CN116367726A - 具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白、以及使用其的发酵乳及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

选自由下述(a)~(d)的蛋白组成的组中的至少1种蛋白。(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白;(b)由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;(c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;(d)由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白。

Description

具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白、以 及使用其的发酵乳及其制造方法
技术领域
本发明涉及具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白、以及使用其的发酵乳及其制造方法,更详细而言,涉及具有在乳酸菌中表达时产生的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白、DNA、载体、乳酸菌及乳酸菌组合物以及使用其的发酵乳、免疫激活剂及它们的制造方法、提高发酵乳的免疫激活活性的方法及乳酸菌的评价方法。
背景技术
发酵乳是被广泛食用的食品,在日本的“乳及乳制品的成分标准等相关条例(乳等条例)”中被定义为“将含有乳或与其同等以上的非脂乳固体成分的乳等以乳酸菌或酵母进行发酵,成为糊状或液状者、或将其冷冻而成者”。作为所述发酵乳的代表例,例如可举出固体型酸奶(固体状发酵乳)、软型酸奶(糊状发酵乳)及饮料型酸奶(液状发酵乳)之类的酸奶。近年来,随着消费者的健康意识的提高,有对于发酵乳也要求多种功能的倾向。
例如,在酸奶等发酵乳的制造中,向原料乳接种乳酸菌使其发酵而制备者为主流,已知一些种的乳酸菌所产生的胞外多糖(Exopolysaccharide:EPS)具有活化NK细胞等免疫激活活性。例如在日本特开2005-194259号公报(专利文献1)中,记载了含有来自乳酸菌的酸性多糖类作为有效成分的NK细胞活化剂,在国际公开第2011/065300号(专利文献2)中,记载了含有Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus(例如OLL1073R-1株)的乳酸菌所产生的中性多糖类作为有效成分的抗病毒剂。另外,牧野等人在2013年,JapaneseJournal of Lactic Acid Bacteria,Vol.24,No.1,p.10-17(非专利文献1)中记载了Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus OLL1073R-1所产生的胞外多糖的免疫激活作用、感染防御效果。
然而,对于上述Lctobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus OLL1073R-1或其它乳酸菌,哪些基因或蛋白与免疫激活活性高的胞外多糖的产生有关则尚未被阐明,在选拔产生具有优异免疫激活活性的胞外多糖的乳酸菌时需要花更多的时间与劳动。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2005-194259号公报
专利文献2:国际公开第2011/065300号
非专利文献
非专利文献1:牧野等,2013年,Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria,Vol.24,No.1,p.10-17
发明内容
发明要解决的问题
本发明是鉴于上述现有技术所具有的课题而做出的,以提供具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的新颖蛋白、以及含有具有优异的免疫激活活性的胞外多糖的发酵乳及其制造方法为目的。
用于解决问题的方案
本发明人们为了达成上述目的而进行了详细研究,阐明了提高乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的蛋白及编码其的基因。即,如上所述,已知德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1(保藏编号:FERM BP-10741)(以下有时称为“R-1株”)大量产生具有优异的免疫激活作用的胞外多糖,但R-1株的哪个基因或蛋白可提高胞外多糖的免疫激活活性这一点尚不明确。因此,本发明人们为了阐明该具有胞外多糖的免疫激活活性提高作用的新颖蛋白,首先确认与德氏乳杆菌保加利亚亚种2038(以下有时称为“2038株”)产生的胞外多糖相比,R-1株所产生的胞外多糖确实具有更高免疫激活活性。
接着,在2038株的序列与R-1株的序列之间比较了EPS基因簇的序列。已知在认为与免疫激活活性相关的IFN-γ的产生量方面,酸性胞外多糖(APS)高于中性胞外多糖(NPS)(牧野等,2013年,Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria,Vol.24,No.1,p.10-17,图3)。比较NPS的结构与APS的结构时,仅在APS中确认到微量磷,除此以外构成糖的组成几乎相同(UEMURA et al.,”Chemical characterization of exocellular polysaccharidefrom Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1073R-1”,Milchwissenschaft53(8)1998,p.443-446),因此表明,在APS的情况下通过糖转移而将磷带入多糖中。因此,在EPS基因簇中,着眼于糖转移相关基因,比较两者序列。其结果,发现在R-1株与2038株中,在糖转移相关基因中,仅在epsF基因确认到核苷酸序列的差异性,发现该R-1株的epsF基因所编码的蛋白为具有胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白。
另外,于2020年2月5日对R-1株的epsF的核苷酸序列进行查询,对于NCBI的nt数据库进行web Blast(参数:默认值)后,热门的序列为2038株的epsF基因,查询覆盖率(QueryCover)为100%,Per.Ident为99.9%。进而,该碱基的差异也反映于氨基酸的差异。因此,本发明人们发现R-1株的epsF基因的核苷酸序列及作为其产物的蛋白是新颖的,而完成本发明。
即,本发明涉及具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白、以及使用其的发酵乳及其制造方法等,更详细如以下所示。
[1]
选自由下述(a)~(d)的蛋白组成的组中的至少1种蛋白。
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白;
(b)由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;(c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;(d)由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白。
[1’]
一种组合物,其含有选自由上述(a)~(d)的蛋白组成的组中的至少1种蛋白(优选为用于提高乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的组合物)。
[2]
一种DNA,其编码如[1]所述的蛋白。
[2’]
一种组合物,其含有选自由编码上述(a)~(d)中的任意蛋白的DNA组成的组中的至少1种DNA(优选为用于提高乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的组合物)。
[3]
一种载体,其含有如[2]所述的DNA。
[3’]
一种载体,其含有选自由编码上述(a)~(d)中的任意蛋白的DNA组成的组中的至少1种DNA。
[4]
一种组合物,其含有选自由如[1]所述的蛋白、如[2]所述的DNA及如[3]所述的载体组成的组中的至少1种。
[5]
一种乳酸菌,其导入了选自由如[2]所述的DNA及如[3]所述的载体组成的组中的至少1种。
[5’]
一种乳酸菌,其导入了如[3’]所述的载体(优选胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌)。
[6]
一种乳酸菌,其具有如[2]所述的DNA。
[7]
如[6]所述的乳酸菌,其胞外多糖的免疫激活活性高。
[8]
一种乳酸菌组合物,其含有如[5]~[7]中任一项所述的乳酸菌。
[8’]
一种乳酸菌组合物,其含有如[5’]所述的乳酸菌(优选为用于提高发酵乳的免疫激活活性的乳酸菌组合物)。
[9]
如[8]或[8’]所述的乳酸菌组合物,其为发酵乳。
[10]
如[8]、[8’]或[9]所述的乳酸菌组合物,其含有来自如[5]~[7]中任一项或[5’]所述的乳酸菌的胞外多糖。
[11]
一种发酵乳的制造方法,其包括下述步骤:向含有原料乳的调制乳液体中添加如[5]~[7]中任一项或者如[5’]所述的乳酸菌或如[8]~[10]中任一项或者如[8’]所述的乳酸菌组合物而使其发酵,得到包含胞外多糖的发酵物。
[12]
一种提高发酵乳的免疫激活活性的方法,其包括下述步骤:向含有原料乳的调制乳液体中,添加如[5]~[7]中任一项或者如[5’]所述的乳酸菌或如[8]~[10]中任一项或者如[8’]所述的乳酸菌组合物而使其发酵,得到包含胞外多糖的发酵物。
[13]
一种乳酸菌的评价方法,其以选自由编码下述(a)~(d)中的任意蛋白的DNA组成的组中的至少1种DNA为指标来评价胞外多糖的免疫激活活性,
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白;
(b)由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;
(c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;
(d)由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白。
[14]
一种乳酸菌的制造方法,其包括:通过如[13]所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;和得到在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌的步骤。
[15]
一种发酵乳的制造方法,其包括:通过如[13]所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;和向含有原料乳的调制乳液体中,添加在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌而使其发酵,得到包含胞外多糖的发酵物的发酵步骤。
