WO2022080245A1 - 乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、並びに、それを用いた発酵乳及びその製造方法 - Google Patents

乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、並びに、それを用いた発酵乳及びその製造方法 Download PDF

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immunostimulatory activity
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exopolysaccharide
acid bacteria
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慎 藤原
聖也 牧野
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株式会社明治
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Definitions

  • the present invention relates to a protein having an effect of improving the exopolysaccharide immunostimulatory activity of lactic acid bacteria, fermented milk using the same, and a method for producing the same. More specifically, the present invention is a bacterium produced when expressed by lactic acid bacteria. Proteins, DNAs, vectors, lactic acid bacteria, and lactic acid bacteria compositions having an effect of improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharides, fermented milk using these, immunostimulators, methods for producing them, and immunostimulatory activity of fermented milk. And a method for evaluating lactic acid bacteria.
  • Fermented milk is a food that is widely and generally eaten, and in Japan's "Ministry Ordinance on Ingredient Standards for Milk and Milk Products (Milk, etc. It is defined as "a milk containing milk or the like fermented with lactic acid bacteria or yeast to make it paste-like or liquid, or a frozen product thereof".
  • Typical examples of such fermented milk include yogurts such as set type yogurt (solid fermented milk), soft type yogurt (paste fermented milk), and drink type yogurt (liquid fermented milk).
  • fermented milk is also required to have various functions.
  • EPS exopolysaccharide
  • NK cells For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-194259 (Patent Document 1) describes an NK cell activator containing an acidic polysaccharide derived from lactic acid bacteria as an active ingredient, and International Publication No. 2011/065300 (Patent Document 1). In 2), Lactobacillus delbruecchii ssp.
  • Non-Patent Document 1 Lactobacillus delbruecchii ssp. The immunostimulatory effect and infection protection effect of exopolysaccharide produced by bulgaricus OLL1073R-1 are described.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and is a novel protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria, and an extracellular polysaccharide having excellent immunostimulatory activity. It is an object of the present invention to provide fermented milk containing lactic acid and a method for producing the same.
  • the present inventors conducted diligent research to achieve the above object, and clarified a protein that improves the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria and a gene encoding the same. That is, as described above, Lactobacillus delbruecchii subsp. Although it was known that bulgaricus OLL1073R-1 (accession number: FERM BP-10741) (hereinafter, sometimes referred to as "R-1 strain”) produces exopolysaccharide having an excellent immunostimulatory effect. It has not been clarified which gene or protein of the R-1 strain enhances the immunostimulatory activity of exopolysaccharide.
  • the present inventors first, first, Lactobacillus delbruecchii subsp. It was shown that the extracellular polysaccharide produced by the R-1 strain certainly has higher immunostimulatory activity than the extracellular polysaccharide produced by bulgaricus 2038 (hereinafter, sometimes referred to as "2038 strain").
  • the sequence of the EPS gene cluster was compared between the sequence of the 2038 strain and the sequence of the R-1 strain. It is known that the production of IFN- ⁇ , which is said to be involved in immunostimulatory activity, is higher in acidic extracellular polysaccharide (APS) than in neutral extracellular polysaccharide (NPS) (Makino et al., 2013). , Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria, Vol. 24, No. 1, p. 10-17, Fig. 3).
  • the nucleotide sequence of the R-1 strain and the 2038 strain was different only in the epsF gene in the gene involved in glycosylation, and the protein encoded by the epsF gene of the R-1 strain was extracellular. It was found that it is a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of polysaccharides.
  • Amino acid consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • b In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, one of amino acids other than serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at positions 334 to 338 or Amino acid sequence in which a plurality of amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and which has an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria
  • c amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acids consisting of amino acid sequences having 80% or more identity and corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side.
  • a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria (d) Encoded by a DNA that hybridizes with a complementary strand of a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 under strict conditions.
  • amino acids consisting of amino acid sequences and corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side, and are extracellular of lactic acid bacteria.
  • [2'] A composition containing at least one DNA selected from the group consisting of DNA encoding any of the proteins (a) to (d) (preferably immunostimulation of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria). Composition for use in improving activity).
  • [3] A vector containing the DNA according to [2].
  • [3'] A vector containing at least one DNA selected from the group consisting of DNA encoding any of the proteins (a) to (d).
  • [4] A composition comprising at least one selected from the group consisting of the protein according to [1], the DNA according to [2], and the vector according to [3].
  • [5] A lactic acid bacterium into which at least one selected from the group consisting of the DNA described in [2] and the vector described in [3] has been introduced.
  • [5'] A lactic acid bacterium into which the vector described in [3'] has been introduced (preferably a lactic acid bacterium having a high immunostimulatory activity of extracellular polysaccharide).
  • [6] A lactic acid bacterium having the DNA described in [2].
  • the lactic acid bacterium according to [6] which has a high immunostimulatory activity of exopolysaccharide.
  • [8] A lactic acid bacterium composition containing the lactic acid bacterium according to any one of [5] to [7].
  • [8'] A lactic acid bacterium composition containing the lactic acid bacterium according to [5'] (preferably a lactic acid bacterium composition for use in improving the immunostimulatory activity of fermented milk).
  • [10] [8], [8'], or [9] which contains an extracellular polysaccharide derived from the lactic acid bacterium according to any one of [5] to [7] or [5'].
  • Lactic acid bacteria composition [11] The lactic acid bacterium according to any one of [5] to [7] or [5'] or any one of [8] to [10] or [8] is added to the preparation liquid containing the raw milk.
  • a method for producing fermented milk which comprises a fermentation step of adding and fermenting the lactic acid bacterium composition according to'] to obtain a fermented product containing exopolysaccharide.
  • the lactic acid bacterium according to any one of [5] to [7] or [5'] or any one of [8] to [10] or [8] is added to the formula containing the raw milk.
  • a method for improving the immunostimulatory activity of fermented milk which comprises a fermentation step of adding and fermenting the lactic acid bacterium composition according to'] to obtain a fermented product containing exopolysaccharide.
  • Amino acid consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • b In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, one of amino acids other than serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at positions 334 to 338 or Amino acid sequence in which a plurality of amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and which has an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria
  • c amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acids consisting of amino acid sequences having 80% or more identity and corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side.
  • a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria (d) Encoded by a DNA that hybridizes with a complementary strand of a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 under strict conditions.
  • amino acids consisting of amino acid sequences and corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side, and are extracellular of lactic acid bacteria.
  • a method for producing lactic acid bacteria including.
  • the evaluation step for evaluating the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria by the evaluation method for lactic acid bacteria according to [13], and Lactic acid bacteria evaluated to have exopolysaccharide having immunostimulatory activity or exopolysaccharide immunostimulatory activity in the evaluation step are added to a milk preparation solution containing raw milk and fermented to ferment the exopolysaccharide. Fermentation process to obtain fermented products containing A method for producing fermented milk, including.
  • the evaluation step for evaluating the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria by the evaluation method for lactic acid bacteria according to [13], and Lactic acid bacteria evaluated to have exopolysaccharide having immunostimulatory activity or exopolysaccharide immunostimulatory activity in the evaluation step are added to a milk preparation solution containing raw milk and fermented to ferment the exopolysaccharide. Fermentation process to obtain fermented products containing A method of improving the immunostimulatory activity of fermented milk, including.
  • [17'] Use of exopolysaccharide derived from lactic acid bacterium according to any one of [5] to [7] or [5'] for immunostimulation.
  • [17''] Use of an extracellular polysaccharide derived from a lactic acid bacterium according to any one of [5] to [7] or [5'] for the production of an immunostimulant.
  • a method for producing exopolysaccharide of lactic acid bacteria which comprises a step of adding and fermenting the lactic acid bacterium composition according to any one of the above items or [8'] to collect exopolysaccharide contained in the fermented product.
  • the evaluation step for evaluating the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria by the evaluation method for lactic acid bacteria according to [13], and Lactic acid bacteria evaluated to have exopolysaccharide having immunostimulatory activity or exopolysaccharide having high immunostimulatory activity in the evaluation step are added to a medium containing glucose and / or a sugar containing glucose as a constituent sugar.
  • a method for producing an extracellular polysaccharide of lactic acid bacteria including.
  • a method for producing an immunostimulatory agent which comprises a step of obtaining the agent.
  • the evaluation step for evaluating the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria by the evaluation method for lactic acid bacteria according to [13], and Lactic acid bacteria evaluated to have exopolysaccharide having immunostimulatory activity or exopolysaccharide having high immunostimulatory activity in the evaluation step are added to a medium containing glucose and / or a sugar containing glucose as a constituent sugar. Fermentation process to obtain a fermented product containing extracellular polysaccharides The step of obtaining an immunostimulant containing the extracellular polysaccharide as an active ingredient, and A method for producing an immunostimulant, including.
  • a novel protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria, and a fermented milk containing the extracellular polysaccharide having excellent immunostimulatory activity and a method for producing the same.
  • a novel protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharide produced when expressed in lactic acid bacteria, a DNA encoding the protein, a vector containing the DNA, the DNA or the vector.
  • a lactic acid bacterium containing lactic acid bacterium and a lactic acid bacterium composition thereof and a fermented milk, an immunostimulator, a method for producing the same, a method for improving the immunostimulatory activity of the fermented milk, and a method for evaluating lactic acid bacteria using the same.
  • the lactic acid bacterium can easily produce an extracellular polysaccharide having excellent immunostimulatory activity, and fermented milk or an immunostimulator containing the same. It becomes possible to manufacture. Further, by using the sequence of DNA encoding the novel protein of the present invention as a selection criterion, exopolysaccharide having excellent immunostimulatory activity, and fermented milk or an immunostimulator containing the same can be produced as a lactic acid bacterium. Can be easily selected.
  • NK cell activity (NK activity (NK activity) of exopolysaccharide derived from 2038 strain (2038 strain EPS) or exopolysaccharide derived from R-1 strain (R-1 strain EPS) obtained by ⁇ evaluation of immunostimulatory activity>. %)) Is a graph showing.
  • the protein of the present invention is a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria, and the following proteins (a) to (d):
  • the amino acid consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is serine from the N-terminal side. , Leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid, and a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of the extracellular polysaccharide of lactic acid bacteria, and (d) a complementary strand of DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acids corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, which consist of an amino acid sequence encoded by DNA that hybridizes under strict conditions, are serine, leucine, phenylalanine, and serine from the N-terminal side.
  • a protein that is aspartic acid and has an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria It is at least one protein selected from the group consisting of.
  • the protein of the present invention is a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria (hereinafter, referred to as "immunostimulatory activity improving protein" in some cases).
  • exopolysaccharide of lactic acid bacterium means exopolysaccharide produced by lactic acid bacterium (in the present specification, sometimes referred to as "EPS"), and such EPS refers to a neutral bacterium.
  • EPS exopolysaccharide produced by lactic acid bacterium
  • NPS exopolysaccharide
  • APS acidic exopolysaccharide
  • ZPS amphoteric exopolysaccharide
  • immuno-activating activity of exopolysaccharide of lactic acid bacterium means an action of activating immunity in the subject when the exopolysaccharide produced by lactic acid bacterium is administered to the subject (the present specification). In the book, in some cases, it simply refers to “immunostimulatory activity”), and more preferably, it indicates an action of improving (activating) NK cell activity in the subject. Further, in the present invention, "the effect of improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacterium” means the immunostimulatory activity against the exopolysaccharide produced by the lactic acid bacterium when expressed by the lactic acid bacterium.
  • the protein of the present invention has the effect of improving the immunostimulatory activity
  • the present inventors act on the protein of the present invention in the process of biosynthesis of EPS, particularly in the process of glycosylation, to immunize. It is speculated that this is because EPS with a structure with high activating activity is generated.
  • the immunostimulatory activity of the extracellular polysaccharide produced by lactic acid bacteria can be evaluated, for example, by the NK cell activity when the extracellular polysaccharide is administered to a subject.
  • the NK cell activity can be measured by the chromium release method, for example, according to the method of Takeda et al. (Takeda, K. et al., J. Immunol., 156: 3366, 1996). It can be evaluated that the extracellular polysaccharide administered to the subject having a high NK cell activity has a high immunostimulatory activity and is excellent.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the immunostimulatory activity-enhancing protein (hereinafter, in some cases, referred to as “immune-activated activity-enhancing DNA”). That is, the DNA of the present invention is the DNA of the following (a') to (d'): (A') DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. (B') In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, one or more amino acids other than serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at positions 334 to 338 are substituted, deleted, inserted and / or added.
  • a DNA encoding a protein having an amino acid sequence and having an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria (C') The amino acid consisting of the amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is from the N-terminal side.
  • DNA encoding serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid which have an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria, and the nucleotide sequence shown in (d') SEQ ID NO: 2.
  • amino acid corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, which consists of an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under strict conditions with the complementary strand of the DNA consisting of, is serine from the N-terminal side. , Leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid, and DNA encoding a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria, At least one DNA selected from the group consisting of.
  • (A) Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is described in Lactobacillus delbruecchii subsp. It is an amino acid sequence encoded by the epsF gene of bulgaricus OLL1073R-1 (accession number: FERM BP-10741) (R-1 strain).
  • the "DNA encoding the amino acid sequence shown in (a') SEQ ID NO: 1” is not particularly limited as long as it encodes the amino acid sequence, but is preferably the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of the epsF gene of the R-1 strain.
  • the present inventors have found that the protein encoded by the epsF gene of the R-1 strain has, in particular, the above-mentioned immunostimulatory activity-enhancing effect.
  • the amino acids at positions 334 to 338 are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side.
  • these amino acids are replaced with other amino acids (for example, 2038 strains in Examples), even if the other sequences are common, excellent immunostimulatory activity is not exhibited in the extracellular polysaccharide produced by lactic acid bacteria.
  • R1-EpsF amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • R1-epsF amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • nucleotide sequence (R1-epsF) information of the epsF gene of the R-1 strain or the amino acid sequence (R1-EpsF) information of the protein encoded by the nucleotide sequence (R1-epsF). If so, it is also possible to modify the nucleotide sequence to prepare an immunostimulatory activity-enhancing protein that is different from the amino acid sequence encoding the same, but that maintains or further enhances the immunostimulatory activity-enhancing effect.
  • the "immunity-activating activity-enhancing protein” according to the present invention, "(b) Serine, leucine, phenylalanine, serine, and asparagine at positions 334 to 338 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1". Also included is a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids other than acid are substituted, deleted, inserted and / or added, and which has an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria.
  • plural is a range in which the protein (modified form) after substitution, deletion, insertion and / or addition (hereinafter, these are collectively referred to as "modification”) has an immunostimulatory activity improving effect.
  • the number of amino acid modifications in the above usually 100 or less, 1 to 80, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, still more preferably 1 to several (for example, 1 to 10, 1). ⁇ 8 pieces, 1 ⁇ 4 pieces, 1 ⁇ 2 pieces).
  • the polynucleotide encoding such a variant can be, for example, a known site-directed mutagen based on the nucleotide sequence (R1-epsF) information of the epsF gene of the R-1 strain. It can be prepared by using a mutagenesis) method or the like.
  • nucleotide sequence (R1-epsF) information of the epsF gene of the R-1 strain the hybridization technique (Southern, EM, J. Mol. Mol. Biol., 98: 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki, RK, et al. Science, 230: 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. It is possible to obtain a polynucleotide (homologous gene) encoding an immunostimulatory activity-enhancing protein from a microorganism other than the R-1 strain by Science, 239: 487-491, 1988).
  • the aspect of the "immunostimulatory activity improving protein" according to the present invention is encoded by "(d) a DNA that hybridizes with a complementary strand of a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 under strict conditions.
  • the amino acids consisting of amino acid sequences and corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side, and are extracellular of lactic acid bacteria.
  • a protein that has the effect of improving the immunostimulatory activity of polysaccharides.
  • the amino acids consisting of the encoded amino acid sequences and corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side, and are lactic acid bacteria.
  • DNA encoding a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side.
  • amino acid corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence and amino acid sequence analysis software (GENETYX-MAC, Sequencer, etc.) or BLAST (Basic Local Algorithm).
  • Amino acids shown in SEQ ID NO: 1 using (for example, parameter: default value (that is, initial setting value)) using Search Tool at the National Center for Biological Information (basic local alignment search tool of the US National Center for Biological Information) and the like.
  • a hybridization reaction is usually carried out under strict conditions.
  • “Strict conditions” mean that the membrane washing operation after hybridization is performed in a low salt concentration solution at high temperature, for example, 2 ⁇ SSC concentration (1 ⁇ SSC: 15 mM sodium citrate, 150 mM). Sodium chloride), 0.5% SDS solution at 60 ° C. for 20 minutes.
  • hybridization can be performed, for example, according to the method described in the instruction manual attached to a known ECL direct DNA / RNA labeling / detection system (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). The more stringent the hybridization conditions, the more likely it is to expect the isolation of DNA with higher identity. However, the above conditions are exemplary, and the required rigor (stringency) can be achieved by appropriately combining the concentration of DNA, the length of DNA, the reaction time of hybridization, and the like.
  • the protein encoded by the homologous gene obtained by such a method or the like usually has high homology with the amino acid sequence (R1-EpsF) shown in SEQ ID NO: 1. Therefore, in the embodiment of the "immunostimulatory activity improving protein" according to the present invention, it is composed of "(c) an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acids corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side, and a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria.
  • the aspect of the "immunity-activating activity-enhancing DNA” comprises an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in "(c') SEQ ID NO: 1 and is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acids corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence are serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid from the N-terminal side, and have an effect of improving the immunostimulatory activity of the extracellular polysaccharide of lactic acid bacteria.
  • DNA encoding a protein is also included.
  • the identity of the amino acid sequence can be determined using, for example, the BLAST or the like (for example, parameter: default value (that is, initial setting value)).
  • the identity with the amino acid sequence (R1-EpsF) shown in SEQ ID NO: 2 is usually 80% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more (for example, 96%). Above, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the immunostimulatory activity-enhancing protein encoded by the homologous gene may be a protein encoded by a gene isolated from a microorganism different from lactic acid bacteria, but is preferably isolated from lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacterium include a family of Streptococcusaee, a family of Lactobacillusceae, a family of Lactobacillusceae, and more specifically, Lactobacillus genus Lactobacillus.
  • Lactococcus Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus.. Lactobacillus genus (Weissella); Pediococcus, Leuconostock, Lactococcus, Streptococcus (Streptococcus), Enterococcus (Entococcus), Enterococcus (Entococcus) Examples include the genus Lactobacillus. Among these, the genus Lactobacillus is preferable, Lactobacillus delbrucky (including subspecies) is more preferable, and Lactobacillus delbrucky subspecies bulgaricus
  • the NK cell activity when administered to c mice) does not have any DNA encoding any of the proteins (a) to (d), for example, the above (a') to (d).
