WO2022080246A1 - 発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、並びに、それを用いた発酵乳及びその製造方法 - Google Patents

発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、並びに、それを用いた発酵乳及びその製造方法 Download PDF

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佳子 本目
泰子 佐々木
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a protein having an action of improving the spinnability of fermented milk, and a fermented milk using the same and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a vector, a lactic acid bacterium, and a lactic acid bacterium composition, and a fermented milk using these, a thickener for the fermented milk, a method for producing them, a method for improving the spinnability of the fermented milk, and a method for evaluating lactic acid bacteria.
  • Fermented milk is a food that is widely and generally eaten, and in Japan's "Ministry Ordinance on Ingredient Standards for Milk and Milk Products (Milk, etc. It is defined as "a milk containing milk or the like fermented with lactic acid bacteria or yeast to make it paste-like or liquid, or a frozen product thereof".
  • Typical examples of such fermented milk include yogurts such as set type yogurt (solid fermented milk), soft type yogurt (paste fermented milk), and drink type yogurt (liquid fermented milk).
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-178911 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2018-143220 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2007-236227 Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-255465
  • a protein consisting of an added amino acid sequence and having an action of improving the spinnability of fermented milk (c) It consists of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is composed of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in (d) is a protein having an action of improving the spinnability of fermented milk (d) and the complementary strand of DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • [6] A lactic acid bacterium having the DNA described in [2]. [7] The lactic acid bacterium according to [6], which has an effect of improving the spinnability of fermented milk. [8] A lactic acid bacterium composition containing the lactic acid bacterium according to any one of [5] to [7]. [8'] A lactic acid bacterium composition containing the lactic acid bacterium according to [5'] (preferably a lactic acid bacterium composition for use in improving the spinnability of fermented milk). [9] The lactic acid bacterium composition according to [8] or [8'], which is fermented milk.
  • the lactic acid bacterium according to any one of [5] to [7] or [5'] or any one of [8] to [10] or [8] is added to the formula containing the raw milk.
  • a method for improving the spinnability of fermented milk which comprises a fermentation step of adding and fermenting the lactic acid bacterium composition according to'].
  • the amino acid corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in (d) is a protein having an action of improving the spinnability of fermented milk (d) and the complementary strand of DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. It consists of an amino acid sequence encoded by DNA that hybridizes under strict conditions, and the amino acid corresponding to position 40 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is tyrosine, and has an effect of improving the spinnability of fermented milk. Protein with. [14] Fermented milk containing lactic acid bacteria evaluated to have an action of improving the spinnability of fermented milk by the method for evaluating lactic acid bacteria according to [13].
  • an evaluation step for evaluating whether or not the lactic acid bacteria have an effect of improving the spinnability of fermented milk, and an evaluation step.
  • a step of obtaining a lactic acid bacterium evaluated to have an action of improving the spinnability of fermented milk and a step of obtaining the lactic acid bacterium.
  • a method for producing lactic acid bacteria including.
  • an evaluation step for evaluating whether or not the lactic acid bacteria have an effect of improving the spinnability of fermented milk, and an evaluation step.
  • an evaluation step for evaluating whether or not the lactic acid bacteria have an effect of improving the spinnability of fermented milk and an evaluation step.
  • Lactic acid bacteria evaluated to have an effect of improving the spinnability of fermented milk in the evaluation step are added to a medium containing glucose and / or a sugar containing glucose and fermented to contain extracellular polysaccharides. Fermentation process to obtain fermented products and The step of obtaining a thickener for fermented milk containing the extracellular polysaccharide as an active ingredient, and A method for producing a thickener for fermented milk, including.
  • a novel protein having an action of improving the spinnability of fermented milk fermented milk having excellent spinnability, and a method for producing the same. More specifically, a novel protein having an action of improving the spinnability of fermented milk, a DNA encoding the protein, a vector containing the DNA, a lactic acid bacterium containing the DNA or the vector, and a lactic acid bacterium composition thereof, and these. It is possible to provide fermented milk having excellent spinnability, a thickener for fermented milk, a method for producing them, a method for improving the spinnability of fermented milk, and a method for evaluating lactic acid bacteria.
  • the protein of the present invention is a protein having an action of improving the spinnability of fermented milk, and the following proteins (a) to (d):
  • a protein that improves filamentousness (C) The amino acid consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is tyrosine and fermented milk. (D) Amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under strict conditions with a complementary strand of DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a protein having an action of improving spinnability. The amino acid corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in 1 is tyrosine, and the protein has an effect of improving the spinnability of fermented milk. It is at least one protein selected from the group consisting of.
  • the spinnability of fermented milk can be evaluated, for example, by the time (adhesion time) during which the thread-like integrated form is maintained when the fermented milk is stretched.
  • the time immediately after compressing the fermented milk twice is set to 0 seconds, and the fermented milk is raised to raise the fermented milk and the inside of the container. It can be measured as the time until it is completely separated from the fermented milk. It can be evaluated that the longer the adhesion time is, the higher the spinnability of the fermented milk is and the better it is.
  • a DNA consisting of a sequence, the amino acid corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is tyrosine, and which encodes a protein having an action of improving the spinnability of fermented milk. At least one DNA selected from the group consisting of.
  • (A) Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is described in Lactobacillus delbruecchii subsp. It is an amino acid sequence encoded by the epsC gene of bulgaricus OLL1073R-1 (accession number: FERM BP-10741) (R-1 strain).
  • the "DNA encoding the amino acid sequence shown in (a') SEQ ID NO: 1” is not particularly limited as long as it encodes the amino acid sequence, but is preferably the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of the epsC gene of the R-1 strain.
  • a mutation in a nucleotide sequence will result in a mutation in the amino acid sequence of the protein encoded by that sequence.
  • those skilled in the art can obtain, for example, the nucleotide sequence (R1-epsC) information of the epsC gene of the R-1 strain or the amino acid sequence (R1-EpsC) information of the protein encoded by the nucleotide sequence. If so, it is also possible to modify the nucleotide sequence to prepare a spinnability-enhancing protein that is different from the amino acid sequence that encodes it, but that maintains or further improves the spinnability-enhancing effect.
  • a DNA encoding a protein consisting of a deleted, inserted and / or added amino acid sequence and having an effect of improving the spinnability of fermented milk is also included.
  • “plurality” is a range in which the protein (modified form) after substitution, deletion, insertion and / or addition (hereinafter, these are collectively referred to as "modification") has a spinnability improving effect.
  • the number of amino acid modifications in the above usually 100 or less, 1 to 80, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, still more preferably 1 to several (for example, 1 to 10, 1). ⁇ 8 pieces, 1 ⁇ 4 pieces, 1 ⁇ 2 pieces).
  • the aspect of the "pinning-enhancing protein" according to the present invention is encoded by "(d) a DNA that hybridizes with a complementary strand of a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 under strict conditions.
  • a protein consisting of an amino acid sequence and corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is tyrosine and has an effect of improving the spinnability of fermented milk.
  • amino acid corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is tyrosine, and also contains "DNA encoding a protein having an action of improving the spinnability of fermented milk". Is done.
  • amino acid corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence and amino acid sequence analysis software (GENETYX-MAC, Sequencer, etc.) or BLAST (Basic Local Alginnment Sensor Tool).
  • the aspect of the "pinning property improving DNA” comprises an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in "(c') SEQ ID NO: 1 and is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid corresponding to the 40th position of the amino acid sequence is tyrosine, and "DNA encoding a protein having an action of improving the spinnability of fermented milk” is also included.
  • each protein has the spinnability improving action.
  • lactic acid bacterium (however, it does not have any type of DNA encoding any of the proteins (a) to (d), that is, the DNA of the above (a') to (d') is 1.
  • Adhesion time of fermented milk obtained by using the introduced lactic acid bacterium (transformer) when the DNA encoding each protein or the vector containing the DNA is expressively introduced into (without seeds).
  • the isolated DNA may be a chemically synthesized DNA obtained by artificially chemically synthesizing the spinnability-enhancing DNA.
  • a DNA (isolated DNA) or an expression vector containing the DNA (isolated DNA) or an expression vector containing the same is prepared, and the transformant introduced into the host cell is cultured to express the spinnability-enhancing protein of the present invention in the transformant.
  • the protein can be obtained as a recombinant protein from the culture.
  • the procedure and method for constructing the expression vector a known method or a method similar thereto can be appropriately adopted.
  • the isolated DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate plasmid, and ligated to the plasmid. The method of doing so is adopted.
  • the host cell is not particularly limited, but is preferably a microorganism, and examples thereof include filamentous fungi, yeast, Escherichia coli, actinomycetes, and lactic acid bacteria.
  • the host cell is not particularly limited, but the host cell into which the DNA has been introduced is used as it is in the following ⁇ method for producing fermented milk> and ⁇ spinning of fermented milk.
  • ⁇ method for improving sex> ⁇ method for producing extracellular polysaccharide of lactic acid bacteria>, or ⁇ method for producing thickener for fermented milk>, lactic acid bacteria are preferable.
  • the host cell may be a cell or a mutant that has already been transformed so as to lack a specific function, if necessary.
  • the culture conditions of the transformant for example, the culture conditions of the host cell can be applied, and if it is a person skilled in the art, the temperature, the presence or absence of addition of air, and the like according to the type of the host cell, the medium used, and the like.
  • the oxygen concentration, carbon dioxide concentration, medium pH, culture temperature, culture time, humidity and the like can be appropriately adjusted and set.
  • the spinnability-enhancing protein from the culture for example, the spinnability-improving protein is expressed in a host cell (for example, Escherichia coli), and after the transformation is completed, the cultured cells are centrifuged. It is also possible to use a method of collecting the cells by filtration or the like and crushing the cells to obtain a crude product.
  • this supernatant can be concentrated by an ultrafiltration method or the like, and a preservative or the like can be added to obtain a concentrated crude product.
  • the crude product or the concentrated crude product may be purified by using, for example, a salting out method, an organic solvent precipitation method, a membrane separation method, or a chromatographic separation method alone or in combination of two or more. ..
  • the spinnability-enhancing protein to which a purification tag is added is expressed in a host cell (for example, Escherichia coli), the crude extract is passed through a column for purification of the tagged protein, and then the tagged protein is eluted for purification. You may.
  • the addition is not particularly limited, and may be an addition at the gene level or a chemical addition.
  • the site to be added is not particularly limited, and is either an amino terminal (hereinafter, also referred to as “N terminal”) or a carboxy terminal (hereinafter, also referred to as “C terminal”) of the spinnability improving protein of the present invention. Or both.
  • Addition at the gene level is achieved by using the DNA encoding the spinnability-enhancing protein of the present invention (the spinnability-improving DNA) to which the DNA encoding another protein is added in accordance with the reading frame. Will be done.
  • the lactic acid bacterium of the present invention may be an embodiment of a lactic acid bacterium composition, and the present invention also provides a lactic acid bacterium composition containing at least one of these lactic acid bacteria of the present invention.
  • the lactic acid bacterium composition can be used for producing fermented milk with improved spinnability, improving the spinnability of fermented milk, producing exopolysaccharide of lactic acid bacteria, or fermented milk. It can be a lactic acid bacterium composition for use in the production of a thickener.
  • the adhesion time of the obtained fermented milk is 1, it can be confirmed that it is 2 or more, preferably 3 or more, and more preferably 4 or more.
  • the bonding time is set to 0 seconds immediately after each fermented milk is compressed twice using the creep meter under the above conditions, and the jig is raised to be between the fermented milk adhering to the jig and the fermented milk in the container. Can be measured as the time until it is completely divided.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention is a composition containing the lactic acid bacterium of the present invention.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention may further contain other components, and the other components are not particularly limited, but for example, in the culture supernatant, medium component, etc. after the culture of the lactic acid bacteria is completed.
  • a certain culture; a concentrate, a crude product, a refined product, a diluted product, a dried product (spray dried product, freeze-dried product, etc.), a frozen product, etc. of the culture; a protective agent, a fermentation accelerator, etc. are included, and these are included. Only one of them may be used, or a combination of two or more of them may be used.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention is at least selected from the group consisting of the vector of the present invention containing the lactic acid bacterium of the present invention (that is, the spinnability-enhancing protein, the spinnability-improving DNA, and the spinnability-improving DNA). Lactic acid bacterium into which one type has been introduced; lactic acid bacterium having spinnability improving DNA; lactic acid bacterium evaluated to have an action of improving the spinnability of fermented milk by the evaluation method of lactic acid bacterium of the present invention (high possibility of having the above-mentioned action). (Including those evaluated as); compositions containing (lactic acid bacteria obtained by the method for producing lactic acid bacteria of the present invention) are included, and the following fermented milk of the present invention is also included therein.