[16]
一种提高发酵乳的免疫激活活性的方法,其包括:通过如[13]所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;和向含有原料乳的调制乳液体中,添加在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌而使其发酵,得到包含胞外多糖的发酵物的发酵步骤。
[17]
一种免疫激活剂,其含有来自如[5]~[7]中任一项或如[5’]所述的乳酸菌的胞外多糖作为有效成分。
[17’]
用于免疫激活的、来自如[5]~[7]中任一项或如[5’]所述的乳酸菌的胞外多糖的应用。
[17”]
用于制造免疫激活剂的、来自如[5]~[7]中任一项或如[5’]所述的乳酸菌的胞外多糖的应用。
[17”’]
一种免疫激活方法,向对象给予来自如[5]~[7]中任一项或如[5’]所述的乳酸菌的胞外多糖。
[18]
一种乳酸菌的胞外多糖的制造方法,其包括下述步骤:向含有葡萄糖和/或以葡萄糖为构成糖的糖的培养基中,添加如[5]~[7]中任一项或者如[5’]所述的乳酸菌或如[8]~[10]中任一项或者如[8’]所述的乳酸菌组合物而使其发酵,采集发酵物所含的胞外多糖。
[19]
一种乳酸菌的胞外多糖的制造方法,其包括:通过如[13]所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;和向含有葡萄糖和/或以葡萄糖为构成糖的糖的培养基中,添加在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌而使其发酵,并采集发酵物所含的胞外多糖的步骤。
[20]
一种免疫激活剂的制造方法,其包括:向含有葡萄糖和/或以葡萄糖为构成糖的糖的培养基中,添加如[5]~[7]中任一项或者如[5’]所述的乳酸菌或如[8]~[10]中任一项或者如[8’]所述的乳酸菌组合物而使其发酵,得到含有胞外多糖的发酵物的发酵步骤;和得到含有所述胞外多糖作为有效成分的免疫激活剂的步骤。
[21]
一种免疫激活剂的制造方法,其包括:通过如[13]所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;向含有葡萄糖和/或以葡萄糖为构成糖的糖的培养基中,添加在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌而使其发酵,得到含有胞外多糖的发酵物的发酵步骤;和得到含有所述胞外多糖作为有效成分的免疫激活剂的步骤。
发明的效果
根据本发明,能够提供具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的新颖蛋白,以及含有具有优异的免疫激活活性的胞外多糖的发酵乳及其制造方法。更详细地,能够提供具有在乳酸菌中表达时产生的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的新颖蛋白、编码上述蛋白的DNA、含有上述DNA的载体、含有上述DNA或上述载体的乳酸菌及其乳酸菌组合物,以及使用其的发酵乳、免疫激活剂及它们的制造方法、提高发酵乳的免疫激活活性的方法、乳酸菌的评价方法。
例如通过将编码本发明的新颖蛋白的DNA导入于各种乳酸菌,利用该乳酸菌可容易制造出免疫激活活性优异的胞外多糖及含有其的发酵乳或免疫激活剂。另外,通过将编码本发明的新颖蛋白的DNA的序列作为选择基准,可容易选出可制造出免疫激活活性优异的胞外多糖及含有其的发酵乳或免疫激活剂的乳酸菌。
附图说明
图1为示出通过<免疫激活活性评价>而得的、来自2038株的胞外多糖(2038株EPS)或来自R-1株的胞外多糖(R-1株EPS)的NK细胞活性(NK活性(%))的图表。
具体实施方式
以下通过其优选实施方式对本发明进行详细说明。
<蛋白、DNA、载体及含有它们的组合物>
本发明的蛋白为具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白,其为选自由下述(a)~(d)的蛋白组成的组中的至少1种蛋白,
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白;
(b)由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;
(c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;和
(d)由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白。
本发明的蛋白为具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白(以下根据情况有时称为“免疫激活活性提高蛋白”)。
本发明中,所谓“乳酸菌的胞外多糖”是指:通过乳酸菌而产生的胞外多糖(Exopolysaccharide;本说明书中根据情况有时称为“EPS”),该EPS包括中性胞外多糖(NPS)、酸性胞外多糖(APS)、两性离子胞外多糖(ZPS)及它们的混合物。
另外,本发明中,所谓“乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性”是指:将乳酸菌所产生的胞外多糖给予于对象时,使该对象的免疫得以活化的作用(本说明书中,根据情况有时仅称为“免疫激活活性”),更优选表示可提高上述对象的NK细胞活性(使其活化)的作用。进而,本发明中,所谓“乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用”是指:在乳酸菌中表达时,对于该乳酸菌所产生的胞外多糖,可赋予或提高上述免疫激活活性的作用(本说明书中,根据情况称为“免疫激活活性提高作用”)。本发明的蛋白具有上述免疫激活活性提高作用的理由尚不明确,本发明人们推测,可能是在EPS的生物合成过程、特别是糖转移过程中本发明的蛋白发挥作用,生成免疫激活活性高的结构的EPS。
本发明中,乳酸菌所产生的胞外多糖的免疫激活活性例如可通过将该胞外多糖给予于对象时的NK细胞活性进行评价。上述NK细胞活性在本发明中例如可根据竹田等的方法(Takeda,K.et al.,J.Immunol.,156:3366,1996)通过铬释放法(Chromium releasemethod)进行测定。结果为上述NK细胞活性高的对象所被给予的胞外多糖之类,可评价为免疫激活活性高度优异。
本发明的DNA为编码上述免疫激活活性提高蛋白的DNA(以下根据情况称为“免疫激活活性提高DNA”)。即,本发明的DNA为选自由下述(a’)~(d’)的DNA组成的组中的至少1种DNA,
(a’)编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白的DNA;
(b’)编码由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白的DNA;
(c’)编码由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白的DNA;及
(d’)编码下述蛋白的DNA,所述蛋白为:由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白。
“(a)序列号1所示的氨基酸序列”为德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1(保藏编号:FERM BP-10741)(R-1株)的epsF基因编码的氨基酸序列。作为“(a’)编码序列号1所示的氨基酸序列的DNA”,只要编码该氨基酸序列即可,没有特别限制,优选序列号2所示的核苷酸序列。序列号2所示的核苷酸序列为R-1株的epsF基因的核苷酸序列。如上所述,本发明人们发现R-1株的epsF基因所编码的蛋白尤其具有上述的免疫激活活性提高作用。对于序列号1所示的氨基酸序列,特别重要的是第334~338位的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸。这些氨基酸被其它氨基酸置换时(例如实施例中的2038株),即使此外的序列相同,乳酸菌所产生的胞外多糖也无法发挥优异的免疫激活活性。以下根据情况,将序列号1所示的氨基酸序列称为“R1-EpsF”,将序列号2所示的核苷酸序列称为“R1-epsF”。
另外,在自然界中,通过核苷酸序列的变异,该序列所编码的蛋白的氨基酸序列可能会引起变异。进而,在现在技术水平下,如果本领域技术人员得到了例如R-1株的epsF基因的核苷酸序列(R1-epsF)信息或其编码的蛋白的氨基酸序列(R1-EpsF)信息,则可改变该核苷酸序列而制备出虽所编码的氨基酸序列不同、但免疫激活活性提高作用得以维持或进一步提高的免疫激活活性提高蛋白。
因此,作为本发明的“免疫激活活性提高蛋白”的另一方式,包括“(b)由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白”。另外,作为本发明的“免疫激活活性提高DNA”的另一方式,包括“(b’)编码由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白的DNA”。在此,所谓“多个”表示经置换、缺失、插入和/或添加(以下根据情况统称为“改变”)后的蛋白(改变体)在具有免疫激活活性提高作用的范围内的氨基酸改变数,一般为100个以内、1~80个,优选为1~40个,更优选为1~20个,进一步优选为1~数个(例如1~10个、1~8个、1~4个、1~2个)。
编码这种改变体的多核苷酸可由本领域技术人员例如根据R-1株的epsF基因的核苷酸序列(R1-epsF)信息使用公知的定点诱变(site-directed mutagenesis)法等而制备。
另外,于现在技术水平下,本领域技术人员在得到了R-1株的epsF基因的核苷酸序列(R1-epsF)信息的情况下,通过杂交技术(Southern,E.M.,J.Mol.Biol.,98:503,1975)或聚合酶链式反应(PCR)技术(Saiki,R.K.,et al.Science,230:1350-1354,1985、Saiki,R.K.et al.Science,239:487-491,1988)等,可自R-1株以外的其它微生物取得编码免疫激活活性提高蛋白的多核苷酸(同源基因)。因此,本发明的“免疫激活活性提高蛋白”的方式中也包括“(d)由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白”。另外,在本发明的“免疫激活活性提高DNA”的另一方式中,也包括“(d’)编码下述蛋白的DNA,所述蛋白为:由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白”。另外,本发明中,所谓“与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸”是指:使用核苷酸序列及氨基酸序列解析软件(GENETYX-MAC、Sequencher等)或BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool at the National Center for Biological Information(美国国立生物信息中心的基本局部比对搜索工具))等(例如参数:默认值(即初始设定值))与序列号1所示的氨基酸序列(R1-EpsF)对齐时,处于与R1-EpsF中的第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸并列的位置的氨基酸。