  • Extracellular polysaccharides produced using lactic acid bacteria eg, lactobacillus delbrucky subspecies bulgaricus 2038 strain (2038 strain)
  • that do not have any DNA of' are administered to similar mice.
  • the NK cell activity is set to 1, it can be confirmed that it is 1.03 or more, preferably 1.05 or more, and more preferably 1.10 or more.
  • the dose of 50 to 200 ⁇ g / mouse per day is preferably 1 week or more, and the upper limit of the administration period is not particularly limited, but is, for example, 12 weeks or less.
  • the method for measuring NK cell activity is as described above. Further, the 2038 strain is separated by smearing a diluted solution of Meiji Bulgaria yogurt LB81 (manufactured by Meiji Co., Ltd.) on a BCP agar medium, culturing at 37 ° C. for 48 hours, and then picking up rough colonies. Can be done.
  • the lactic acid bacterium having the DNA encoding each of the proteins does not have any DNA encoding any of the proteins (a) to (d), that is, the above (a') to ( To a lactic acid bacterium having no DNA of d') (for example, at least one lactic acid bacterium selected from the group consisting of Lactobacillus delbrucky, preferably Lactobacillus delbrucky subspecies bulgaricus).
  • a lactic acid bacterium (transformant) into which the DNA or a vector containing the DNA is expressively introduced, NK cells measured in the same manner as above for the extracellular polysaccharide produced using the lactic acid bacterium.
  • the activity is 1.03 or more, preferably 1.05 or more, with the NK cell activity measured in the same manner as above for the extracellular polysaccharides produced using the lactic acid bacteria before transformation being 1. It may be confirmed that the amount is 1.10 or more, more preferably 1.10 or more.
  • each lactic acid bacterium has or does not have at least one kind of DNA of (a') to (d'), based on the nucleotide sequence of these DNAs, it is appropriately confirmed by a known method or a method similar thereto. For example, it can be confirmed by the method for detecting the immunostimulatory activity-enhancing DNA described in the evaluation step of ⁇ Evaluation method for lactic acid bacteria> below. Further, as a method for introducing the DNA or vector encoding the protein into the lactic acid bacterium, a known method or a method similar thereto can be appropriately selected, and for example, the method described in the following [Protein for Improving Immunostimulatory Activity]. In the above, a method using the lactic acid bacterium as a host cell can be mentioned.
  • the immunostimulatory activity-enhancing protein according to the present invention can be obtained by appropriately using a known method or a method similar thereto. For example, a step of culturing a host cell into which at least one selected from the group consisting of a DNA encoding the immunostimulatory activity improving protein and a vector containing the DNA has been introduced and collecting the protein expressed in the host cell. It can be obtained by a manufacturing method including. More specifically, first, the immunostimulatory activity-enhancing protein is encoded by a conventional method from a target microorganism having at least one of the DNAs (a') to (d') such as R-1 strain. DNA (DNA for improving immunostimulatory activity) is obtained as isolated DNA.
  • the isolated DNA may be a chemically synthesized DNA obtained by artificially synthesizing the immunostimulatory activity-enhancing DNA.
  • a DNA (isolated DNA) or an expression vector containing the DNA (isolated DNA) or an expression vector containing the same is prepared, and the transformant introduced into the host cell is cultured to express the immunostimulatory activity-enhancing protein of the present invention in the transformant.
  • the protein can be obtained as a recombinant protein from the culture.
  • a genomic DNA extracted from the microorganism or a cDNA synthesized based on the mRNA extracted from the microorganism can be used as a plasmid vector, a phage vector, a cosmid vector, or a BAC.
  • a DNA library or a cDNA library is prepared by linking with a vector such as a vector or a PAC vector, and by hybridization using a probe prepared based on the nucleotide sequence of the immunostimulatory activity-enhancing DNA (for example, R1-epsF).
  • a method of isolating the desired genomic DNA by carrying out PCR using the above as a template and ligating the amplified DNA fragment with an appropriate vector as needed;
  • the expression vector is a vector that can be replicated in a host cell and contains a protein encoded by the polynucleotide sequence in a state that can be expressed in the host cell.
  • Such an expression vector exists as a self-replicating vector, i.e., an extrachromosomal independent entity whose replication is independent of chromosomal replication, eg, can be constructed on the basis of a plasmid.
  • the expression vector when the expression vector is introduced into a host cell, the expression vector may be constructed based on phage DNA that is integrated into the genome of the host cell and is replicated together with the chromosome into which the expression vector is integrated.
  • Examples of the plasmid include Escherichia coli-derived plasmids (pET22, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, YCp50, etc.), and Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110, pTP5, etc.). , Shuttle vector of Escherichia coli and lactic acid bacteria (pGM ⁇ 1, etc.).
  • Examples of the phage DNA include ⁇ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.).
  • the procedure and method for constructing the expression vector a known method or a method similar thereto can be appropriately adopted.
  • the isolated DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate plasmid, and ligated to the plasmid. The method of doing so is adopted.
  • the expression vector can be used in order to actually introduce the expression vector into a host cell to express the immunostimulatory activity-enhancing protein. It is preferable to include a polynucleotide sequence that controls expression, a polynucleotide sequence that induces expression other than the polynucleotide sequence that controls expression, a gene marker for selecting cells, and the like.
  • polynucleotide sequence that controls the expression examples include a polynucleotide sequence that encodes a promoter, a terminator, and a signal peptide, and one of these or a combination of two or more thereof may be used. ..
  • the promoter is not particularly limited as long as it exhibits transcriptional activity in the host cell, and may be a polynucleotide sequence that controls the expression of a gene encoding a protein homologous or heterologous to the host cell.
  • the polynucleotide sequence that induces the expression when the host cell is a bacterium, for example, the expression of the gene located downstream is expressed by the addition of isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG). Examples include lactose operons that can be induced.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • lactose operons that can be induced.
  • the gene marker can be appropriately selected depending
  • the host cell is not particularly limited, but is preferably a microorganism, and examples thereof include filamentous fungi, yeast, Escherichia coli, actinomycetes, and lactic acid bacteria.
  • the host cell is not particularly limited, but the host cell into which the DNA has been introduced is used as it is in the following ⁇ method for producing fermented milk> and ⁇ immunity activation of fermented milk.
  • ⁇ method for improving activity> ⁇ method for producing extracellular polysaccharide of lactic acid bacterium>, or ⁇ method for producing immunostimulatory agent>
  • lactic acid bacterium is preferable.
  • the host cell may be a cell or a mutant that has already been transformed so as to lack a specific function, if necessary.
  • a known method or a method similar thereto can be appropriately adopted, and for example, a heat shock method, an electroporation method, a spheroplast method, or an acetate method can be adopted.
  • the lithium method is mentioned, and the joining method is also mentioned as a method of introducing into lactic acid bacteria.
  • a method for introducing into plant cells a method using Agrobacterium and a particle gun method can be mentioned, and as a method for introducing into insect cells, a method using baculovirus and an electroporation method can be mentioned.
  • Examples of the method for introduction into animal cells include a calcium phosphate method, a lipofection method, and an electroporation method.
  • the immunostimulatory activity-enhancing protein of the present invention can be collected from a culture (for example, cultured microbial cells) by culturing a transformant in which the DNA or an expression vector has been introduced into a host cell in an appropriate medium. can. Therefore, the present invention can also provide a method for producing an immunostimulatory activity-enhancing protein of the present invention, which comprises a step of culturing the transformant and collecting the immunostimulatory activity-enhancing protein expressed in the transformant. can.
  • the culture conditions of the transformant for example, the culture conditions of the host cell can be applied, and if it is a person skilled in the art, the temperature, the presence or absence of addition of air, and the like according to the type of the host cell, the medium used, and the like.
  • the oxygen concentration, carbon dioxide concentration, medium pH, culture temperature, culture time, humidity and the like can be appropriately adjusted and set.
  • the immunostimulatory activity-enhancing protein is expressed in a host cell (for example, Escherichia coli), and after the transformation is completed, the cultured cells are centrifuged.
  • the crude product or the concentrated crude product may be purified by using, for example, a salting out method, an organic solvent precipitation method, a membrane separation method, or a chromatographic separation method alone or in combination of two or more. ..
  • the immunostimulatory activity-enhancing protein to which a purification tag is added is expressed in a host cell (for example, Escherichia coli), the crude extract is passed through a column for purification of the tagged protein, and then the tagged protein is eluted for purification. You may.
  • a host cell for example, Escherichia coli
  • the addition is not particularly limited, and may be an addition at the gene level or a chemical addition.
  • the site to be added is also not particularly limited, and the amino-terminal (also referred to as "N-terminal” in the present specification) and carboxy-terminal (also referred to as "C-terminal” in the present specification) of the immunostimulatory activity-enhancing protein of the present invention are not particularly limited. It may be either or both.
  • Addition at the gene level is achieved by using a DNA encoding the immunostimulatory activity-enhancing protein of the present invention (immunostimulatory activity-enhancing DNA) to which DNA encoding another protein is added according to the reading frame. Will be done.
  • the "other protein” added in this manner is not particularly limited, and for example, for the purpose of facilitating the purification of the immunostimulatory activity enhancing protein of the present invention, a polyhistidine (His-) tag (tag) is used.
  • Protein, FLAG-tag protein (registered trademark, Sigma-Aldrich), purifying tag protein such as glutathione-S-transferase (GST) are preferably used, and for example, detection of the immunostimulatory activity enhancing protein of the present invention.
  • GST glutathione-S-transferase
  • a tag protein for detection such as a fluorescent protein such as GFP and a chemically luminescent protein such as luciferase is preferably used.
  • the chemical addition may be covalent or non-covalent.
  • the “covalent bond” is not particularly limited, for example, an amide bond between an amino group and a carboxy group, an alkylamine bond between an amino group and an alkyl halide group, a disulfide bond between thiols, a thiol group and a maleimide group or an alkyl halide.
  • a thioether bond with a group can be mentioned.
  • Examples of the "non-covalent bond” include a biotin-avidin bond.
  • the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention may be a DNA in which a mutation is introduced into a natural DNA as long as it encodes the amino acid sequence of the immunostimulatory activity-enhancing protein of the present invention, and is an artificially designed nucleotide. It may be a DNA consisting of a sequence, or a part or all thereof may be composed of non-natural nucleotides. Further, the morphology is not particularly limited, and for example, cDNA, genomic DNA, and chemically synthesized DNA mentioned as isolated DNA in the above-mentioned [immunity-activating activity-enhancing protein] are included.
  • the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention has optimized codons according to the type of the host cell from the viewpoint of further improving the expression efficiency of the encoded immunostimulatory activity-enhancing protein in the host cell. It can also take the form of DNA encoding an immunostimulatory activity enhancing protein.
  • the DNA for improving the immunostimulatory activity of the present invention may be in the form of a vector into which the DNA is inserted so that the DNA can be replicated in the host cell. Therefore, the present invention also provides a vector containing the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention.
  • the vector of the present invention include the expression vectors mentioned in the above-mentioned [Protein for Improving Immunostimulatory Activity], including preferred embodiments thereof.
  • the present invention provides a composition containing at least one of the immunostimulatory activity-enhancing protein, the immunostimulatory activity-enhancing DNA, and the vector of the present invention.
  • the composition of the present invention contains at least one of the immunostimulatory activity-enhancing protein, the immunostimulatory activity-enhancing DNA, and the vector of the present invention as an active ingredient for improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria. It can be used as a composition, for example, by introducing the composition of the present invention into various lactic acid bacteria to obtain the following lactic acid bacterium of the present invention, and using it to produce exopolysaccharide or fermented milk. It is possible to obtain exopolysaccharides and fermented milk containing them, which are more excellent in immunostimulatory activity than before.
  • composition of the present invention may further contain other components.
  • the other components are not particularly limited, and examples thereof include sterile water, physiological saline, vegetable oils, surfactants, lipids, solubilizing agents, buffers, DNase inhibitors, and preservatives. It may be only one kind or a combination of two or more kinds.
  • the present invention also provides a transformant in which the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention or the vector of the present invention containing the immunostimulatory activity-enhancing DNA is introduced into the host cell.
  • the transformant include the transformants mentioned in the above-mentioned [Protein for enhancing immunostimulatory activity].
  • the host cell of the transformant is preferably a lactic acid bacterium
  • the "lactic acid bacterium of the present invention” includes the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention and the immunostimulatory activity-enhancing DNA.
  • a lactic acid bacterium into which at least one selected from the group consisting of the vectors of the present invention has been introduced; and the lactic acid bacterium having the above-mentioned immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention are included.
  • the "lactic acid bacterium of the present invention” also includes a lactic acid bacterium into which the immunostimulatory activity improving protein itself of the present invention has been introduced. Therefore, the lactic acid bacterium of the present invention can exhibit the exopolysaccharide produced to exert immunostimulatory activity.
  • the lactic acid bacterium of the present invention may be an embodiment of a lactic acid bacterium composition, and the present invention also provides a lactic acid bacterium composition containing at least one of these lactic acid bacteria of the present invention.
  • the lactic acid bacterium composition is used not only for the production of the immunostimulatory activity-enhancing protein, but also for the production of fermented milk, the immunostimulatory activity of the fermented milk, the production of extracellular polysaccharide with improved immunostimulatory activity, or the immunostimulatory agent. It can be a lactic acid bacterium composition for use in production.
  • the lactic acid bacterium as a host cell into which the immunostimulatory activity-enhancing protein, the immunostimulatory activity-enhancing DNA, or the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and is, for example, Streptococcusaeae, Lactobacillusaceae. , Lactocococcus, and more specifically, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, and Lactobacillus.
  • Lactobacillus Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Weissella, Weissella, and other lactic acid bacteria; (Leuconostoc), Lactococcus genus, Streptococcus genus, Enterococcus genus (Enterococcus) and other lactic acid bacteria; Bifidobacterium and the like.
  • the genus Lactobacillus is preferable, Lactobacillus delbrucky (including subspecies) is more preferable, and Lactobacillus delbrucky subspecies bulgaricus is further preferable.
  • the lactic acid bacterium as the host cell already has at least one of the proteins (a) to (d) or at least one of the DNAs (a') to (d'). There may be.
  • a further effect of improving immunostimulatory activity can be expected.
  • the method for introducing the DNA or the expression vector in the above-mentioned [immunostimulatory activity-enhancing protein] is mentioned.
  • the method can be appropriately adopted, and for example, at least one selected from the group consisting of a heat shock method, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, and a bonding method is used to improve the immunostimulatory activity. It is preferable to introduce DNA or the vector.
  • lactic acid bacterium of the present invention as the lactic acid bacterium having the immunostimulatory activity improving DNA of the present invention, for example, among the lactic acid bacteria listed as the host cells, among the DNAs (a') to (d'). Lactic acid bacteria having at least one kind of DNA can be mentioned.
  • the lactic acid bacterium of the present invention has (including introduced) the immunostimulatory activity-enhancing protein or the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention can be appropriately confirmed by a known method or a method similar thereto. It can be confirmed, for example, by the method for detecting immunostimulatory activity-enhancing DNA described in the evaluation step of ⁇ Evaluation method for lactic acid bacteria> below. Therefore, the "lactic acid bacterium of the present invention” includes a lactic acid bacterium (immunostimulation) in which exopolysaccharide has an immunostimulatory activity or has a high exopolysaccharide immunostimulatory activity according to the following evaluation method of the lactic acid bacterium of the present invention. It also includes lactic acid bacteria obtained by the method for producing lactic acid bacteria of the present invention (including those evaluated to have activity or have a high possibility of having high immunostimulatory activity).
  • the DNA possessed by (including introduced) of the lactic acid bacterium of the present invention may be retained in the genomic DNA in the lactic acid bacterium, and if it is a vector, it is replicated as an independent body outside the genomic DNA. It may be retained.
  • the DNA introduced into the lactic acid bacterium may be retained by being randomly inserted into the genomic DNA, or may be retained by homologous recombination.
  • the lactic acid bacterium of the present invention may be an artificial mutant strain, a natural mutant strain, or a genetically modified strain of the same strain of the lactic acid bacterium or its successor strain as long as it has an effect of improving immunostimulatory activity.
  • the lactic acid bacterium of the present invention it is preferable to produce an extracellular polysaccharide having improved immunostimulatory activity.
  • the lactic acid bacterium into which the immunostimulatory activity-enhancing protein, the immunostimulatory activity-enhancing DNA, or the vector is introduced produces an extracellular polysaccharide having improved immunostimulatory activity, for example, the lactic acid bacterium.
  • the extracellular polysaccharides produced using the above-mentioned (a') to (a')-( The NK cell activity measured for exopolysaccharides produced using lactic acid bacteria that do not have any DNA of d') is set to 1.03 or more, preferably 1.05 or more. It can be confirmed that the amount is 1,10 or more, more preferably 1.10 or more. Alternatively, for example, it can be confirmed that the NK cell activity is 21% or more, preferably 22% or more, and more preferably 22.5% or more.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention is a composition containing the lactic acid bacterium of the present invention.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention may further contain other components, and the other components are not particularly limited, but for example, in the culture supernatant, medium component, etc. after the culture of the lactic acid bacteria is completed.
  • a certain culture; a concentrate, a crude product, a refined product, a diluted product, a dried product (spray dried product, freeze-dried product, etc.), a frozen product, etc. of the culture; a protective agent, a fermentation accelerator, etc. are included, and these are included. Only one of them may be used, or a combination of two or more of them may be used.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention is at least selected from the group consisting of the vector of the present invention containing the lactic acid bacterium of the present invention (that is, an immunostimulatory activity-enhancing protein, an immunostimulatory activity-enhancing DNA, and an immunostimulatory activity-enhancing DNA).
  • Lactic acid bacterium into which one species was introduced lactic acid bacterium having immunostimulatory activity improving DNA; exopolysaccharide had immunostimulatory activity or exopolysaccharide was evaluated to have high immunostimulatory activity by the evaluation method of lactic acid bacterium of the present invention.
  • composition containing lactic acid bacteria (including those evaluated to have immunostimulatory activity or highly likely to have immunostimulatory activity); lactic acid bacteria obtained by the method for producing lactic acid bacteria of the present invention) is included.
  • the following fermented milk of the present invention is also included in this.
  • the method for evaluating lactic acid bacteria of the present invention is the above-mentioned protein for improving immunostimulatory activity of the present invention, that is, the following proteins (a) to (d):
  • the amino acid consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is serine from the N-terminal side. , Leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid, and a protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of the extracellular polysaccharide of lactic acid bacteria, and (d) a complementary strand of DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acids corresponding to positions 334 to 338 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, which consist of an amino acid sequence encoded by DNA that hybridizes under strict conditions, are serine, leucine, phenylalanine, and serine from the N-terminal side.
  • a protein that is aspartic acid and has an effect of improving the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria Using at least one DNA selected from the group consisting of DNA encoding any of the above (that is, the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention) as an index, the immunostimulatory activity of exopolysaccharide produced by lactic acid bacteria is measured. It is a method of evaluation.