  • a protein that improves filamentousness (C) The amino acid consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is tyrosine and fermented milk. (D) Amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under strict conditions with a complementary strand of DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a protein having an action of improving spinnability. The amino acid corresponding to the 40th position of the amino acid sequence shown in 1 is tyrosine, and the protein has an effect of improving the spinnability of fermented milk.
  • Lactic acid bacteria have an action of improving the spinnability of fermented milk by using at least one DNA selected from the group consisting of DNA encoding any of the above (that is, the spinnability-enhancing DNA of the present invention) as an index. It is a method to evaluate whether or not it is.
  • the spinnability of fermented milk is measured using the spinnability-enhancing DNA of the present invention as an index, that is, whether or not the lactic acid bacteria have the spinnability-improving DNA of the present invention. Evaluate whether or not it has an improving effect (evaluation step).
  • the lactic acid bacterium has the spinnability improving DNA
  • the lactic acid bacterium can be evaluated as having the spinnability improving action of fermented milk (including evaluating that it is likely to have), while the DNA is used. If it does not have, the lactic acid bacterium can be evaluated as having no effect of improving the spinnability of fermented milk (including evaluating that it is highly likely that it does not have).
  • the lactic acid bacterium to be evaluated is not particularly limited, and a desired lactic acid bacterium can be appropriately targeted.
  • Whether or not the lactic acid bacterium has the spinnability-enhancing DNA of the present invention can be determined by detecting the DNA.
  • a method for detecting the spinnability-enhancing DNA a known method or a method similar thereto can be appropriately adopted.
  • genomic DNA is extracted from the lactic acid bacterium to be evaluated.
  • the method for extracting genomic DNA is not particularly limited, and a known method or a method similar thereto can be appropriately adopted.
  • the PCI method, GuSCN / Silka method, SDS phenol method, CTAB method, and alkali treatment method can be used. Can be mentioned.
  • a commercially available kit can also be used as appropriate.
  • the method for detecting the spinnability-enhancing DNA can then be carried out by isolating the DNA corresponding to the spinnability-enhancing DNA and determining the nucleotide sequence of the isolated DNA.
  • the DNA can be isolated, for example, by PCR using genomic DNA as a template, using at least a pair of oligonucleotide primers designed to sandwich the DNA corresponding to the spinnability-enhancing DNA.
  • the nucleotide sequence of the isolated DNA can be determined by a method known to those skilled in the art, such as the Sanger method and the Maxam-Gilbert method. Further, the nucleotide sequence of the DNA corresponding to the spinnability-enhancing DNA may be directly determined from the genomic DNA using a next-generation sequencer or the like.
  • the DNA corresponding to the spinnability-enhancing DNA preferably contains at least a site encoding an amino acid corresponding to the 40th position of R1-EpsC, and the pair of oligonucleotide primers sandwiching the site comprises the spinnability-enhancing DNA. It may be designed based on the nucleotide sequence of DNA (for example, R1-epsC) and a public database (Genbank, etc.). Such oligonucleotides can be designed by those skilled in the art by known methods or similar methods.
  • the PCR-SSP PCR-sequence-specific primer
  • the DNA to be detected is the above (a').
  • PCR using a pair of oligonucleotide primers designed in this way is amplified only when the spinnability-enhancing DNA of the present invention is used as a template, and the site encoding tyrosine at position 40 is other. It is not amplified when the genomic DNA encoding the amino acid of is used as a template. Therefore, the DNA can be detected using the presence or absence of such amplification as an index.
  • a restriction enzyme fragment length polymorph (Restriction Fragment Length Polymorphism / RFLP) is set at the 40th position of R1-EpsC or the corresponding tyrosine-encoding site. If possible, these RFLP markers can be used as an index for detection by, for example, the PCR-RFLP method (or the CAPS [Cleared Applied Polymorphic Sequence] method).
  • the PCR-SCSP PCR-single-strand higher-order structure polymorphism
  • the double-stranded DNA amplified by PCR using a pair of oligonucleotide primers designed to sandwich the spinnability-enhancing DNA was denatured by treatment with heat, alkali, etc. to obtain single-stranded DNA. Later, when subjected to denaturant-free polyacrylamide gel electrophoresis, the single-stranded DNA is folded in the gel by intramolecular interaction to form a higher-order structure.
  • a method using an intercalator can be mentioned.
  • the DNA corresponding to the spinnability-enhancing DNA is amplified using the genomic DNA as a template.
  • the temperature of the reaction system is changed, the change in the fluorescence intensity emitted by the intercalator is detected, and the change in the fluorescence intensity accompanying the detected change in the temperature is used as an index to improve the spinnability DNA (particularly R1-EpsC).
  • the 40th position of the above or the corresponding site encoding tyrosine) can be detected. Examples of such a method include a high resolution melting curve analysis (HRM) method.
  • HRM high resolution melting curve analysis
  • this oligonucleotide probe is hybridized with the genomic DNA, and the DNA containing the site encoding tyrosine at position 40 is amplified using the DNA sample hybridized with the oligonucleotide probe as a template. Then, the fluorescence emitted by the reporter fluorescent dye whose suppression by the quencher is released is detected by the decomposition of the oligonucleotide probe accompanying the amplification. Examples of such a method include a double die probe method, a so-called TaqMan (registered trademark) probe method.
  • a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method can be mentioned.
  • a total of 6 regions are set, 3 on each side of the target site of the double-stranded DNA, and 4 types of primers (2 types on each side) containing these regions are used to form a strand-replacement enzyme.
  • amplification starting points of the loop structure can be generated on both sides of the target site. Amplified.
  • Examples of the method for detecting the mRNA encoded by the spinnability-enhancing DNA include the RT-PCR method and the Northern blotting method.
  • the spinnability improving protein can be directly detected, but when it is not labeled, the antibody is further recognized.
  • a labeled molecule eg, secondary antibody or protein A
  • the label of the molecule can be used to indirectly detect the spinnability-enhancing protein.
  • an immunohistochemistry (immunostaining) method for example, an immunohistochemistry (immunostaining) method, a Western blotting method, an ELISA method, a flow cytometry, an imaging cytometry, a radioimmunoassay, an immunoprecipitation method, an analysis method using an antibody array, or the like is used.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and methods of preparing these antibodies are well known to those skilled in the art.
  • the spinnability-enhancing DNA or the DNA corresponding to the spinnability-enhancing DNA of the present invention can be used. It is not particularly limited as long as it hybridizes and enables amplification and detection of these.
  • the primer may be DNA alone, or may be partially or wholly substituted with an artificial nucleic acid (modified nucleic acid) such as a crosslinked nucleic acid.
  • the size of the primer may be at least about 15 nucleotides in length, preferably 15 to 100 nucleotides in length, more preferably 18 to 50 nucleotides in length, and even more preferably 20 to 40 nucleotides in length. Such a primer can be designed and produced by a method known to those skilled in the art according to the above detection method.
  • the method for producing a lactic acid bacterium of the present invention is the above-mentioned method for evaluating a lactic acid bacterium of the present invention, which comprises an evaluation step of evaluating whether or not the lactic acid bacterium has an effect of improving the spinnability of fermented milk.
  • a step of obtaining a lactic acid bacterium evaluated to have an action of improving the spinnability of fermented milk and a step of obtaining the lactic acid bacterium. It is a method including.
  • the evaluation step includes the evaluation step of the above ⁇ method for evaluating lactic acid bacteria>.
  • lactic acid bacteria having or are likely to have an action of improving the spinnability of fermented milk are selected.
  • the method for producing lactic acid bacteria of the present invention it is possible to obtain lactic acid bacteria evaluated to have an action of improving the spinnability of fermented milk (including those evaluated to have the above action) by the evaluation step.
  • the lactic acid bacterium may be obtained as the culture by culturing the selected lactic acid bacterium in an appropriate medium.
  • the aspect of the lactic acid bacterium obtained by the method for producing the lactic acid bacterium of the present invention may be the aspect of the lactic acid bacterium composition such as the culture thereof. Therefore, the method for producing a lactic acid bacterium of the present invention includes a step of obtaining a lactic acid bacterium composition containing a lactic acid bacterium evaluated to have an effect of improving the spinnability of fermented milk by the evaluation step. Is also included.
  • the other components that may be contained in the lactic acid bacterium composition other than the lactic acid bacterium are as described above.
  • the method for producing fermented milk of the present invention includes a fermentation step in which a lactic acid bacterium or a lactic acid bacterium composition is added to a milk preparation solution containing raw milk and fermented.
  • the lactic acid bacterium according to the method for producing fermented milk of the present invention comprises the vector of the present invention containing the above-mentioned lactic acid bacterium of the present invention (that is, a spinnability-improving protein, a spinnability-improving DNA, and a spinnability-improving DNA). Lactic acid bacteria into which at least one selected from the group has been introduced; lactic acid bacteria having spinnability improving DNA; lactic acid bacteria evaluated to have an action of improving the spinnability of fermented milk by the method for evaluating lactic acid bacteria of the present invention (the above-mentioned action).
  • lactic acid bacteria other than the above-mentioned lactic acid bacteria of the present invention may be further used in combination.
  • yeast may be added.
  • the other lactic acid bacteria and yeast include lactic acid bacteria and yeast that have been conventionally known to be contained in fermented milk.
  • the addition amount of the fermentation starter can be appropriately set according to the addition amount adopted in the known method for producing fermented milk.
  • the number of lactic acid bacteria (two or more kinds) is set with respect to the volume of the preparation liquid.
  • the total number of bacteria is preferably 1 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 9 CFU / mL, and more preferably 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 9 CFU / mL. preferable. Further, it is preferably 0.1 to 2% (wt / wt), more preferably 0.5 to 1.5% (wt / wt), and 0. It is even more preferable that it is 5 to 1% (wt / wt).

