CN106676162B - 用于鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的引物组及其应用 - Google Patents

用于鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的引物组及其应用。本发明提供的引物组，由引物对甲、引物对乙和引物对丙组成；引物对甲由序列9和序列10所示的单链DNA分子组成；引物对乙由序列11和序列12所示的单链DNA分子组成；引物对丙由序列13和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成。所述引物组的用途为鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌。通过本发明所述的方法，可以高通量、快速筛选具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌，从而改善酸奶产业中的后酸化现象，对于酸奶产业具有重大应用价值。

Description

用于鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的引物组及其 应用
技术领域
本发明涉及一种用于鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的引物组及其应用。
背景技术
群体感应(Quorum Sensing，QS)是指某些微生物群体其基因的表达受到与群体密度相关的信号分子调控的现象。QS系统参与调控一系列生物学功能，如：菌体发光、抗生素的生物合成、毒性因子的产生、胞外多糖的合成、细菌丛集、生物膜形成、质粒接合转移等。
QS系统被认为参与调控细菌的多项生理功能，该系统包括自诱导肽(autoinducingpeptide，AIP)、组氨酸蛋白激酶和感应调节蛋白，又称为三组分系统。AIP作为信号分子，用于指示细胞密度，当AIP达到某一临界的浓度阈值时，便可激活一系列特定基因的表达。目前已经在多种细菌上观测到了群体感应现象的存在，比如金黄色葡萄球菌、变异链球菌等。
对革兰氏阴性菌群体感应的研究一般通过检测其信号分子—高丝氨酸内酯类来进行确认，而且其检测方法已有很多报道和专利。而对于像保加利亚乳杆菌这类革兰氏阳性菌来说，这类菌以小肽作为其信号分子，且不同革兰氏阳性菌之间信号肽的序列差异很大，这成为限制其群体感应研究的巨大障碍。对于保加利亚乳杆菌，目前还未报道有效的鉴定其群体感应系统的检测方法。
酸奶是含活菌的乳制品，正常发酵结束后，在产品贮存、运输、销售、食用前这一过程中，菌体仍要生长繁殖，发生后酸化现象(postacidification)，即酸奶的pH值继续下降，以至出现消费者不可接受的过酸味及感官质量下降。酸奶后酸化现象导致的结果是酸奶无法长期贮存，酸奶贮存期短的缺陷困扰着酸奶的消费。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的引物组及其应用。
本发明首先提供了一种引物组，由引物对甲、引物对乙和引物对丙组成；所述引物对甲由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述引物对丙由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成。
所述引物组的用途为鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌。
本发明还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌。
本发明还保护含有所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物独立包装的步骤。
本发明还保护一种鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的方法，包括如下步骤：以待测保加利亚乳杆菌的基因组DNA为模板，分别采用所述引物对甲、所述引物对乙和所述引物对丙进行PCR扩增，如果采用所述引物对甲、所述引物对乙和所述引物对丙均可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测保加利亚乳杆菌为具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌。
本发明还保护一种鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的方法，包括如下步骤：以待测保加利亚乳杆菌的基因组DNA为模板，分别采用所述引物对甲、所述引物对乙和所述引物对丙进行PCR扩增，如果采用所述引物对甲可以得到438bp的扩增产物且采用所述引物对乙可以得到1641bp的扩增产物且采用所述引物对丙可以得到763bp的扩增产物，待测保加利亚乳杆菌为具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌。
以上任一所述具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)ljj-6，其保藏编号为CGMCC NO.11346。