  • the extracellular activity produced by the lactic acid bacterium is used as an index, that is, whether or not the lactic acid bacterium has the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention. It is evaluated whether or not the polysaccharide has an immunostimulatory activity or whether or not the extracellular polysaccharide has a high immunostimulatory activity (evaluation step).
  • the extracellular polysaccharide produced by the lactic acid bacterium is evaluated to have the immunostimulatory activity or has a high immunostimulatory activity (there is a high possibility of having the immunostimulatory activity).
  • the lactic acid bacterium to be evaluated is not particularly limited, and a desired lactic acid bacterium can be appropriately targeted.
  • Whether or not the lactic acid bacterium has the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention can be determined by detecting the DNA.
  • a method for detecting the immunostimulatory activity-enhancing DNA a known method or a method similar thereto can be appropriately adopted.
  • genomic DNA is extracted from the lactic acid bacterium to be evaluated.
  • the method for extracting genomic DNA is not particularly limited, and a known method or a method similar thereto can be appropriately adopted.
  • the PCI method, GuSCN / Silka method, SDS phenol method, CTAB method, and alkali treatment method can be used. Can be mentioned.
  • a commercially available kit can also be used as appropriate.
  • the method for detecting the immunostimulatory activity-enhancing DNA can then be carried out by isolating the DNA corresponding to the immunostimulatory activity-enhancing DNA and determining the nucleotide sequence of the isolated DNA.
  • the DNA can be isolated, for example, by PCR using genomic DNA as a template, using at least a pair of oligonucleotide primers designed to sandwich the DNA corresponding to the immunostimulatory activity-enhancing DNA.
  • the nucleotide sequence of the isolated DNA can be determined by a method known to those skilled in the art, such as the Sanger method and the Maxam-Gilbert method. Further, the nucleotide sequence of the DNA corresponding to the immunostimulatory activity-enhancing DNA may be directly determined from the genomic DNA using a next-generation sequencer or the like.
  • the DNA corresponding to the immunostimulatory activity-enhancing DNA preferably contains at least a site encoding an amino acid corresponding to positions 334 to 338 of R1-EpsF, and the pair of oligonucleotide primers sandwiching the same is the immunostimulatory DNA. It may be designed based on the nucleotide sequence of the activity-enhancing DNA (for example, R1-epsF) and a public database (Genbank, etc.). Such oligonucleotides can be designed by those skilled in the art by known methods or similar methods.
  • the PCR-SSP PCR-sequence-specific primer
  • the DNA to be detected is the above (a'). Is designed to be a base species complementary to the site encoding serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at positions 334 to 338 of R1-EpsF.
  • Amplification by PCR using a pair of oligonucleotide primers designed in this way is limited to the case where the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention is used as a template, and serine, leucine, and phenylalanine at positions 334 to 338 are amplified. , Serin, and any of the sites encoding aspartic acid are not amplified when the genomic DNA encoding the other amino acid is used as a template. Therefore, the DNA can be detected using the presence or absence of such amplification as an index.
  • a restriction enzyme fragment length is applied to the site encoding serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at positions 334 to 338 of R1-EpsF or corresponding portions.
  • a polymorphism Restriction Fragment Longth Polymorphism / RFLP
  • it can also be detected by, for example, the PCR-RFLP method (or the CAPS [Cleared Applied Polymorphic Sequence] method) using these RFLP markers as an index.
  • the PCR-SCSP PCR-single-strand higher-order structure polymorphism
  • the double-stranded DNA amplified by PCR using a pair of oligonucleotide primers designed to sandwich the immunostimulatory activity-enhancing DNA was denatured by treatment with heat, alkali, etc. to obtain single-stranded DNA. Later, when subjected to denaturant-free polyacrylamide gel electrophoresis, the single-stranded DNA is folded in the gel by intramolecular interaction to form a higher-order structure.
  • the separated single-stranded DNA is detected by silver staining or radioisotope, and the mobility of the single-stranded DNA on the gel is used as an index.
  • the DNA for improving immunostimulatory activity can be detected.
  • a method using an intercalator can be mentioned.
  • the DNA corresponding to the immunostimulatory activity-enhancing DNA is amplified using the genomic DNA as a template. Then, the temperature of the reaction system is changed, the change in the fluorescence intensity emitted by the intercalator is detected, and the change in the fluorescence intensity accompanying the detected change in the temperature is used as an index to improve the immunostimulatory activity (particularly R1-EpsF).
  • R1-EpsF high resolution melting curve analysis
  • the DNA to be detected is the above (a')
  • serine, leucine, phenylalanine, serine at positions 334 to 338 of R1-EpsF And a method using an oligonucleotide probe that hybridizes to a region containing a site encoding aspartic acid.
  • the reporter fluorescent dye and the quencher fluorescent dye are specifically hybridized to the sites encoding serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at positions 334 to 338.
  • this oligonucleotide probe is hybridized to the genomic DNA, and the DNA sample hybridized with the oligonucleotide probe is used as a template to encode serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at positions 334 to 338. Amplifies the DNA containing the site. Then, the fluorescence emitted by the reporter fluorescent dye whose suppression by the quencher is released is detected by the decomposition of the oligonucleotide probe accompanying the amplification. Examples of such a method include a double die probe method, a so-called TaqMan (registered trademark) probe method.
  • oligonucleotide probe labeled with a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye include a chimeric oligonucleotide (RNA and DNA chimera) that specifically hybridizes to the immunostimulatory activity-enhancing DNA and RNase H. It is also possible to utilize a cycling probe method using a combination with the enzyme of.
  • a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method can be mentioned.
  • a total of 6 regions are set, 3 on each side of the target site of the double-stranded DNA, and 4 types of primers (2 types on each side) containing these regions are used to form a strand-replacement enzyme.
  • amplification starting points of the loop structure can be generated on both sides of the target site. Amplified.
  • the DNA to be detected is the above (a')
  • it is amplified when the target site is the site encoding serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at positions 334 to 338 of R1-EpsF.
  • the presence or absence of each modification can be detected by determining the nucleotide sequence of the product.
  • the target site is not amplified if there is a modification. Therefore, the DNA can be detected using the presence or absence of such amplification as an index.
  • the method for detecting the immunostimulatory activity-enhancing DNA is not limited to the above embodiment.
  • modifier concentration gradient gel electrophoresis DGGE method
  • invader method pyrosequencing method
  • SNuPE single nucleotide primer extension
  • ASO allergen-specific oligonucleotide hybridization method
  • ribonuclease A mismatch cleavage method etc.
  • Other known techniques such as the DNA microarray method and the DNA array method, can also be utilized in the present invention.
  • the detection of the immunostimulatory activity-enhancing DNA it is also preferable to detect its expression.
  • a method for detecting the expression of the spinnability-enhancing DNA for example, mRNA or protein is extracted from a target lactic acid bacterium according to a conventional method, and the mRNA encoded by the immunostimulatory activity-enhancing DNA is obtained by a known method or a method similar thereto. Alternatively, it may be performed by detecting a protein (that is, a protein that enhances immunostimulatory activity).
  • Examples of the method for detecting mRNA encoded by the immunostimulatory activity-enhancing DNA include RT-PCR method and Northern blotting method.
  • a protein sample is prepared from a target lactic acid bacterium, and an antibody specific to the immunostimulatory activity-enhancing protein, that is, An antigen-antibody reaction is carried out using an antibody specific for serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at least at positions 334 to 338 to detect the immunostimulatory activity-enhancing protein.
  • an antibody specific to the immunostimulatory activity-enhancing protein is added to the protein sample to carry out an antigen-antibody reaction with respect to the immunostimulatory activity-enhancing protein.
  • the binding of the antibody is detected.
  • the immunostimulatory activity-enhancing protein can be directly detected, but when it is not labeled, the antibody is further recognized.
  • a labeled molecule for example, a secondary antibody or protein A
  • the label of the molecule can be used to indirectly detect the immunostimulatory activity-enhancing protein.
  • an immunohistochemistry (immunostaining) method for example, a Western blotting method, an ELISA method, a flow cytometry, an imaging cytometry, a radioimmunoassay, an immunoprecipitation method, an analysis method using an antibody array, or the like is used.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and methods of preparing these antibodies are well known to those skilled in the art.
  • the present invention relates to the following agents (i) to (ii) for use in the above-mentioned evaluation method: (I) A drug containing an oligonucleodo having a chain length of at least 15 nucleotides that hybridizes to the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention, a transcript thereof or a complementary nucleotide thereof, and (ii) the immunostimulatory activity of the present invention.
  • kits containing at least one agent selected from the group consisting of.
  • the oligonucleode may be in the form of a primer or in the form of a probe, depending on the method for detecting the immunostimulatory activity-enhancing DNA.
  • the primer may be a DNA corresponding to the immunostimulatory activity-enhancing DNA or the immunostimulatory activity-enhancing DNA of the present invention, or a complementary nucleotide (including cDNA and cRNA) thereof, or a transcript (mRNA) of the immunostimulatory activity-enhancing DNA. It is not particularly limited as long as it hybridizes and enables amplification and detection of these.
  • the primer may be DNA alone, or may be partially or wholly substituted with an artificial nucleic acid (modified nucleic acid) such as a crosslinked nucleic acid.
  • the size of the primer may be at least about 15 nucleotides in length, preferably 15 to 100 nucleotides in length, more preferably 18 to 50 nucleotides in length, and even more preferably 20 to 40 nucleotides in length.
  • Such a primer can be designed and produced by a method known to those skilled in the art according to the above detection method.
  • the probe is particularly as long as it hybridizes to an immunostimulatory activity-enhancing DNA, a DNA corresponding to the immunostimulatory activity-enhancing DNA, or a complementary nucleotide thereof, or a transcript of the immunostimulatory activity-enhancing DNA, and enables detection thereof.
  • the probe may be DNA, RNA, artificial nucleic acid, or a chimeric molecule thereof or the like.
  • the probe may be either single-stranded or double-stranded.
  • the size of the probe may be at least about 15 nucleotides in length, preferably 15 to 1000 nucleotides in length, more preferably 20 to 500 nucleotides in length, and even more preferably 30 to 300 nucleotides in length.
  • Such a probe can be designed and manufactured by a method known to those skilled in the art. Further, the probe may be provided in a form fixed on a substrate, such as a microarray.
  • the antibody is not particularly limited as long as it can specifically bind to the immunostimulatory activity enhancing protein of the present invention.
  • it may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, or it may be a functional fragment of the antibody (Fab, Fab', scFv, etc.).
  • Such an antibody can be produced by a method known to those skilled in the art.
  • the antibody may be provided in a form fixed on a substrate such as a plate for use in an ELISA method, an antibody array, or the like.
  • the oligonucleotide or antibody contained in the kit may be labeled with a labeling substance according to the detection method.
  • the labeling substance include fluorescent substances such as FITC, FAM, DEAC, R6G, TexRed, and Cy5, enzymes such as ⁇ -D-glucosidase, luciferase, and HRP, 3H , 14C , 32P , and 35 .
  • radioactive isotopes such as S and 123 I
  • affinity substances such as biotin and streptavidin
  • luminescent substances such as luminol, luciferin and luciferin.
  • the method for evaluating a lactic acid bacterium of the present invention may further include a confirmation step of confirming whether the extracellular polysaccharide of the lactic acid bacterium has an immunostimulatory activity or has a high immunostimulatory activity.
  • a confirmation method is not particularly limited, but for example, it is confirmed that the above-mentioned protein has an immunostimulatory activity improving effect on the extracellular polysaccharide produced by using the lactic acid bacterium to be evaluated.
  • the NK cell activity measured in the same manner as the method is 21% or more, it can be evaluated that the exopolysaccharide has an immunostimulatory activity, preferably 22% or more, and more preferably 22. Those with 5% or more can be evaluated as having high immunostimulatory activity of exopolysaccharide.
  • the method for producing a lactic acid bacterium of the present invention is the above-mentioned method for evaluating a lactic acid bacterium of the present invention, which comprises an evaluation step of evaluating the exopolysaccharide immunostimulatory activity of the lactic acid bacterium.
  • a step of obtaining a lactic acid bacterium in which exopolysaccharide has an immunostimulatory activity or is evaluated to have a high immunostimulatory activity of exopolysaccharide It is a method including.
  • the evaluation step includes the evaluation step of the above ⁇ method for evaluating lactic acid bacteria>.
  • a lactic acid bacterium having or likely to produce an extracellular polysaccharide having or having a high immunostimulatory activity is selected.
  • a lactic acid bacterium (having an immunostimulatory activity or having an immunostimulatory activity) evaluated by the evaluation step as having an exopolysaccharide having an immunostimulatory activity or having a high exopolysaccharide immunostimulatory activity (has an immunostimulatory activity or has an immunostimulatory activity) (Including those evaluated to have a high possibility) can be obtained, but for example, the lactic acid bacteria may be obtained as the culture by culturing the selected lactic acid bacteria in an appropriate medium.
  • the aspect of the lactic acid bacterium obtained by the method for producing the lactic acid bacterium of the present invention may be the aspect of the lactic acid bacterium composition such as the culture thereof. Therefore, in the method for producing lactic acid bacteria of the present invention, a lactic acid bacterium composition containing lactic acid bacteria evaluated by the evaluation step to have exopolysaccharide having an immunostimulatory activity or exopolysaccharide having a high immunostimulatory activity is obtained. A method for producing a lactic acid bacterium composition including a step is also included. The other components that may be contained in the lactic acid bacterium composition other than the lactic acid bacterium are as described above.
  • the method for producing fermented milk of the present invention includes a fermentation step of adding a lactic acid bacterium or a lactic acid bacterium composition to a milk preparation solution containing raw milk and fermenting it to obtain a fermented product containing extracellular polysaccharides.
  • the lactic acid bacterium according to the method for producing fermented milk of the present invention comprises the vector of the present invention containing the above-mentioned lactic acid bacterium of the present invention (that is, an immunostimulatory activity-enhancing protein, an immunostimulatory activity-enhancing DNA, and an immunostimulatory activity-enhancing DNA).
  • Lactic acid bacteria into which at least one selected from the group has been introduced Lactic acid bacteria having immunostimulatory activity-enhancing DNA; Lactic acid bacteria evaluated to be high (including those evaluated to have immunostimulatory activity or highly likely to have high immunostimulatory activity); lactic acid bacteria obtained by the method for producing lactic acid bacteria of the present invention) are included, and these are included. One of them may be used alone or in combination of two or more.
  • the lactic acid bacterium composition according to the method for producing fermented milk of the present invention includes the above-mentioned lactic acid bacterium composition of the present invention; and the lactic acid bacterium composition obtained by the method for producing lactic acid bacteria of the present invention; One of the above may be used alone or in combination of two or more.
  • fermented milk containing exopolysaccharide having immunostimulatory activity or having high immunostimulatory activity can be obtained.
  • the fermented milk of the present invention is used.
  • the production method may include the evaluation step, but in this case, the evaluation step may be performed only once at the beginning.
  • lactic acid bacteria other than the above-mentioned lactic acid bacteria of the present invention may be further used in combination.
  • yeast may be added.
  • the other lactic acid bacteria and yeast include lactic acid bacteria and yeast that have been conventionally known to be contained in fermented milk.
  • the milk preparation liquid according to the present invention contains raw milk.
  • the raw milk preferably contains lactose, and is, for example, raw milk (for example, milk from cows, squid, sheep, goats, etc.), sterilized milk, full-fat milk, skim milk, whey, and these.
  • Processed products eg, full-fat milk powder, full-fat concentrated milk, skim milk powder, skim-fat concentrated milk, condensed milk, whey flour, butter milk, butter, cream, cheese, whey protein concentrate (WPC), whey protein isolate (WPI) ), ⁇ -lactoalbumin ( ⁇ -La), ⁇ -lactoglobulin ( ⁇ -Lg)
  • WPC whey protein concentrate
  • WPI whey protein isolate
  • ⁇ -lactoalbumin ⁇ -La
  • ⁇ -lactoglobulin ⁇ -Lg
  • the milk preparation liquid according to the present invention may be composed of only the raw material milk, or may be an aqueous solution, a diluted solution, or a concentrated liquid of the raw material milk, and in addition to the raw material milk, if necessary. It may further contain other components. Other such ingredients include water; soymilk, sugars and other sugars and sweeteners, fragrances, fruit juices, flesh, vitamins, minerals, fats and oils, ceramides, collagen, milk phospholipids, yeast extracts, polyphenols and other foods. Food ingredients, food additives; stabilizers such as pectin, soybean polysaccharides, CMC (carboxymethyl cellulose), agar, gelatin, carrageenan, gums, thickeners, gelling agents, and one of them. It may be a mixture of two or more kinds.
  • the emulsion can be prepared by mixing the components while heating as needed and / or homogenizing as needed. Further, as the milk preparation liquid, one that has been sterilized by heating can also be used.
  • a known method or a method similar thereto can be appropriately adopted, and is not particularly limited, for example. Examples thereof include a method in which the lactic acid bacterium or the lactic acid bacterium composition is inoculated into the prepared milk solution as a fermentation starter and fermented.
  • the lactic acid bacterium or the lactic acid bacterium composition is preferably added to the emulsion in the form of the lactic acid bacterium composition, more preferably in the form of a culture or a concentrate of the culture.
  • the addition amount of the fermentation starter can be appropriately set according to the addition amount adopted in the known method for producing fermented milk.
  • the number of lactic acid bacteria (two or more kinds) is set with respect to the volume of the preparation liquid.
  • the total number of bacteria is preferably 1 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 9 CFU / mL, and more preferably 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 9 CFU / mL. preferable. Further, it is preferably 0.1 to 2% (wt / wt), more preferably 0.5 to 1.5% (wt / wt), and 0. It is even more preferable that it is 5 to 1% (wt / wt).
  • the inoculation method of the fermentation starter is not particularly limited, and the method commonly used in the method for producing fermented milk can be appropriately used.
  • the fermentation conditions can be appropriately selected depending on the growth conditions of the lactic acid bacteria to be added, the amount of the milk preparation liquid, and the like, and are not particularly limited, but are, for example, a temperature of 35 to 45 ° C., more preferably a temperature of 38 to 38.
  • At 43 ° C. under aerobic or anaerobic conditions, usually 3 to 24 until the pH of the emulsion to which the lactic acid bacterium or the lactic acid bacterium composition is added reaches 4.8 or less, more preferably 4.0 to 4.6. It is preferably allowed to stand or stir (preferably stand) for an hour, more preferably 3 to 8 hours, still more preferably 4 to 6 hours.
  • the anaerobic condition for example, fermentation under a nitrogen aeration condition can be adopted.
  • the fermented milk of the present invention can be obtained by the above fermentation.