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Abstract

下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質。 （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質 （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質 （ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質。

Description

発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、並びに、それを用いた発酵乳及びその製造方法
　本発明は、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、並びにそれを用いた発酵乳及びその製造方法に関し、より詳細には、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、ＤＮＡ、ベクター、乳酸菌、及び乳酸菌組成物、並びに、これらを用いた発酵乳、発酵乳の増粘剤、及びこれらの製造方法、発酵乳の曳糸性を向上させる方法、及び乳酸菌の評価方法に関する。
　発酵乳は広く一般的に食される食品であり、日本の「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）」においては、「乳又はこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させ、糊状又は液状にしたもの、又はこれらを凍結したもの」と定義されている。かかる発酵乳の代表例としては、例えば、セットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトタイプヨーグルト（糊状発酵乳）、及びドリンクタイプヨーグルト（液状発酵乳）といったヨーグルトが挙げられる。近年では、需要者の嗜好の多様化に伴って、発酵乳に対しても多様な需要が存在しており、特に、粘性や曳糸性の高い、濃厚な発酵乳の需要が高まっている。
　ヨーグルト等の発酵乳の製造においては、原料乳に乳酸菌を播種し、発酵させて調製したものが主流であり、前記乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス属菌やストレプトコッカス・サーモフィラスが用いられている。発酵乳の曳糸性に関与する成分としては、乳酸菌が産生する菌体外多糖（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＥＰＳ）が知られている。例えば、特開２０１６－１７８９１１号公報（特許文献１）には、曳糸性菌体外多糖を産生する乳酸菌を用いて発酵させることを特徴とする豆乳発酵物の製法が記載されており、前記乳酸菌としてはラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　クレモリス　ＦＣ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ　ＦＣ，ＦＥＲＭ　Ｐ－２０１８５）が挙げられている。さらに、特開２０１８－１４３２２０号公報（特許文献２）には、乳酸菌の粘性多糖を含有し、メジアン径が１μｍ以上３０μｍ以下である発酵乳が記載されており、前記乳酸菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＢＴ００８７等が挙げられている。
　また、特開２００７－２３６２２７号公報（特許文献３）には、乳酸菌又はその培養物を有効成分とする肝機能障害予防用組成物が記載されており、前記乳酸菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ　ＳＲ－１（ＦＥＲＭ　Ｐ－２０６００）等を用いることにより、離水やホエー分離が抑制されることが記載されている。さらに、特開平７－２５５４６５号公報（特許文献４）には、菌体外に多量の多糖を生産することを特徴とするビフィズス菌株として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）ＳＢＴ１００１３が記載されている。またこれまで、発酵乳の曳糸性に関与するタンパク質やそれをコードするヌクレオチド配列についていくつかの研究がなされている。しかしながら、曳糸性に関与するタンパク質の情報は未だ十分ではなく、新たな発酵乳の曳糸性向上作用を有するタンパク質の提供が求められている。
特開２０１６－１７８９１１号公報 特開２０１８－１４３２２０号公報 特開２００７－２３６２２７号公報 特開平７－２５５４６５号公報
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、発酵乳の曳糸性の向上作用を有する新規タンパク質、並びに、曳糸性に優れた発酵乳及びその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行い、発酵乳の曳糸性を向上させるタンパク質及びそれをコードする遺伝子を明らかにした。すなわち、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１）（以下、場合により「Ｒ－１株」という）で発酵させた発酵乳は、他の乳酸菌株で発酵させた発酵乳よりも曳糸性が高い傾向にあることはわかっていたが、Ｒ－１株のどの遺伝子或いはタンパク質が発酵乳の曳糸性を向上させているのかは解明されていなかった。そこで本発明者らは、発酵乳の曳糸性の向上作用を有する新規タンパク質を解明すべく、先ず、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８（以下、場合により「２０３８株」という）で発酵させた発酵乳よりも、確かにＲ－１株で発酵させた発酵乳の方が高い曳糸性を有することを示した。
　次いで、曳糸性に関与する成分として乳酸菌が産生する菌体外多糖（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＥＰＳ）が知られていることから、ＥＰＳの生合成に関与すると考えられているＥＰＳ遺伝子クラスターの配列を、両者間で比較した。その結果、Ｒ－１株と２０３８株とでは、ｅｐｓＣ遺伝子及びｅｐｓＦ遺伝子においてヌクレオチド配列に差異が認められることを見出した。さらに、２０３８株に、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子又はｅｐｓＦ遺伝子を導入した形質転換体をそれぞれ作製したところ、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子を導入した形質転換体においてのみ曳糸性が向上し、かかるＲ－１株のｅｐｓＣ遺伝子がコードするタンパク質が発酵乳の曳糸性向上作用を有することを見出した。
　また、２０２０年２月５日にＲ－１株のｅｐｓＣのヌクレオチド配列をクエリーとして、ＮＣＢＩのｎｔデータベースに対してｗｅｂ　Ｂｌａｓｔ（パラメータ：デフォルト値）を行ったところ、トップヒットの配列は２０３８株のｅｐｓＣ遺伝子であり、Ｑｕｅｒｙ　Ｃｏｖｅｒは１００％、Ｐｅｒ．Ｉｄｅｎｔは９９．８７％であった。さらに、その塩基の差異はアミノ酸の差異にも反映されていた。したがって本発明者らは、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子のヌクレオチド配列及びその産物であるタンパク質は新規であることも見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、並びに、それを用いた発酵乳及びその製造方法等に関し、より詳しくは、以下のとおりである。
［１］
　下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質。
［１’］
　前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含有する、組成物（好ましくは、発酵乳の曳糸性の向上に用いるための組成物）。
［２］
　［１］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
［２’］
　前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを含有する、組成物（好ましくは、発酵乳の曳糸性の向上に用いるための組成物）。
［３］
　［２］に記載のＤＮＡを含むベクター。
［３’］
　前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを含むベクター。
［４］
　［１］に記載のタンパク質、［２］に記載のＤＮＡ、及び［３］に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１種を含有する、組成物。
［５］
　［２］に記載のＤＮＡ及び［３］に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された、乳酸菌。
［５’］
　［３’］に記載のベクターが導入された、乳酸菌（好ましくは、発酵乳の曳糸性の向上作用を有する乳酸菌）。
［６］
　［２］に記載のＤＮＡを有する乳酸菌。
［７］
　発酵乳の曳糸性の向上作用を有する、［６］に記載の乳酸菌。
［８］
　［５］～［７］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物。
［８’］
　［５’］に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物（好ましくは、発酵乳の曳糸性の向上に用いるための乳酸菌組成物）。
［９］
　発酵乳である、［８］又は［８’］に記載の乳酸菌組成物。
［１０］
　［５］～［７］のうちのいずれか一項又は［５’］に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖を含有する、［８］、［８’］、又は［９］に記載の乳酸菌組成物。
［１１］
　原料乳を含有する調乳液に、［５］～［７］のうちのいずれか一項若しくは［５’］に記載の乳酸菌又は［８］～［１０］のうちのいずれか一項若しくは［８’］に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させる発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
［１２］
　原料乳を含有する調乳液に、［５］～［７］のうちのいずれか一項若しくは［５’］に記載の乳酸菌又は［８］～［１０］のうちのいずれか一項若しくは［８’］に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させる発酵工程を含む、発酵乳の曳糸性を向上させる方法。
［１３］
　下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを指標として、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する、乳酸菌の評価方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質。
［１４］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を含有する、発酵乳。
［１５］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
　前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を得る工程と、
を含む、乳酸菌の製造方法。
［１６］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
　原料乳を含有する調乳液に、前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を添加して発酵させる発酵工程と、
を含む、発酵乳の製造方法。
［１７］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
　原料乳を含有する調乳液に、前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を添加して発酵させる発酵工程と、
を含む、発酵乳の曳糸性を向上させる方法。
［１８］
　［５］～［７］のうちのいずれか一項又は［５’］に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖を有効成分として含有する、発酵乳の増粘剤。
［１９］
　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、［５］～［７］のうちのいずれか一項若しくは［５’］に記載の乳酸菌又は［８］～［１０］のうちのいずれか一項若しくは［８’］に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法。
［２０］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程と、
を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法。
［２１］
　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、［５］～［７］のうちのいずれか一項若しくは［５’］に記載の乳酸菌又は［８］～［１０］のうちのいずれか一項若しくは［８’］に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、前記菌体外多糖を有効成分として含有する発酵乳の増粘剤を得る工程と、を含む、発酵乳の増粘剤の製造方法。
［２２］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、
　前記菌体外多糖を有効成分として含有する発酵乳の増粘剤を得る工程と、
を含む、発酵乳の増粘剤の製造方法。
　本発明によれば、発酵乳の曳糸性の向上作用を有する新規タンパク質、並びに、曳糸性に優れた発酵乳及びその製造方法を提供することが可能となる。より詳細には、発酵乳の曳糸性の向上作用を有する新規タンパク質、前記タンパク質をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含むベクター、前記ＤＮＡ又は前記ベクターを含む乳酸菌及びその乳酸菌組成物、並びに、これらを用いた、曳糸性に優れた発酵乳、発酵乳の増粘剤、及びそれらの製造方法、発酵乳の曳糸性を向上させる方法、乳酸菌の評価方法を提供することが可能となる。
　例えば、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡを様々な乳酸菌に導入することにより、当該乳酸菌によって、従来よりも曳糸性が高く濃厚な発酵乳を容易に製造することが可能となる。また、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡの配列を選抜基準とすることにより、従来よりも曳糸性が高く濃厚な発酵乳を製造することができる乳酸菌を容易に選抜することが可能となる。さらに、本発明の新規タンパク質によって発酵乳の曳糸性を向上できることに伴い、遊離ホエー量が減少して、発酵乳の見た目を改善することも可能となる。
＜曳糸性評価　１＞の接着時間測定で得られた、２０３８株又はＲ－１株で発酵させた発酵乳の接着時間（秒）を示すグラフである。 ＜ＥＰＳ遺伝子クラスター領域の比較＞における、ＥＰＳ遺伝子クラスター１及びＥＰＳ遺伝子クラスター２の模式図である。 ＜曳糸性評価　２＞の発酵乳の調製で得られた、２０３８株、Ｒ－１株、２０３８－ｅｐｓＣ株、又は２０３８－ｅｐｓＦ株で発酵させた発酵乳の外観を示す写真である。 ＜曳糸性評価　２＞の接着時間測定で得られた、２０３８株、Ｒ－１株、２０３８－ｅｐｓＣ株、又は２０３８－ｅｐｓＦ株で発酵させた発酵乳の接着時間（秒）を示すグラフである。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
　＜タンパク質、ＤＮＡ、ベクター、及びそれらを含有する組成物＞
　本発明のタンパク質は、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質であって、下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、及び
（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、
からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である。
　本発明のタンパク質は、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質（以下、場合により「曳糸性向上タンパク質」という）である。本発明において、「発酵乳の曳糸性」とは、発酵乳の粘性及び／又は弾性によって、糸をひく性質のことを示し、「発酵乳の曳糸性の向上作用」とは、前記曳糸性を発酵乳に付与、又は発酵乳における前記曳糸性を向上せしめる作用（本明細書中、場合により「曳糸性向上作用」という）を示す。本発明のタンパク質が前記曳糸性向上作用を有する理由は定かではないが、本発明者らは、乳酸菌によるＥＰＳの生合成の過程において本発明のタンパク質が作用して、曳糸性の高い構造のＥＰＳが生成されるためではないかと推察する。
　本発明において、発酵乳の曳糸性は、例えば、発酵乳を引き伸ばしたときに糸状の一体形態を維持している時間（接着時間）で評価することができる。前記接着時間は、本発明においては例えば、クリープメーター（モデル：ＲＥ２－３３００５Ｓ（株式会社山電製）、容器：φ＝４１ｍｍ　ｈｅｉｇｈｔ＝３５ｍｍの円柱状容器、冶具：φ＝２５．２ｍｍ　ｈｅｉｇｈｔ＝２５ｍｍ、速度：１０ｍｍ／ｓｅｃ、戻り距離：１０ｍｍ、発酵乳量：１０ｇ）を用いて、発酵乳を二回圧縮した直後を０秒として、冶具を上昇させ、冶具に付着した発酵乳と容器内の発酵乳との間が完全に分断されるまでの時間として測定することができる。前記接着時間が長いほど、発酵乳の曳糸性が高く優れていると評価することができる。
　本発明のＤＮＡは、前記曳糸性向上タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、場合により「曳糸性向上ＤＮＡ」という）である。すなわち、本発明のＤＮＡは、下記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡ：
（ａ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