欲分离同源基因时,通常在严谨条件下进行杂交反应。作为“严谨条件”,是指在高温下在低盐浓度溶液中进行杂交后的膜的清洗操作,例如可举出在2×SSC浓度(1×SSC:15mM柠檬酸钠、150mM氯化钠)、0.5% SDS溶液中于60℃下进行20分钟的清洗条件。另外,杂交可根据公知ECL直接DNA/RNA标记·检测系统(Amersham Pharmacia Biotech公司制)附带的使用说明书中记载的方法而进行。杂交条件越严谨,越可期待具有较高同一性的DNA的分离。但,上述条件仅为例示,可通过适宜地组合DNA的浓度、DNA的长度、杂交的反应时间等,而实现必要的严谨性(严谨条件)。
进而,经这样的方法等取得的同源基因所编码的蛋白通常与序列号1所示的氨基酸序列(R1-EpsF)具有较高的同一性。因此,本发明的“免疫激活活性提高蛋白”的方式中也包括“(c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白”。另外,本发明的“免疫激活活性提高DNA”的方式中也包括“(c’)编码由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白的DNA”。
氨基酸序列的同一性例如可使用上述BLAST等(例如,参数:默认值(即初始设定值))确定。另外,与序列号2记载的氨基酸序列(R1-EpsF)的同一性,通常为80%以上即可,优选为90%以上,更优选为95%以上(例如96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)。
同源基因所编码的免疫激活活性提高蛋白可为从不同于乳酸菌的微生物分离的基因所编码的蛋白,但是优选从乳酸菌分离者。作为上述乳酸菌,例如可举出链球菌科(Streptococcuaceae科)、乳杆菌科(Lactobacillaceae科)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)等,更具体地,可举出乳杆菌属(Lactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)等乳杆菌;片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)等乳球菌;双歧杆菌属(Bifidobacterium)等。它们中优选乳杆菌属(Lactobacillus),更优选德氏乳杆菌(含亚种),进一步优选德氏乳杆菌保加利亚亚种。
本发明中,各蛋白具有上述免疫激活活性提高作用这一点例如可由下述得到确认:将使用不具有编码上述(a)~(d)的蛋白中任1种的DNA、例如不具有上述(a’)~(d’)中的1种DNA的乳酸菌(例如德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株(2038株))所产生的胞外多糖类给予于同样小鼠时的NK细胞活性设为1时,将使用具有编码各蛋白的DNA的乳酸菌所产生的胞外多糖类给予于小鼠(优选BALB/c小鼠)的情况时的NK细胞活性成为1.03以上,优选成为1.05以上,更优选成为1.10以上。作为对上述小鼠的给予条件,优选以每1天50~200μg/小鼠的给予量进行1周以上,给予期间的上限没有特别限制,例如可为12周以下。上述NK细胞活性的测定方法如上述所示。进而,上述2038株可通过将明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治制)的稀释液涂抹于BCP加琼脂培养基并在37℃培养48小时后,采集粗糙型的菌落而分离。
另外,具有编码上述各蛋白的DNA的乳酸菌为向不具有编码上述(a)~(d)中的任意蛋白的DNA、即不具有上述(a’)~(d’)中的1种DNA的乳酸菌(例如德氏乳杆菌,优选为选自由德氏乳杆菌保加利亚亚种组成的组中的至少1种乳酸菌)中可表达地导入上述DNA或含有上述DNA的载体而成的乳酸菌(转化体)的情况时,可通过下述得到确认:使用该乳酸菌所产生的胞外多糖类通过与上述同样方式测定的NK细胞活性成为1.03以上,优选成为1.05以上,更优选成为1.10以上,其中,将使用上述转化前的乳酸菌而产生的胞外多糖类的、与上述同样方式测定的NK细胞活性设为1。
另外,各乳酸菌具有或不具有上述(a’)~(d’)的DNA中的1种这一点可根据它们DNA的核苷酸序列通过公知方法或根据其的方法适宜地确认,例如可通过下述<乳酸菌的评价方法>的评价步骤中记载的免疫激活活性DNA的检测方法进行确认。进而,对于向上述乳酸菌导入编码上述蛋白的DNA或载体的方法,可适宜地选择公知方法或根据其的方法,例如可举出:在下述[免疫激活活性提高蛋白]中记载的方法中,使用上述乳酸菌作为宿主细胞的方法。
[免疫激活活性提高蛋白]
本发明的免疫激活活性提高蛋白可适宜地使用公知方法或根据其的方法而得。例如可通过包括下述步骤的制造方法得到:培养导入了选自由上述编码免疫激活活性提高蛋白的DNA及含有上述DNA的载体组成的组中的至少1种的宿主细胞,采集上述宿主细胞中表达的蛋白。更具体为,首先自R-1株等具有上述(a’)~(d’)的DNA中的至少1种的目标微生物中,通过惯用方法以分离DNA形式得到编码上述免疫激活活性提高蛋白的DNA(免疫激活活性提高DNA)。作为上述分离DNA,可为人工地将上述免疫激活活性提高DNA以化学方式合成的化学合成DNA。接着,制备出DNA(上述分离DNA)或含有其的表达载体,将其导入于宿主细胞,培养所得到的转化体,由此在该转化体中表达本发明的免疫激活活性提高蛋白,自培养物中以重组蛋白形式得到该蛋白。
作为自目标微生物得到上述分离DNA的方法,例如可举出:将自上述微生物提取的基因组DNA、或以自上述微生物提取的mRNA为基础而合成的cDNA,与质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、BAC载体、PAC载体等载体进行连接而制作DNA文库或cDNA文库,使用基于免疫激活活性提高DNA的核苷酸序列(例如R1-epsF)所作成的探针进行杂交而自上述文库分离出所期望的基因组DNA或cDNA的方法;使用基于免疫激活活性提高DNA的核苷酸序列(例如R1-epsF)而作成的引物,实施以目标微生物的基因组DNA或上述cDNA为模板的PCR,根据需要将扩增出的DNA片段与适当载体进行连接,从而分离所期望的基因组DNA的方法。
上述表达载体为:可在宿主细胞内进行复制、且以可在宿主细胞内表达所编码的蛋白的状态包含该多核苷酸序列的载体。该表达载体例如基本上可构建为自复制载体,即,作为染色体外的独立体而存在,其复制并不依赖染色体的复制的质粒。另外,上述表达载体也可基本上构建为在导入于宿主细胞时整合于该宿主细胞的基因组中、且其与所整合的染色体一起复制的噬菌体DNA。作为上述质粒,可举出来自大肠杆菌的质粒(pET22、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、来自酵母的质粒(YEp13、YEp24、YCp50等)、来自枯草菌的质粒(pUB110、pTP5等)、大肠杆菌与乳酸菌的穿梭载体(pGMβ1等)。作为上述噬菌体DNA,可举出λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)。
构建上述表达载体的步骤及方法可适宜地采用公知方法或根据其的方法。例如在将上述免疫激活活性提高DNA插入于载体时可采用下述方法:首先,以适当限制酶切断上述分离DNA,插入于适当质粒的限制酶位点或多克隆位点而连接于上述质粒;等。
上述表达载体中,为了将其实际导入于宿主细胞而表达免疫激活活性提高蛋白,优选除了编码本发明的免疫激活活性提高蛋白的DNA(免疫激活活性提高DNA)以外还含有控制其表达的多核苷酸序列、上述控制表达的多核苷酸序列以外的诱导表达的多核苷酸序列及用于选择细胞的基因标记等。
作为上述控制表达的多核苷酸序列,例如可举出启动子、终止子及编码信号肽的多核苷酸序列,可为它们中的1种,也可为2种以上的组合。上述启动子只要是在宿主细胞中显示转录活性者即可,没有特别限定,可为控制编码与宿主细胞为同种或者异种的蛋白的基因的表达的多核苷酸序列。作为上述诱导表达的多核苷酸序列,宿主细胞为细菌时,例如可举出可通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而诱导配置于下游的基因的表达的乳糖操纵子。作为上述基因标记,可根据转化体的选择方法而适宜选择,例如可使用编码抗药性的基因或营养缺陷型的互补基因。
作为上述宿主细胞,没有特别限制,优选微生物,例如可举出丝状菌、酵母、大肠杆菌、放线菌、乳酸菌等。用于本发明的免疫激活活性提高蛋白的制造方法时,作为上述宿主细胞没有特别限制,在将导入了上述DNA的宿主细胞直接用于下述<发酵乳的制造方法>、<发酵乳的免疫激活活性提高方法>、<乳酸菌的胞外多糖的制造方法>或<免疫激活剂的制造方法>时,优选乳酸菌。作为上述宿主细胞,根据需要也可以为以缺失特定功能的方式进行了转化者或突变体。
作为向这些宿主细胞中导入上述DNA或表达载体的方法,可适宜地采用公知方法或根据其的方法,例如可举出热休克法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法,作为对乳酸菌的导入方法,也可举出接合法。另外,作为向植物细胞进行导入时的方法,可举出使用农杆菌(Agrobacterium)的方法或粒子枪法,作为导入于昆虫细胞时的方法,可举出使用杆状病毒(Baculovirus)的方法或电穿孔法,作为导入于动物细胞时的方法,可举出磷酸钙法、脂质体转染法、电穿孔法。
本发明的免疫激活活性提高蛋白可通过将如此地对宿主细胞导入了上述DNA或表达载体的转化体在适当培养基中进行培养,由其培养物(例如培养微生物细胞)采集。因此,本发明也可提供:本发明的免疫激活活性提高蛋白的制造方法,其包括培养上述转化体并采集该转化体中表达的免疫激活活性提高蛋白的步骤。
作为上述转化体的培养条件,例如可适用宿主细胞的培养条件,本领域技术人员可根据宿主细胞的种类、使用的培养基等适宜地调整温度、是否添加空气、氧的浓度、二氧化碳的浓度、培养基的pH、培养温度、培养时间、湿度等而设定。另外,作为自培养物采集上述免疫激活活性提高蛋白的方法,例如也可使用下述方法:使免疫激活活性提高蛋白在宿主细胞(例如大肠杆菌)内表达,在转化体的培养结束后,将培养细胞通过离心分离或过滤等回收,破碎细胞,将得到的液体作为粗纯化物而得到的方法。进一步可将该上清液通过超滤法等进行浓缩,加入防腐剂等而成为浓缩粗纯化物。另外,将上述粗纯化物或上述浓缩粗纯化物例如通过单独使用盐析法、有机溶剂沉淀法、膜分离法、色谱分离方法或将其组合2种以上而进行纯化。或者也可使添加了纯化用标签的免疫激活活性提高蛋白在宿主细胞(例如大肠杆菌)内表达,使该粗提取液通过带有标签的蛋白的纯化用柱后,洗脱带有标签的蛋白而进行纯化。