  • the fermented product after the fermentation step that is, the milk preparation liquid after the fermentation step and the lactic acid bacterium or the lactic acid bacterium composition
  • the fermented milk of the present invention may be obtained by crushing or heat-treating the lactic acid bacteria in the fermented product, or by concentrating, diluting, drying, freezing or the like as necessary.
  • the fermented milk of the present invention is at least selected from the group consisting of the above-mentioned lactic acid bacterium of the present invention (that is, a vector of the present invention containing an immunostimulatory activity-enhancing protein, an immunostimulatory activity-enhancing DNA, and an immunostimulatory activity-enhancing DNA.
  • Lactic acid bacterium into which one species was introduced lactic acid bacterium having immunostimulatory activity improving DNA; exopolysaccharide had immunostimulatory activity or exopolysaccharide was evaluated to have high immunostimulatory activity by the evaluation method of lactic acid bacterium of the present invention.
  • At least one selected from the group consisting of lactic acid bacteria (including those evaluated to have immunostimulatory activity or highly likely to have immunostimulatory activity); lactic acid bacteria obtained by the method for producing lactic acid bacteria of the present invention).
  • Fermented milk containing lactic acid bacteria is provided.
  • the fermented milk of the present invention preferably contains proteins for improving immunostimulatory activity derived from these lactic acid bacteria, and more preferably contains extracellular polysaccharides derived from these lactic acid bacteria. Further, the fermented milk of the present invention may further contain other lactic acid bacteria and yeast.
  • the fermented milk of the present invention is not particularly limited, and is not particularly limited. More specifically, the content of non-fat milk solids is 8.0% or more, the number of lactic acid bacteria or yeast (preferably the number of lactic acid bacteria) is 10 million / mL or more), "dairy product lactic acid bacteria beverage" (More specifically, the content of non-fat milk solids is 3.0% or more, and the number of lactic acid bacteria or yeast (preferably the number of lactic acid bacteria) is 10 million / mL or more), "Lactic acid bacteria Beverages that meet the standards of "beverages” (more specifically, those with a non-fat milk solid content of less than 3.0% and a lactic acid bacteria count or yeast count (preferably lactic acid bacteria count) of 1 million / mL or more) It may be either.
  • the non-fat milk solid content refers to the remaining components (mainly proteins, lactose, minerals, etc.) obtained by subtracting the fat content from the total milk solid content, and the number of lactic acid bacteria and yeast is the above-mentioned before sterilization. It is measured by the inspection method specified by the Ordinance of the Ministry of Milk, etc.
  • the fermented milk of the present invention may be a fermented product after the fermentation step, may be a sterilized product of the fermented product, or may be concentrated, diluted, dried, frozen or the like.
  • the fermented milk may be, for example, the fermented milk, the dairy product lactic acid bacteria beverage, or the lactic acid bacteria beverage that has been sterilized. In this case, the number of the lactic acid bacteria is converted into the number of viable bacteria. be.
  • the lactic acid bacteria contained in the fermented milk of the present invention include not only live bacteria but also dead bacteria, and crushed and heat-treated products of lactic acid bacteria, their concentrates, crude products, refined products, diluted products, and dried products (although spray-dried products, freeze-dried products, etc.) and frozen products are also included, the lactic acid bacteria contained in the fermented milk of the present invention preferably contain at least live bacteria.
  • the fermented milk of the present invention may further contain the other lactic acid bacteria and yeast as lactic acid bacteria as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the fermented milk of the present invention may further contain various components that can be contained in foods and drinks. Such components are not particularly limited, and are, for example, water, sugars, sugar alcohols, minerals, vitamins, proteins, peptides, amino acids, organic acids, pH regulators, starches and processed starches, dietary fibers, and the like.
  • yogurt As such fermented milk, yogurt, cheese, fermented cream, fermented butter and the like are preferable, and yogurt is particularly preferable.
  • Specific examples of the yogurt include set-type yogurt (solid fermented milk) such as plain yogurt, soft-type yogurt (paste-like fermented milk), and drink-type yogurt (liquid fermented milk). It may be frozen yogurt used as.
  • the fermented milk of the present invention can also be used as a material for fermented foods such as cheese, fermented cream, fermented butter, and kefir.
  • the fermented milk of the present invention can be obtained by the above-mentioned method for producing fermented milk of the present invention, and since it contains an extracellular polysaccharide having the immunostimulatory activity or having a high immunostimulatory activity, the immunostimulatory activity is improved. It can be fermented milk.
  • the lactic acid bacterium or the lactic acid bacterium composition of the present invention is added to a medium containing glucose and / or a sugar containing glucose and fermented, and exopolysaccharide contained in the fermented product is collected. Also provided is a method for producing exopolysaccharide of lactic acid bacteria, which comprises a step.
  • the medium needs to contain at least one sugar selected from glucose and sugars having glucose as constituent sugars.
  • sugars having glucose as constituent sugars include disaccharides (maltose, sucrose, lactose, etc.), oligosaccharides (galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, mannan oligosaccharides, etc.), and polysaccharides (starch (amylopectin, amylopectin), glycogen. Etc.).
  • the sugar contained in the medium may be only one of the sugars or a combination of two or more, and among them, lactose is preferably contained.
  • the sugar contained in the medium for example, those contained in the raw milk can be used, and the medium preferably contains the raw milk, and the preparation containing the raw milk.
  • a milky lotion is more preferable, and skim milk powder is preferable as the raw material milk.
  • the lactic acid bacterium, the lactic acid bacterium composition, and the method of fermentation are the same as the fermentation step in the above-mentioned method for producing fermented milk, except that the medium may be used as the preparation liquid, including the preferred embodiment thereof. be.
  • the method for collecting the extracellular polysaccharide from the fermented milk is not particularly limited, and a conventionally known method or a method similar thereto can be appropriately adopted. For example, a fermented product after fermentation may be used as needed.
  • a protein modifier trichloroacetic acid, etc.
  • removing the protein by heat treatment to obtain a crude product
  • a salting out method, an organic solvent precipitation method, a membrane separation method, or a chromatographic separation method can be used alone or 2 Examples thereof include a method of purifying by using a combination of seeds or more.
  • the present invention is at least one selected from the group consisting of the above-mentioned lactic acid bacterium of the present invention (that is, a vector of the present invention containing an immunostimulatory activity-enhancing protein, an immunostimulatory activity-enhancing DNA, and an immunostimulatory activity-enhancing DNA.
  • the exopolysaccharide derived from the lactic acid bacterium is produced exopoly when the lactic acid bacterium or the lactic acid bacterium composition of the present invention is added to the medium and fermented by the method for producing the exopolysaccharide. Yes, it is contained in the fermented product after the fermentation.
  • the immunostimulant of the present invention can be administered to a subject, for example, a human or a non-human animal (preferably a mammal) by either an oral or parenteral route.
  • a subject for example, a human or a non-human animal (preferably a mammal) by either an oral or parenteral route.
  • This makes it possible to contribute to the prevention of infections such as influenza, the prevention of cancer, and the inhibition of progression, mainly because the activity of the NK cells of the subject is improved. Therefore, the present invention also provides an immunostimulatory method, more preferably a method for improving NK cell activity, which comprises a step of administering the extracellular polysaccharide to a subject.
  • oral administration includes ingestion of food and drink compositions and feed compositions.
  • the immunostimulator of the present invention may remain as the fermented product after fermentation, and may be a concentrate, crude product, refined product, paste product, dried product (spray dried product, freeze-dried product, etc.) of the fermented product. ), Granulated product, pulverized product, liquid material dispersed in a medium, and a processed product obtained by combining two or more of these, and the extracellular polysaccharide obtained by the method for producing an extracellular polysaccharide. It may consist only of. Further, depending on the purpose, subject, method, dose, etc. of administration, for example, a pharmaceutical composition, a quasi-drug composition, a food / drink composition, a feed composition, or the like can be used.
  • the pharmaceutical composition and the non-pharmaceutical product composition can be, for example, a pharmaceutical product, and the form thereof is not particularly limited, but for example, solids such as tablets, pills, granules, powders, powders and capsules.
  • the pharmaceutical product is, for example, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a thickener, a gelling agent, a surfactant, a buffer, a stabilizer, a preservative, an excipient, a binder, and a disintegration agent, in addition to the above-mentioned extracellular polysaccharide.
  • Manufactured according to a known method or a method similar thereto by adding one or more of the pharmaceutical excipients such as an agent, a dissolving aid, a lubricant, a colorant, a flavoring agent, a sweetening agent, a coating agent, and a fragrance. can do.
  • the form of the food or drink composition is not particularly limited, and is, for example, a solid such as a bar, a liquid such as a beverage or a liquid food, a paste, a semi-liquid, a gel (jelly), or a gel-like fat or oil. (Semi-solid fats and oils), powdery forms can be mentioned.
  • Examples of such food and drink compositions are not particularly limited, but are, for example, the above-mentioned fermented milk (including lactic acid bacteria beverage, yogurt, etc.) and beverages (tea, carbonated beverage, cocoa, coffee, soymilk) of the present invention.
  • Such a food or drink composition is, for example, the fermented milk of the present invention
  • the above-mentioned method for producing fermented milk the method of blending the above-mentioned fermented product or exopolysaccharide into an existing food or drink; It can be produced by the above-mentioned method of adding a fermented product or exopolysaccharide in the production process of the product.
  • the food and drink composition may further contain various components that can be contained in the food and drink as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • Such components are not particularly limited, and examples thereof include various components mentioned in the above ⁇ fermented milk>, and the pharmaceutical adjuncts mentioned in the pharmaceutical composition and the quasi-drug composition. 1 type or a combination of 2 or more types of the above may be contained in an appropriate amount.
  • Examples of the feed composition include those obtained by appropriately modifying the above-mentioned food and drink composition according to the purpose, subject, method, dose, etc. of the feed composition.
  • the content of the extracellular polysaccharide as an active ingredient is appropriately determined according to the dosage type, dosage and the like.
  • it is preferably 0.001 to 90% by mass, more preferably 0.002 to 50% by mass, based on the total immunostimulant. It is more preferably 003 to 10% by mass, further preferably 0.01 to 5% by mass, 0.1 to 1% by mass, or 0.003 to 1% by mass. preferable.
  • the dose of the immunostimulant of the present invention cannot be unequivocally determined because it is appropriately determined according to each individual case in consideration of the target species, age, weight, sex, therapeutic purpose, and the like.
  • the amount of extracellular polysaccharide that is the active ingredient is usually set to, for example, 0.01 mg / kg per day for an adult. It is preferably 0.02 mg / kg, more preferably 0.05 mg / kg.
  • the upper limit of the dose is not particularly limited, but may be, for example, 1 g / kg per day for an adult.
  • a fermentation step of adding the lactic acid bacterium or the lactic acid bacterium composition of the present invention to a milk preparation solution containing raw milk and fermenting the fermented milk to obtain a fermented product containing exopolysaccharide is performed. It is a method to include. As a result, fermented milk containing extracellular polysaccharide with improved immunostimulatory activity can be obtained, and the immunostimulatory activity of the fermented milk can be improved.
  • the lactic acid bacterium, the lactic acid bacterium composition, and the fermentation step are as described in the above-mentioned method for producing fermented milk of the present invention, respectively.
  • the excellent immunostimulatory activity of fermented milk means that, for example, the above protein has an immunostimulatory activity improving effect on extracellular polysaccharides purified by a conventional method from fermented milk to be evaluated.
  • the NK cell activity measured in the same manner as the confirmation method is 21% or more, preferably 22% or more, more preferably 22.5% or more, it can be said that the immunostimulatory activity is excellent.
  • the improvement in the immunostimulatory activity of fermented milk confirms that, for example, the above protein has an immunostimulatory activity improving effect on extracellular polysaccharides purified by a conventional method from the fermented milk to be evaluated.
  • the NK cell activity measured in the same manner as in the above method is a cell purified from fermented milk obtained in the same manner using a lactic acid bacterium having no DNA of (a') to (d'). It can be confirmed that the NK cell activity measured for the outer polysaccharide is 1.03 or more, preferably 1.05 or more, and more preferably 1.10 or more, where 1 is set.
  • the lactic acid bacteria used in the following tests are as follows.
  • R-1 strain Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 (accession number: FERM BP-10471)
  • 2038 strain Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus 2038
  • the 2038 strain is a strain separated by smearing a diluted solution of Meiji Bulgarian yogurt LB81 (manufactured by Meiji Co., Ltd.) on a BCP agar medium, culturing at 37 ° C. for 48 hours, and then picking up rough colonies.
  • KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
  • ⁇ Immune activation activity evaluation> Preparation of extracellular polysaccharide (preparation of fermented milk)
  • the R-1 strain was mixed with 10% (wt / wt) of skim milk powder, 0.1% (wt / wt) of yeast extract, and 1% (wt / wt) of 10% skim milk powder prepared with distilled water.
  • the seeds were sown so as to be, and fermented at 37 ° C. overnight under anaerobic conditions to obtain fermented milk.
  • fermented milk was obtained under the same conditions except that the 2038 strain was used instead of the R-1 strain.
  • Trichloroacetic acid was added to each fermented milk obtained above so that the final concentration was 10% by mass, and the produced denatured protein was removed to obtain a crude product.
  • An equal amount of cold ethanol was added to the obtained crude product, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours for ethanol precipitation to obtain a precipitate 1 containing extracellular polysaccharide (EPS).
  • EPS extracellular polysaccharide
  • the obtained precipitate 1 is dialyzed against MilliQ water using a dialysis membrane (fractional molecular weight: 6 to 8 kDa), the nucleic acid and the residual protein are enzymatically decomposed, and then ethanol precipitation is performed again to obtain the precipitate 2. Obtained.
  • the obtained precipitate 2 was dissolved in MilliQ water, dialyzed again, and then freeze-dried to obtain each purified extracellular polysaccharide.
  • the purified extracellular polysaccharide purified from the fermented milk obtained using the R-1 strain is referred to as "R-1 strain EPS”
  • the purified extracellular polysaccharide purified from the fermented milk obtained using the 2038 strain is referred to as "R-1 strain EPS”.
  • the NK cell activity was measured by the chromium release method according to the method of Takeda et al. (Takeda, K. et al., J. Immunol., 156: 3366, 1996). That is, the Effector cells were each spleen cell, the Target cells were YAC-1 cells (mouse lymphoma) labeled with 51 Cr, and the E / T ratio (Number of Effector cells / Number of Target cells) was 200: 1, and the cells were cultured for 4 hours.
  • NK activity The radioactivity of the culture medium supernatant and the whole medium was measured, and the ratio of the radioactivity of the supernatant to the radioactivity of the whole medium was defined as NK cell activity (NK activity (%)).
  • NK activity %
  • the results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, significantly higher NK cell activity was observed in the mice administered with the R-1 strain EPS as compared with the mice administered with the 2038 strain EPS, and the R-1 strain EPS was higher than the 2038 strain EPS. Was confirmed to have high immunostimulatory activity.
  • EPS gene cluster 1 From the nucleotide sequence of the 2038 strain genome registered in KEGG, two EPS gene cluster regions: LBU1598-LBU1588 (EPS gene cluster 1) and LBU1630-LBU1618 (EPS gene cluster 2), respectively, from -100 bp to + 100 bp. was extracted. The full-length genome of the R-1 strain was obtained by the next-generation sequencer MiSeq (manufactured by Illumina). Genetyx Ver.
  • EPS gene clusters 1 and 2 were highly conserved in both the 2038 strain genome and the R-1 strain genome.
  • EPS gene cluster 1 the nucleotide sequence of the 2038 strain and the nucleotide sequence of the R-1 strain were completely consistent over the entire region (11,569 bp).
  • EPS gene cluster 2 a total of 4 base differences were observed in the epsC gene and the epsF gene, and in the two intergenic regions between the epsM gene and the Transposase gene among 15,769 bp.
  • the difference in bases in the epsF gene which is a gene involved in glycosylation, and the associated amino acids. It can be said that the difference in composition is related to the difference in immunostimulatory activity between the extracellular polysaccharide produced by the R-1 strain and the extracellular polysaccharide produced by the 2038 strain.
  • Table 1 shows the base of the epsF gene, the codon containing the base, the amino acid encoded by the codon, and the position of the amino acid in the gene, in which a difference was observed between the 2038 strain genome and the R-1 strain genome. show.
  • nucleotides below the codon containing the base in which the difference was observed between the 2038 strain genome and the R-1 strain genome are shown in Table 2 below.
  • the sequence and the amino acid sequence encoded by it are shown.
  • nucleotide sequence of the 2038 strain genome shown in Table 2 is assigned to SEQ ID NO: 3
  • amino acid sequence is assigned to SEQ ID NO: 4
  • nucleotide sequence of the R-1 strain genome is assigned to SEQ ID NO: 5
  • amino acid sequence is assigned to SEQ ID NO: 6, respectively. show.
  • the difference between the 2038 strain genome and the R-1 strain genome is that guanine (G) at the 999th base of the epsF gene of the 2038 strain genome is deleted (del) in the R-1 strain genome. )Was.
  • G guanine
  • the amino acid specified by the codon containing this base is glycine at position 333 in both the 2038 strain genome and the R-1 strain genome. It was (G).
  • the amino acid sequence from glycine to the C-terminal differs between the two strains due to the frame shift, and in the 2038 strain genome, the N-terminal side-Gly-Leu-Ala-Ile-Leu-C terminal Although it was on the side, in the R-1 strain genome, it was on the N-terminal side-Gly-Ser-Leu-Phe-Ser-Asp-C-terminal side.
  • serine, leucine, phenylalanine, serine, and aspartic acid at positions 334 to 338 of the protein encoded by the epsF gene of the R-1 strain are used to improve the immunostimulatory activity of extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria. Can be said to be important.
  • a novel protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharide of lactic acid bacteria, and fermented milk containing the extracellular polysaccharide having excellent immunostimulatory activity and the like thereof It becomes possible to provide a manufacturing method. More specifically, a novel protein having an effect of improving the immunostimulatory activity of exopolysaccharide produced when expressed in lactic acid bacteria, a DNA encoding the protein, a vector containing the DNA, the DNA or the vector.
  • a lactic acid bacterium containing lactic acid bacterium and a lactic acid bacterium composition thereof and a fermented milk, an immunostimulator, a method for producing the same, a method for improving the immunostimulatory activity of the fermented milk, and a method for evaluating lactic acid bacteria using the same.
  • the lactic acid bacterium can easily produce an extracellular polysaccharide having excellent immunostimulatory activity, and fermented milk or an immunostimulator containing the same. It becomes possible to manufacture. Further, by using the sequence of DNA encoding the novel protein of the present invention as a selection criterion, exopolysaccharide having excellent immunostimulatory activity, and fermented milk or an immunostimulator containing the same can be produced as a lactic acid bacterium. Can be easily selected.

