontaneamente il pH del terreno colturale fino ad un valore compreso da 5,0 a 5,2, in un intervallo di tempo sufficiente al verificarsi di un'ulteriore duplicazione cellulare ; h) raffreddare la coltura di cui alla fase g), fino ad una temperatura compresa da 4°C a 8°C; i) confezionare detta coltura di cui alla fase h) in condizioni di sterilità, 22. Uso di una coltura liquida secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 come starter per la preparazione di prodotti dell'industria alimentare. 23. L'uso secondo la rivendicazione 22, in cui detti prodotti dell'industria alimentare sono scelti dal gruppo comprendente: prodotti lattiero-caseari, formaggi, yogurt, latti fermentati, pane, prodotti da forno, salumi, insaccati fermentati, bevande alcoliche . 24. L'uso secondo la rivendicazione 23, in cui detti prodotti sono scelti tra i prodotti lattiero-caseari. 25. Uso di una coltura liquida secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 come inoculo diretto del latte. 26. L'uso secondo la rivendicazione 25, in cui detto 21 Μ0294.12.ΓΓ.9 Doli arami Ai 938 B inoculo è compreso da 0,2% a 0,8% (V/V) in volume, rispetto al volume del latte; preferibilmente, è compreso da 0,3% a 0,6% (V/V). 27. Un metodo per preparare un prodotto lattierocaseario, comprendente almeno una fase dì inoculo del latte con una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, in cui detto inoculo è in accordo a quanto riportato nella rivendicazione 26 . 28. Uso dì almeno un microrganismo scelto tra quelli elencati nella rivendicazione 10, per la preparazione di una coltura liquida starter secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10. 29. Un ceppo batterico scelto tra i seguenti: DSM 18613; DSM 18614; DSM 18615; DSM 18616; DSM 18617; DSM 18618; DSM 18619; DSM 18620; DSM 18621; DSM 18622; DSM 18623; DSM 18624; DSM 18625. Il Mandatario