本发明的免疫激活活性提高蛋白上直接或间接地连接其它化合物。作为该连接,没有特别限制,可在基因水平下连接,也可为化学性连接。另外,对于添加的位点也没有特别限制,可为本发明的免疫激活活性提高蛋白的氨基末端(本说明书中也称为“N末端”)及羧基末端(本说明书中也称为“C末端”)中的任一者,也可为这两者。基因水平下的连接可通过使用在编码本发明的免疫激活活性提高蛋白的DNA(免疫激活活性提高DNA)上以读码框合并的方式连接有编码其它蛋白的DNA而成者而达成。作为这样连接的“其它蛋白”,没有特别限制,例如出于本发明的免疫激活活性提高蛋白更容易纯化的目的时,优选使用聚组氨酸(His-)标签(tag)蛋白、FLAG-标签蛋白(注册商标,Sigma-Aldrich公司)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等纯化用标签蛋白,另外,例如在出于本发明的免疫激活活性提高蛋白的检测更容易的目的时,优选使用GFP等荧光蛋白、荧光素酶等化学发光蛋白等检测用标签蛋白。化学性连接可为共价键,也可为非共价键。作为“共价键”,没有特别限制,例如可举出氨基与羧基的酰胺键、氨基与烷基卤化物基的烷基胺键、硫醇彼此间的二硫键、硫醇基与马来酰亚胺基或烷基卤化物基的硫醚键。作为“非共价键”,例如可举出生物素-亲和素间的结合。
[免疫激活活性提高DNA]
本发明的免疫激活活性提高DNA编码上述本发明的免疫激活活性提高蛋白的氨基酸序列即可,可为于天然DNA中导入变异的DNA,也可为经人工设计的核苷酸序列所构成的DNA,另外可由非天然型核苷酸构成其一部分或全部。另外,对其形态没有特别限制,例如包括上述[免疫激活活性提高蛋白]中作为分离DNA所举出的cDNA、基因组DNA及化学合成DNA。
另外,从在宿主细胞中进一步提高编码的免疫激活活性提高蛋白的表达效率的观点来看,本发明的免疫激活活性DNA可采取根据该宿主细胞的种类而使密码子最适化的编码本发明的免疫激活活性提高蛋白的DNA的方式。
[载体]
作为本发明的免疫激活活性提高DNA,为了能够在宿主细胞内复制该DNA,也可以采取插入了该DNA的载体的方式。因此,本发明也提供:含有本发明的免疫激活活性提高DNA的载体。作为本发明的载体、包括其优选方式在内,可举出上述[免疫激活活性提高蛋白]中所举出的表达载体。
[组合物]
本发明提供:含有上述本发明的免疫激活活性提高蛋白、免疫激活活性提高DNA及载体中的至少1种的组合物。本发明的组合物是含有本发明的免疫激活活性提高蛋白、免疫激活活性提高DNA及载体中的至少1种作为有效成分的用于提高乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的组合物,例如将本发明的组合物导入于各种乳酸菌而制成下述本发明的乳酸菌并使用其制造胞外多糖和发酵乳,由此可得到免疫激活活性比过去优异的胞外多糖和含有其的发酵乳。
作为本发明的组合物,可进一步含有其它成分。作为上述其它成分,没有特别限制,例如可举出灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、溶解助剂、缓冲剂、DNase抑制剂、保存剂,可仅为它们中的1种,也可为2种以上的组合。
<乳酸菌及乳酸菌组合物>
本发明也提供:一种转化体,其是向上述宿主细胞导入上述本发明的免疫激活活性提高DNA、或含有上述免疫激活活性提高DNA的本发明的载体而成的。作为上述转化体,可举出上述[免疫激活活性提高蛋白]中所举出的转化体。
本发明中,作为上述转化体的宿主细胞,优选乳酸菌,“本发明的乳酸菌”包括:导入了选自由上述本发明的免疫激活活性提高DNA及含有上述免疫激活活性提高DNA的本发明的载体组成的组中的至少1种的乳酸菌;以及,具有上述本发明的免疫激活活性提高DNA的乳酸菌。进一步地,“本发明的乳酸菌”中也包括导入了本发明的免疫激活活性提高蛋白本身的乳酸菌。本发明的乳酸菌因此可使所产生的胞外多糖达成免疫激活活性。
另外,本发明的乳酸菌可为乳酸菌组合物的方式,本发明也提供:含有这些本发明的乳酸菌中的至少1种的乳酸菌组合物。上述乳酸菌组合物可以为:除了用于上述免疫激活活性提高蛋白的制造以外也可用于发酵乳的制造、发酵乳的免疫激活活性的提高、免疫激活活性提高的胞外多糖的制造、或免疫激活剂的制造的乳酸菌组合物。
[乳酸菌]
就作为导入本发明的免疫激活活性提高蛋白、免疫激活活性提高DNA或载体的宿主细胞的乳酸菌而言,没有特别限制,例如可举出链球菌科(Streptococcuaceae科)、乳杆菌科(Lactobacillaceae科)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)等,更具体地,可举出乳杆菌属(Lactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)等乳杆菌;片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)等乳球菌;双歧杆菌属(Bifidobacterium)等。它们中优选乳杆菌属(Lactobacillus),更优选德氏乳杆菌(含亚种),进一步优选德氏乳杆菌保加利亚亚种。作为上述宿主细胞的乳酸菌可以已经具有上述(a)~(d)的蛋白中的至少1种、或上述(a’)~(d’)的DNA中的至少1种。将该乳酸菌作为宿主细胞时,可期待进一步的免疫激活活性提高作用。
作为对这些乳酸菌导入上述免疫激活活性提高蛋白、上述免疫激活活性提高DNA或上述载体的方法,可适宜地采用上述[免疫激活活性提高蛋白]中作为导入DNA或表达载体的方法所举出的方法,例如优选使用选自由热休克法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法及接合法组成的组中的至少1种而导入上述免疫激活活性提高DNA或上述载体。
另外,作为本发明的乳酸菌,作为具有上述本发明的免疫激活活性提高DNA的乳酸菌,例如可举出上述作为宿主细胞所举出的乳酸菌中具有上述(a’)~(d’)的DNA中的至少1种DNA的乳酸菌。
另外,本发明的乳酸菌具有(包括导入有)上述本发明的免疫激活活性提高蛋白或免疫激活活性提高DNA这一点可通过公知方法或根据其的方法而适宜地确认,例如可通过下述<乳酸菌的评价方法>的评价步骤中记载的免疫激活活性提高DNA的检测方法进行确认。因此,“本发明的乳酸菌”中也包括:通过下述本发明的乳酸菌的评价方法评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌(包括评价为具有免疫激活活性或免疫激活活性高的可能性高者)、通过本发明的乳酸菌的制造方法所得的乳酸菌。
本发明的乳酸菌所具有(包括导入有)的DNA在该乳酸菌内可以保持于其基因组DNA,另外若为载体,也可以作为其基因组DNA外的独立体而复制、保持。作为导入于乳酸菌的DNA,可通过随机地插入于基因组DNA而保持,也可通过同源重组而保持。另外,作为本发明的乳酸菌,可以为具有免疫激活活性提高作用的范围内的、上述乳酸菌的本株或其传代株的人工变异株、自然变异株或基因重组株。
作为本发明的乳酸菌,优选产生免疫激活活性提高的胞外多糖。本发明中,导入有上述免疫激活活性提高蛋白、上述免疫激活活性提高DNA、或上述载体的乳酸菌产生免疫激活活性提高的胞外多糖这一点例如可通过下述方式确认:对于使用该乳酸菌所产生的胞外多糖类,与上述确认蛋白具有免疫激活活性提高作用的方法同样测得的NK细胞活性成为1.03以上,优选成为1.05以上,更优选成为1.10以上,其中,将对于使用不具有上述(a’)~(d’)中的1种DNA的乳酸菌所产生的胞外多糖类测得的NK细胞活性设为1。或者,例如可通过上述NK细胞活性为21%以上、优选22%以上、更优选22.5%以上来确认。
[乳酸菌组合物]
本发明的乳酸菌组合物为含有上述本发明的乳酸菌的组合物。作为本发明的乳酸菌组合物,可进一步含有其它成分,作为上述其它成分,没有特别限制,例如含有上述乳酸菌的培养结束后的培养上清液、培养基成分等的培养物;上述培养物的浓缩物、粗纯化物、纯化物、稀释物、干燥物(喷雾干燥物、冷冻干燥物等)、冷冻物等;保护剂、发酵促进剂等,可为它们中的单独1种,也可为2种以上的组合。
另外,本发明的乳酸菌组合物包括:含有本发明的乳酸菌(即导入了选自由免疫激活活性提高蛋白、免疫激活活性提高DNA及含有免疫激活活性提高DNA的本发明的载体组成的组中的至少1种的乳酸菌;具有免疫激活活性提高DNA的乳酸菌;通过本发明的乳酸菌的评价方法评价为胞外多糖具有免疫激活活性、或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌(包括评价为具有免疫激活活性或免疫激活活性高的可能性高者);通过本发明的乳酸菌的制造方法所得到的乳酸菌)的组合物,下述本发明的发酵乳也包括在内。
<乳酸菌的评价方法、乳酸菌的制造方法>
本发明的乳酸菌的评价方法是以下述DNA(即,本发明的免疫激活活性提高DNA)为指标来评价乳酸菌产生的胞外多糖的免疫激活活性的方法,所述DNA是选自由编码上述本发明的免疫激活活性提高蛋白、即下述(a)~(d)中的任意蛋白的DNA组成的组中的至少1种。
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白;
(b)由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;
(c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;和
(d)由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白。
[评价步骤]
本发明的乳酸菌的评价方法中,以本发明的免疫激活活性提高DNA为指标、即以乳酸菌是否具有本发明的免疫激活活性提高DNA为指标来评价乳酸菌所产生的胞外多糖是否具有免疫激活活性或该胞外多糖的免疫激活活性是否高(评价步骤)。具有上述免疫激活活性提高DNA时,可评价为该乳酸菌所产生的胞外多糖具有免疫激活活性、或该免疫激活活性高(包括评价为具有该免疫激活活性的可能性高、或该免疫激活活性高的可能性高的情况),另外,不具有上述DNA时评价为该乳酸菌所产生的胞外多糖不具有免疫激活活性、或该免疫激活活性低(包括评价为不具有该免疫激活活性的可能性高、或该免疫激活活性低的可能性高的情况)。由此,能够选拔产生具有免疫激活活性或免疫激活活性高的胞外多糖、或产生其的可能性高的乳酸菌。本发明的乳酸菌的评价方法中,作为成为评价对象的乳酸菌,没有特别限制,可适宜将所期望乳酸菌作为对象。
乳酸菌是否具有本发明的免疫激活活性提高DNA这一点,可通过检测该DNA而判断。作为免疫激活活性提高DNA的检测方法,可适宜地采用公知方法或根据其的方法。
例如,首先自评价对象的乳酸菌提取基因组DNA。作为基因组DNA的提取方法,没有特别限制,可采用公知方法或根据其的方法,例如可举出PCI法、GuSCN/Silica法、SDS苯酚法、CTAB法、碱处理法。另外,可适宜地使用市售的试剂盒。