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Abstract

下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質。 （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質 （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質 （ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質。

Description

乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、並びに、それを用いた発酵乳及びその製造方法
　本発明は、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、並びにそれを用いた発酵乳及びその製造方法に関し、より詳細には、乳酸菌で発現させた場合に産生される菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、ＤＮＡ、ベクター、乳酸菌、及び乳酸菌組成物、並びに、これらを用いた発酵乳、免疫賦活剤、及びこれらの製造方法、発酵乳の免疫賦活活性を向上させる方法、及び乳酸菌の評価方法に関する。
　発酵乳は広く一般的に食される食品であり、日本の「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）」においては、「乳又はこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させ、糊状又は液状にしたもの、又はこれらを凍結したもの」と定義されている。かかる発酵乳の代表例としては、例えば、セットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトタイプヨーグルト（糊状発酵乳）、及びドリンクタイプヨーグルト（液状発酵乳）といったヨーグルトが挙げられる。近年では、消費者の健康志向の高まりに伴って、発酵乳に対しても多様な機能が求められる傾向にある。
　例えば、ヨーグルト等の発酵乳の製造においては、原料乳に乳酸菌を播種し、発酵させて調製したものが主流であるが、ある種の乳酸菌が産生する菌体外多糖（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＥＰＳ）には、ＮＫ細胞の活性化等の免疫賦活活性があることが知られている。例えば、特開２００５－１９４２５９号公報（特許文献１）には、乳酸菌由来の酸性多糖類を有効成分として含有するＮＫ細胞活性化剤が記載されており、国際公開第２０１１／０６５３００号（特許文献２）には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（例えば、ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株）である乳酸菌が産生する中性多糖類を有効成分として含む抗ウイルス剤が記載されている。また、牧野ら，２０１３年，Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１，ｐ．１０－１７（非特許文献１）には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１が産生する菌体外多糖の免疫賦活作用、感染防御効果が記載されている。
　しかしながら、上記のＬｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１や他の乳酸菌においても、どの遺伝子やタンパク質が免疫賦活活性の高い菌体外多糖の産生に関わっているのかが未だ明らかになっておらず、優れた免疫賦活活性を有する菌体外多糖を産生する乳酸菌の選抜には多くの時間と労力を要していた。
特開２００５－１９４２５９号公報 国際公開第２０１１／０６５３００号
牧野ら，２０１３年，Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１，ｐ．１０－１７
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有する新規タンパク質、並びに、優れた免疫賦活活性を有する菌体外多糖を含有する発酵乳及びその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行い、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を向上させるタンパク質及びそれをコードする遺伝子を明らかにした。すなわち、上記のように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１）（以下、場合により「Ｒ－１株」という）が、優れた免疫賦活作用を有する菌体外多糖を高産生することはわかっていたが、Ｒ－１株のどの遺伝子或いはタンパク質が菌体外多糖の免疫賦活活性を向上させているのかは解明されていなかった。そこで本発明者らは、その菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有する新規タンパク質を解明すべく、先ず、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８（以下、場合により「２０３８株」という）が産生する菌体外多糖よりも、確かにＲ－１株が産生する菌体外多糖の方が高い免疫賦活活性を有することを示した。
　次いで、ＥＰＳ遺伝子クラスターの配列を２０３８株の配列とＲ－１株の配列とで比較した。免疫賦活活性に関与するといわれているＩＦＮ－γの産生量は、中性菌体外多糖（ＮＰＳ）よりも酸性菌体外多糖（ＡＰＳ）で高いことが知られている（牧野ら，２０１３年，Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１，ｐ．１０－１７、図３）。ＮＰＳの構造とＡＰＳの構造とを比べると、ＡＰＳにおいてのみわずかにリンが認められる以外は構成糖の組成はほとんど共通することから（ＵＥＭＵＲＡ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｆｒｏｍ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１”，Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ　５３（８）１９９８，ｐ．４４３－４４６）、ＡＰＳでは多糖中に、糖転移によってリンが組み込まれていることが示唆される。そのため、ＥＰＳ遺伝子クラスターの中でも、糖転移に関わる遺伝子に着目して、両者の配列を比較した。その結果、Ｒ－１株と２０３８株とでは、糖転移に関わる遺伝子ではｅｐｓＦ遺伝子においてのみヌクレオチド配列に差異が認められることを見出し、かかるＲ－１株のｅｐｓＦ遺伝子がコードするタンパク質が菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質であることを見出した。
　また、２０２０年２月５日にＲ－１株のｅｐｓＦのヌクレオチド配列をクエリーとして、ＮＣＢＩのｎｔデータベースに対してｗｅｂ　Ｂｌａｓｔ（パラメータ：デフォルト値）を行ったところ、トップヒットの配列は２０３８株のｅｐｓＦ遺伝子であり、Ｑｕｅｒｙ　Ｃｏｖｅｒは１００％、Ｐｅｒ．Ｉｄｅｎｔは９９．９％であった。さらに、その塩基の差異はアミノ酸の差異にも反映されていた。したがって本発明者らは、Ｒ－１株のｅｐｓＦ遺伝子のヌクレオチド配列及びその産物であるタンパク質は新規であることも見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、並びに、それを用いた発酵乳及びその製造方法等に関し、より詳しくは、以下のとおりである。
［１］
　下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質。
［１’］
　前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含有する、組成物（好ましくは、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上に用いるための組成物）。
［２］
　［１］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
［２’］
　前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを含有する、組成物（好ましくは、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上に用いるための組成物）。
［３］
　［２］に記載のＤＮＡを含むベクター。
［３’］
　前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを含むベクター。
［４］
　［１］に記載のタンパク質、［２］に記載のＤＮＡ、及び［３］に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１種を含有する、組成物。
［５］
　［２］に記載のＤＮＡ及び［３］に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された、乳酸菌。
［５’］
　［３’］に記載のベクターが導入された、乳酸菌（好ましくは、菌体外多糖の免疫賦活活性が高い乳酸菌）。
［６］
　［２］に記載のＤＮＡを有する乳酸菌。
［７］
　菌体外多糖の免疫賦活活性が高い、［６］に記載の乳酸菌。
［８］
　［５］～［７］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物。
［８’］
　［５’］に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物（好ましくは、発酵乳の免疫賦活活性の向上に用いるための乳酸菌組成物）。
［９］
　発酵乳である、［８］又は［８’］に記載の乳酸菌組成物。
［１０］
　［５］～［７］のうちのいずれか一項又は［５’］に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖を含有する、［８］、［８’］、又は［９］に記載の乳酸菌組成物。
［１１］
　原料乳を含有する調乳液に、［５］～［７］のうちのいずれか一項若しくは［５’］に記載の乳酸菌又は［８］～［１０］のうちのいずれか一項若しくは［８’］に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
［１２］
　原料乳を含有する調乳液に、［５］～［７］のうちのいずれか一項若しくは［５’］に記載の乳酸菌又は［８］～［１０］のうちのいずれか一項若しくは［８’］に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程を含む、発酵乳の免疫賦活活性を向上させる方法。
［１３］
　下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを指標として、菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する、乳酸菌の評価方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質。
［１４］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
　前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を得る工程と、
を含む、乳酸菌の製造方法。
［１５］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
　原料乳を含有する調乳液に、前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、
を含む、発酵乳の製造方法。
［１６］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
　原料乳を含有する調乳液に、前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、
を含む、発酵乳の免疫賦活活性を向上させる方法。
［１７］
　［５］～［７］のうちのいずれか一項又は［５’］に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖を有効成分として含有する、免疫賦活剤。
［１７’］
　免疫賦活のための、［５］～［７］のうちのいずれか一項又は［５’］に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖の使用。
［１７’’］
　免疫賦活剤の製造のための、［５］～［７］のうちのいずれか一項又は［５’］に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖の使用。
［１７’’’］
　［５］～［７］のうちのいずれか一項又は［５’］に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖を対象に投与する、免疫賦活方法。
［１８］
　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、［５］～［７］のうちのいずれか一項若しくは［５’］に記載の乳酸菌又は［８］～［１０］のうちのいずれか一項若しくは［８’］に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法。
［１９］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程と、
を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法。
［２０］
　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、［５］～［７］のうちのいずれか一項若しくは［５’］に記載の乳酸菌又は［８］～［１０］のうちのいずれか一項若しくは［８’］に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、前記菌体外多糖を有効成分として含有する免疫賦活剤を得る工程と、を含む、免疫賦活剤の製造方法。
［２１］
　［１３］に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、
　前記菌体外多糖を有効成分として含有する免疫賦活剤を得る工程と、
を含む、免疫賦活剤の製造方法。
　本発明によれば、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有する新規タンパク質、並びに、優れた免疫賦活活性を有する菌体外多糖を含有する発酵乳及びその製造方法を提供することが可能となる。より詳細には、乳酸菌で発現させた場合に産生される菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有する新規タンパク質、前記タンパク質をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含むベクター、前記ＤＮＡ又は前記ベクターを含む乳酸菌及びその乳酸菌組成物、並びに、これらを用いた、発酵乳、免疫賦活剤、及びこれらの製造方法、発酵乳の免疫賦活活性を向上させる方法、乳酸菌の評価方法を提供することが可能となる。
　例えば、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡを様々な乳酸菌に導入することにより、当該乳酸菌によって、免疫賦活活性に優れた菌体外多糖、及びそれを含有する発酵乳や免疫賦活剤を容易に製造することが可能となる。また、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡの配列を選抜基準とすることにより、免疫賦活活性に優れた菌体外多糖、及びそれを含有する発酵乳や免疫賦活剤を製造することができる乳酸菌を容易に選抜することが可能となる。
＜免疫賦活活性評価＞で得られた、２０３８株由来の菌体外多糖（２０３８株ＥＰＳ）又はＲ－１株由来の菌体外多糖（Ｒ－１株ＥＰＳ）のＮＫ細胞活性（ＮＫ活性（％））を示すグラフである。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
　＜タンパク質、ＤＮＡ、ベクター、及びそれらを含有する組成物＞
　本発明のタンパク質は、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質であって、下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、及び
（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、
からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である。
　本発明のタンパク質は、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質（以下、場合により「免疫賦活活性向上タンパク質」という）である。
　本発明において、「乳酸菌の菌体外多糖」とは、乳酸菌によって産生される菌体外多糖（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；本明細書中、場合により「ＥＰＳ」という）を示し、かかるＥＰＳには、中性菌体外多糖（ＮＰＳ）、酸性菌体外多糖（ＡＰＳ）、両イオン性菌体外多糖（ＺＰＳ）、及びこれらの混合物が含まれる。
　また、本発明において、「乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性」とは、乳酸菌によって産生される菌体外多糖を対象に投与した場合に、当該対象における免疫を活性化せしめる作用（本明細書中、場合により単に「免疫賦活活性」という）のことを示し、より好ましくは、前記対象におけるＮＫ細胞活性を向上せしめる（活性化させる）作用のことを示す。さらに、本発明において、「乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用」とは、乳酸菌で発現させた場合に、当該乳酸菌で産生される菌体外多糖に対して、前記免疫賦活活性を付与又は向上せしめる作用（本明細書中、場合により「免疫賦活活性向上作用」という）を示す。本発明のタンパク質が前記免疫賦活活性向上作用を有する理由は定かではないが、本発明者らは、ＥＰＳの生合成の過程、特に糖転移の過程において、本発明のタンパク質が作用して、免疫賦活活性が高い構造のＥＰＳが生成されるためではないかと推察する。
　本発明において、乳酸菌によって産生される菌体外多糖の免疫賦活活性は、例えば、当該菌体外多糖を対象に投与した場合のＮＫ細胞活性で評価することができる。前記ＮＫ細胞活性は、本発明においては例えば、竹田らの方法（Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：３３６６，１９９６）に従って、クロムリリース法で測定することができる。前記ＮＫ細胞活性が高い結果となった対象に投与した菌体外多糖ほど、免疫賦活活性が高く優れていると評価することができる。
　本発明のＤＮＡは、前記免疫賦活活性向上タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、場合により「免疫賦活活性向上ＤＮＡ」という）である。すなわち、本発明のＤＮＡは、下記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡ：
（ａ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
（ｄ’）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡである。
　「（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列」は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１）（Ｒ－１株）のｅｐｓＦ遺伝子にコードされるアミノ酸配列である。「（ａ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ」としては、当該アミノ酸配列をコードしていれば特に制限されないが、配列番号２に示されるヌクレオチド配列であることが好ましい。配列番号２に示されるヌクレオチド配列は、Ｒ－１株のｅｐｓＦ遺伝子のヌクレオチド配列である。本発明者らは、上述のように、Ｒ－１株のｅｐｓＦ遺伝子がコードするタンパク質が特に、上記の免疫賦活活性向上作用を有することを見出した。配列番号１に示されるアミノ酸配列においては、特に第３３４～３３８位のアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であることが重要である。これらのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されると（例えば、実施例における２０３８株）、他の配列が共通であっても、乳酸菌が産生する菌体外多糖において優れた免疫賦活活性は発揮されない。以下、場合により、配列番号１に示されるアミノ酸配列を「Ｒ１－ＥｐｓＦ」といい、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を「Ｒ１－ｅｐｓＦ」という。
　また、自然界において、ヌクレオチド配列の変異によってその配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、Ｒ－１株のｅｐｓＦ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｒ１－ｅｐｓＦ）情報或いはそれがコードするタンパク質のアミノ酸配列（Ｒ１－ＥｐｓＦ）情報が得られた場合、そのヌクレオチド配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列とは異なるが、免疫賦活活性向上作用を維持した又はより向上させた免疫賦活活性向上タンパク質を調製することもできる。
　したがって、本発明に係る「免疫賦活活性向上タンパク質」の他の態様には、「（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質」も含まれる。また、本発明に係る「免疫賦活活性向上ＤＮＡ」の他の態様には、「（ｂ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」も含まれる。ここで、「複数」とは、置換、欠失、挿入及び／又は付加（以下、場合によりこれらを「改変」と総称する）後のタンパク質（改変体）が、免疫賦活活性向上作用を有する範囲におけるアミノ酸の改変数であり、通常、１００個以内、１～８０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～数個（例えば、１～１０個、１～８個、１～４個、１～２個）である。
　このような改変体をコードするポリヌクレオチドは、当業者であれば、例えば、Ｒ－１株のｅｐｓＦ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｒ１－ｅｐｓＦ）情報に基づき、公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法等を用いて調製することが可能である。
　さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、Ｒ－１株のｅｐｓＦ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｒ１－ｅｐｓＦ）情報が得られた場合、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）や、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）等により、Ｒ－１株以外の他の微生物から、免疫賦活活性向上タンパク質をコードするポリヌクレオチド（相同遺伝子）を取得することが可能である。したがって、本発明に係る「免疫賦活活性向上タンパク質」の態様には、「（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質」も含まれる。また、本発明に係る「免疫賦活活性向上ＤＮＡ」の他の態様には、「（ｄ’）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」も含まれる。なお、本発明において、「配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸」とは、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））、配列番号１に示されるアミノ酸配列（Ｒ１－ＥｐｓＦ）と整列させた際に、Ｒ１－ＥｐｓＦにおける第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸と同列になる位置のアミノ酸のことである。
　相同遺伝子を単離するためには、通常、厳密な条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。「厳密な条件」としては、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％　ＳＤＳ溶液中で６０℃、２０分間の洗浄条件が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションは、例えば、公知であるＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど、高い同一性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記の条件は例示であり、ＤＮＡの濃度、ＤＮＡの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間等を適宜組み合わせることにより、必要な厳密性（ストリンジェンシー）を実現することが可能である。
　さらに、このような方法等にて取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号１に示されるアミノ酸配列（Ｒ１－ＥｐｓＦ）と高い相同性を有する。したがって、本発明に係る「免疫賦活活性向上タンパク質」の態様には、「（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質」も含まれる。また、本発明に係る「免疫賦活活性向上ＤＮＡ」の態様には、「（ｃ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」も含まれる。
　アミノ酸配列の同一性は、例えば、前記ＢＬＡＳＴ等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））決定することができる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列（Ｒ１－ＥｐｓＦ）との同一性は、通常、８０％以上あればよいが、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
　相同遺伝子がコードする免疫賦活活性向上タンパク質は、乳酸菌とは異なる微生物から単離された遺伝子にコードされるタンパク質であってもよいが、乳酸菌から単離されることが好ましい。前記乳酸菌としては、例えば、ストレプトコッカセエ科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕａｃｅａｅ科）、ラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）、ロイコノストック科（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）等が挙げられ、より具体的には、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクチカゼイバチルス属（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクチプランティバチルス属（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、リクォリラクトバチルス属（Ｌｉｑｕｏｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リモシラクトバチルス属（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レビラクトバチルス属（Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レンチラクトバチルス属（Ｌｅｎｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）等の乳酸桿菌；ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）等の乳酸球菌；ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられる。これらの中でも、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー（サブスピーシーズを含む）がより好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスがさらに好ましい。