（ｄ’）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡである。
　「（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列」は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１）（Ｒ－１株）のｅｐｓＣ遺伝子にコードされるアミノ酸配列である。「（ａ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ」としては、当該アミノ酸配列をコードしていれば特に制限されないが、配列番号２に示されるヌクレオチド配列であることが好ましい。配列番号２に示されるヌクレオチド配列は、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子のヌクレオチド配列である。本発明者らは、上述のように、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子がコードするタンパク質が、発酵乳の曳糸性向上作用を有することを見出した。配列番号１に示されるアミノ酸配列においては、特に第４０位のアミノ酸がチロシンであることが重要である。かかるアミノ酸が他のアミノ酸に置換されると（例えば、実施例における２０３８株及び２０３８－ｅｐｓＦ株）、他の配列が共通であっても、発酵乳において優れた曳糸性は発揮されない。以下、場合により、配列番号１に示されるアミノ酸配列を「Ｒ１－ＥｐｓＣ」といい、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を「Ｒ１－ｅｐｓＣ」という。
　また、自然界において、ヌクレオチド配列の変異によってその配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｒ１－ｅｐｓＣ）情報或いはそれがコードするタンパク質のアミノ酸配列（Ｒ１－ＥｐｓＣ）情報が得られた場合、そのヌクレオチド配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列とは異なるが、曳糸性向上作用を維持した又はより向上させた曳糸性向上タンパク質を調製することもできる。
　したがって、本発明に係る「曳糸性向上タンパク質」の他の態様には、「（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質」も含まれる。また、本発明に係る「曳糸性向上ＤＮＡ」の他の態様には、「（ｂ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」も含まれる。ここで、「複数」とは、置換、欠失、挿入及び／又は付加（以下、場合によりこれらを「改変」と総称する）後のタンパク質（改変体）が、曳糸性向上作用を有する範囲におけるアミノ酸の改変数であり、通常、１００個以内、１～８０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～数個（例えば、１～１０個、１～８個、１～４個、１～２個）である。
　このような改変体をコードするポリヌクレオチドは、当業者であれば、例えば、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｒ１－ｅｐｓＣ）情報に基づき、公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法等を用いて調製することが可能である。
　さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｒ１－ｅｐｓＣ）情報が得られた場合、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）や、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）等により、Ｒ－１株以外の他の微生物から、曳糸性向上タンパク質をコードするポリヌクレオチド（相同遺伝子）を取得することが可能である。したがって、本発明に係る「曳糸性向上タンパク質」の態様には、「（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質」も含まれる。また、本発明に係る「曳糸性向上ＤＮＡ」の他の態様には、「（ｄ’）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」も含まれる。なお、本発明において、「配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸」とは、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））、配列番号１に示されるアミノ酸配列（Ｒ１－ＥｐｓＣ）と整列させた際に、Ｒ１－ＥｐｓＣにおける第４０位のチロシンと同列になる位置のアミノ酸のことである。
　相同遺伝子を単離するためには、通常、厳密な条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。「厳密な条件」としては、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％　ＳＤＳ溶液中で６０℃、２０分間の洗浄条件が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションは、例えば、公知であるＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど、高い同一性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記の条件は例示であり、ＤＮＡの濃度、ＤＮＡの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間等を適宜組み合わせることにより、必要な厳密性（ストリンジェンシー）を実現することが可能である。
　さらに、このような方法等にて取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号１に示されるアミノ酸配列（Ｒ１－ＥｐｓＣ）と高い相同性を有する。したがって、本発明に係る「曳糸性向上タンパク質」の態様には、「（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質」も含まれる。また、本発明に係る「曳糸性向上ＤＮＡ」の態様には、「（ｃ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」も含まれる。
　アミノ酸配列の同一性は、例えば、前記ＢＬＡＳＴ等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））決定することができる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列（Ｒ１－ＥｐｓＣ）との同一性は、通常、８０％以上あればよいが、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
　相同遺伝子がコードする曳糸性向上タンパク質は、乳酸菌とは異なる微生物から単離された遺伝子にコードされるタンパク質であってもよいが、乳酸菌から単離されることが好ましい。前記乳酸菌としては、例えば、ストレプトコッカセエ科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕａｃｅａｅ科）、ラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）、ロイコノストック科（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）等が挙げられ、より具体的には、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクチカゼイバチルス属（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクチプランティバチルス属（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、リクォリラクトバチルス属（Ｌｉｑｕｏｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リモシラクトバチルス属（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レビラクトバチルス属（Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レンチラクトバチルス属（Ｌｅｎｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）等の乳酸桿菌；ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）等の乳酸球菌；ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられる。これらの中でも、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー（サブスピーシーズを含む）がより好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスがさらに好ましい。
　本発明において、各タンパク質が前記曳糸性向上作用を有していることは、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー、好ましくはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスからなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌（ただし、前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡを１種も有さない、すなわち、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有さない）に、各タンパク質をコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡを含むベクターを発現可能に導入したときに、当該導入をした乳酸菌（形質転換体）を用いて得られた発酵乳の接着時間が、導入前の乳酸菌を用いて同じ発酵条件（例えば、導入前の乳酸菌が発酵可能な条件）で得られた発酵乳の接着時間を１としたときに、２以上となること、好ましくは３以上となること、より好ましくは４以上となること、で確認することができる。前記ＤＮＡ又はベクターを導入する乳酸菌として、具体的には例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス２０３８株（２０３８株）が好ましい。２０３８株は、明治ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（株式会社明治製）の希釈液をＢＣＰ加寒天培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した後、ラフ型のコロニーをピックアップすることで分離することができる。
　前記接着時間は、前記クリープメーターを上記の条件で用いて、各発酵乳を二回圧縮した直後を０秒として、冶具を上昇させ、冶具に付着した発酵乳と容器内の発酵乳との間が完全に分断されるまでの時間として測定することができる。また、各乳酸菌が前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有さないことは、これらＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、公知の方法又はそれに準じた方法で適宜確認することができ、例えば、下記の＜乳酸菌の評価方法＞の評価工程に記載の曳糸性向上ＤＮＡの検出方法により確認することができる。さらに、前記タンパク質をコードするＤＮＡ又はベクターの前記乳酸菌への導入方法は、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜選択することができ、例えば、下記の〔曳糸性向上タンパク質〕に記載の方法において、宿主細胞として前記乳酸菌を用いる方法を挙げることができる。
　〔曳糸性向上タンパク質〕
　本発明に係る曳糸性向上タンパク質は、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜用いて得ることができる。例えば、前記曳糸性向上タンパク質をコードするＤＮＡ及び前記ＤＮＡを含むベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された宿主細胞を培養し、前記宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む製造方法により、得ることができる。より具体的には、先ず、Ｒ－１株等の、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡのうちの少なくとも１種を有する目的の微生物から慣行法によって前記曳糸性向上タンパク質をコードするＤＮＡ（曳糸性向上ＤＮＡ）を単離ＤＮＡとして得る。前記単離ＤＮＡとしては、人工的に前記曳糸性向上ＤＮＡを化学合成した化学合成ＤＮＡであってもよい。次いで、ＤＮＡ（前記単離ＤＮＡ）又はこれを含む発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入した形質転換体を培養することにより、同形質転換体に本発明の曳糸性向上タンパク質を発現させ、培養物から同タンパク質を組み換えタンパク質として得ることができる。
　目的の微生物から前記単離ＤＮＡを得る方法としては、例えば、前記微生物から抽出したゲノムＤＮＡ、又は、前記微生物から抽出したｍＲＮＡを基に合成したｃＤＮＡを、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター、ＰＡＣベクター等のベクターと連結してＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、曳糸性向上ＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、Ｒ１－ｅｐｓＣ）に基づいて作成したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、前記ライブラリーから所望のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを単離する方法；曳糸性向上ＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、Ｒ１－ｅｐｓＣ）に基づいて作成したプライマーを用いて、目的の微生物のゲノムＤＮＡ又は前記ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施し、必要に応じて増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することによって所望のゲノムＤＮＡを単離する方法；が挙げられる。
　前記発現ベクターは、宿主細胞内で複製可能で、かつ、そのポリヌクレオチド配列がコードするタンパク質を宿主細胞内で発現可能な状態で含むベクターである。かかる発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、前記発現ベクターは、宿主細胞に導入された場合、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるファージＤＮＡを基本に構築してもよい。前記プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ２２、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、大腸菌と乳酸菌とのシャトルベクター（ｐＧＭβ１等）が挙げられる。前記ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。
　前記発現ベクターの構築の手順及び方法は、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。例えば、前記曳糸性向上ＤＮＡをベクターに挿入するには、先ず、前記単離ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なプラスミドの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して前記プラスミドに連結する方法等が採用される。
　前記発現ベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して曳糸性向上タンパク質を発現させるために、本発明の曳糸性向上タンパク質をコードするＤＮＡ（曳糸性向上ＤＮＡ）の他に、その発現を制御するポリヌクレオチド配列、前記発現を制御するポリヌクレオチド配列以外の発現を誘導するポリヌクレオチド配列、及び細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいることが好ましい。
　前記発現を制御するポリヌクレオチド配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、及びシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。前記プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチド配列とすることができる。前記発現を誘導するポリヌクレオチド配列としては、宿主細胞が細菌である場合には、例えば、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。前記遺伝子マーカーとしては、形質転換体の選択方法に応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を用いることができる。
　前記宿主細胞としては、特に制限されないが、微生物であることが好ましく、例えば、糸状菌、酵母、大腸菌、放線菌、乳酸菌などが挙げられる。本発明の曳糸性向上タンパク質の製造方法に用いる場合、前記宿主細胞としては特に制限されないが、前記ＤＮＡを導入した宿主細胞をそのまま下記の＜発酵乳の製造方法＞、＜発酵乳の曳糸性向上方法＞、＜乳酸菌の菌体外多糖の製造方法＞、又は＜発酵乳の増粘剤の製造方法＞に用いる場合には、乳酸菌であることが好ましい。前記宿主細胞としては、必要に応じて、特定の機能が欠損するように既に形質転換されたものや変異体であってもよい。