作为上述免疫激活活性提高DNA的检测方法,接着分离对应于免疫激活活性提高DNA的DNA,确定经分离的DNA的核苷酸序列,从而可以实施。该DNA的分离,例如可如下进行:通过至少使用设计为夹住对应于上述免疫激活活性提高DNA的DNA的一对寡核苷酸引物且以基因组DNA为模板的PCR等而进行。经分离的DNA的核苷酸序列的确定可通过桑格法(Sanger method)及马克萨姆-吉尔伯特测序法(Maxam-Gilbert method)等本领域技术人员公知的方法而进行。另外,也可通过上述基因组DNA,使用下一代测序仪等直接确定对应于上述免疫激活活性提高DNA的DNA的核苷酸序列。
作为对应于上述免疫激活活性提高DNA的DNA,优选至少含有编码对应R1-EpsF的第334~338位的氨基酸的位点者,将此夹住的一对寡核苷酸引物可根据上述免疫激活活性提高DNA的核苷酸序列(例如R1-epsF)及公共数据库(Genbank等)而分别设计。本领域技术人员可以通过公知方法或根据其的方法而设计这种寡核苷酸。
作为上述免疫激活活性提高DNA的检测方法的其它方法,例如可举出PCR-SSP(PCR-序列特异性引物)法。该方法中,构成引物的一对寡核苷酸中,一方寡核苷酸的3’末端为上述免疫激活活性提高DNA的特定碱基,例如在检测的DNA为上述(a’)时,设计成与编码R1-EpsF的第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、及天冬氨酸的位点互补的碱基种类。通过使用这种设计的一对寡核苷酸引物的PCR,仅在以本发明的免疫激活活性提高DNA为模板的情况时进行扩增,以第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸的位点中任一者是编码其它氨基酸的基因组DNA为模板时不进行扩增。因此,可以以这种扩增的有无为指标来检测上述DNA。
另外,作为上述免疫激活活性提高DNA的检测方法的其它方法,在编码R1-EpsF的第334~338位或对应其的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、及天冬氨酸的位点上可设计限制性片段多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)时,可以以这些RFLP标记为指标,例如通过PCR-RFLP法(或CAPS[Cleaved Amplified PolymorphicSequence,酶切扩增多态性序列]法)等进行检测。
作为上述免疫激活活性提高DNA的检测方法的其它方法,例如可举出PCR-SSCP(PCR-单链高级结构多态性)法。对于通过使用设计成夹住上述免疫激活活性提高DNA的一对寡核苷酸引物的PCR扩增出的双链DNA,通过热或碱等处理而使其变性而成为单链DNA后,施行不含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,在凝胶中单链DNA会因分子内相互作用而折叠,形成高级结构。折叠结构的相互作用会根据碱基种类的不同而产生变化,因此利用银染色或放射性同位素而检测经分离的该单链DNA,以该单链DNA在凝胶上的移动度为指标,可检测上述免疫激活活性提高DNA。
作为上述免疫激活活性提高DNA的检测方法的其它方法,例如可举出使用嵌入剂(Intercalator)的方法。该方法中,首先在含有插入DNA双链间则发出荧光的嵌入剂的反应体系中,以上述基因组DNA为模板而扩增对应于上述免疫激活活性提高DNA的DNA。然后,改变反应体系的温度,检测嵌入剂所发出的荧光强度的变动,以随着检测温度变化的荧光强度变动为指标,可检测上述免疫激活活性提高DNA(特别是编码R1-EpsF的第334~338位或对应其的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、及天冬氨酸的位点)。作为这种方法,可举出高分辨率熔解曲线解析(HRM)法。
作为上述免疫激活活性提高DNA的检测方法的其它方法,例如可举出:要检测的DNA为上述(a’)时,使用与含有编码R1-EpsF的第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、及天冬氨酸位点的区域进行杂交的寡核苷酸探针的方法。在该方法的一个方式中,首先制备寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针能与编码上述第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、及天冬氨酸的位点特异性杂交且标记有报告荧光色素及淬灭剂荧光色素。接着,使该寡核苷酸探针与上述基因组DNA进行杂交,进一步以杂交有寡核苷酸探针的DNA试样为模板,扩增含有编码上述第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、及天冬氨酸的位点的DNA。然后检测荧光,所述荧光是随着扩增而寡核苷酸探针分解、淬灭剂的抑制被解除的报告荧光色素所发出的。作为这种方法,可举出双模探针法、所谓的TaqMan(注册商标)探针法。作为使用标记有报告荧光色素及淬灭剂荧光色素的寡核苷酸探针的另一方式,也可利用循环探针法,所述循环探针法使用与上述免疫激活活性提高DNA特异性杂交的嵌合体寡核苷酸(RNA与DNA的嵌合体)与RNase H等酶的组合。
作为上述免疫激活活性提高DNA的检测方法的其它方法,例如可举出LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification,环介导的等温扩增)法。在该方法中,于双链DNA的目标位点的两侧上设置各3个、总共6个区域,使用含有这些区域的4种(每侧各2种)引物,通过在链置换型酶的存在下进行反应,能够在上述目标位点的两侧生成环结构的扩增起点,接下来在同一链上生成彼此互补的序列重复结构并扩增上述目标位点。要检测的DNA为上述(a’)时,将上述目标位点设为编码R1-EpsF的第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、及天冬氨酸的位点时,通过测定扩增产物的核苷酸序列,可进行各改变存在或不存在的检测。另外,将上述6个区域中的1个设为编码上述第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、及天冬氨酸的位点时,当有改变时上述目标位点不会被扩增,因此可以以有无该扩增为指标来检测上述DNA。
上述免疫激活活性提高DNA的检测方法并非限定于上述方式。例如变性剂浓度梯度凝胶电泳法(DGGE法)、侵入法(Invader method)、焦磷酸测序法(Pyro-sequencingmethod)、单核苷酸引物延伸(SNuPE)法、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交法、核糖核酸酶A错配切断法、DNA微阵列法、DNA阵列法等其它公知技术也可利用于本发明中。
进而,作为上述免疫激活活性提高DNA的检测,优选检测其表达。作为上述拉丝性提高DNA的表达的检测方法,例如自对象的乳酸菌按照常规方法提取mRNA或蛋白,通过公知方法或根据其的方法检测该免疫激活活性提高DNA所编码的mRNA或蛋白(即免疫激活活性提高蛋白)而进行。
作为检测上述免疫激活活性提高DNA所编码的mRNA的方法,例如可举出RT-PCR法、RNA印迹法(Northern blotting法)。
作为检测上述免疫激活活性提高DNA所编码的蛋白(免疫激活活性提高蛋白)的方法,首先自对象乳酸菌制备蛋白试样,使用上述免疫激活活性提高蛋白特异性抗体、即至少对第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、及天冬氨酸具有特异性的抗体而进行抗原抗体反应,检测上述免疫激活活性提高蛋白。在这种使用抗体的蛋白检测法中,例如对于上述蛋白试样添加上述免疫激活活性提高蛋白特异性抗体而进行抗原抗体反应,检测上述抗体对免疫激活活性提高蛋白的结合。免疫激活活性提高蛋白特异性抗体经标记时,可直接检测免疫激活活性提高蛋白,未经标记时,可以进一步用识别该抗体的经标记的分子(例如二抗或蛋白A)进行作用,利用该分子的标记间接地检测免疫激活活性提高蛋白。作为这种方法,例如可利用免疫组织化学(免疫染色)法、免疫印迹法、ELISA法、流式细胞仪(Flow cytometry)、成像细胞仪(Imaging cytometry)、放射免疫分析(Radioimmunoassay)、免疫沉淀法、使用抗体阵列的解析法等。作为上述抗体,可为多克隆抗体也可为单克隆抗体,这些抗体的制备方法是本领域技术人员已知的。
[用于本发明的评价方法的试剂盒]
如上所述,通过检测本发明的免疫激活活性提高DNA,可评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性。因此,本发明提供一种用于上述评价方法且含有选自由下述(i)~(ii)的药剂组成的组中的至少一种药剂的试剂盒,
(i)含有可与本发明的免疫激活活性提高DNA、其转录产物或其互补核苷酸杂交的具有至少15个核苷酸的链长的寡核苷酸的药剂;及
(ii)含有与本发明的免疫激活活性提高蛋白结合的抗体的药剂。
作为上述寡核苷酸,根据上述免疫激活活性提高DNA的检测方法,可为引物的形态,也可为探针的形态。
作为上述引物,只要能够与本发明的免疫激活活性提高DNA或者对应于免疫激活活性提高DNA的DNA、或其互补核苷酸(包括cDNA、cRNA)、或免疫激活活性提高DNA的转录产物(mRNA)进行杂交而进行它们的扩增及检测即可,没有特别限定。作为上述引物,也可仅为DNA,另外也可为将其一部分或全部用交联化核酸等人工核酸(修饰核酸)进行置换而得者。作为上述引物的尺寸,若为至少约15核苷酸长以上者即可,优选15~100核苷酸长,更优选为18~50核苷酸长,进一步优选为20~40核苷酸长。这种引物可根据上述检测方法由本领域技术人员通过公知方法进行设计并制作。
作为上述探针,若为与免疫激活活性提高DNA或者对应于免疫激活活性提高DNA的DNA、或其互补核苷酸、或免疫激活活性提高DNA的转录产物进行杂交而可进行它们的检测者则没有特别限定。作为上述探针,可为DNA、RNA、人工核酸或它们的嵌合体分子等。作为上述探针,可为单链或双链中任一者。作为上述探针的尺寸,若为至少约15核苷酸长以上即可,优选15~1000核苷酸长,更优选为20~500核苷酸长,进一步优选为30~300核苷酸长。这种探针可以由本领域技术人员通过公知方法而设计并制作。另外,上述探针可如微阵列那样以固定于基板上的形态提供。
上述抗体只要能够与本发明的免疫激活活性提高蛋白特异性结合就没有特别限制。例如可为多克隆抗体、单克隆抗体中任一者,也可为抗体的功能性片段(Fab、Fab’、scFv等)。这种抗体可以由本领域技术人员通过公知方法而制作。另外,作为上述抗体,为了用于ELISA法或抗体阵列等,可以以固定于平板等基板上的形态提供。
另外,上述试剂盒所包含的寡核苷酸或抗体可根据上述检测方法而利用标记用物质进行标记。作为上述标记用物质,例如可举出FITC、FAM、DEAC、R6G、TexRed、Cy5等荧光物质、β-D-葡萄糖苷酶(Glucosidase)、荧光素酶、HRP等酶、3H、14C、32P、35S、123I等放射性同位素、生物素、链霉亲和素等亲和性物质、鲁米诺(luminol)、萤光素、光泽精(Lucigenin)等发光物质。