　本発明において、各タンパク質が前記免疫賦活活性向上作用を有していることは、例えば、各タンパク質をコードするＤＮＡを有する乳酸菌を用いて産生させた菌体外多糖類をマウス（好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウス）に投与した場合におけるＮＫ細胞活性が、前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡを１種も有さない、例えば、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有さない乳酸菌（例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス２０３８株（２０３８株））を用いて産生させた菌体外多糖類を同様のマウスに投与した場合におけるＮＫ細胞活性を１としたときに、１．０３以上となること、好ましくは１．０５以上となること、より好ましくは１．１０以上となること、で確認することができる。前記マウスへの投与条件としては、１日あたり５０～２００μｇ／マウスの投与量で、１週間以上であることが好ましく、投与期間の上限に特に制限はないが、例えば、１２週間以下とすることができる。前記ＮＫ細胞活性の測定方法は上述のとおりである。さらに、前記２０３８株は、明治ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（株式会社明治製）の希釈液をＢＣＰ加寒天培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した後、ラフ型のコロニーをピックアップすることで分離することができる。
　また、前記各タンパク質をコードするＤＮＡを有する乳酸菌が、前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡを１種も有さない、すなわち、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有さない乳酸菌（例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー、好ましくはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスからなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌）に、前記ＤＮＡ又は前記ＤＮＡを含むベクターを発現可能に導入した乳酸菌（形質転換体）である場合には、当該乳酸菌を用いて産生させた菌体外多糖類について上記と同様にして測定されるＮＫ細胞活性が、前記形質転換前の乳酸菌を用いて産生させた菌体外多糖類について上記と同様にして測定されるＮＫ細胞活性を１として、１．０３以上となること、好ましくは１．０５以上となること、より好ましくは１．１０以上となること、で確認してもよい。
　なお、各乳酸菌が前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有すること又は有さないことは、これらＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、公知の方法又はそれに準じた方法で適宜確認することができ、例えば、下記の＜乳酸菌の評価方法＞の評価工程に記載の免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法により確認することができる。さらに、前記タンパク質をコードするＤＮＡ又はベクターの前記乳酸菌への導入方法は、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜選択することができ、例えば、下記の〔免疫賦活活性向上タンパク質〕に記載の方法において、宿主細胞として前記乳酸菌を用いる方法を挙げることができる。
　〔免疫賦活活性向上タンパク質〕
　本発明に係る免疫賦活活性向上タンパク質は、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜用いて得ることができる。例えば、前記免疫賦活活性向上タンパク質をコードするＤＮＡ及び前記ＤＮＡを含むベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された宿主細胞を培養し、前記宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む製造方法により、得ることができる。より具体的には、先ず、Ｒ－１株等の、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡのうちの少なくとも１種を有する目的の微生物から慣行法によって前記免疫賦活活性向上タンパク質をコードするＤＮＡ（免疫賦活活性向上ＤＮＡ）を単離ＤＮＡとして得る。前記単離ＤＮＡとしては、人工的に前記免疫賦活活性向上ＤＮＡを化学合成した化学合成ＤＮＡであってもよい。次いで、ＤＮＡ（前記単離ＤＮＡ）又はこれを含む発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入した形質転換体を培養することにより、同形質転換体に本発明の免疫賦活活性向上タンパク質を発現させ、培養物から同タンパク質を組み換えタンパク質として得ることができる。
　目的の微生物から前記単離ＤＮＡを得る方法としては、例えば、前記微生物から抽出したゲノムＤＮＡ、又は、前記微生物から抽出したｍＲＮＡを基に合成したｃＤＮＡを、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター、ＰＡＣベクター等のベクターと連結してＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、免疫賦活活性向上ＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、Ｒ１－ｅｐｓＦ）に基づいて作成したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、前記ライブラリーから所望のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを単離する方法；免疫賦活活性向上ＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、Ｒ１－ｅｐｓＦ）に基づいて作成したプライマーを用いて、目的の微生物のゲノムＤＮＡ又は前記ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施し、必要に応じて増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することによって所望のゲノムＤＮＡを単離する方法；が挙げられる。
　前記発現ベクターは、宿主細胞内で複製可能で、かつ、そのポリヌクレオチド配列がコードするタンパク質を宿主細胞内で発現可能な状態で含むベクターである。かかる発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、前記発現ベクターは、宿主細胞に導入された場合、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるファージＤＮＡを基本に構築してもよい。前記プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ２２、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、大腸菌と乳酸菌とのシャトルベクター（ｐＧＭβ１等）が挙げられる。前記ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。
　前記発現ベクターの構築の手順及び方法は、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。例えば、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡをベクターに挿入するには、先ず、前記単離ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なプラスミドの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して前記プラスミドに連結する方法等が採用される。
　前記発現ベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して免疫賦活活性向上タンパク質を発現させるために、本発明の免疫賦活活性向上タンパク質をコードするＤＮＡ（免疫賦活活性向上ＤＮＡ）の他に、その発現を制御するポリヌクレオチド配列、前記発現を制御するポリヌクレオチド配列以外の発現を誘導するポリヌクレオチド配列、及び細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいることが好ましい。
　前記発現を制御するポリヌクレオチド配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、及びシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。前記プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチド配列とすることができる。前記発現を誘導するポリヌクレオチド配列としては、宿主細胞が細菌である場合には、例えば、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。前記遺伝子マーカーとしては、形質転換体の選択方法に応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を用いることができる。
　前記宿主細胞としては、特に制限されないが、微生物であることが好ましく、例えば、糸状菌、酵母、大腸菌、放線菌、乳酸菌などが挙げられる。本発明の免疫賦活活性向上タンパク質の製造方法に用いる場合、前記宿主細胞としては特に制限されないが、前記ＤＮＡを導入した宿主細胞をそのまま下記の＜発酵乳の製造方法＞、＜発酵乳の免疫賦活活性向上方法＞、＜乳酸菌の菌体外多糖の製造方法＞、又は＜免疫賦活剤の製造方法＞に用いる場合には、乳酸菌であることが好ましい。前記宿主細胞としては、必要に応じて、特定の機能が欠損するように既に形質転換されたものや変異体であってもよい。
　これらの宿主細胞に前記ＤＮＡ又は発現ベクターを導入する方法としては、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられ、乳酸菌への導入方法としては、接合法も挙げられる。また、植物細胞へ導入する場合の方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法やパーティクルガン法が挙げられ、昆虫細胞へ導入する場合の方法としては、バキュロウィルスを用いる方法やエレクトロポレーション法が挙げられ、動物細胞へ導入する場合の方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられる。
　本発明の免疫賦活活性向上タンパク質は、こうして宿主細胞に前記ＤＮＡ又は発現ベクターが導入された形質転換体を適当な培地で培養することにより、その培養物（例えば培養微生物細胞）から採取することができる。したがって、本発明は、前記形質転換体を培養し、該形質転換体に発現した免疫賦活活性向上タンパク質を採取する工程を含む、本発明の免疫賦活活性向上タンパク質の製造方法をも提供することができる。
　前記形質転換体の培養条件としては、例えば、宿主細胞の培養条件を適用することができ、当業者であれば、宿主細胞の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養温度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。また、培養物から前記免疫賦活活性向上タンパク質を採取する方法としては、例えば、免疫賦活活性向上タンパク質を宿主細胞（例えば大腸菌）内で発現させ、形質転換体の培養終了後、培養細胞を遠心分離や濾過等によって回収し、細胞を破砕して得られる液を粗精製物として得る方法を用いることもできる。さらに、この上清液を、限外濾過法等によって濃縮し、防腐剤等を加えて濃縮粗精製物とすることもできる。また、前記粗精製物又は前記濃縮粗精製物を、例えば、塩析法、有機溶媒沈殿法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることによって精製してもよい。或いは、精製用タグを付加した免疫賦活活性向上タンパク質を宿主細胞（例えば大腸菌）内で発現させ、その粗抽出液をタグ付きタンパクの精製用カラムに通した後にタグ付きタンパク質を溶出させることで精製してもよい。
　本発明の免疫賦活活性向上タンパク質には、他の化合物が直接又は間接的に付加されていてもよい。かかる付加としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの付加であってもよく、化学的な付加であってもよい。また付加される部位についても特に制限はなく、本発明の免疫賦活活性向上タンパク質のアミノ末端（本明細書中「Ｎ末端」とも称する）及びカルボキシ末端（本明細書中「Ｃ末端」とも称する）のいずれかであってもよく、その両方であってもよい。遺伝子レベルでの付加は、本発明の免疫賦活活性向上タンパク質をコードするＤＮＡ（免疫賦活活性向上ＤＮＡ）に、他のタンパク質をコードするＤＮＡを読み枠を合わせて付加させたものを用いることにより達成される。このようにして付加される「他のタンパク質」としては特に制限はなく、例えば、本発明の免疫賦活活性向上タンパク質の精製を容易にする目的の場合には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ－）タグ（ｔａｇ）タンパク質、ＦＬＡＧ－タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の精製用タグタンパク質が好適に用いられ、また例えば、本発明の免疫賦活活性向上タンパク質の検出を容易にする目的の場合には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質等の検出用タグタンパク質が好適に用いられる。化学的な付加は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシ基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエーテル結合が挙げられる。「非共有結合」としては、例えば、ビオチン－アビジン間結合が挙げられる。
　〔免疫賦活活性向上ＤＮＡ〕
　本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡは、前記本発明の免疫賦活活性向上タンパク質のアミノ酸配列をコードする限り、天然のＤＮＡに変異が導入されたＤＮＡであってもよく、人工的に設計されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡであってもよく、非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。さらに、その形態について特に制限はなく、例えば、上記の〔免疫賦活活性向上タンパク質〕において単離ＤＮＡとして挙げた、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。
　さらに、本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡは、コードする免疫賦活活性向上タンパク質の発現効率を宿主細胞においてより向上させるという観点から、当該宿主細胞の種類に合わせて、コドンを最適化した本発明の免疫賦活活性向上タンパク質をコードするＤＮＡの態様もとり得る。
　〔ベクター〕
　本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡとしては、当該ＤＮＡを宿主細胞内において複製することができるよう、当該ＤＮＡが挿入されているベクターの態様もとり得る。したがって、本発明は、本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡを含むベクターをも提供する。本発明のベクターとしては、その好ましい態様も含めて、上記の〔免疫賦活活性向上タンパク質〕において挙げた発現ベクターが挙げられる。
　〔組成物〕
　本発明は、上記本発明の免疫賦活活性向上タンパク質、免疫賦活活性向上ＤＮＡ、及びベクターのうちの少なくとも１種を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の免疫賦活活性向上タンパク質、免疫賦活活性向上ＤＮＡ、及びベクターのうちの少なくとも１種を有効成分として含有する、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上に用いるための組成物とすることができ、例えば、本発明の組成物を様々な乳酸菌に導入して下記の本発明の乳酸菌とし、それを用いて菌体外多糖や発酵乳を製造することにより、従来よりも免疫賦活活性に優れた菌体外多糖やそれを含有する発酵乳を得ることが可能となる。
　本発明の組成物としては、他の成分をさらに含有していてもよい。前記他の成分としては、特に制限されないが、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられ、これらのうちの１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　＜乳酸菌及び乳酸菌組成物＞
　本発明は、上記本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡ、又は前記免疫賦活活性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターが前記宿主細胞に導入された形質転換体も提供する。前記形質転換体としては、上記の〔免疫賦活活性向上タンパク質〕において挙げた形質転換体が挙げられる。
　本発明において、前記形質転換体の宿主細胞としては、乳酸菌であることが好ましく、「本発明の乳酸菌」には、上記本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡ、及び前記免疫賦活活性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；並びに、上記本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡを有する乳酸菌が含まれる。さらに、「本発明の乳酸菌」には、本発明の免疫賦活活性向上タンパク質自体が導入された乳酸菌も含む。本発明の乳酸菌は、そのため、産生する菌体外多糖が免疫賦活活性を奏することが可能である。
　また、本発明の乳酸菌は乳酸菌組成物の態様であってもよく、本発明は、これら本発明の乳酸菌のうちの少なくとも１種を含有する乳酸菌組成物も提供する。前記乳酸菌組成物は、前記免疫賦活活性向上タンパク質の製造に用いる他、発酵乳の製造、発酵乳の免疫賦活活性向上、免疫賦活活性が向上された菌体外多糖の製造、又は免疫賦活剤の製造に用いるための乳酸菌組成物とすることができる。
　〔乳酸菌〕
　本発明の免疫賦活活性向上タンパク質、免疫賦活活性向上ＤＮＡ、又はベクターが導入される宿主細胞としての乳酸菌としては、特に制限されないが、例えば、ストレプトコッカセエ科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕａｃｅａｅ科）、ラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）、ロイコノストック科（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）等が挙げられ、より具体的には、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクチカゼイバチルス属（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクチプランティバチルス属（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、リクォリラクトバチルス属（Ｌｉｑｕｏｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リモシラクトバチルス属（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レビラクトバチルス属（Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レンチラクトバチルス属（Ｌｅｎｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）等の乳酸桿菌；ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）等の乳酸球菌；ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられる。これらの中でも、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー（サブスピーシーズを含む）がより好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスがさらに好ましい。前記宿主細胞としての乳酸菌は、既に前記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちの少なくとも１種、或いは、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡのうちの少なくとも１種を有するものであってもよい。かかる乳酸菌を宿主細胞とする場合には、さらなる免疫賦活活性向上作用を期待できる。
　これらの乳酸菌に、前記免疫賦活活性向上タンパク質、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡ、又は前記ベクターを導入する方法としては、上記の〔免疫賦活活性向上タンパク質〕においてＤＮＡ又は発現ベクターを導入する方法として挙げた方法を適宜採用することができ、例えば、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、及び接合法からなる群から選択される少なくとも１種を用いて前記免疫賦活活性向上ＤＮＡ又は前記ベクターを導入することが好ましい。
　また、本発明の乳酸菌として、上記本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡを有する乳酸菌としては、例えば、前記宿主細胞として挙げた乳酸菌のうち、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡのうちの少なくとも１種のＤＮＡを有する乳酸菌が挙げられる。
　なお、本発明の乳酸菌が上記本発明の免疫賦活活性向上タンパク質又は免疫賦活活性向上ＤＮＡを有する（導入されているものを含む）ことは、公知の方法又はそれに準じた方法で適宜確認することができ、例えば、下記の＜乳酸菌の評価方法＞の評価工程に記載の免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法で確認することができる。したがって、「本発明の乳酸菌」には、下記の本発明の乳酸菌の評価方法により菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌（免疫賦活活性を有する又は免疫賦活活性が高い可能性が高いと評価されたものを含む）、本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌も含む。
　本発明の乳酸菌が有する（導入されているものを含む）ＤＮＡは、当該乳酸菌内において、そのゲノムＤＮＡに保持されていてもよく、またベクターであれば、そのゲノムＤＮＡ外の独立体として複製され保持されていてもよい。乳酸菌に導入されているＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡにランダムに挿入されることによって保持されていてもよく、相同組み換えによって保持されていてもよい。また、本発明の乳酸菌としては、免疫賦活活性向上作用を有する範囲内において、上記乳酸菌の同株又はその継代株の人工変異株、自然変異株、又は遺伝子組み換え株であってよい。
　本発明の乳酸菌としては、免疫賦活活性が向上された菌体外多糖を産生することが好ましい。本発明において、前記免疫賦活活性向上タンパク質、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡ、又は前記ベクターが導入された乳酸菌が、免疫賦活活性が向上された菌体外多糖を産生することは、例えば、当該乳酸菌を用いて産生させた菌体外多糖類について、上記のタンパク質が免疫賦活活性向上作用を有していることを確認する方法と同様にして測定されるＮＫ細胞活性が、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有さない乳酸菌を用いて産生させた菌体外多糖類について測定されるＮＫ細胞活性を１として、１．０３以上となること、好ましくは１．０５以上となること、より好ましくは１．１０以上となること、で確認することができる。或いは、例えば、前記ＮＫ細胞活性が、２１％以上、好ましくは２２％以上、さらに好ましくは２２．５％以上となることで確認することもできる。
　〔乳酸菌組成物〕
　本発明の乳酸菌組成物は、上記本発明の乳酸菌を含有する組成物である。本発明の乳酸菌組成物としては、他の成分をさらに含有していてもよく、前記他の成分としては、特に制限されないが、例えば、前記乳酸菌の培養終了後の培養上清、培地成分等である培養物；前記培養物の濃縮物、粗精製物、精製物、希釈物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物等）、凍結物等；保護剤、発酵促進剤等が含まれ、これらのうちの１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　また、本発明の乳酸菌組成物には、本発明の乳酸菌（すなわち、免疫賦活活性向上タンパク質、免疫賦活活性向上ＤＮＡ、及び免疫賦活活性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；免疫賦活活性向上ＤＮＡを有する乳酸菌；本発明の乳酸菌の評価方法により菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌（免疫賦活活性を有する又は免疫賦活活性が高い可能性が高いと評価されたものを含む）；本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌）を含有する組成物であれば包含され、下記の本発明の発酵乳もこれに包含される。
　＜乳酸菌の評価方法、乳酸菌の製造方法＞
　本発明の乳酸菌の評価方法は、上記本発明の免疫賦活活性向上タンパク質、すなわち、下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、及び
（ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質、
のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡ（すなわち、本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡ）を指標として、乳酸菌が産生する菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する方法である。
　〔評価工程〕
　本発明の乳酸菌の評価方法においては、本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡを指標として、すなわち、乳酸菌が本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡを有するか否かを指標として、乳酸菌が産生する菌体外多糖が免疫賦活活性を有するか否か、又は、同菌体外多糖の免疫賦活活性が高いか否か、を評価する（評価工程）。前記免疫賦活活性向上ＤＮＡを有する場合には、その乳酸菌が産生する菌体外多糖は免疫賦活活性を有する、又は、同免疫賦活活性が高いと評価し（同免疫賦活活性を有する可能性が高い、又は、同免疫賦活活性が高い可能性が高いと評価することを含む）、他方、前記ＤＮＡを有していない場合には、その乳酸菌が産生する菌体外多糖は免疫賦活活性を有さない、又は、同免疫賦活活性が低いと評価する（同免疫賦活活性を有さない可能性が高い、又は、同免疫賦活活性が低い可能性が高いと評価することを含む）。これにより、免疫賦活活性を有する、若しくは免疫賦活活性が高い菌体外多糖を産生する、又は産生する可能性が高い乳酸菌を選抜することが可能となる。本発明の乳酸菌の評価方法において、評価対象となる乳酸菌としては、特に制限されず、所望の乳酸菌を適宜対象とすることができる。