　これらの宿主細胞に前記ＤＮＡ又は発現ベクターを導入する方法としては、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられ、乳酸菌への導入方法としては、接合法も挙げられる。また、植物細胞へ導入する場合の方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法やパーティクルガン法が挙げられ、昆虫細胞へ導入する場合の方法としては、バキュロウィルスを用いる方法やエレクトロポレーション法が挙げられ、動物細胞へ導入する場合の方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられる。
　本発明の曳糸性向上タンパク質は、こうして宿主細胞に前記ＤＮＡ又は発現ベクターが導入された形質転換体を適当な培地で培養することにより、その培養物（例えば培養微生物細胞）から採取することができる。したがって、本発明は、前記形質転換体を培養し、該形質転換体に発現した曳糸性向上タンパク質を採取する工程を含む、本発明の曳糸性向上タンパク質の製造方法をも提供することができる。
　前記形質転換体の培養条件としては、例えば、宿主細胞の培養条件を適用することができ、当業者であれば、宿主細胞の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養温度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。また、培養物から前記曳糸性向上タンパク質を採取する方法としては、例えば、曳糸性向上タンパク質を宿主細胞（例えば大腸菌）内で発現させ、形質転換体の培養終了後、培養細胞を遠心分離や濾過等によって回収し、細胞を破砕して得られる液を粗精製物として得る方法を用いることもできる。さらに、この上清液を、限外濾過法等によって濃縮し、防腐剤等を加えて濃縮粗精製物とすることもできる。また、前記粗精製物又は前記濃縮粗精製物を、例えば、塩析法、有機溶媒沈殿法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることによって精製してもよい。或いは、精製用タグを付加した曳糸性向上タンパク質を宿主細胞（例えば大腸菌）内で発現させ、その粗抽出液をタグ付きタンパクの精製用カラムに通した後にタグ付きタンパク質を溶出させることで精製してもよい。
　本発明の曳糸性向上タンパク質には、他の化合物が直接又は間接的に付加されていてもよい。かかる付加としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの付加であってもよく、化学的な付加であってもよい。また付加される部位についても特に制限はなく、本発明の曳糸性向上タンパク質のアミノ末端（以下「Ｎ末端」とも称する）及びカルボキシ末端（以下「Ｃ末端」とも称する）のいずれかであってもよく、その両方であってもよい。遺伝子レベルでの付加は、本発明の曳糸性向上タンパク質をコードするＤＮＡ（曳糸性向上ＤＮＡ）に、他のタンパク質をコードするＤＮＡを読み枠を合わせて付加させたものを用いることにより達成される。このようにして付加される「他のタンパク質」としては特に制限はなく、例えば、本発明の曳糸性向上タンパク質の精製を容易にする目的の場合には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ－）タグ（ｔａｇ）タンパク質、ＦＬＡＧ－タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の精製用タグタンパク質が好適に用いられ、また例えば、本発明の曳糸性向上タンパク質の検出を容易にする目的の場合には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質等の検出用タグタンパク質が好適に用いられる。化学的な付加は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシ基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエーテル結合が挙げられる。「非共有結合」としては、例えば、ビオチン－アビジン間結合が挙げられる。
　〔曳糸性向上ＤＮＡ〕
　本発明の曳糸性向上ＤＮＡは、前記本発明の曳糸性向上タンパク質のアミノ酸配列をコードする限り、天然のＤＮＡに変異が導入されたＤＮＡであってもよく、人工的に設計されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡであってもよく、非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。さらに、その形態について特に制限はなく、例えば、上記の〔曳糸性向上タンパク質〕において単離ＤＮＡとして挙げた、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。
　さらに、本発明の曳糸性向上ＤＮＡは、コードする曳糸性向上タンパク質の発現効率を宿主細胞においてより向上させるという観点から、当該宿主細胞の種類に合わせて、コドンを最適化した本発明の曳糸性向上タンパク質をコードするＤＮＡの態様もとり得る。
　〔ベクター〕
　本発明の曳糸性向上ＤＮＡとしては、当該ＤＮＡを宿主細胞内において複製することができるよう、当該ＤＮＡが挿入されているベクターの態様もとり得る。したがって、本発明は、本発明の曳糸性向上ＤＮＡを含むベクターをも提供する。本発明のベクターとしては、その好ましい態様も含めて、上記の〔曳糸性向上タンパク質〕において挙げた発現ベクターが挙げられる。
　〔組成物〕
　本発明は、上記本発明の曳糸性向上タンパク質、曳糸性向上ＤＮＡ、及びベクターのうちの少なくとも１種を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の曳糸性向上タンパク質、曳糸性向上ＤＮＡ、及びベクターのうちの少なくとも１種を有効成分として含有する、発酵乳の曳糸性の向上に用いるための組成物とすることができ、例えば、本発明の組成物を様々な乳酸菌に導入して下記の本発明の乳酸菌とし、それを用いて発酵乳を製造することにより、従来よりも曳糸性が高く濃厚な発酵乳を得ることが可能となる。
　本発明の組成物としては、他の成分をさらに含有していてもよい。前記他の成分としては、特に制限されないが、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられ、これらのうちの１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　＜乳酸菌及び乳酸菌組成物＞
　本発明は、上記本発明の曳糸性向上ＤＮＡ、又は前記曳糸性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターが前記宿主細胞に導入された形質転換体も提供する。前記形質転換体としては、上記の〔曳糸性向上タンパク質〕において挙げた形質転換体が挙げられる。
　本発明において、前記形質転換体の宿主細胞としては、乳酸菌であることが好ましく、「本発明の乳酸菌」には、上記本発明の曳糸性向上ＤＮＡ、及び前記曳糸性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；並びに、上記本発明の曳糸性向上ＤＮＡを有する乳酸菌が含まれる。さらに、「本発明の乳酸菌」には、本発明の曳糸性向上タンパク質自体が導入された乳酸菌も含む。本発明の乳酸菌は、そのため、発酵乳の曳糸性の向上作用を奏することが可能である。
　また、本発明の乳酸菌は乳酸菌組成物の態様であってもよく、本発明は、これら本発明の乳酸菌のうちの少なくとも１種を含有する乳酸菌組成物も提供する。前記乳酸菌組成物は、前記曳糸性向上タンパク質の製造に用いる他、曳糸性が向上した発酵乳の製造、発酵乳の曳糸性の向上、乳酸菌の菌体外多糖の製造、又は発酵乳の増粘剤の製造に用いるための乳酸菌組成物とすることができる。
　〔乳酸菌〕
　本発明の曳糸性向上タンパク質、曳糸性向上ＤＮＡ、又はベクターが導入される宿主細胞としての乳酸菌としては、特に制限されないが、例えば、ストレプトコッカセエ科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕａｃｅａｅ科）、ラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）、ロイコノストック科（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）等が挙げられ、より具体的には、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクチカゼイバチルス属（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクチプランティバチルス属（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、リクォリラクトバチルス属（Ｌｉｑｕｏｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リモシラクトバチルス属（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レビラクトバチルス属（Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レンチラクトバチルス属（Ｌｅｎｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）等の乳酸桿菌；ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）等の乳酸球菌；ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられる。これらの中でも、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー（サブスピーシーズを含む）がより好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスがさらに好ましい。前記宿主細胞としての乳酸菌は、既に前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちの少なくとも１種、或いは、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡのうちの少なくとも１種を有するものであってもよい。かかる乳酸菌を宿主細胞とする場合には、さらなる曳糸性向上作用を期待できる。
　これらの乳酸菌に、前記曳糸性向上タンパク質、前記曳糸性向上ＤＮＡ、又は前記ベクターを導入する方法としては、上記の〔曳糸性向上タンパク質〕においてＤＮＡ又は発現ベクターを導入する方法として挙げた方法を適宜採用することができ、例えば、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、及び接合法からなる群から選択される少なくとも１種を用いて前記曳糸性向上ＤＮＡ又は前記ベクターを導入することが好ましい。
　また、本発明の乳酸菌として、上記本発明の曳糸性向上ＤＮＡを有する乳酸菌としては、例えば、前記宿主細胞として挙げた乳酸菌のうち、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡのうちの少なくとも１種のＤＮＡを有する乳酸菌が挙げられる。
　なお、本発明の乳酸菌が上記本発明の曳糸性向上タンパク質又は曳糸性向上ＤＮＡを有する（好ましくは導入されている）ことは、公知の方法又はそれに準じた方法で適宜確認することができ、例えば、下記の＜乳酸菌の評価方法＞の評価工程に記載の曳糸性向上ＤＮＡの検出方法で確認することができる。したがって、「本発明の乳酸菌」には、下記の本発明の乳酸菌の評価方法により発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌（前記作用を有する可能性が高いと評価されたものを含む）、本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌も含む。
　本発明の乳酸菌が有する（好ましくは導入されている）ＤＮＡは、当該乳酸菌内において、そのゲノムＤＮＡに保持されていてもよく、またベクターであれば、そのゲノムＤＮＡ外の独立体として複製され保持されていてもよい。乳酸菌に導入されているＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡにランダムに挿入されることによって保持されていてもよく、相同組み換えによって保持されていてもよい。また、本発明の乳酸菌としては、発酵乳の曳糸性向上作用を有する範囲内において、上記乳酸菌の同株又はその継代株の人工変異株、自然変異株、又は遺伝子組み換え株であってよい。
　本発明の乳酸菌としては、発酵乳の曳糸性向上作用を有することが好ましい。本発明において、前記曳糸性向上タンパク質、前記曳糸性向上ＤＮＡ、又は前記ベクターが導入された乳酸菌が発酵乳の曳糸性向上作用を有することは、例えば、前記曳糸性向上タンパク質、前記曳糸性向上ＤＮＡ、又は前記ベクターを導入した乳酸菌を用いて得られた発酵乳の接着時間が、導入前の乳酸菌を用いて同じ発酵条件（例えば、導入前の乳酸菌が発酵可能な条件）で得られた発酵乳の接着時間を１としたときに、２以上となること、好ましくは３以上となること、より好ましくは４以上となること、で確認することができる。前記接着時間は、前記クリープメーターを上記の条件で用いて、各発酵乳を二回圧縮した直後を０秒として、冶具を上昇させ、冶具に付着した発酵乳と容器内の発酵乳との間が完全に分断されるまでの時間として測定することができる。
　〔乳酸菌組成物〕
　本発明の乳酸菌組成物は、上記本発明の乳酸菌を含有する組成物である。本発明の乳酸菌組成物としては、他の成分をさらに含有していてもよく、前記他の成分としては、特に制限されないが、例えば、前記乳酸菌の培養終了後の培養上清、培地成分等である培養物；前記培養物の濃縮物、粗精製物、精製物、希釈物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物等）、凍結物等；保護剤、発酵促進剤等が含まれ、これらのうちの１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　また、本発明の乳酸菌組成物には、本発明の乳酸菌（すなわち、曳糸性向上タンパク質、曳糸性向上ＤＮＡ、及び曳糸性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；曳糸性向上ＤＮＡを有する乳酸菌；本発明の乳酸菌の評価方法により発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌（前記作用を有する可能性が高いと評価されたものを含む）；本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌）を含有する組成物であれば包含され、下記の本発明の発酵乳もこれに包含される。
　＜乳酸菌の評価方法、乳酸菌の製造方法＞
　本発明の乳酸菌の評価方法は、上記本発明の曳糸性向上タンパク質、すなわち、下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、及び
（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質、
のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡ（すなわち、本発明の曳糸性向上ＤＮＡ）を指標として、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する方法である。
　〔評価工程〕
　本発明の乳酸菌の評価方法においては、本発明の曳糸性向上ＤＮＡを指標として、すなわち、乳酸菌が本発明の曳糸性向上ＤＮＡを有するか否かを指標として、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する（評価工程）。前記曳糸性向上ＤＮＡを有する場合には、その乳酸菌を発酵乳の曳糸性向上作用を有すると評価すること（有する可能性が高いと評価することを含む）ができ、他方、前記ＤＮＡを有していない場合には、その乳酸菌を発酵乳の曳糸性向上作用を有さないと評価すること（有さない可能性が高いと評価することを含む）ができる。これにより、発酵乳の曳糸性向上作用を有する又は有する可能性が高い乳酸菌を選抜することが可能となる。本発明の乳酸菌の評価方法において、評価対象となる乳酸菌としては、特に制限されず、所望の乳酸菌を適宜対象とすることができる。
　乳酸菌が本発明の曳糸性向上ＤＮＡを有するか否かは、当該ＤＮＡを検出することにより判定することができる。曳糸性向上ＤＮＡの検出方法としては、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。
　例えば、先ず、評価対象の乳酸菌からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出方法としては、特に制限はなく、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、ＰＣＩ法、ＧｕＳＣＮ／Ｓｉｌｉｃａ法、ＳＤＳフェノール法、ＣＴＡＢ法、アルカリ処理法が挙げられる。また、市販のキットを適宜用いることもできる。
　前記曳糸性向上ＤＮＡの検出方法としては、次いで、曳糸性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することにより実施することができる。当該ＤＮＡの単離は、例えば、少なくとも前記曳糸性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡを挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離したＤＮＡのヌクレオチド配列の決定は、サンガー法及びマキサムギルバート法など、当業者に公知の方法で行うことができる。また、前記ゲノムＤＮＡより、次世代シーケンサー等を用いて直接に前記曳糸性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡのヌクレオチド配列を決定してもよい。