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)ljj-6，已于2015年09月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.11346。
一方面，在MRS液体培养基中进行相同时间的培养，12小时时，乳杆菌ljj-6的菌密度与现有的保加利亚乳杆菌类似，24小时后乳杆菌ljj-6的菌密度显著低于现有的保加利亚乳杆菌。另一方面，进行相同时间的培养，加入乳杆菌ljj-6得到的酸奶的酸度值与加入现有保加利亚乳杆菌得到的酸奶的酸度值没有显著差异，但将酸奶进行货架期保存后，加入乳杆菌ljj-6得到的酸奶的酸度值显著低于加入现有保加利亚乳杆菌得到的酸奶的酸度值。结果表明，乳杆菌ljj-6可以解决酸奶后酸化现象，为具有群体感性现象的保加利亚乳杆菌菌株。
通过本发明所述的方法，可以高通量、快速筛选具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌，从而改善酸奶产业中的后酸化现象，对于酸奶产业具有重大应用价值。
附图说明
图1为实施例1中的酸度值结果。
图2为实施例2中的序列比对结果。
图3为实施例2中的遗传进化树。
图4为实施例2中采用简并引物对进行PCR扩增的电泳图。
图5为实施例2中采用特异引物对进行PCR扩增的电泳图。
图6为实施例3中的菌液OD600nm值结果。
图7为实施例4中PCR扩增体系甲的电泳结果。
图8为实施例4中PCR扩增体系乙的电泳结果。
图9为实施例4中PCR扩增体系丙的电泳结果。
图10为实施例4中特异性的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
MRS液体培养基的制备方法如下：取酪蛋白胨10.0克、牛肉浸取物10.0克、酵母提取液5.0克、葡萄糖5.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸二胺2.0克、吐温801.0克、磷酸氢二钾2.0克、七水硫酸镁0.2克、七水硫酸锰0.05克和碳酸钙20.0克，用蒸馏水溶解并定容至1.0升，调pH至6.8。
保加利亚乳杆菌LJJ：崔文明等，“保加利亚乳杆菌LJJ自溶的影响因素分析”，食品与发酵工业，2013年第39卷第7期(总第307期)，6-12。
细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN Bacteria DNA kit)：天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号DP302-02。
实施例1、乳杆菌ljj-6的鉴定、保藏和应用
一、乳杆菌ljj-6的鉴定和保藏
2012年08月，从内蒙牧区传统发酵乳制品中分离得到一株菌，将其命名为ljj-6。
ljj-6的形态特征：革兰氏阳性杆菌，菌体粗而长，菌体长2μm～9μm、宽0.15μm～0.18μm,单个体呈长杆状或成链，菌体两端稍圆，通常呈单个，平行或短链排列。
ljj-6的生理生化特征：兼性厌氧菌，最适培养温度为3℃，最适宜生长的pH为6.5-7.0，最适宜的培养基为MRS培养基；能够发酵牛奶中的乳糖生成乳酸，同时产生特殊的香气。
ljj-6的16sRNA的编码序列(见序列表的序列18)与GenBank中的德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842的16sRNA的编码序列同源性为98％。
本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)ljj-6，已于2015年09月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.11346。德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)ljj-6，简称乳杆菌ljj-6。
二、乳杆菌ljj-6的培养(MRS培养基)
1、分组处理如下(进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置5个重复处理)：
第一组：将乳杆菌ljj-6接种至MRS液体培养基并使其初始浓度为104cfu/ml，37℃静置培养20小时；
第二组：将保加利亚乳杆菌LJJ接种至MRS液体培养基并使其初始浓度为104cfu/ml，37℃静置培养20小时。
2、步骤1中，静置培养12小时时，检测检测培养体系的OD600nm值。第一组的OD600nm值为2.4±0.1，第二组的OD600nm值为2.4±0.15。
3、完成步骤1后，检测培养体系的OD600nm值。
第一组的OD600nm值为2.8±0.1，第二组的OD600nm值为3.45±0.15。
4、完成步骤1后，检测培养体系的pH值。
第一组的pH值4.4±0.2，第二组的pH值4.3±0.2，两组之间无显著性差异。
结果表明：在培养过程中，乳杆菌ljj-6和保加利亚乳杆菌LJJ的起始生长速度没有显著差异；随着培养时间的增加，培养体系中的菌浓度越来越高，乳杆菌ljj-6由于具备群体感应现象从而生长速度变慢，而保加利亚乳杆菌LJJ由于不具备群体感性现象从而生长速度没有变慢。
三、乳杆菌ljj-6的培养(牛奶)
1、分组处理如下(进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置5个重复处理)：