在本发明的乳酸菌的评价方法中,可进一步包括:确认上述乳酸菌的胞外多糖具有免疫激活活性或该免疫激活活性是否高的确认步骤。作为这种确认方法,没有特别限制,例如对于使用评价对象的乳酸菌而产生的胞外多糖类,与上述确认蛋白具有免疫激活活性提高作用的方法同样测定NK细胞活性,为21%以上者可评价为胞外多糖具有免疫激活活性,优选22%以上、进一步优选22.5%以上者可评价为胞外多糖的免疫激活活性高。
[乳酸菌的制造方法]
本发明的乳酸菌的制造方法为包括以下步骤的方法,该步骤为:通过上述本发明的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;和,
得到在上述评价步骤中被评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌的步骤。
本发明的乳酸菌的制造方法中,作为上述评价步骤,可举出上述<乳酸菌的评价方法>的评价步骤。通过本发明的乳酸菌的制造方法的评价步骤,由此可选出产生具有免疫激活活性或免疫激活活性高的胞外多糖、或产生其的可能性高的乳酸菌。通过本发明的乳酸菌的制造方法可得到在上述评价步骤中被评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌(包括被评价为具有免疫激活活性或免疫激活活性高的可能性高者),但是,例如通过将选出的乳酸菌在适当培养基中进行培养,也可以以其培养物形式得到上述乳酸菌。
另外,作为以本发明的乳酸菌的制造方法所得的乳酸菌的形态,可为该培养物等乳酸菌组合物的形态。因此,在本发明的乳酸菌的制造方法中,还包括包含下述步骤的乳酸菌组合物的制造方法,所述步骤为得到含有通过上述评价步骤而评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌的乳酸菌组合物的步骤。作为上述乳酸菌组合物中的除上述乳酸菌以外的可含有的其它成分,如上述所示。
<发酵乳的制造方法>
本发明的发酵乳的制造方法包括:向含有原料乳的调制乳液体中添加乳酸菌或乳酸菌组合物而使其发酵,得到包含胞外多糖的发酵物的发酵步骤。
本发明的发酵乳的制造方法中的乳酸菌包括上述的本发明的乳酸菌(即导入了选自由免疫激活活性提高蛋白、免疫激活活性提高DNA及含有免疫激活活性提高DNA的本发明的载体组成的组中的至少1种的乳酸菌;具有免疫激活活性提高DNA的乳酸菌;通过本发明的乳酸菌的评价方法评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌(包括被评价为具有免疫激活活性或免疫激活活性高的可能性高者);通过本发明的乳酸菌的制造方法得到的乳酸菌),可单独使用它们中的1种也可组合2种以上。另外,本发明的发酵乳的制造方法中的乳酸菌组合物包括:上述本发明的乳酸菌组合物;及通过本发明的乳酸菌的制造方法所得的乳酸菌组合物,它们可为单独1种,也可为2种以上的组合。通过使用这些乳酸菌或乳酸菌组合物,可得到含有具有免疫激活活性或免疫激活活性高的胞外多糖的发酵乳。进而,使用通过本发明的乳酸菌的评价方法评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌作为上述乳酸菌时,作为本发明的发酵乳的制造方法,也可包括上述评价步骤,但作为此时的该评价步骤,仅为最初的1次即可。
对于本发明的发酵乳的制造方法,也可进一步组合使用上述本发明的乳酸菌以外的其它乳酸菌。另外,也可进一步添加酵母。作为上述其它乳酸菌及酵母,可举出以往包含于发酵乳的公知的乳酸菌或酵母。
(调制乳液体)
本发明的调制乳液体含有原料乳。作为上述原料乳,以含有乳糖者为优选,例如可举出鲜乳(例如牛、水牛、绵羊、山羊等的乳)、杀菌乳、全脂乳、脱脂乳、乳清及它们的加工品(例如全脂奶粉、全脂浓缩乳、脱脂奶粉、脱脂浓缩乳、炼乳、乳清粉、酪乳、牛油、奶油、干酪、乳清蛋白浓缩物(WPC)、分离乳清蛋白(WPI)、α-乳清蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg)),可以为这些中的一种,也可为2种以上的混合物。
作为本发明的调制乳液体,可仅由上述原料乳构成,也可以为上述原料乳的水溶液、稀释液或浓缩液,也可以除了上述原料乳以外根据需要进一步含有其它成分。作为这种其它成分,可举出水;豆乳、砂糖为主的糖类或甜味料、香料、果汁、果肉、维生素、矿物质、油脂、神经酰胺、胶原、牛奶磷脂质、酵母提取物、多酚等食品、食品成分、食品添加物;果胶、大豆多糖类、CMC(羧甲基纤维素)、琼脂、明胶、角叉菜胶、胶类等稳定化剂、增稠剂、凝胶化剂,可以为这些中的一种,也可为2种以上的混合物。上述调制乳液体根据需要可一边加温和/或根据需要一边使其均质化,一边通过混合上述成分而制备。另外,作为上述调制乳液体,可使用经加热杀菌者。
(发酵)
作为向上述调制乳液体中添加上述乳酸菌或乳酸菌组合物而使其发酵、得到发酵物的发酵步骤,可适宜地采用公知方法或根据其的方法,没有特别限制,例如可举出向上述调制乳液体中接种上述乳酸菌或乳酸菌组合物作为发酵剂并使其发酵的方法。作为上述乳酸菌或乳酸菌组合物,可以以上述乳酸菌组合物的形态、优选培养物或培养物的浓缩物的形态添加于上述调制乳液体中。
上述发酵剂的添加量可根据在公知发酵乳的制造方法中所采用的添加量而适宜地设定,例如相对于上述调制乳液体的体积,以乳酸菌数(2种以上的组合时为它们合计菌数)换算优选1×107~5×109CFU/mL,更优选1×108~2×109CFU/mL。另外,相对于上述调制乳液体的体积,优选0.1~2%(wt/wt),更优选0.5~1.5%(wt/wt),进一步优选0.5~1%(wt/wt)。
上述发酵剂的接种方法没有特别限制,可适宜地使用在发酵乳的制造方法中惯用的方法。作为上述发酵的条件,可根据所添加的乳酸菌的生育条件、上述调制乳液体的量等而适宜地选择,没有特别限制,例如优选:在温度35~45℃、更优选温度38~43℃下,在有氧或厌氧条件下静置或搅拌(优选为静置)通常3~24小时、更优选为3~8小时、进一步优选为4~6小时,直至添加上述乳酸菌或乳酸菌组合物的调制乳液体的pH为4.8以下,更优选为4.0~4.6。另外,作为上述厌氧条件,例如可采用通入氮气条件下的发酵。
通过上述发酵,可得到本发明的发酵乳。上述发酵步骤后的发酵物(即,上述发酵步骤后的调制乳液体及乳酸菌或乳酸菌组合物)可直接或根据需要通过浓缩、稀释、干燥或者冷冻等制成本发明的发酵乳。另外,也可将上述发酵物中的乳酸菌破碎或者进行加热处理等、或根据需要将起浓缩、稀释、干燥或者冷冻等而制成本发明的发酵乳。
<发酵乳>
作为本发明的发酵乳,提供含有选自由上述的本发明的乳酸菌(即导入了选自由免疫激活活性提高蛋白、免疫激活活性提高DNA及含有免疫激活活性提高DNA的本发明的载体组成的组中的至少1种的乳酸菌;具有免疫激活活性提高DNA的乳酸菌;通过本发明的乳酸菌的评价方法评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌(包括评价为具有免疫激活活性或免疫激活活性高的可能性高者);由通过本发明的乳酸菌的制造方法得到的乳酸菌)组成的组中的至少1种乳酸菌的发酵乳。作为本发明的发酵乳,优选含有来自这些乳酸菌的免疫激活活性提高蛋白,更优选含有来自这些乳酸菌的胞外多糖。另外,作为本发明的发酵乳,也可进一步含有此外的其它乳酸菌及酵母。
作为本发明的发酵乳,没有特别限定,例如可以为符合日本厚生劳动省的乳及乳制品的成分标准等的条例(乳等条例)中的“发酵乳”的标准的发酵乳(更具体为非脂乳固体成分的含量为8.0%以上,乳酸菌数或酵母数(优选为乳酸菌数)为1000万/mL以上者)、符合“乳制品乳酸菌饮料”的标准者(更具体为非脂乳固体成分的含量为3.0%以上,乳酸菌数或酵母数(优选为乳酸菌数)为1000万/mL以上者)、符合“乳酸菌饮料”的标准者(更具体为非脂乳固体成分的含量未达3.0%,乳酸菌数或酵母数(优选为乳酸菌数)为100万/mL以上者)中的任一者。进而,所谓上述非脂乳固体成分,表示从总乳固体成分减去脂肪部分而得的剩余成分(主要为蛋白、乳糖及矿物质等),上述乳酸菌及酵母数在杀菌前通过上述乳等条例所规定的检査法进行测定。
作为本发明的发酵乳,可为上述发酵步骤后的发酵物、或者也可为上述发酵物经杀菌处理者、或也可为将它们经浓缩、稀释、干燥或者冷冻等者,例如作为上述发酵乳,可为将上述发酵乳、乳制品乳酸菌饮料或乳酸菌饮料进行杀菌处理者,此时上述乳酸菌数为活菌数换算。本发明的发酵乳所含的乳酸菌中,除活菌以外,也含有死菌,且也含有乳酸菌的破碎物及加热处理物、它们的浓缩物、粗纯化物、纯化物、稀释物、干燥物(喷雾干燥物、冷冻干燥物等)、冷冻物,作为本发明的发酵乳所含的乳酸菌,优选至少含有活菌。
作为本发明的发酵乳,可以在不妨碍本发明的效果的范围内进一步含有上述其它乳酸菌或酵母作为乳酸菌。另外,作为本发明的发酵乳,另外可进一步含有可含于饮食品的各种成分。作为这种成分,没有特别限制,例如可举出水、糖类、糖醇类、矿物质类、维生素类、蛋白、肽、氨基酸类、有机酸、pH调整剂、淀粉及改性淀粉、食物纤维、果实·蔬菜及其加工品、动物及植物生药提取物、来自天然的高分子(胶原、玻尿酸、软骨素等)、油脂、增稠剂、乳化剂、溶剂、表面活性剂、凝胶化剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮化剂、粘稠剂、赋形剂、崩解剂、结合剂、流动化剂、保存料、着色料、香料、矫味剂、甜味剂等,可含有这些中的单独1种,也可组合含有2种以上。
作为这种发酵乳,优选酸奶、干酪、发酵奶油、发酵牛油等,特别优选为酸奶。作为上述酸奶,具体可举出原味酸奶等固体型酸奶(固体状发酵乳)、软型酸奶(糊状发酵乳)及饮料型酸奶(液状发酵乳),也可为将它们作为材料使用的冷冻酸奶。另外,本发明的发酵乳也可作为干酪、发酵奶油、发酵牛油、开菲尔酸奶(Kefir)等发酵食品的材料使用。
本发明的发酵乳可通过上述本发明的发酵乳的制造方法而得到,由于含有上述具有免疫激活活性或免疫激活活性高的胞外多糖而可作为提高免疫激活活性的发酵乳。
<胞外多糖的制造方法>
本发明也提供乳酸菌的胞外多糖的制造方法,其包括下述步骤:向含有葡萄糖和/或以葡萄糖为构成糖的糖的培养基中,添加上述本发明的乳酸菌或乳酸菌组合物进行发酵,采集发酵物所含的胞外多糖。
作为上述培养基,必须含有选自葡萄糖及将葡萄糖作为构成糖的糖中的至少1种糖。作为将葡萄糖作为构成糖的糖,例如可举出二糖(麦芽糖、蔗糖、乳糖等)、寡聚糖(低聚半乳糖、低聚果糖、低聚甘露糖等)及多糖(淀粉(直链淀粉、支链淀粉)、糖原(glycogen)等)。作为包含于上述培养基的糖,可为上述糖中的仅1种,也可为2种以上的组合,其中优选含有乳糖。另外,作为包含于上述培养基的糖,例如可使用包含于上述原料乳者,作为上述培养基,优选含有上述原料乳者,更优选含有上述原料乳的上述调制乳液体,另外作为上述原料乳,优选脱脂奶粉。
作为上述乳酸菌及乳酸菌组合物、以及发酵的方法,包括其优选方式在内,除了使用上述培养基作为上述调制乳液体以外均与上述发酵乳的制造方法中的发酵步骤相同。作为自上述发酵乳采集上述胞外多糖的方法,没有特别限制,可适宜地采用过去公知的方法或根据其的方法,例如可列举下述方法:对于发酵后的发酵物,根据需要通过添加蛋白变性剂(三氯乙酸等)或进行加热处理而进行除蛋白,由此制成粗纯化物,然后例如单独使用盐析法、有机溶剂沉淀法、膜分离法、色谱分离方法或将这些方法中的2种以上组合而进行纯化。
<免疫激活剂及其制造方法>