　前記曳糸性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡとしては、少なくともＲ１－ＥｐｓＣの第４０位に対応するアミノ酸をコードする部位を含むことが好ましく、これを挟み込む一対のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記曳糸性向上ＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、Ｒ１－ｅｐｓＣ）及び公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）に基づいて、それぞれ設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドは、当業者であれば、公知の方法又はそれに準じた方法で設計することができる。
　前記曳糸性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＰ（ＰＣＲ－配列特異的プライマー）法が挙げられる。当該方法においては、プライマーを構成する一対のオリゴヌクレオチドのうちの片方のオリゴヌクレオチドの３’末端が前記曳糸性向上ＤＮＡの特定の塩基、例えば、検出するＤＮＡが前記（ａ’）である場合にはＲ１－ＥｐｓＣの第４０位のチロシンをコードする部位に相補的な塩基種になるように設計する。このように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されるのは、本発明の曳糸性向上ＤＮＡを鋳型にした場合に限られ、第４０位のチロシンをコードする部位が他のアミノ酸をコードするゲノムＤＮＡを鋳型にした場合には増幅されない。したがって、このような増幅の有無を指標として、前記ＤＮＡを検出することができる。
　また、前記曳糸性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法として、Ｒ１－ＥｐｓＣの第４０位又はそれに対応するチロシンをコードする部位に制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を設定できる場合には、それらＲＦＬＰマーカーを指標として、例えば、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法（又は、ＣＡＰＳ［Ｃｌｅａｖｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ］法）などにより検出することもできる。
　前記曳糸性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ＰＣＲ－一本鎖高次構造多型）法が挙げられる。前記曳糸性向上ＤＮＡを挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより増幅された２本鎖ＤＮＡを、熱やアルカリ等で処理することにより変性させ、１本鎖ＤＮＡにした後、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、ゲル中で１本鎖ＤＮＡは分子内相互作用により折り畳まれ、高次構造を形成する。折り畳まれ構造の相互作用は、塩基種の相違により変化するため、分離した当該１本鎖ＤＮＡを銀染色やラジオアイソトープにより検出し、当該１本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を指標として、前記曳糸性向上ＤＮＡの検出をすることができる。
　前記曳糸性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、インターカレーターを用いる方法が挙げられる。この方法においては、先ず、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、前記曳糸性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡを増幅する。そして、反応系の温度を変化させ、インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出し、検出した温度の変化に伴う蛍光の強度の変動を指標として、前記曳糸性向上ＤＮＡ（特にＲ１－ＥｐｓＣの第４０位又はそれに対応するチロシンをコードする部位）を検出することができる。このような方法としては、高分解融解曲線解析（ＨＲＭ）法が挙げられる。
　前記曳糸性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、検出するＤＮＡが上記（ａ’）である場合にはＲ１－ＥｐｓＣの第４０位のチロシンをコードする部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法が挙げられる。この方法の一つの態様においては、先ず、前記第４０位のチロシンをコードする部位に特異的にハイブリダイズし、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。次いで、このオリゴヌクレオチドプローブを前記ゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、さらにオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズしたＤＮＡ試料を鋳型として、前記第４０位のチロシンをコードする部位を含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、クエンチャーによる抑制が解除されたレポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する。このような方法としては、ダブルダイプローブ法、いわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が挙げられる。レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる他の態様としては、前記曳糸性向上ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするキメラオリゴヌクレオチド（ＲＮＡとＤＮＡのキメラ）とＲＮａｓｅ　Ｈなどの酵素との組み合わせを用いるサイクリングプローブ法を利用することもできる。
　前記曳糸性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。この方法では、２本鎖ＤＮＡの目的部位の両側に３つずつ、計６つの領域を設定し、これら領域を含む４種類（各側２種類ずつ）のプライマーを用いて、鎖置換型酵素の存在下で反応させることにより、前記目的部位の両側にループ構造の増幅起点を生成させることができるため、以降、同一鎖上に互いに相補的な配列の繰り返し構造が生成されて、前記目的部位が増幅される。検出するＤＮＡが前記（ａ’）である場合、前記目的部位をＲ１－ＥｐｓＣの第４０位のチロシンをコードする部位とした場合には、増幅産物のヌクレオチド配列の決定を行うことにより各改変の存在又は不存在の検出を行うことができる。また、前記６つの領域のうちの１つを前記第４０位のチロシンをコードする部位とした場合、改変がある場合には前記目的部位が増幅されないため、かかる増幅の有無を指標として、前記ＤＮＡを検出することができる。
　前記曳糸性向上ＤＮＡの検出方法は、上記態様に限定されるものではない。例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）、インベーダー法、パイロシークエンシング法、シングルヌクレオチドプライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡアレイ法などの、その他の公知の技術も、本発明において利用し得る。
　さらに、前記曳糸性向上ＤＮＡの検出としては、その発現を検出するものであることも好ましい。前記曳糸性向上ＤＮＡの発現の検出方法としては、例えば、対象の乳酸菌から常法に従ってｍＲＮＡ又はタンパク質を抽出し、公知の手法又はそれに準じた方法により、当該曳糸性向上ＤＮＡがコードするｍＲＮＡ又はタンパク質（すなわち曳糸性向上タンパク質）の検出によって行ってもよい。
　前記曳糸性向上ＤＮＡがコードするｍＲＮＡを検出する方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンブロット法が挙げられる。
　前記曳糸性向上ＤＮＡがコードするタンパク質（曳糸性向上タンパク質）を検出する方法としては、先ず、対象の乳酸菌からタンパク質試料を調製し、前記曳糸性向上タンパク質に特異的な抗体、すなわち、少なくとも第４０位のチロシンに特異的抗体を用いて抗原抗体反応を行い、前記曳糸性向上タンパク質を検出する。このような抗体を用いたタンパク質の検出法においては、例えば、前記タンパク質試料に対して、前記曳糸性向上タンパク質に特異的な抗体を添加して抗原抗体反応を行い、曳糸性向上タンパク質に対する前記抗体の結合を検出する。曳糸性向上タンパク質に特異的な抗体が標識されている場合には、直接的に曳糸性向上タンパク質を検出することができるが、標識されていない場合には、さらに、当該抗体を認識する標識された分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）を作用させて、当該分子の標識を利用して、間接的に曳糸性向上タンパク質を検出することができる。このような方法としては、例えば、免疫組織化学（免疫染色）法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法等を利用することができる。前記抗体としては、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。
　〔本発明の評価方法に用いるためのキット〕
　上述のとおり、本発明の曳糸性向上ＤＮＡを検出することによって、乳酸菌における曳糸性向上作用を評価することができる。したがって、本発明は、上述の評価方法に用いるための、下記（ｉ）～（ｉｉ）の薬剤：
（ｉ）本発明の曳糸性向上ＤＮＡ、その転写産物又はその相補的ヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオドを含む薬剤、及び
（ｉｉ）本発明の曳糸性向上タンパク質に結合する抗体を含む薬剤、
からなる群から選択される少なくとも１種の薬剤を含むキットも提供する。前記オリゴヌクレオドとしては、上記の曳糸性向上ＤＮＡの検出方法に応じて、プライマーの態様であってもよく、プローブの態様であってもよい。
　前記プライマーとしては、本発明の曳糸性向上ＤＮＡ若しくは曳糸性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡ、又はその相補的ヌクレオチド（ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡを含む）、又は曳糸性向上ＤＮＡの転写産物（ｍＲＮＡ）にハイブリダイズし、これらの増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。前記プライマーとしては、ＤＮＡのみであってもよく、またその一部又は全部において、架橋化核酸等の人工核酸（修飾核酸）によって置換されているものであってもよい。前記プライマーのサイズとしては、少なくとも約１５ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは１５～１００ヌクレオチド長、より好ましくは１８～５０ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０～４０ヌクレオチド長である。このようなプライマーは、上記検出方法に合わせて、当業者であれば公知の方法により設計し、作製することができる。
　前記プローブとしては、曳糸性向上ＤＮＡ若しくは曳糸性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡ、又はその相補的ヌクレオチド、又は曳糸性向上ＤＮＡの転写産物にハイブリダイズし、それらの検出を可能とする限り特に限定されない。前記プローブとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸、又はそれらのキメラ分子等であり得る。前記プローブとしては、１本鎖又は２本鎖のいずれでもよい。前記プローブのサイズとしては、少なくとも約１５ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは１５～１０００ヌクレオチド長、より好ましくは２０～５００ヌクレオチド長、さらに好ましくは３０～３００ヌクレオチド長である。このようなプローブは、当業者であれば公知の方法により設計し、作製することができる。また、前記プローブは、マイクロアレイのように、基板上に固定された形態で提供されてもよい。
　前記抗体は、本発明の曳糸性向上タンパク質に特異的に結合し得る限り特に限定されない。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、抗体の機能的断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ等）であってもよい。このような抗体は、当業者であれば公知の方法により作製することができる。また、前記抗体としては、ＥＬＩＳＡ法や抗体アレイ等に用いるべく、プレート等の基板上に固定された形態で提供されてもよい。
　また、前記キットに含まれるオリゴヌクレオチド又は抗体は、上記検出方法に合わせて、標識用物質で標識されていてもよい。前記標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＤＥＡＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５等の蛍光物質、β－Ｄ－グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ、ＨＲＰ等の酵素、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質が挙げられる。
　本発明の乳酸菌の評価方法には、前記乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを確認する確認工程をさらに含んでいてもよい。このような確認方法としては、特に制限されないが、評価対象の乳酸菌を用いて得られた発酵乳について、例えば、前記クリープメーターを上記の条件で用いて測定した接着時間を指標とすることで確認することができる。前記発酵乳としては、例えば、１０％脱脂粉乳培地に対して前記乳酸菌を１％（ｗｔ／ｗｔ）となるように播種し、３７℃において終夜、嫌気条件で発酵させたものが挙げられる。また、前記接着時間としては、例えば、２秒以上、好ましくは３秒以上、さらに好ましくは４秒以上であったものを、前記乳酸菌が発酵乳の曳糸性向上作用を有すると評価することができる。
　〔乳酸菌の製造方法〕
　本発明の乳酸菌の製造方法は、上記本発明の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
　前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を得る工程と、
を含む方法である。
　本発明の乳酸菌の製造方法において、前記評価工程としては、上記の＜乳酸菌の評価方法＞の評価工程が挙げられる。本発明の乳酸菌の製造方法に係る評価工程では、これにより発酵乳の曳糸性の向上作用を有する又は有する可能性が高い乳酸菌を選抜する。本発明の乳酸菌の製造方法では、前記評価工程により発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌（前記作用を有する可能性が高いと評価されたものを含む）を得ることができるが、例えば、選抜した乳酸菌を適当な培地で培養することにより、その培養物として前記乳酸菌を得てもよい。
　また、本発明の乳酸菌の製造方法で得られる乳酸菌の態様としては、その培養物等の乳酸菌組成物の態様であってもよい。そのため、本発明の乳酸菌の製造方法には、前記評価工程により発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を含有する乳酸菌組成物を得る工程を含む、乳酸菌組成物の製造方法も包含される。前記乳酸菌組成物に前記乳酸菌以外で含有されていてもよい他の成分としては、上述のとおりである。
　＜発酵乳の製造方法＞
　本発明の発酵乳の製造方法は、原料乳を含有する調乳液に、乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加して発酵させる発酵工程を含むものである。
　本発明の発酵乳の製造方法に係る乳酸菌には、上記の、本発明の乳酸菌（すなわち、曳糸性向上タンパク質、曳糸性向上ＤＮＡ、及び曳糸性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；曳糸性向上ＤＮＡを有する乳酸菌；本発明の乳酸菌の評価方法により発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌（前記作用を有する可能性が高いと評価されたものを含む）；本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌）が含まれ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。また、本発明の発酵乳の製造方法に係る乳酸菌組成物には、上記の本発明の乳酸菌組成物；及び本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌組成物；が含まれ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。これらの乳酸菌又は乳酸菌組成物を用いることにより、曳糸性に優れた発酵乳を得ることができる。なお、前記乳酸菌として、本発明の乳酸菌の評価方法により発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を用いる場合、本発明の発酵乳の製造方法としては、前記評価工程を含んでいてもよいが、この場合の当該評価工程としては最初の１回のみでよい。
　本発明の発酵乳の製造方法においては、上記本発明の乳酸菌以外の他の乳酸菌をさらに組み合わせて用いてもよい。また、酵母をさらに加えてもよい。前記他の乳酸菌及び酵母としては、従来から発酵乳に含有させることが公知の乳酸菌や酵母が挙げられる。
　（調乳液）
　本発明に係る調乳液は、原料乳を含有する。前記原料乳としては、乳糖を含有するものであることが好ましく、例えば、生乳（例えば、ウシ、スイギュウ、ヒツジ、ヤギ等の乳）、殺菌乳、全脂乳、脱脂乳、ホエイ、及びこれらの加工品（例えば、全脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂粉乳、脱脂濃縮乳、練乳、ホエイ粉、バターミルク、バター、クリーム、チーズ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α－ラクトアルブミン（α－Ｌａ）、β－ラクトグロブリン（β－Ｌｇ））が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。