第一组：将乳杆菌ljj-6接种至三元纯牛奶并使其初始浓度为104cfu/ml，37℃静置培养12小时；
第二组：将保加利亚乳杆菌LJJ接种至三元纯牛奶并使其初始浓度为104cfu/ml，37℃静置培养12小时。
接种了乳杆菌的纯牛奶静置培养后称为酸奶。
2、完成步骤1后，检测酸奶的酸度值。
第一组、第二组酸奶的酸度均为60°T-80°T。
3、完成步骤1后，将酸奶进行货架期保存(货架期保存即4-6℃保存)，每天取样并检测酸度。
结果见图1(从货架期保存开始计时，每24小时为1天，横坐标为保存天数；纵坐标为酸度值，单位为°T)。随着保存时间的延长，第一组和第二组之间的差异开始显现，乳杆菌ljj-6发酵的酸奶的酸度值上升较慢，保存至第10天的时候，乳杆菌ljj-6发酵的酸奶的酸度值明显低于保加利亚乳杆菌LJJ发酵的酸奶。
实施例2、从乳杆菌ljj-6中克隆群体感应信号肽基因
本实施例中采用的待测革兰氏阳性菌为乳杆菌ljj-6。
一、从已公开的革兰氏阳性菌群体感应信号肽的编码基因中收集序列
通过检索GenBank数据库和
Figure BDA0000842154240000051
数据库中收录的革兰氏阳性菌群体感应信号肽的编码序列，结合目前发表在期刊杂志上的革兰氏阳性菌群体感应信号肽的编码序列，共收集到15条编码革兰氏阳性菌群体感应信号肽的DNA序列(含全序列和片段)。
二、菌群遗传进化分析
1、分别获取步骤一获得的15条序列的菌株信息，然后分别从GenBank数据库中获取菌株的16s rDNA序列，获得15条16s rDNA序列。
2、将待测革兰氏阳性菌的16s rDNA序列与步骤1获得的15条16s rDNA序列进行序列比对，比对结果见图2。
3、基于步骤2的比对结果，构建遗传进化树，见图3。待测革兰氏阳性菌在遗传距离上，距离Lactobacillus casei W56、Pediococcusclausseni i、Lactobacillusparaplantarum和Lactobacillus plantarum ZJ316这四株革兰氏阳性菌亲缘关系最近，均为95％以上。
三、简并引物的设计
以步骤二筛选到的与待测革兰氏阳性菌亲缘关系最近的四株革兰氏阳性菌为基础，对其群体感应信号肽的编码序列进行序列比对，查找其保守区域，根据保守序列设计得到如下简并引物对(退火温度为47℃)：
上游引物(序列表的序列1)：5’-CASSATTGAACACCTYCT-3’；
下游引物(序列表的序列2)：5’-CGYCTCTGAWTGCYYTGA-3’；
S＝G或C，W＝A或T，Y＝C或T。
四、待测革兰氏阳性菌的群体感应信号肽的编码基因的部分片段的克隆
提取待测革兰氏阳性菌的基因组DNA，利用步骤三设计的简并引物对进行PCR扩增(PCR扩增产物的电泳图见图4)，回收PCR扩增产物并测序。PCR扩增产物为167bp，如序列表的序列3所示。序列3即编码待测革兰氏阳性菌的群体感应信号肽的编码基因的部分片段。在GenBank数据库中进行BLAST，发现序列3与NCBI中的Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusATCC 11842菌株基因组的1286023-1286189位置的序列吻合。
五、待测革兰氏阳性菌的群体感应信号肽全长序列的克隆
1、在待测革兰氏阳性菌的群体感应信号肽的编码基因的部分片段的基础上，参考Genbank上Lactobacillus delbruecki i subsp.bulgaricus ATCC 11842菌株的基因组DNA中1286023-1286189位核苷酸所在的全长基因序列，设计了克隆编码待测菌株的群体感应信号肽全长序列的DNA分子的如下特异引物对(退火温度为55.6℃)：
上游引物(序列表的序列4)：5’-ACGCGTCGACATGGCTAAAGTAG-3’；
下游引物(序列表的序列5)：5’-ACATGCATGCGTCGTCGCTGAT-3’。
2、提取待测革兰氏阳性菌的基因组DNA，利用步骤1设计的特异引物对进行PCR扩增(PCR扩增产物的电泳图见图5)，回收PCR扩增产物并测序。PCR扩增产物为1008bp，如序列表的序列6所示(自5’末端第24-986位核苷酸为开放阅读框)，编码序列表的序列7所示的多肽(由320个氨基酸残基组成)，即待测菌株的群体感应信号肽全长序列。
六、待测菌株的群体感应信号肽成熟肽序列分析
根据目前已有的文献报道，在革兰氏阳性菌群体感应系统中，具有生物学活性、发挥信号分子作用的通常是15-30个氨基酸残基组成的短肽，革兰氏阳性菌转录的前体肽必须经过体内酶切的作用，生成短片段的成熟肽，才可以游离到菌体外发挥信号传导的作用。利用SignalP 4.1对群体感应信号肽全长序列进行分析，获得了一条26个氨基酸残基组成的成熟肽序列(见序列表的序列8)。
将序列表的序列8所示的多肽命名为群体感应信号肽AIP，简称AIP。
实施例3、AIP的功能验证和应用
一、AIP作为群体感应信号肽对乳杆菌ljj-6菌群浓度的调节作用
1、人工合成序列表的序列8所示的多肽(AIP)。
2、分组处理如下(进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置5个重复处理)：
第一组：将乳杆菌ljj-6接种至含2μM AIP的MRS液体培养基并使其初始浓度为104cfu/ml，37℃静置培养32小时；