　乳酸菌が本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡを有するか否かは、当該ＤＮＡを検出することにより判定することができる。免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法としては、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。
　例えば、先ず、評価対象の乳酸菌からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出方法としては、特に制限はなく、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、ＰＣＩ法、ＧｕＳＣＮ／Ｓｉｌｉｃａ法、ＳＤＳフェノール法、ＣＴＡＢ法、アルカリ処理法が挙げられる。また、市販のキットを適宜用いることもできる。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法としては、次いで、免疫賦活活性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することにより実施することができる。当該ＤＮＡの単離は、例えば、少なくとも前記免疫賦活活性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡを挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離したＤＮＡのヌクレオチド配列の決定は、サンガー法及びマキサムギルバート法など、当業者に公知の方法で行うことができる。また、前記ゲノムＤＮＡより、次世代シーケンサー等を用いて直接に前記免疫賦活活性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡのヌクレオチド配列を決定してもよい。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡとしては、少なくともＲ１－ＥｐｓＦの第３３４～３３８位に対応するアミノ酸をコードする部位を含むことが好ましく、これを挟み込む一対のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、Ｒ１－ｅｐｓＦ）及び公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）に基づいて、それぞれ設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドは、当業者であれば、公知の方法又はそれに準じた方法で設計することができる。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＰ（ＰＣＲ－配列特異的プライマー）法が挙げられる。当該方法においては、プライマーを構成する一対のオリゴヌクレオチドのうちの片方のオリゴヌクレオチドの３’末端が前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの特定の塩基、例えば、検出するＤＮＡが前記（ａ’）である場合にはＲ１－ＥｐｓＦの第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸をコードする部位に相補的な塩基種になるように設計する。このように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されるのは、本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡを鋳型にした場合に限られ、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸をコードする部位のうちのいずれかが他のアミノ酸をコードするゲノムＤＮＡを鋳型にした場合には増幅されない。したがって、このような増幅の有無を指標として、前記ＤＮＡを検出することができる。
　また、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法として、Ｒ１－ＥｐｓＦの第３３４～３３８位又はそれに対応するセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸をコードする部位に制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を設定できる場合には、それらＲＦＬＰマーカーを指標として、例えば、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法（又は、ＣＡＰＳ［Ｃｌｅａｖｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ］法）などにより検出することもできる。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ＰＣＲ－一本鎖高次構造多型）法が挙げられる。前記免疫賦活活性向上ＤＮＡを挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより増幅された２本鎖ＤＮＡを、熱やアルカリ等で処理することにより変性させ、１本鎖ＤＮＡにした後、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、ゲル中で１本鎖ＤＮＡは分子内相互作用により折り畳まれ、高次構造を形成する。折り畳まれ構造の相互作用は、塩基種の相違により変化するため、分離した当該１本鎖ＤＮＡを銀染色やラジオアイソトープにより検出し、当該１本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を指標として、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出をすることができる。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、インターカレーターを用いる方法が挙げられる。この方法においては、先ず、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡを増幅する。そして、反応系の温度を変化させ、インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出し、検出した温度の変化に伴う蛍光の強度の変動を指標として、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡ（特にＲ１－ＥｐｓＦの第３３４～３３８位又はそれに対応するセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸をコードする部位）を検出することができる。このような方法としては、高分解融解曲線解析（ＨＲＭ）法が挙げられる。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、検出するＤＮＡが上記（ａ’）である場合にはＲ１－ＥｐｓＦの第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸をコードする部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法が挙げられる。この方法の一つの態様においては、先ず、前記第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸をコードする部位に特異的にハイブリダイズし、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。次いで、このオリゴヌクレオチドプローブを前記ゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、さらにオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズしたＤＮＡ試料を鋳型として、前記第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸をコードする部位を含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、クエンチャーによる抑制が解除されたレポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する。このような方法としては、ダブルダイプローブ法、いわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が挙げられる。レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる他の態様としては、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするキメラオリゴヌクレオチド（ＲＮＡとＤＮＡのキメラ）とＲＮａｓｅ　Ｈなどの酵素との組み合わせを用いるサイクリングプローブ法を利用することもできる。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法の別の方法としては、例えば、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。この方法では、２本鎖ＤＮＡの目的部位の両側に３つずつ、計６つの領域を設定し、これら領域を含む４種類（各側２種類ずつ）のプライマーを用いて、鎖置換型酵素の存在下で反応させることにより、前記目的部位の両側にループ構造の増幅起点を生成させることができるため、以降、同一鎖上に互いに相補的な配列の繰り返し構造が生成されて、前記目的部位が増幅される。検出するＤＮＡが前記（ａ’）である場合、前記目的部位をＲ１－ＥｐｓＦの第３３４～３３８位の、セリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸をコードする部位とした場合には、増幅産物のヌクレオチド配列の決定を行うことにより各改変の存在又は不存在の検出を行うことができる。また、前記６つの領域のうちの１つを前記第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸をコードする部位とした場合、改変がある場合には前記目的部位が増幅されないため、かかる増幅の有無を指標として、前記ＤＮＡを検出することができる。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法は、上記態様に限定されるものではない。例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）、インベーダー法、パイロシークエンシング法、シングルヌクレオチドプライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡアレイ法などの、その他の公知の技術も、本発明において利用し得る。
　さらに、前記免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出としては、その発現を検出するものであることも好ましい。前記曳糸性向上ＤＮＡの発現の検出方法としては、例えば、対象の乳酸菌から常法に従ってｍＲＮＡ又はタンパク質を抽出し、公知の手法又はそれに準じた方法により、当該免疫賦活活性向上ＤＮＡがコードするｍＲＮＡ又はタンパク質（すなわち免疫賦活活性向上タンパク質）の検出によって行ってもよい。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡがコードするｍＲＮＡを検出する方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンブロット法が挙げられる。
　前記免疫賦活活性向上ＤＮＡがコードするタンパク質（免疫賦活活性向上タンパク質）を検出する方法としては、先ず、対象の乳酸菌からタンパク質試料を調製し、前記免疫賦活活性向上タンパク質に特異的な抗体、すなわち、少なくとも第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸に特異的抗体を用いて抗原抗体反応を行い、前記免疫賦活活性向上タンパク質を検出する。このような抗体を用いたタンパク質の検出法においては、例えば、前記タンパク質試料に対して、前記免疫賦活活性向上タンパク質に特異的な抗体を添加して抗原抗体反応を行い、免疫賦活活性向上タンパク質に対する前記抗体の結合を検出する。免疫賦活活性向上タンパク質に特異的な抗体が標識されている場合には、直接的に免疫賦活活性向上タンパク質を検出することができるが、標識されていない場合には、さらに、当該抗体を認識する標識された分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）を作用させて、当該分子の標識を利用して、間接的に免疫賦活活性向上タンパク質を検出することができる。このような方法としては、例えば、免疫組織化学（免疫染色）法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法等を利用することができる。前記抗体としては、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。
　〔本発明の評価方法に用いるためのキット〕
　上述のとおり、本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡを検出することによって、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価することができる。したがって、本発明は、上述の評価方法に用いるための、下記（ｉ）～（ｉｉ）の薬剤：
（ｉ）本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡ、その転写産物又はその相補的ヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオドを含む薬剤、及び
（ｉｉ）本発明の免疫賦活活性向上タンパク質に結合する抗体を含む薬剤、
からなる群から選択される少なくとも１種の薬剤を含むキットも提供する。前記オリゴヌクレオドとしては、上記の免疫賦活活性向上ＤＮＡの検出方法に応じて、プライマーの態様であってもよく、プローブの態様であってもよい。
　前記プライマーとしては、本発明の免疫賦活活性向上ＤＮＡ若しくは免疫賦活活性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡ、又はその相補的ヌクレオチド（ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡを含む）、又は免疫賦活活性向上ＤＮＡの転写産物（ｍＲＮＡ）にハイブリダイズし、これらの増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。前記プライマーとしては、ＤＮＡのみであってもよく、またその一部又は全部において、架橋化核酸等の人工核酸（修飾核酸）によって置換されているものであってもよい。前記プライマーのサイズとしては、少なくとも約１５ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは１５～１００ヌクレオチド長、より好ましくは１８～５０ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０～４０ヌクレオチド長である。このようなプライマーは、上記検出方法に合わせて、当業者であれば公知の方法により設計し、作製することができる。
　前記プローブとしては、免疫賦活活性向上ＤＮＡ若しくは免疫賦活活性向上ＤＮＡに対応するＤＮＡ、又はその相補的ヌクレオチド、又は免疫賦活活性向上ＤＮＡの転写産物にハイブリダイズし、それらの検出を可能とする限り特に限定されない。前記プローブとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸、又はそれらのキメラ分子等であり得る。前記プローブとしては、１本鎖又は２本鎖のいずれでもよい。前記プローブのサイズとしては、少なくとも約１５ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは１５～１０００ヌクレオチド長、より好ましくは２０～５００ヌクレオチド長、さらに好ましくは３０～３００ヌクレオチド長である。このようなプローブは、当業者であれば公知の方法により設計し、作製することができる。また、前記プローブは、マイクロアレイのように、基板上に固定された形態で提供されてもよい。
　前記抗体は、本発明の免疫賦活活性向上タンパク質に特異的に結合し得る限り特に限定されない。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、抗体の機能的断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ等）であってもよい。このような抗体は、当業者であれば公知の方法により作製することができる。また、前記抗体としては、ＥＬＩＳＡ法や抗体アレイ等に用いるべく、プレート等の基板上に固定された形態で提供されてもよい。
　また、前記キットに含まれるオリゴヌクレオチド又は抗体は、上記検出方法に合わせて、標識用物質で標識されていてもよい。前記標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＤＥＡＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５等の蛍光物質、β－Ｄ－グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ、ＨＲＰ等の酵素、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質が挙げられる。
　本発明の乳酸菌の評価方法には、前記乳酸菌の菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は同免疫賦活活性が高いか否かを確認する確認工程をさらに含んでいてもよい。このような確認方法としては、特に制限されないが、例えば、評価対象の乳酸菌を用いて産生させた菌体外多糖類について、上記のタンパク質が免疫賦活活性向上作用を有していることを確認する方法と同様にして測定されるＮＫ細胞活性が、２１％以上であったものを、菌体外多糖が免疫賦活活性を有すると評価することができ、好ましくは２２％以上、さらに好ましくは２２．５％以上であったものを、菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価することができる。
　〔乳酸菌の製造方法〕
　本発明の乳酸菌の製造方法は、上記本発明の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
　前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を得る工程と、
を含む方法である。
　本発明の乳酸菌の製造方法において、前記評価工程としては、上記の＜乳酸菌の評価方法＞の評価工程が挙げられる。本発明の乳酸菌の製造方法に係る評価工程では、これにより、免疫賦活活性を有する、若しくは免疫賦活活性が高い菌体外多糖を産生する、又は産生する可能性が高い乳酸菌を選抜する。本発明の乳酸菌の製造方法では、前記評価工程により菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌（免疫賦活活性を有する又は免疫賦活活性が高い可能性が高いと評価されたものを含む）を得ることができるが、例えば、選抜した乳酸菌を適当な培地で培養することにより、その培養物として前記乳酸菌を得てもよい。
　また、本発明の乳酸菌の製造方法で得られる乳酸菌の態様としては、その培養物等の乳酸菌組成物の態様であってもよい。そのため、本発明の乳酸菌の製造方法には、前記評価工程により菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を含有する乳酸菌組成物を得る工程を含む、乳酸菌組成物の製造方法も包含される。前記乳酸菌組成物に前記乳酸菌以外で含有されていてもよい他の成分としては、上述のとおりである。
　＜発酵乳の製造方法＞
　本発明の発酵乳の製造方法は、原料乳を含有する調乳液に、乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程を含むものである。
　本発明の発酵乳の製造方法に係る乳酸菌には、上記の、本発明の乳酸菌（すなわち、免疫賦活活性向上タンパク質、免疫賦活活性向上ＤＮＡ、及び免疫賦活活性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；免疫賦活活性向上ＤＮＡを有する乳酸菌；本発明の乳酸菌の評価方法により菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌（免疫賦活活性を有する又は免疫賦活活性が高い可能性が高いと評価されたものを含む）；本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌）が含まれ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。また、本発明の発酵乳の製造方法に係る乳酸菌組成物には、上記の本発明の乳酸菌組成物；及び本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌組成物；が含まれ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。これらの乳酸菌又は乳酸菌組成物を用いることにより、免疫賦活活性を有する又は免疫賦活活性が高い菌体外多糖を含有する発酵乳を得ることができる。なお、前記乳酸菌として、本発明の乳酸菌の評価方法により菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を用いる場合、本発明の発酵乳の製造方法としては、前記評価工程を含んでいてもよいが、この場合の当該評価工程としては最初の１回のみでよい。
　本発明の発酵乳の製造方法においては、上記本発明の乳酸菌以外の他の乳酸菌をさらに組み合わせて用いてもよい。また、酵母をさらに加えてもよい。前記他の乳酸菌及び酵母としては、従来から発酵乳に含有させることが公知の乳酸菌や酵母が挙げられる。
　（調乳液）
　本発明に係る調乳液は、原料乳を含有する。前記原料乳としては、乳糖を含有するものであることが好ましく、例えば、生乳（例えば、ウシ、スイギュウ、ヒツジ、ヤギ等の乳）、殺菌乳、全脂乳、脱脂乳、ホエイ、及びこれらの加工品（例えば、全脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂粉乳、脱脂濃縮乳、練乳、ホエイ粉、バターミルク、バター、クリーム、チーズ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α－ラクトアルブミン（α－Ｌａ）、β－ラクトグロブリン（β－Ｌｇ））が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。
　本発明に係る調乳液としては、前記原料乳のみからなるものであっても、前記原料乳の水溶液、希釈液、又は濃縮液であってもよく、前記原料乳の他に、必要に応じて他の成分をさらに含有するものであってもよい。このような他の成分としては、水；豆乳、砂糖を始めとする糖類や甘味料、香料、果汁、果肉、ビタミン、ミネラル、油脂、セラミド、コラーゲン、ミルクリン脂質、酵母エキス、ポリフェノール等の食品、食品成分、食品添加物；ペクチン、大豆多糖類、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、寒天、ゼラチン、カラギーナン、ガム類などの安定化剤、増粘剤、ゲル化剤が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。前記調乳液は、必要に応じて加温しながら、及び／又は、必要に応じて均質化させながら、前記成分を混合することにより調製することができる。また、前記調乳液としては、加熱殺菌したものを用いることもできる。
　（発酵）
　前記調乳液に、前記乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加して発酵させ、発酵物を得る発酵工程としては、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、特に制限されないが、例えば、前記調乳液に、前記乳酸菌又は乳酸菌組成物を発酵スターターとして接種し、発酵させる方法が挙げられる。前記乳酸菌又は乳酸菌組成物としては、前記乳酸菌組成物の形態、より好ましくは、培養物又は培養物の濃縮物の形態で前記調乳液に添加されることが好ましい。
　前記発酵スターターの添加量は、公知の発酵乳の製造方法において採用されている添加量に従って、適宜設定することができるが、例えば、前記調乳液の体積に対して、乳酸菌数（２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計菌数）換算で、１×１０７～５×１０９ＣＦＵ／ｍＬであることが好ましく、１×１０８～２×１０９ＣＦＵ／ｍＬであることがより好ましい。また、前記調乳液の体積に対して、０．１～２％（ｗｔ／ｗｔ）であることも好ましく、０．５～１．５％（ｗｔ／ｗｔ）であることもより好ましく、０．５～１％（ｗｔ／ｗｔ）であることもさらに好ましい。
　前記発酵スターターの接種方法は、特に制限されることなく、発酵乳の製造方法で慣用されている方法を適宜用いることができる。前記発酵の条件としては、添加される乳酸菌の生育条件、前記調乳液の量等に応じて適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、温度３５～４５℃、より好ましくは温度３８～４３℃において、好気又は嫌気条件下で、前記乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加した調乳液のｐＨが４．８以下、より好ましくは４．０～４．６になるまで、通常、３～２４時間、より好ましくは３～８時間、さらに好ましくは４～６時間、静置又は撹拌（好ましくは静置）することが好ましい。また、前記嫌気条件としては、例えば、窒素通気条件下での発酵を採用することができる。
　上記発酵により、本発明の発酵乳を得ることができる。前記発酵工程後の発酵物（すなわち、前記発酵工程後の調乳液、及び乳酸菌又は乳酸菌組成物）は、そのまま、又は必要に応じて濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵乳とすることができる。また、前記発酵物における乳酸菌を破砕若しくは加熱処理等して、又は必要に応じてこれを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵乳としてもよい。
　＜発酵乳＞
　本発明の発酵乳としては、上記の、本発明の乳酸菌（すなわち、免疫賦活活性向上タンパク質、免疫賦活活性向上ＤＮＡ、及び免疫賦活活性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；免疫賦活活性向上ＤＮＡを有する乳酸菌；本発明の乳酸菌の評価方法により菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌（免疫賦活活性を有する又は免疫賦活活性が高い可能性が高いと評価されたものを含む）；本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌）からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌を含有する発酵乳が提供される。本発明の発酵乳としては、これらの乳酸菌由来の免疫賦活活性向上タンパク質を含有していることが好ましく、これらの乳酸菌由来の菌体外多糖を含有していることがより好ましい。また、本発明の発酵乳としては、これ以外の他の乳酸菌及び酵母をさらに含有していてもよい。
　本発明の発酵乳としては、特に限定されるものではなく、例えば、日本国厚生労働省の乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）による「発酵乳」の規格を満たす発酵乳（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が８．０％以上、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数）が１，０００万/ｍＬ以上のもの）、「乳製品乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％以、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数）が１０００万／ｍＬ以上のもの）、「乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％未満、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数）が１００万／ｍＬ以上のもの）のいずれであってもよい。なお、前記無脂乳固形分とは、全乳固形分から脂肪分を差引いた残りの成分（主に、たんぱく質、乳糖、及びミネラル等）を示し、前記乳酸菌及び酵母数は、殺菌前において、前記乳等省令で定められた検査法により測定される。