另外,本发明也提供含有胞外多糖作为有效成分的免疫激活剂,所述胞外多糖来自选自由上述本发明的乳酸菌(即导入了选自由免疫激活活性提高蛋白、免疫激活活性提高DNA及含有免疫激活活性提高DNA的本发明的载体组成的组中的至少1种的乳酸菌;具有免疫激活活性提高DNA的乳酸菌;通过本发明的乳酸菌的评价方法评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌(包括评价为具有免疫激活活性或免疫激活活性高的可能性高者);通过本发明的乳酸菌的制造方法得到的乳酸菌)组成的组中的至少1种乳酸菌。上述来自乳酸菌的胞外多糖是:通过上述胞外多糖的制造方法将上述本发明的乳酸菌或乳酸菌组合物添加于上述培养基而进行发酵时产生于菌体外者,包含于上述发酵后的发酵物中。
本发明的免疫激活剂可对于对象、例如人类或非人类动物(优选为哺乳动物)以经口或非经口中任一途径进行给予。由此,主要提高上述对象的NK细胞活性,而可能有助于流感等感染的预防、癌的预防或进展的抑制。因此,本发明也提供一种免疫激活方法,其包括向对象给予上述胞外多糖的步骤,优选为NK细胞活性提高方法。进而,本发明中,经口给予也包括饮食品组合物或饲料组合物的摄取。
本发明的免疫激活剂可直接为上述发酵后的发酵物,也可为上述发酵物的浓缩物、粗纯化物、纯化物、糊化物、干燥物(喷雾干燥物、冷冻干燥物等)、造粒物、粉碎物、分散于介质的液状物及组合这些中的2种以上的处理物,另外也可仅包含通过上述胞外多糖的制造方法得到的胞外多糖。进而,根据给予的目的、对象、方法、用量等,例如可为药品组合物、准药品组合物、饮食品组合物、饲料组合物等。
作为上述药品组合物及准药品组合物,例如可为制剂,其形态没有特别限定,例如可举出片剂、丸剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固体剂;一般液剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂等液剂;凝胶剂;注射剂或点滴剂;经管给予剂或经鼻管给予剂;栓剂。上述制剂例如可如下制造:向上述胞外多糖中添加如溶剂、分散剂、乳化剂、增稠剂、凝胶化剂、表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、保存料、赋形剂、结合剂、崩解剂、溶解助剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、甜味剂、涂布剂、香料之类的制剂助剂中的1种或2种以上,通过公知方法或根据其的方法而制造。
作为上述饮食品组合物的形态,没有特别限定,例如可举出如棒状的固体状、如饮料或流食的液状、糊状、半液体状、凝胶状(胶状)、凝胶状油脂(半固体状油脂)、粉末状的形态。作为这种饮食品组合物的例子,没有特别限制,例如可举出上述本发明的发酵乳(含有乳酸菌饮料、酸奶等)、或饮料(茶类、碳酸饮料、可亚、咖啡、豆乳饮料、果汁·蔬菜汁饮料、清凉饮料、营养饮料、酒精饮料等)、加工食品(巧克力、胶、软糖、果冻、烤点心(面包、蛋糕、曲奇饼、饼干等)、糖果等)、乳制品(制备奶粉(粉末牛奶)、调整乳、乳饮料、冰淇淋、人造奶油、炼乳等)、调味料(调味酱、汤、色拉酱、美乃滋、美乃滋型调味料、奶油等)、补充剂、食用油、功能性食用油脂等。关于这种饮食品组合物,例如在为本发明的发酵乳的情况时可通过上述发酵乳的制造方法;于现有饮食品中添加上述发酵物或胞外多糖的方法;在上述饮食品的制造过程中添加上述发酵物或胞外多糖的方法等而制造。
作为上述饮食品组合物,此外可以在不会妨碍本发明的效果的范围内进一步含有可于饮食品中含有的各种成分。作为这种成分,没有特别限制,例如可举出上述<发酵乳>中所举出的各种成分、上述药品组合物及准药品组合物所举出的制剂助剂,可以适当量含有它们中的1种或组合2种以上。
作为上述饲料组合物,可举出根据赋予饲料组合物的目的、对象、方法、用量等而适宜地改变上述饮食品组合物。
对于本发明的免疫激活剂,有效成分的胞外多糖的含量(若为2种以上的混合物时则为它们的合计量)可根据剂型、给予量等而适宜确定,因此无法一概而论,相对于免疫激活剂整体而言,优选0.001~90质量%,更优选0.002~50质量%,进一步优选0.003~10质量%,进一步更优选0.01~5质量%,还优选0.1~1质量%或0.003~1质量%。
另外,本发明的免疫激活剂的给予量可考虑对象种类、年龄、体重、性别、治疗目的等而根据个体情况适宜确定,因此无法一概而论,通常以有效成分的胞外多糖的量(若为2种以上混合物时其为它们的合计量)计,作为成人每1天的下限值,例如可设定为0.01mg/kg,优选为0.02mg/kg,更优选为0.05mg/kg。另外,作为上述给予量的上限值,没有特别限制,成人每1天例如可为1g/kg。
<发酵乳的免疫激活活性提高方法>
本发明的发酵乳的免疫激活活性提高方法包括:向含有原料乳的调制乳液体中添加本发明的乳酸菌或乳酸菌组合物而使其发酵,得到含有胞外多糖的发酵物的发酵步骤。由此,可得到含有免疫激活活性提高的胞外多糖的发酵乳,可提高该发酵乳的免疫激活活性。作为上述乳酸菌、乳酸菌组合物及发酵步骤,分别如上述本发明的发酵乳的制造方法所述。
本发明中,发酵乳的免疫激活活性优异例如是指:对于由评价对象的发酵乳通过常规方法而纯化的胞外多糖类,与上述确认蛋白具有免疫激活活性提高作用的方法同样地测得的NK细胞活性为21%以上、优选为22%以上、更优选为22.5%以上者为免疫激活活性优异。另外,发酵乳的免疫激活活性提高例如可如下确认:对于由评价对象的发酵乳通过常规方法而纯化的胞外多糖类,与上述确认蛋白具有免疫激活活性提高作用的方法同样地测得的NK细胞活性成为1.03以上、优选1.05以上、更优选1.10以上,其中,将对于使用连1种上述(a’)~(d’)的DNA也不具有的乳酸菌同样得到的发酵乳纯化而得的胞外多糖类测得的NK细胞活性设为1。
[实施例]
以下根据实施例更具体地说明本发明,但本发明并非受限于以下实施例。
<乳酸菌>
用于以下试验的乳酸菌如以下所示。
R-1株:德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1(保藏编号:FERM BP-10741)
2038株:德氏乳杆菌保加利亚亚种2038
另外,2038株是将明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治制)的稀释液涂抹于BCP加琼脂培养基并在37℃进行48小时培养后,挑取粗糙型菌落而分离出的菌株,2038株的全长基因组以登记号码:T01957登记于以分子间的相互作用·反应、关系网络整合了基因组、蛋白、化合物的信息的生命系统信息综合数据库-京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)。
<免疫激活活性评价>
(1)胞外多糖的制备
(发酵乳的制备)
对由脱脂奶粉10%(wt/wt)、酵母提取物0.1%(wt/wt)及蒸馏水制备的10%脱脂奶粉培养基接种R-1株至1%(wt/wt),在37℃且在厌氧条件下使其发酵一整夜,从而得到发酵乳。另外,除了使用2038株代替R-1株以外,在相同条件下得到发酵乳。
(胞外多糖的纯化)
向上述所得的各发酵乳中,加入三氯乙酸至终浓度为10质量%,除去所生成的变性蛋白而得到粗纯化物。向所得的粗纯化物中加入与其等量的冷乙醇,在4℃静置16小时,进行乙醇沉淀,得到含有胞外多糖(EPS)的沉淀物1。将所得的沉淀物1使用透析膜(截留分子量:6~8kDa)对于MilliQ水进行透析,将核酸及残蛋白进行酶解后,再度进行乙醇沉淀得到沉淀物2。将所得的沉淀物2溶解于MilliQ水,再度进行透析后,使其冷冻干燥,得到各纯化胞外多糖。将自使用R-1株所得的发酵乳纯化而得的纯化胞外多糖设为“R-1株EPS”,将自使用2038株所得的发酵乳纯化而得的纯化胞外多糖设为“2038株EPS”。
(2)NK细胞活性评价
对于上述(1)所得的各纯化胞外多糖,测定作为免疫激活活性评价的NK细胞活性。即,首先将BALB/c母小鼠(7周龄,Japan Claire株式会社)计20只分为2组,将一组作为R-1株EPS给予小鼠组(n=10),另一组作为2038株EPS给予小鼠组(n=10)。对于两组,均以100μg/小鼠/1天的给予量给予各纯化胞外多糖,进行3周的经口给予。给予期间结束后,摘出各小鼠的脾脏,得到各脾脏细胞。
接着,对于各脾脏细胞,根据竹田等的方法(Takeda,K.et al.,J.Immunol.,156:3366,1996),以铬释放法测定NK细胞活性。即,将效应细胞设为各脾脏细胞,将靶细胞设为以51Cr标记的YAC-1细胞(小鼠淋巴瘤),将E/T比(效应细胞数/靶细胞数)设定在200:1而进行4小时培养后,测定培养基上清液及全部培养基的放射能,将上清液的放射能在全部培养基的放射能中所占的比例作为NK细胞活性(NK活性(%))。结果如图1所示。如图1所示,与给予2038株EPS的小鼠相比,对于给予R-1株EPS的小鼠确认到显著高的NK细胞活性,确认R-1株EPS具有比2038株EPS更高的免疫激活活性。
<EPS基因簇区域的比较>
从注册于KEGG的2038株基因组的核苷酸序列中,对于2个EPS基因簇区域:LBU1598-LBU1588(EPS基因簇1)及LBU1630-LBU1618(EPS基因簇2),各提取-100bp~+100bp的区域。另外,R-1株的全长基因组通过下一代测序仪MiSeq(Illumina公司制)取得。使用Genetyx Ver.13(Genetics株式会社制)的Homology/Local BLASTN,从R-1株的基因组中提取与上述2个EPS基因簇区域同源的核苷酸序列(E值阈值(E-value threshold)=0.00001,字符串长度(word size)=11)。
在2038株基因组及R-1株基因组这两者中,EPS基因簇1、2高度保守。特别地,EPS基因簇1的整个区域(11569bp)内,2038株的核苷酸序列与R-1株的核苷酸序列完全一致。另一方面,在EPS基因簇2的情况下,在15769bp中,在epsC基因与epsF基因、以及epsM基因与转座酶基因之间的2处基因间区域中,确认到合计4碱基的差异。考虑到epsC基因并非糖转移相关基因,另外基因间区域中的变异与任一基因无关,因此推测,糖转移相关基因即epsF基因中的碱基差异及与此相伴随的氨基酸组成差异导致了R-1株所产生的胞外多糖与2038株所产生的胞外多糖的免疫激活活性的差异。表1示出2038株基因组与R-1株基因组之间确认到差异的epsF基因的碱基、包含该碱基的密码子、该密码子编码的氨基酸及该氨基酸在基因中的位置。另外,对于epsF基因,因该碱基差异而引起移框,因此在下述表2中示出包括了2038株基因组与R-1株基因组之间确认到差异的碱基在内的密码子及其下游的核苷酸序列及它们所编码的氨基酸序列。另外,将表2中记载的2038株基因组的核苷酸序列示于序列号3、氨基酸序列示于序列号4,将R-1株基因组的核苷酸序列示于序列号5、氨基酸序列示于序列号6。
表1
Figure BDA0004173803650000401
表2
核苷酸序列(5’-3’) 氨基酸序列(N-C)
2038 GGGCTCGCTATTCTCTGA GLAIL
R-1 GG-CTCGCTATTCTCTGATTGA GSLFSD