第二组：将乳杆菌ljj-6接种至MRS液体培养基并使其初始浓度为104cfu/ml，37℃静置培养32小时。
培养过程中，每2小时取样监测菌液OD600nm值，记录其变化规律。
结果见图6。结果显示：添加了2μM AIP的培养体系中，乳杆菌ljj-6生长速度较慢；在培养至16h时，未添加AIP的培养体系已经呈现明显的浑浊状态，但是相同培养时间含有2μM AIP的培养体系未呈现肉眼可见的浑浊；添加AIP和未添加AIP的培养体系中乳杆菌ljj-6的生长曲线具有明显的不同(未添加AIP的培养体系中，OD600nm值先增高，到20h时达到最高点，而后缓慢降低；添加AIP的培养体系中，OD600nm值尽管总体也有升高的趋势，但是曲线的坡度明显低于未添加AIP的培养体系，曲线整体比较平缓)。结果表明，添加AIP能够调控乳杆菌ljj-6的菌群密度，序列8所示的多肽确实为群体感应信号肽。
二、AIP的应用(采用乳杆菌ljj-6和AIP制备酸奶)
1、人工合成序列表的序列8所示的多肽(AIP)。
2、分组处理如下(进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置5个重复处理)：
第一组：将乳杆菌ljj-6接种至三元纯牛奶并使其初始浓度为104cfu/ml，37℃静置培养12小时；
第二组：将乳杆菌ljj-6接种至三元纯牛奶并使其初始浓度为104cfu/ml，37℃静置培养12小时后在体系中加入AIP并使其浓度为2μM。
接种了乳杆菌的纯牛奶静置培养后称为酸奶。
2、完成步骤1后，检测酸奶的酸度值。
第一组、第二组酸奶的酸度均为60°T-80°T。
3、完成步骤1后，将酸奶进行货架期保存(货架期保存即4-6℃保存)，每天取样并检测酸度。
保存至第10天的时候，第一组酸奶的酸度值为95°T，第二组酸奶的酸度值为80°T。
实施例4、设计引物组并通过引物组鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌
一、引物组的设计
基于大量序列分析、引物设计、引物筛选和效果验证，设计用于鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的引物组，由六条引物组成，依次为AipF、AipR、hpkF1、hpkR1、rrF1和rrR1。引物的具体信息见表1。AipF和AipR组成引物对甲。hpkF1和hpkR1组成引物对乙。rrF1和rrR1组成引物对丙。
表1 PCR扩增所用引物
Figure BDA0000842154240000071
二、引物组的应用
1、采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取乳杆菌ljj-6的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别进行三个体系的PCR扩增。
PCR扩增体系甲：2×Taq PCR Master Mix，模板10ng，AipF(浓度为10pmolμL-1)1μL，AipR(浓度为10pmolμL-1)1μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增体系甲的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
PCR扩增体系乙：2×Taq PCR Master Mix，模板10ng，hpkF1(浓度为10pmolμL-1)1μL，hpkR1(浓度为10pmolμL-1)1μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增体系乙的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
PCR扩增体系丙：2×Taq PCR Master Mix，模板10ng，rrF1(浓度为10pmolμL-1)1μL，rrR1(浓度为10pmolμL-1)1μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增体系丙的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶(电压为100V，电泳时间为20min)。
PCR扩增体系甲的电泳结果见图7(泳道1为扩增产物)，PCR扩增产物的测序结果见序列15(438bp)。
PCR扩增体系乙的电泳结果见图8(泳道1和泳道2为扩增产物)，PCR扩增产物的测序结果见序列16(1641bp)。
PCR扩增体系丙的电泳结果见图9(泳道1为扩增产物)，PCR扩增产物的测序结果见序列17(763bp)。
三、引物组的特异性
待测菌为乳杆菌ljj-6或保加利亚乳杆菌LJJ。
1、采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测菌的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别进行三个体系的PCR扩增。
PCR扩增体系和扩增程序同步骤二。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶(电压为100V，电泳时间为20min)。