　本発明の発酵乳としては、前記発酵工程後の発酵物であっても、若しくは前記発酵物を殺菌処理したものであってもよく、又はこれらを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等したものであってもよく、例えば、前記発酵乳としては、上記の発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、又は乳酸菌飲料を殺菌処理したものであってもよく、この場合、上記乳酸菌数は、生菌数換算である。本発明の発酵乳に含有される乳酸菌には、生菌の他、死菌も含み、乳酸菌の破砕物及び加熱処理物、これらの濃縮物、粗精製物、精製物、希釈物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物等）、凍結物も含むが、本発明の発酵乳に含有される乳酸菌としては、少なくとも生菌を含むことが好ましい。
　本発明の発酵乳としては、本発明の効果を阻害しない範囲内において、乳酸菌として、前記他の乳酸菌や酵母をさらに含有していてもよい。また、本発明の発酵乳としては、他に、飲食品に含有させることが可能な各種成分をさらに含有してもよい。このような成分としては、特に制限されず、例えば、水、糖類、糖アルコール類、ミネラル類、ビタミン類、タンパク質、ペプチド、アミノ酸類、有機酸、ｐＨ調整剤、澱粉及び加工澱粉、食物繊維、果実・野菜及びその加工品、動物及び植物生薬エキス、天然由来高分子（コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン等）、油脂、増粘剤、乳化剤、溶剤、界面活性剤、ゲル化剤、安定剤、緩衝剤、懸濁化剤、粘稠剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、保存料、着色料、香料、矯味剤、甘味剤等が挙げられ、これらのうちの１種のみを含有していても２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
　このような発酵乳としては、ヨーグルト、チーズ、発酵クリーム、発酵バター等が好ましく、特にヨーグルトが好ましい。前記ヨーグルトとしては、具体的には、プレーンヨーグルト等のセットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトタイプヨーグルト（糊状発酵乳）、及びドリンクタイプヨーグルト（液状発酵乳）が挙げられ、これらを材料として用いたフローズンヨーグルトであってもよい。また、本発明の発酵乳は、チーズ、発酵クリーム、発酵バター、ケフィア等の発酵食品の材料として用いることもできる。
　本発明の発酵乳は、上記本発明の発酵乳の製造方法によって得ることができ、前記免疫賦活活性を有する又は免疫賦活活性が高い菌体外多糖を含有するため、免疫賦活活性が向上された発酵乳とすることができる。
　＜菌体外多糖の製造方法＞
　本発明は、グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、上記本発明の乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法も提供する。
　前記培地としては、グルコース及びグルコースを構成糖とする糖から選択される少なくとも１種の糖を含有することが必要である。グルコースを構成糖とする糖としては、例えば、二糖（マルトース、ショ糖、ラクトース等）、オリゴ糖（ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖等）、及び多糖（デンプン（アミロース、アミロペクチン）、グリコーゲン等）が挙げられる。前記培地に含有される糖としては、前記糖のうちの１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよいが、中でも、ラクトースが含有されることが好ましい。また、前記培地に含有される糖としては、例えば、前記原料乳に含まれるものを用いることができ、前記培地としては、前記原料乳を含有することが好ましく、前記原料乳を含有する前記調乳液であることがより好ましく、また、前記原料乳としては、脱脂粉乳が好ましい。
　前記乳酸菌及び乳酸菌組成物、並びに、発酵の方法としては、その好ましい態様も含めて、前記調乳液として前記培地を用いてもよいこと以外は、上記の発酵乳の製造方法における発酵工程と同様である。前記発酵乳から前記菌体外多糖を採取する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、発酵後の発酵物に、必要に応じてタンパク質変性剤（トリクロロ酢酸等）の添加や加熱処理による除タンパクを行って粗精製物とした後、例えば、塩析法、有機溶媒沈殿法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることによって精製する方法が挙げられる。
　＜免疫賦活剤及びその製造方法＞
　また、本発明は、上記の、本発明の乳酸菌（すなわち、免疫賦活活性向上タンパク質、免疫賦活活性向上ＤＮＡ、及び免疫賦活活性向上ＤＮＡを含む本発明のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された乳酸菌；免疫賦活活性向上ＤＮＡを有する乳酸菌；本発明の乳酸菌の評価方法により菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌（免疫賦活活性を有する又は免疫賦活活性が高い可能性が高いと評価されたものを含む）；本発明の乳酸菌の製造方法で得られた乳酸菌）からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌に由来する菌体外多糖を有効成分として含有する、免疫賦活剤も提供する。前記乳酸菌に由来する菌体外多糖は、前記菌体外多糖の製造方法によって上記本発明の乳酸菌又は乳酸菌組成物を前記培地に添加して発酵させた際に菌体外に産生されるものであり、前記発酵後の発酵物に含有される。
　本発明の免疫賦活剤は、対象、例えば、ヒト又は非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）に、経口又は非経口のいずれかの経路で投与することができる。これにより、主に前記対象のＮＫ細胞活性を向上させるため、インフルエンザなどの感染予防、癌の予防や進行の阻害に寄与することが可能となる。そのため、本発明は、前記菌体外多糖を対象に投与する工程を含む、免疫賦活方法、より好ましくは、ＮＫ細胞活性向上方法も提供する。なお、本発明において、経口投与には、飲食品組成物や飼料組成物の摂取を含む。
　本発明の免疫賦活剤は、前記発酵後の発酵物のままであってもよく、前記発酵物の濃縮物、粗精製物、精製物、ペースト化物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物等）、造粒物、粉砕物、媒体に分散させた液状物、及びこれらの２以上を組み合わせた処理物であってよく、また、前記菌体外多糖の製造方法で得られた菌体外多糖のみからなるものであってもよい。さらに、投与する目的、対象、方法、用量等に応じて、例えば、医薬品組成物、医薬部外品組成物、飲食品組成物、飼料組成物等とすることができる。
　前記医薬品組成物及び医薬部外品組成物としては、例えば製剤とすることができ、その形態は特に限定されないが、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤；一般液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液剤；ゼリー剤；注射剤や点滴剤；経管投与剤や経鼻管投与剤；坐剤が挙げられる。前記製剤は、例えば、上記の菌体外多糖に、溶剤、分散剤、乳化剤、増粘剤、ゲル化剤、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、保存料、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶解助剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、甘味剤、コーティング剤、香料といった製剤補助剤のうちの１種又は２種以上を加えて、公知の方法又はそれに準じた方法に従って製造することができる。
　前記飲食品組成物の形態としては、特に限定されず、例えば、バーのような固形状、飲料や流動食のような液状、ペースト状、半液体状、ゲル状（ゼリー状）、ゲル状油脂（半固形状油脂）、粉末状の形態が挙げられる。このような飲食品組成物の例としては、特に制限されないが、例えば、上記の本発明の発酵乳（乳酸菌飲料、ヨーグルト等を含む）や、飲料（茶類、炭酸飲料、ココア、コーヒー、豆乳飲料、果汁・野菜汁飲料、清涼飲料、栄養飲料、アルコール飲料等）、加工食品（チョコレート、ガム、グミ、ゼリー、焼菓子（パン、ケーキ、クッキー、ビスケット等）、キャンデー等）、乳製品（調製粉乳（粉末ミルク）、調整乳、乳飲料、アイスクリーム、マーガリン、練乳等）、調味料（ソース、スープ、ドレッシング、マヨネーズ、マヨネーズタイプ調味料、クリーム等）、サプリメント、食用油、機能性食用油脂等が挙げられる。このような飲食品組成物は、例えば、本発明の発酵乳である場合には上記の発酵乳の製造方法；既存の飲食品に上記の発酵物や菌体外多糖を配合する方法；前記飲食品の製造過程において上記の発酵物や菌体外多糖を添加する方法等によって製造することができる。
　前記飲食品組成物としては、他に、本発明の効果を阻害しない範囲内において、飲食品に含有させることが可能な各種成分をさらに含有させてもよい。このような成分としては、特に制限されず、例えば、上記の＜発酵乳＞において挙げた各種成分、前記医薬品組成物及び医薬部外品組成物に挙げた製剤補助剤が挙げられ、これらのうちの１種又は２種以上を組み合わせて適当量含有していてもよい。
　前記飼料組成物としては、飼料組成物を与える目的、対象、方法、用量等に応じて、上記飲食品組成物を適宜改変したものが挙げられる。
　本発明の免疫賦活剤において、有効成分である菌体外多糖の含有量（２種以上の混合物である場合にはそれらの合計量）は、剤型、投与量等に応じて適宜決定されるものであるため一概にはいえないが、免疫賦活剤全体に対して、０．００１～９０質量％であることが好ましく、０．００２～５０質量％であることがより好まししく、０．００３～１０質量％であることがさらに好ましく、０．０１～５質量％であることがさらにより好ましく、０．１～１質量％であることや、０．００３～１質量％であることも好ましい。
　また、本発明の免疫賦活剤の投与量は、対象の種、年齢、体重、性別、治療目的などを考慮して、個々の場合に応じて適宜決定されるものであるため一概にはいえないが、通常、有効成分である菌体外多糖の量（２種以上の混合物である場合にはそれらの合計量）で、成人１日当り、下限値としては、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇとすることができ、好ましくは０．０２ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇである。また、前記投与量の上限値としては、特に制限はないが、成人１日当り、例えば１ｇ／ｋｇとすることができる。
　＜発酵乳の免疫賦活活性向上方法＞
　本発明の発酵乳の免疫賦活活性向上方法は、原料乳を含有する調乳液に、本発明の乳酸菌又は乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程を含む方法である。これにより、免疫賦活活性が向上された菌体外多糖を含有する発酵乳を得ることができ、当該発酵乳の免疫賦活活性を向上せしめることができる。前記乳酸菌、乳酸菌組成物、及び発酵工程としては、それぞれ、上記の本発明の発酵乳の製造方法において述べたとおりである。
　本発明において、発酵乳の免疫賦活活性が優れることは、例えば、評価対象の発酵乳から定法により精製した菌体外多糖類について、上記のタンパク質が免疫賦活活性向上作用を有していることを確認する方法と同様にして測定されるＮＫ細胞活性が、２１％以上、好ましくは２２％以上、さらに好ましくは２２．５％以上であったものを、免疫賦活活性に優れるとすることができる。また、発酵乳の免疫賦活活性が向上したことは、例えば、評価対象の発酵乳から定法により精製した菌体外多糖類について、上記のタンパク質が免疫賦活活性向上作用を有していることを確認する方法と同様にして測定されるＮＫ細胞活性が、前記（ａ’）～（ｄ’）のＤＮＡを１種も有さない乳酸菌を用いて同様にして得られた発酵乳から精製した菌体外多糖類について測定されるＮＫ細胞活性を１として、１．０３以上となること、好ましくは１．０５以上となること、より好ましくは１．１０以上となること、で確認することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　＜乳酸菌＞
　以下の試験に用いた乳酸菌は次のとおりである。
Ｒ－１株：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１）
２０３８株：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８
なお、２０３８株は、明治ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（株式会社明治製）の希釈液をＢＣＰ加寒天培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した後、ラフ型のコロニーをピックアップすることで分離した株であり、２０３８株の完全長ゲノムは、ゲノム、タンパク質、化合物の情報を分子間の相互作用・反応、関係ネットワークで統合した生命システム情報統合データベースである、Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）において、エントリー番号：Ｔ０１９５７で登録されている。
　＜免疫賦活活性評価＞
　（１）菌体外多糖の調製
　（発酵乳の調製）
　Ｒ－１株を、脱脂粉乳１０％（ｗｔ／ｗｔ）、酵母エキス０．１％（ｗｔ／ｗｔ）、及び蒸留水で調製した１０％脱脂粉乳培地に対して１％（ｗｔ／ｗｔ）となるように播種し、３７℃において終夜、嫌気条件で発酵させて発酵乳を得た。また、Ｒ－１株に代えて２０３８株を用いたこと以外は同じ条件で、発酵乳を得た。
　（菌体外多糖の精製）
　上記で得られた各発酵乳に、終濃度が１０質量％となるようにトリクロロ酢酸を加え、生成した変性タンパク質を除去して粗精製物を得た。得られた粗精製物にこれと等量の冷エタノールを加え、４℃で１６時間静置してエタノール沈殿を行い、菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む沈殿物１を得た。得られた沈殿物１を、透析膜（分画分子量：６～８ｋＤａ）を用いてＭｉｌｌｉＱ水に対して透析し、核酸及び残タンパク質を酵素分解した後、再度エタノール沈殿を行って沈殿物２を得た。得られた沈殿物２をＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、再度透析した後、凍結乾燥させ、各精製菌体外多糖を得た。Ｒ－１株を用いて得られた発酵乳から精製した精製菌体外多糖を「Ｒ－１株ＥＰＳ」とし、２０３８株を用いて得られた発酵乳から精製した精製菌体外多糖を「２０３８株ＥＰＳ」とした。
　（２）ＮＫ細胞活性評価
　上記（１）で得られた各精製菌体外多糖について、免疫賦活活性評価としてＮＫ細胞活性を測定した。すなわち、先ず、ＢＡＬＢ／ｃマウスのメス（７週齢、日本クレア株式会社）の計２０匹を２つの群に分け、一方をＲ－１株ＥＰＳ投与マウス群（ｎ＝１０）、他方を２０３８株ＥＰＳ投与マウス群（ｎ＝１０）、とした。両群とも、各精製菌体外多糖を１００μｇ／マウス／１日の投与量で、３週間経口投与した。投与期間終了後、各マウスの脾臓を摘出し、各脾臓細胞を得た。
　次いで、各脾臓細胞について、竹田らの方法（Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：３３６６，１９９６）に従って、クロムリリース法でＮＫ細胞活性を測定した。すなわち、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞を各脾臓細胞、Ｔａｒｇｅｔ細胞を５１ＣｒでラベルしたＹＡＣ－１細胞（マウスリンパ腫）とし、Ｅ／Ｔ比（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞数／Ｔａｒｇｅｔ細胞数）を２００：１として４時間培養後、培地上清及び全培地の放射能を測定し、全培地の放射能に占める上清の放射能の割合をＮＫ細胞活性（ＮＫ活性（％））とした。結果を図１に示す。図１に示したように、２０３８株ＥＰＳを投与したマウスに比べ、Ｒ－１株ＥＰＳを投与したマウスにおいて有意に高いＮＫ細胞活性が認められ、Ｒ－１株ＥＰＳの方が２０３８株ＥＰＳよりも高い免疫賦活活性を有することが確認された。
　＜ＥＰＳ遺伝子クラスター領域の比較＞
　ＫＥＧＧに登録されている２０３８株ゲノムのヌクレオチド配列より、２つのＥＰＳ遺伝子クラスター領域：ＬＢＵ１５９８－ＬＢＵ１５８８（ＥＰＳ遺伝子クラスター１）及びＬＢＵ１６３０－ＬＢＵ１６１８（ＥＰＳ遺伝子クラスター２）について、それぞれの－１００ｂｐ～＋１００ｂｐの領域を抽出した。また、Ｒ－１株の完全長ゲノムは、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）により取得した。Ｇｅｎｅｔｙｘ　Ｖｅｒ．１３（株式会社ゼネティックス製）のＨｏｍｏｌｏｇｙ／Ｌｏｃａｌ　ＢＬＡＳＴＮを用いて、Ｒ－１株のゲノムより、上記の２つのＥＰＳ遺伝子クラスター領域と相同なヌクレオチド配列を抽出した（Ｅ－ｖａｌｕｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．００００１、ｗｏｒｄ　ｓｉｚｅ＝１１）。
　２０３８株ゲノム及びＲ－１株ゲノムの双方において、ＥＰＳ遺伝子クラスター１、２は高度に保存されていた。特に、ＥＰＳ遺伝子クラスター１では全領域（１１，５６９ｂｐ）に渡って、２０３８株のヌクレオチド配列とＲ－１株のヌクレオチド配列とは完全に一致していた。他方、ＥＰＳ遺伝子クラスター２では、１５，７６９　ｂｐのうち、ｅｐｓＣ遺伝子及びｅｐｓＦ遺伝子、並びに、ｅｐｓＭ遺伝子とＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ遺伝子との間の２箇所の遺伝子間領域において、合計４塩基の差異が認められた。ｅｐｓＣ遺伝子は糖転移に関わる遺伝子ではなく、また、遺伝子間領域における変異はいずれの遺伝子にも関わっていないと考えられることから、糖転移に関わる遺伝子であるｅｐｓＦ遺伝子における塩基の差異及びそれに伴うアミノ酸組成の差異が、Ｒ－１株が産生した菌体外多糖と２０３８株が産生した菌体外多糖との免疫賦活活性の差異に関与しているといえる。表１に、２０３８株ゲノムとＲ－１株ゲノムとの間で差異が認められたｅｐｓＦ遺伝子の塩基、その塩基が含まれるコドン、そのコドンがコードするアミノ酸、及びそのアミノ酸の遺伝子中の位置を示す。また、ｅｐｓＦ遺伝子においては、当該塩基の差異によってフレームシフトがおきていたため、下記の表２に、２０３８株ゲノムとＲ－１株ゲノムとの間で差異が認められた塩基を含むコドン以下のヌクレオチド配列及びそれがコードするアミノ酸配列を示す。また、表２に記載の２０３８株ゲノムのヌクレオチド配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に；Ｒ－１株ゲノムのヌクレオチド配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に；それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示したように、２０３８株ゲノムとＲ－１株ゲノムとの差異は、２０３８株ゲノムのｅｐｓＦ遺伝子の９９９塩基目にあるグアニン（Ｇ）が、Ｒ－１株ゲノムでは欠失（ｄｅｌ）していた。これによりＲ－１株ゲノムでは、フレームシフトが生じてコドンの読み枠がずれていたが、この塩基を含むコドンが指定するアミノ酸は、２０３８株ゲノム及びＲ－１株ゲノム共に第３３３位のグリシン（Ｇ）であった。しかしながら、表２に示すように、フレームシフトにより、グリシンからＣ末端にかけてのアミノ酸配列が両株間で異なっており、２０３８株ゲノムでは、Ｎ末端側－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｃ末端側であったが、Ｒ－１株ゲノムでは、Ｎ末端側－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｃ末端側であった。これらの結果より、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性向上作用には、Ｒ－１株のｅｐｓＦ遺伝子がコードするタンパク質の第３３４～３３８位の、セリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸が重要であるといえる。
　以上説明したように、本発明によれば、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有する新規タンパク質、並びに、優れた免疫賦活活性を有する菌体外多糖を含有する発酵乳及びその製造方法を提供することが可能となる。より詳細には、乳酸菌で発現させた場合に産生される菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有する新規タンパク質、前記タンパク質をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含むベクター、前記ＤＮＡ又は前記ベクターを含む乳酸菌及びその乳酸菌組成物、並びに、これらを用いた、発酵乳、免疫賦活剤、及びこれらの製造方法、発酵乳の免疫賦活活性を向上させる方法、乳酸菌の評価方法を提供することが可能となる。
　例えば、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡを様々な乳酸菌に導入することにより、当該乳酸菌によって、免疫賦活活性に優れた菌体外多糖、及びそれを含有する発酵乳や免疫賦活剤を容易に製造することが可能となる。また、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡの配列を選抜基準とすることにより、免疫賦活活性に優れた菌体外多糖、及びそれを含有する発酵乳や免疫賦活剤を製造することができる乳酸菌を容易に選抜することが可能となる。

Claims (21)

  1. 　下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質。
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質
    （ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質。
  2. 　請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
  3. 　請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。
  4. 　請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のＤＮＡ、及び請求項３に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１種を含有する、組成物。
  5. 　請求項２に記載のＤＮＡ及び請求項３に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された、乳酸菌。
  6. 　請求項２に記載のＤＮＡを有する乳酸菌。
  7. 　菌体外多糖の免疫賦活活性が高い、請求項６に記載の乳酸菌。
  8. 　請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物。
  9. 　発酵乳である、請求項８に記載の乳酸菌組成物。
  10. 　請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖を含有する、請求項８又は９に記載の乳酸菌組成物。
  11. 　原料乳を含有する調乳液に、請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌又は請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
  12. 　原料乳を含有する調乳液に、請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌又は請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程を含む、発酵乳の免疫賦活活性を向上させる方法。
  13. 　下記（ａ）～（ｄ）のタンパク質のうちのいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを指標として、菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する、乳酸菌の評価方法。
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３３４～３３８位のセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸以外のアミノ酸の１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質
    （ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡの相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３３４～３３８位に対応するアミノ酸が、Ｎ末端側からセリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、及びアスパラギン酸であり、かつ、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性の向上作用を有するタンパク質。
  14. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
    　前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を得る工程と、
    を含む、乳酸菌の製造方法。
  15. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
    　原料乳を含有する調乳液に、前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、
    を含む、発酵乳の製造方法。
  16. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
    　原料乳を含有する調乳液に、前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、
    を含む、発酵乳の免疫賦活活性を向上させる方法。
  17. 　請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌に由来する菌体外多糖を有効成分として含有する、免疫賦活剤。
  18. 　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌又は請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法。
  19. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
    　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を添加して発酵させ、発酵物に含有される菌体外多糖を採取する工程と、
    を含む、乳酸菌の菌体外多糖の製造方法。
  20. 　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌又は請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、前記菌体外多糖を有効成分として含有する免疫賦活剤を得る工程と、を含む、免疫賦活剤の製造方法。
  21. 　請求項１３に記載の乳酸菌の評価方法で、乳酸菌の菌体外多糖の免疫賦活活性を評価する評価工程と、
    　グルコース及び／又はグルコースを構成糖とする糖を含有する培地に、前記評価工程において菌体外多糖が免疫賦活活性を有する又は菌体外多糖の免疫賦活活性が高いと評価された乳酸菌を添加して発酵させ、菌体外多糖を含む発酵物を得る発酵工程と、
    　前記菌体外多糖を有効成分として含有する免疫賦活剤を得る工程と、
    を含む、免疫賦活剤の製造方法。
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