　本発明に係る調乳液としては、前記原料乳のみからなるものであっても、前記原料乳の水溶液、希釈液、又は濃縮液であってもよく、前記原料乳の他に、必要に応じて他の成分をさらに含有するものであってもよい。このような他の成分としては、水；豆乳、砂糖を始めとする糖類や甘味料、香料、果汁、果肉、ビタミン、ミネラル、油脂、セラミド、コラーゲン、ミルクリン脂質、酵母エキス、ポリフェノール等の食品、食品成分、食品添加物；ペクチン、大豆多糖類、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、寒天、ゼラチン、カラギーナン、ガム類などの安定化剤、増粘剤、ゲル化剤が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。前記調乳液は、必要に応じて加温しながら、及び／又は、必要に応じて均質化させながら、前記成分を混合することにより調製することができる。また、前記調乳液としては、加熱殺菌したものを用いることもできる。
　（発酵）
　前記調乳液に、前記乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加して発酵させる発酵工程としては、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、特に制限されないが、例えば、前記調乳液に、前記乳酸菌又は乳酸菌組成物を発酵スターターとして接種し、発酵させる方法が挙げられる。前記乳酸菌又は乳酸菌組成物としては、前記乳酸菌組成物の形態、より好ましくは、培養物又は培養物の濃縮物の形態で前記調乳液に添加されることが好ましい。
　前記発酵スターターの添加量は、公知の発酵乳の製造方法において採用されている添加量に従って、適宜設定することができるが、例えば、前記調乳液の体積に対して、乳酸菌数（２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計菌数）換算で、１×１０７～５×１０９ＣＦＵ／ｍＬであることが好ましく、１×１０８～２×１０９ＣＦＵ／ｍＬであることがより好ましい。また、前記調乳液の体積に対して、０．１～２％（ｗｔ／ｗｔ）であることも好ましく、０．５～１．５％（ｗｔ／ｗｔ）であることもより好ましく、０．５～１％（ｗｔ／ｗｔ）であることもさらに好ましい。
　前記発酵スターターの接種方法は、特に制限されることなく、発酵乳の製造方法で慣用されている方法を適宜用いることができる。前記発酵の条件としては、添加される乳酸菌の生育条件、前記調乳液の量等に応じて適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、温度３５～４５℃、より好ましくは温度３８～４３℃において、好気又は嫌気条件下で、前記乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加した調乳液のｐＨが４．８以下、より好ましくは４．０～４．６になるまで、通常、３～２４時間、より好ましくは３～８時間、さらに好ましくは４～６時間、静置又は撹拌（好ましくは静置）することが好ましい。また、前記嫌気条件としては、例えば、窒素通気条件下での発酵を採用することができる。
　上記発酵により、本発明の発酵乳を得ることができる。前記発酵工程後の発酵物（すなわち、前記発酵工程後の調乳液、及び乳酸菌又は乳酸菌組成物）は、そのまま、又は必要に応じて濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵乳とすることができる。また、前記発酵物における乳酸菌を破砕若しくは加熱処理等して、又は必要に応じてこれを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵乳としてもよい。
　＜発酵乳＞
　本発明の発酵乳としては、上記の、本発明の乳酸菌（すなわち、曳糸性向上タンパク質、曳糸性向上ＤＮＡ、及び曳糸性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；曳糸性向上ＤＮＡを有する乳酸菌；本発明の乳酸菌の評価方法により発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌（前記作用を有する可能性が高いと評価されたものを含む）；本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌）からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌を含有する発酵乳が提供される。本発明の発酵乳としては、これらの乳酸菌由来の曳糸性向上タンパク質及び／又は菌体外多糖を含有していることが好ましい。また、本発明の発酵乳としては、これ以外の他の乳酸菌及び酵母をさらに含有していてもよい。
　本発明の発酵乳としては、特に限定されるものではなく、例えば、日本国厚生労働省の乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）による「発酵乳」の規格を満たす発酵乳（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が８．０％以上、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数）が１，０００万/ｍＬ以上のもの）、「乳製品乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％以、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数）が１０００万／ｍＬ以上のもの）、「乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％未満、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数）が１００万／ｍＬ以上のもの）のいずれであってもよい。なお、前記無脂乳固形分とは、全乳固形分から脂肪分を差引いた残りの成分（主に、たんぱく質、乳糖、及びミネラル等）を示し、前記乳酸菌及び酵母数は、殺菌前において、前記乳等省令で定められた検査法により測定される。
　本発明の発酵乳としては、前記発酵工程後の発酵物であっても、若しくは前記発酵物を殺菌処理したものであってもよく、又はこれらを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等したものであってもよく、例えば、前記発酵乳としては、上記の発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、又は乳酸菌飲料を殺菌処理したものであってもよく、この場合、上記乳酸菌数は、生菌数換算である。本発明の発酵乳に含有される乳酸菌には、生菌の他、死菌も含み、乳酸菌の破砕物及び加熱処理物、これらの濃縮物、粗精製物、精製物、希釈物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物等）、凍結物も含むが、本発明の発酵乳に含有される乳酸菌としては、少なくとも生菌を含むことが好ましい。
　本発明の発酵乳としては、本発明の効果を阻害しない範囲内において、乳酸菌として、前記他の乳酸菌や酵母をさらに含有していてもよい。また、本発明の発酵乳としては、他に、飲食品に含有させることが可能な各種成分をさらに含有してもよい。このような成分としては、特に制限されず、例えば、水、糖類、糖アルコール類、ミネラル類、ビタミン類、タンパク質、ペプチド、アミノ酸類、有機酸、ｐＨ調整剤、澱粉及び加工澱粉、食物繊維、果実・野菜及びその加工品、動物及び植物生薬エキス、天然由来高分子（コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン等）、油脂、増粘剤、乳化剤、溶剤、界面活性剤、ゲル化剤、安定剤、緩衝剤、懸濁化剤、粘稠剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、保存料、着色料、香料、矯味剤、甘味剤等が挙げられ、これらのうちの１種のみを含有していても２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
　このような発酵乳としては、ヨーグルト、チーズ、発酵クリーム、発酵バター等が好ましく、特にヨーグルトが好ましい。前記ヨーグルトとしては、具体的には、プレーンヨーグルト等のセットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトタイプヨーグルト（糊状発酵乳）、及びドリンクタイプヨーグルト（液状発酵乳）が挙げられ、これらを材料として用いたフローズンヨーグルトであってもよい。また、本発明の発酵乳は、チーズ、発酵クリーム、発酵バター、ケフィア等の発酵食品の材料として用いることもできる。
　本発明の発酵乳は、上記本発明の発酵乳の製造方法によって得ることができ、曳糸性に優れた発酵乳とすることができる。
　＜菌体外多糖の製造方法＞
　本発明は、グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、上記本発明の乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法も提供する。
　本発明において、「乳酸菌の菌体外多糖」とは、乳酸菌によって産生される菌体外多糖（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を示し、かかる菌体外多糖には、中性菌体外多糖（ＮＰＳ）、酸性菌体外多糖（ＡＰＳ）、両イオン性菌体外多糖（ＺＰＳ）、及びこれらの混合物が含まれる。
　前記培地としては、グルコース及びグルコースを構成糖とする糖から選択される少なくとも１種の糖を含有することが必要である。グルコースを構成糖とする糖としては、例えば、二糖（マルトース、ショ糖、ラクトース等）、オリゴ糖（ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖等）、及び多糖（デンプン（アミロース、アミロペクチン）、グリコーゲン等）が挙げられる。前記培地に含有される糖としては、前記糖のうちの１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよいが、中でも、ラクトースが含有されることが好ましい。また、前記培地に含有される糖としては、例えば、前記原料乳に含まれるものを用いることができ、前記培地としては、前記原料乳を含有することが好ましく、前記原料乳を含有する前記調乳液であることがより好ましく、また、前記原料乳としては、脱脂粉乳が好ましい。
　前記乳酸菌及び乳酸菌組成物、並びに、発酵の方法としては、その好ましい態様も含めて、前記調乳液として前記培地を用いてもよいこと以外は、上記の発酵乳の製造方法における発酵工程と同様である。前記発酵乳から前記菌体外多糖を採取する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、発酵後の発酵物に、必要に応じてタンパク質変性剤（トリクロロ酢酸等）の添加や加熱処理による除タンパクを行って粗精製物とした後、例えば、塩析法、有機溶媒沈殿法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることによって精製する方法が挙げられる。
　＜発酵乳の増粘剤及びその製造方法＞
　また、本発明は、上記の、本発明の乳酸菌（すなわち、曳糸性向上タンパク質、曳糸性向上ＤＮＡ、及び曳糸性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；曳糸性向上ＤＮＡを有する乳酸菌；本発明の乳酸菌の評価方法により発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌（前記作用を有する可能性が高いと評価されたものを含む）；本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌）からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌に由来する菌体外多糖を有効成分として含有する、発酵乳の増粘剤も提供する。前記乳酸菌に由来する菌体外多糖は、前記菌体外多糖の製造方法によって上記本発明の乳酸菌又は乳酸菌組成物を前記培地に添加して発酵させた際に菌体外に産生されるものであり、前記発酵後の発酵物に含有される。本発明の発酵乳の増粘剤は、例えば、発酵乳に添加することにより、当該発酵乳の曳糸性を向上させ、増粘せしめることができる。
　本発明の発酵乳の増粘剤は、前記発酵後の発酵物のままであってもよく、前記発酵物の濃縮物、粗精製物、精製物、ペースト化物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物等）、粉砕物、媒体に分散させた液状物、及びこれらの２以上を組み合わせた処理物であってよく、また、前記菌体外多糖の製造方法で得られた菌体外多糖のみからなるものであってもよい。さらに、本発明の効果を阻害しない範囲内において、発酵乳に含有させることが可能な他の成分を含有していてもよい。前記他の成分としては、特に制限されず、例えば、上記の＜発酵乳＞において挙げた各種成分が挙げられ、これらのうちの１種又は２種以上を組み合わせて適当量含有していてもよい。
　本発明の発酵乳の増粘剤において、有効成分である菌体外多糖の含有量（２種以上の混合物である場合にはそれらの合計量）は、適宜調整されるものであるため一概にはいえないが、発酵乳の増粘剤全体に対して、０．００１質量％以上であることが好ましく、０．００２質量％以上であることがより好まししく、０．００３質量％以上であることが特に好ましい。前記含有量の上限としては特に制限されず、例えば、１００質量％以下、好ましくは９０質量％以下とすることができる。
　＜発酵乳の曳糸性向上方法＞
　本発明の発酵乳の曳糸性向上方法は、原料乳を含有する調乳液に、本発明の乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加して発酵させる発酵工程を含む方法である。これにより、発酵乳の曳糸性を向上させることができる。前記乳酸菌、乳酸菌組成物、及び発酵工程としては、それぞれ、上記の本発明の発酵乳の製造方法において述べたとおりである。これにより、発酵乳の曳糸性を向上させることができる。
　本発明において、発酵乳の曳糸性が優れること又は向上したことは、例えば、発酵乳の接着時間が、前記乳酸菌以外の乳酸菌、すなわち、（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有さない他の乳酸菌、好ましくは、ラクトバチルス・デルブルッキー、及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスからなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌を用いて、同じ発酵条件で得られた発酵乳の接着時間との比較で評価することができる。例えば、前記他の乳酸菌を用いて得られた発酵乳の接着時間を１としたときに、対象の発酵乳の接着時間が、２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上であったものを、発酵乳の曳糸性が優れる又は向上したと有すると評価することができる。或いは、対象の発酵乳の接着時間が、例えば、２秒以上、好ましくは３秒以上、より好ましくは４秒以上であったものを、発酵乳の曳糸性が優れる又は向上したと有すると評価することができる。
　前記接着時間は、前記クリープメーターを上記の条件で用いて、各発酵乳を二回圧縮した直後を０秒として、冶具を上昇させ、冶具に付着した発酵乳と容器内の発酵乳との間が完全に分断されるまでの時間として測定することができる。また、前記他の乳酸菌が前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有さないことは、例えば、上記の＜乳酸菌の評価方法＞の評価工程に記載の曳糸性向上ＤＮＡの検出方法で確認することができる。前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有さない乳酸菌として、具体的には例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス２０３８株（２０３８株）が好ましい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　＜乳酸菌＞
　以下の試験に用いた乳酸菌は次のとおりである。
Ｒ－１株：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１）
２０３８株：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８
なお、２０３８株は、明治ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（株式会社明治製）の希釈液をＢＣＰ加寒天培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した後、ラフ型のコロニーをピックアップすることで分離した株であり、２０３８株の完全長ゲノムは、ゲノム、タンパク質、化合物の情報を分子間の相互作用・反応、関係ネットワークで統合した生命システム情報統合データベースである、Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）において、エントリー番号：Ｔ０１９５７で登録されている。
　＜曳糸性評価　１＞
　（１）発酵乳の調製
　Ｒ－１株を、脱脂粉乳１０％（ｗｔ／ｗｔ）、酵母エキス０．１％（ｗｔ／ｗｔ）、及び蒸留水で調製した１０％脱脂粉乳培地に対して１％（ｗｔ／ｗｔ）となるように播種し、３７℃において終夜、嫌気条件で発酵させて発酵乳を得た。また、Ｒ－１株に代えて２０３８株を用いたこと以外は同じ条件で、発酵乳を得た。
　（２）接着時間測定