电泳结果见图10(泳道1为乳杆菌ljj-6采用引物对甲的扩增产物，泳道2为保加利亚乳杆菌LJJ采用引物对甲的扩增产物，泳道3为乳杆菌ljj-6采用引物对乙的扩增产物，泳道4为保加利亚乳杆菌LJJ采用引物对乙的扩增产物，泳道5为乳杆菌ljj-6采用引物对丙的扩增产物，泳道6为保加利亚乳杆菌LJJ采用引物对丙的扩增产物)。
对于乳杆菌ljj-6，采用引物对甲、引物对乙和引物对丙进行PCR扩增均为阳性(可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增)，且测序验证后与预期一致(采用引物对甲可以得到438bp的扩增产物，采用引物对乙可以得到1641bp的扩增产物，采用引物对丙可以得到763bp的扩增产物)。对于保加利亚乳杆菌LJJ，引物对甲、引物对乙和引物对丙进行PCR扩增均为阴性。
Figure IDA0000842154340000011
Figure IDA0000842154340000021
Figure IDA0000842154340000031
Figure IDA0000842154340000041
Figure IDA0000842154340000051
Figure IDA0000842154340000061
Figure IDA0000842154340000071
Figure IDA0000842154340000081
Figure IDA0000842154340000091
Figure IDA0000842154340000101
Figure IDA0000842154340000111

Claims (6)

1.一种引物组，由引物对甲、引物对乙和引物对丙组成；所述引物对甲由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述引物对丙由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述引物组的用途为鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌；所述具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）ljj-6，其保藏编号为CGMCC NO.11346。
2.权利要求1所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌；所述具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）ljj-6，其保藏编号为CGMCCNO.11346。
3.含有权利要求1所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌；所述具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）ljj-6，其保藏编号为CGMCC NO.11346。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物独立包装的步骤。
5.一种鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的方法，包括如下步骤：
以待测保加利亚乳杆菌的基因组DNA为模板，分别采用引物对甲、引物对乙和引物对丙进行PCR扩增，如果采用所述引物对甲、所述引物对乙和所述引物对丙均可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测保加利亚乳杆菌为具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌；
所述引物对甲由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述引物对丙由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；
所述具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）ljj-6，其保藏编号为CGMCC NO.11346。
6.一种鉴定具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌的方法，包括如下步骤：
以待测保加利亚乳杆菌的基因组DNA为模板，分别采用引物对甲、引物对乙和引物对丙进行PCR扩增，如果采用所述引物对甲可以得到438bp的扩增产物且采用所述引物对乙可以得到1641bp的扩增产物且采用所述引物对丙可以得到763bp的扩增产物，待测保加利亚乳杆菌为具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌；
所述引物对甲由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述引物对丙由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；
所述具备群体感应系统的保加利亚乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）ljj-6，其保藏编号为CGMCC NO.11346。
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