　上記（１）で得られた各発酵乳について、クリープメーター（モデル：ＲＥ２－３３００５Ｓ（株式会社山電製）、容器：φ＝４１ｍｍ　ｈｅｉｇｈｔ＝３５ｍｍの円柱状容器、冶具：φ＝２５．２ｍｍ　ｈｅｉｇｈｔ＝２５ｍｍ、速度：１０ｍｍ／ｓｅｃ、戻り距離：１０ｍｍ、発酵乳量：１０ｇ）を用いて、それぞれ曳糸性を評価した。すなわち、得られた発酵乳を上記クリープメーターで二回圧縮した直後を０秒として、冶具を上昇させ、冶具に付着した発酵乳と容器内の発酵乳との間が完全に分断されるまでの時間を測定して接着時間（秒）とした。測定は各発酵乳についてそれぞれ３回行い、平均値を算出した。前記接着時間が長いほど、曳糸性が高く優れていると評価することができる。結果を図１に示す。図１に示したように、２０３８株で発酵させた発酵乳の接着時間の平均値に比べて、Ｒ－１株で発酵させた発酵乳の接着時間の平均値は有意に長く（Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ　ｔｅｓｔでｐ＜０．０１）、高い曳糸性を示した。
　＜ＥＰＳ遺伝子クラスター領域の比較＞
　ＫＥＧＧに登録されている２０３８株ゲノムのヌクレオチド配列より、２つのＥＰＳ遺伝子クラスター領域：ＬＢＵ１５９８－ＬＢＵ１５８８（ＥＰＳ遺伝子クラスター１）及びＬＢＵ１６３０－ＬＢＵ１６１８（ＥＰＳ遺伝子クラスター２）について、それぞれの－１００ｂｐ～＋１００ｂｐの領域を抽出した。また、Ｒ－１株の完全長ゲノムは、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）により取得した。Ｇｅｎｅｔｙｘ　Ｖｅｒ．１３（株式会社ゼネティックス製）のＨｏｍｏｌｏｇｙ／Ｌｏｃａｌ　ＢＬＡＳＴＮを用いて、Ｒ－１株のゲノムより、上記の２つのＥＰＳ遺伝子クラスター領域と相同なヌクレオチド配列を抽出した（Ｅ－ｖａｌｕｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．００００１、ｗｏｒｄ　ｓｉｚｅ＝１１）。
　ＥＰＳ遺伝子クラスター１の模式図を図２の（ａ）に、ＥＰＳ遺伝子クラスター２の模式図を図２の（ｂ）に、それぞれ示す。図２において、２０３８株とＲ－１株との間でヌクレオチド配列に差異が認められた箇所を矢印で示す。Ｒ－１株ゲノムにおいても、ＥＰＳ遺伝子クラスター１、２は高度に保存されていた。特に、ＥＰＳ遺伝子クラスター１では全領域（１１，５６９ｂｐ）に渡って、２０３８株のヌクレオチド配列と完全に一致していた。他方、図２に示すように、ＥＰＳ遺伝子クラスター２では、１５，７６９　ｂｐのうち、ｅｐｓＣ遺伝子及びｅｐｓＦ遺伝子、並びに、ｅｐｓＭ遺伝子とＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ遺伝子との間の遺伝子間領域において、合計４塩基の差異が認められた。表１に、２０３８株ゲノムとＲ－１株ゲノムとの間で差異が認められた遺伝子又は領域、塩基、その塩基が含まれるコドン、そのコドンがコードするアミノ酸、及びそのアミノ酸の遺伝子中の位置を示す。また、ｅｐｓＦ遺伝子においては、塩基の差異によってフレームシフトがおきていたため、下記の表２に、２０３８株ゲノムとＲ－１株ゲノムとの間で差異が認められた塩基を含むコドン以下のヌクレオチド配列及びそれがコードするアミノ酸配列を示す。また、表２に記載の２０３８株ゲノムのヌクレオチド配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に；Ｒ－１株ゲノムのヌクレオチド配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に；それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示したように、１つ目の差異は、２０３８株ゲノムのｅｐｓＣ遺伝子の１１８塩基目にあるアデニン（Ａ）が、Ｒ－１株ゲノムではチミン（Ｔ）に置換されていた。また、この塩基を含むコドンが指定する第４０位のアミノ酸は、２０３８株ゲノムではアスパラギンであったが、Ｒ－１株ゲノムではチロシンであった。２つ目の差異は、２０３８株ゲノムのｅｐｓＦ遺伝子の９９９塩基目にあるグアニン（Ｇ）が、Ｒ－１株ゲノムでは欠失していた。これによりＲ－１株ゲノムでは、フレームシフトが生じてコドンの読み枠がずれていたが、この塩基を含むコドンが指定するアミノ酸は、２０３８株ゲノム及びＲ－１株ゲノム共に第３３３位のグリシン（Ｇ）であった。しかしながら、表２に示すように、フレームシフトにより、グリシンからＣ末端にかけてのアミノ酸配列が両株間で異なっており、２０３８株ゲノムでは、Ｎ末－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｃ末であったが、Ｒ－１株ゲノムでは、Ｎ末－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｃ末であった。３、４つ目の差異は、ｅｐｓＭ遺伝子とＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ遺伝子との遺伝子間領域（遺伝子間１、２）であった。遺伝子間領域における変異はいずれの遺伝子にも関わっていないと考えられることから、ｅｐｓＣ遺伝子及びｅｐｓＦ遺伝子のうちのいずれかにおける塩基の差異及びそれに伴うアミノ酸組成の差異が、Ｒ－１株で発酵させた発酵乳と２０３８株で発酵させた発酵乳との曳糸性の差異に関与すると推察された。
　＜曳糸性評価　２＞
　（１）２０３８株の形質転換による、２０３８－ｅｐｓＣ株及び２０３８－ｅｐｓＦ株の作製
　２０３８株の形質転換には、大腸菌と乳酸菌とのシャトルベクターｐＧＭβ１（明治大学より入手）を用いた。エレクトロポレーション法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５）にｐＧＭβ１を導入した。アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）及びエリスロマイシン（終濃度５００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ培地を用いて、ｐＧＭβ１を保有するＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５を選抜した後、プラスミド抽出により、ｐＧＭβ１を精製した。また、ＰＣＲにより、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子及びｅｐｓＦ遺伝子を、それぞれ、下記のプライマー：
　ｅｐｓＣ遺伝子：
　　Ｌｂ＿ｅｐｓＣ＿ｒｅｃ１＿Ｆ（配列番号：７に示すヌクレオチド配列）
　　Ｌｂ＿ｅｐｓＣ＿ｒｅｃ１＿Ｒ（配列番号：８に示すヌクレオチド配列）
　ｅｐｓＦ遺伝子：
　　Ｌｂ＿ｅｐｓＦ＿ｒｅｃ１＿Ｆ（配列番号：９に示すヌクレオチド配列）
　　Ｌｂ＿ｅｐｓＦ＿ｒｅｃ１＿Ｒ（配列番号：１０に示すヌクレオチド配列）
により増幅した。
　次いで、精製したｐＧＭβ１をＳａｃＩ処理又はＳａｌＩ処理して脱リン酸化した。また、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子の増幅産物をＳａｃＩ処理し、ｅｐｓＦ遺伝子の増幅産物をＳａｌＩ処理し、これらをそれぞれ前記ｐＧＭβ１とライゲーションし、プラスミド「ｐＧＭβ１－ｅｐｓＣ」及び「ｐＧＭβ１－ｅｐｓＦ」をそれぞれ得た。エレクトロポレーション法により、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５にｐＧＭβ１－ｅｐｓＣ又はｐＧＭβ１－ｅｐｓＦを導入した。アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）及びエリスロマイシン（終濃度５００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ培地を用いて、ｐＧＭβ１－ｅｐｓＣ又はｐＧＭβ１－ｅｐｓＦを保有するＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５を選抜した後、プラスミド抽出により、ｐＧＭβ１－ｅｐｓＣ及びｐＧＭβ１－ｅｐｓＦをそれぞれ精製した。次いで、エレクトロポレーション法により、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＩＬ１４０３（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ　ＩＬ１４０３）にｐＧＭβ１－ｅｐｓＣ又はｐＧＭβ１－ｅｐｓＦを導入した。次いで、吸引ビンに設置した０．４５μｍのメンブレンフィルター上において、ｐＧＭβ１－ｅｐｓＣ又はｐＧＭβ１－ｅｐｓＦを保有するＬ．ｌａｃｔｉｓ　ＩＬ１４０３の培養液と２０３８株の培養液とを吸引することで、接合伝達により、ｐＧＭβ１－ｅｐｓＣ又はｐＧＭβ１－ｅｐｓＦを２０３８株に導入した。エリスロマイシン（終濃度２５μｇ／ｍＬ）含有ＭＲＳ培地を用いて４０℃で培養することで、ｐＧＭβ１－ｅｐｓＣ又はｐＧＭβ１－ｅｐｓＦを保有する２０３８株を選抜した。その後、ＭＲＳ培地で継代培養を繰り返すことで、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子が導入された２０３８株（実施例１：「２０３８－ｅｐｓＣ株」とする）及びＲ－１株のｅｐｓＦ遺伝子が導入された２０３８株（比較例１：「２０３８－ｅｐｓＦ株」とする）をそれぞれ取得した。
　（２）発酵乳の調製
　２０３８－ｅｐｓＣ株、及び２０３８－ｅｐｓＦ株を、それぞれ、脱脂粉乳１０％（ｗｔ／ｗｔ）、酵母エキス０．１％（ｗｔ／ｗｔ）、及び蒸留水で調製した１０％脱脂粉乳培地に対して１％（ｗｔ／ｗｔ）となるように播種し、３７℃において終夜、嫌気条件で発酵させて各発酵乳を得た。また、Ｒ－１株及び２０３８株についても同様にして、各発酵乳を得た。各株を用いて得られた発酵乳の外観を図３に示す。図３に示したように、２０３８株や２０３８－ｅｐｓＦ株で発酵させた発酵乳に比べて、Ｒ－１株や２０３８－ｅｐｓＣ株で発酵させた発酵乳では、ホエーの分離がほとんど認められなかった。
　（３）接着時間測定
　上記＜曳糸性評価　２＞の（２）で得られた各発酵乳について、＜曳糸性評価　１＞の（２）の接着時間測定と同様にして、それぞれ接着時間を測定し、曳糸性を評価した。接着時間の測定は、各発酵乳についてそれぞれ３回行い、平均値を算出した。結果を図４に示す。図４に示したように、２０３８株や２０３８－ｅｐｓＦ株で発酵させた発酵乳の接着時間の平均値に比べ、２０３８－ｅｐｓＣ株で発酵させた発酵乳の接着時間の平均値は有意に長く（Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ　ｔｅｓｔでｐ＜０．０１）、高い曳糸性を示した。以上に示したように、Ｒ－１株のｅｐｓＣ遺伝子のＤＮＡを乳酸菌に導入することにより、得られる発酵乳の曳糸性を向上できることが確認された。また、高い曳糸性を奏するＲ－１株のｅｐｓＣ遺伝子と、曳糸性に劣る２０３８株のｅｐｓＣ遺伝子とでは、第４０位のアミノ酸のみに差異が確認されたことから、発酵乳の曳糸性向上作用には、ｅｐｓＣ遺伝子がコードするタンパク質の第４０位のチロシンが重要であるといえる。
　以上説明したように、本発明によれば、発酵乳の曳糸性の向上作用を有する新規タンパク質、並びに、曳糸性に優れた発酵乳及びその製造方法を提供することが可能となる。より詳細には、発酵乳の曳糸性の向上作用を有する新規タンパク質、前記タンパク質をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含むベクター、前記ＤＮＡ又は前記ベクターを含む乳酸菌及びその乳酸菌組成物、並びに、これらを用いた、曳糸性に優れた発酵乳、発酵乳の増粘剤、及びそれらの製造方法、発酵乳の曳糸性を向上させる方法、乳酸菌の評価方法、をいずれも提供することが可能となる。
　例えば、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡを様々な乳酸菌に導入することにより、当該乳酸菌によって、従来よりも曳糸性が高く濃厚な発酵乳を容易に製造することが可能となる。また、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡの配列を選抜基準とすることにより、従来よりも曳糸性が高く濃厚な発酵乳を製造することができる乳酸菌を容易に選抜することが可能となる。さらに、本発明の新規タンパク質によって発酵乳の曳糸性を向上できることに伴い、遊離ホエー量が減少して、発酵乳の見た目を改善することも可能となる。

Claims (22)

  1. 　下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質。
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質
    （ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質。
  2. 　請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
  3. 　請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。
  4. 　請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のＤＮＡ、及び請求項３に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１種を含有する、組成物。
  5. 　請求項２に記載のＤＮＡ及び請求項３に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された、乳酸菌。
  6. 　請求項２に記載のＤＮＡを有する乳酸菌。
  7. 　発酵乳の曳糸性の向上作用を有する、請求項６に記載の乳酸菌。
  8. 　請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物。
  9. 　発酵乳である、請求項８に記載の乳酸菌組成物。
  10. 　請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖を含有する、請求項８又は９に記載の乳酸菌組成物。
  11. 　原料乳を含有する調乳液に、請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌又は請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させる発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
  12. 　原料乳を含有する調乳液に、請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌又は請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させる発酵工程を含む、発酵乳の曳糸性を向上させる方法。
  13. 　下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを指標として、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する、乳酸菌の評価方法。
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第４０位のチロシン以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質
    （ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第４０位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ、発酵乳の曳糸性の向上作用を有するタンパク質。
  14. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を含有する、発酵乳。
  15. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
    　前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を得る工程と、
    を含む、乳酸菌の製造方法。
  16. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
    　原料乳を含有する調乳液に、前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を添加して発酵させる発酵工程と、
    を含む、発酵乳の製造方法。
  17. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
    　原料乳を含有する調乳液に、前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を添加して発酵させる発酵工程と、
    を含む、発酵乳の曳糸性を向上させる方法。
  18. 　請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖を有効成分として含有する、発酵乳の増粘剤。
  19. 　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌又は請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法。
  20. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
    　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程と、
    を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法。
  21. 　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌又は請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、前記菌体外多糖を有効成分として含有する発酵乳の増粘剤を得る工程と、を含む、発酵乳の増粘剤の製造方法。
  22. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌が発酵乳の曳糸性の向上作用を有するか否かを評価する評価工程と、
    　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、前記評価工程において発酵乳の曳糸性の向上作用を有すると評価された乳酸菌を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、
    　前記菌体外多糖を有効成分として含有する発酵乳の増粘剤を得る工程と、
    を含む、発酵乳の増粘剤の製造方法。
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