如表1所示,2038株基因组与R-1株基因组的差异是,2038株基因组的epsF基因的第999个碱基的鸟嘌呤(G)在R-1株基因组中缺失(del)。由此,在R-1株基因组中产生移框,密码子的阅读框(reading frame)移位,但含有该碱基的密码子所指定的氨基酸在2038株基因组及R-1株基因组中皆为第333位甘氨酸(G)。然而,如表2所示,通过移框,自甘氨酸至C末端的氨基酸序列在两株间不同,在2038株基因组中,其为N末端-Gly-Leu-Ala-Ile-Leu-C末端,但在R-1株基因组中,其为N末端-Gly-Ser-Leu-Phe-Ser-Asp-C末端。根据这些结果可以说,对于乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用而言,重要的是R-1株的epsF基因所编码的蛋白的第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸。
产业上可利用性
如以上说明,根据本发明可提供具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的新颖蛋白,以及含有具有优异免疫激活活性的胞外多糖的发酵乳及其制造方法。更详细而言,提供具有在乳酸菌表达时所产生的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的新颖蛋白、编码上述蛋白的DNA、含有上述DNA的载体、含有上述DNA或上述载体的乳酸菌及其乳酸菌组合物,以及使用它们的发酵乳、免疫激活剂及它们的制造方法、提高发酵乳的免疫激活活性的方法、乳酸菌的评价方法。
例如通过将编码本发明的新颖蛋白的DNA导入于各种乳酸菌中,利用该乳酸菌,可容易制造出免疫激活活性优异的胞外多糖及含有其的发酵乳或免疫激活剂。另外,将编码本发明的新颖蛋白的DNA的序列作为选拔基准时,可容易地选出可制造免疫激活活性优异的胞外多糖及含有其的发酵乳或免疫激活剂的乳酸菌。
序列表
<110> 株式会社明治(Meiji Co., Ltd.)
<120> 具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白、以及使用其的发酵乳及其制造方法
<130> IBPF21-535WO
<150> JP2020-172078
<151> 2020-10-12
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 338
<212> PRT
<213> 德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)
<400> 1
Met Ile Thr Gly Leu Gly Ile Leu Met Lys Glu Asn Ser Lys Pro Arg
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Phe Val Glu Ala Met Gly Gly Gly Val Phe Thr Tyr Ile
20 25 30
Val Asp Leu Ala Asn Ser Leu Val Asp Asp Trp Asp Val Tyr Ile Gly
35 40 45
Tyr Ala Val Arg Asn Gln Thr Pro Gln Asn Tyr Arg Asp Tyr Phe Asp
50 55 60
Glu Arg Val His Leu Ile Glu Val Lys Asp Phe Ala Arg Ser Thr Ser
65 70 75 80
Ile Met Lys Ala Ile Lys Ala Gly Gln Glu Met Lys Arg Ile Ala Lys
85 90 95
Ala Ile Arg Pro Asp Val Ile His Leu His Ser Ser Ile Ala Gly Ala
100 105 110
Ile Gly Arg Val Val Phe Asn Thr Lys Lys Thr Pro Val Phe Tyr Thr
115 120 125
Pro His Gly Tyr Ser Phe Leu Met Gln Gly Glu Ser Ser Lys Lys Arg
130 135 140
Leu Ala Tyr Lys Leu Val Glu Gln Phe Cys Gly Lys Ser Gln Ala Thr
145 150 155 160
Thr Ile Ala Cys Ser Pro Gly Glu Tyr Gln Glu Ala Leu Lys Val Ser
165 170 175
Lys His Ala Val Glu Val Asp Asn Gly Ile Asn Ile Glu Gln Leu Gln
180 185 190
Glu Leu Ile Asp Thr Thr Asp Ala Ser Lys Ile Asp His Tyr Asp Val
195 200 205
Phe Thr Leu Gly Arg Ile Ser Val Gln Lys Asn Pro Asn Val Phe Asn
210 215 220
Glu Val Ala Leu Lys Leu Pro Asn Leu Lys Phe Leu Trp Ile Gly Asp
225 230 235 240
Gly Glu Leu Arg Ser Glu Leu Thr Ala Pro Asn Ile Thr Val Thr Gly
245 250 255
Trp Leu Thr Arg His Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Leu Asn Ser Asp Thr
260 265 270
Phe Met Leu Thr Ser Leu Trp Glu Gly Leu Pro Met Ser Leu Leu Glu
275 280 285
Ala Met Tyr Met Lys Lys Leu Cys Val Val Ser Asp Val Ile Gly Asn
290 295 300
His Asp Val Ile Asn Asp Gly Val Asn Gly Tyr Val Cys Gln Thr Val
305 310 315 320
Asn Val Phe Tyr Asn Arg Ile Ser Met Ile Gly Gly Gly Ser Leu Phe
325 330 335
Ser Asp
<210> 2
<211> 1017
<212> DNA
<213> 德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)
<400> 2
atgattacag ggttaggcat attaatgaaa gaaaacagta aacctcgcct gctctacttc 60
gtcgaagcga tgggcggcgg ggtttttaca tatattgttg atctagcaaa tagcctagtg 120
gatgattggg atgtctatat tggttatgct gtgcgcaatc aaacgcctca gaattatcga 180
gactattttg atgagcgggt acatctgatc gaggttaaag attttgctcg tagtactagc 240
atcatgaaag caatcaaagc aggacaagag atgaaaagga tagcaaaggc tattcggcca 300
gacgttattc atctacattc tagtattgcg ggtgcaattg gacgtgttgt ctttaataca 360
aagaaaacgc cggtctttta tactccacat ggttacagct tcttaatgca aggcgagagt 420
agcaagaaac gcttggcgta taagttggtt gagcagtttt gcggcaagag ccaagcaacg 480
accattgcat gtagccctgg tgagtatcaa gaagctttaa aagtctctaa acatgccgtg 540
gaagttgata atggtatcaa cattgaacaa ttgcaagaat tgatagacac gacggacgct 600
tcgaagattg atcattatga tgtttttaca ctggggcgta tctcagtaca gaagaatcca 660
aatgttttca atgaggtcgc attgaagttg ccgaatttaa aatttttgtg gattggcgat 720
ggtgaattac gttcagagct aactgctccg aatattactg ttaccggttg gttaacgcgt 780
catgaggcgt taaagtactc acttaatagt gatactttta tgcttacctc actgtgggaa 840
gggttaccga tgagcttgtt ggaagcaatg tacatgaaga aattatgtgt ggtcagcgat 900
gtcatcggta accatgatgt aatcaatgat ggtgttaatg ggtatgtatg tcagaccgtt 960
aatgtttttt ataatagaat atcaatgatc ggggggggct cgctattctc tgattga 1017
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)
<400> 3
gggctcgcta ttctctga 18
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)
<400> 4
Gly Leu Ala Ile Leu
1 5
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)
<400> 5
ggctcgctat tctctgattg a 21
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)
<400> 6
Gly Ser Leu Phe Ser Asp
1 5

Claims (21)

1.选自由下述(a)~(d)的蛋白组成的组中的至少1种蛋白,
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白;
(b)由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;
(c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;
(d)由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白。
2.一种DNA,其编码权利要求1所述的蛋白。
3.一种载体,其含有权利要求2所述的DNA。
4.一种组合物,其含有选自由权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的DNA及权利要求3所述的载体组成的组中的至少1种。
5.一种乳酸菌,其导入了选自由权利要求2所述的DNA及权利要求3所述的载体组成的组中的至少1种。
6.一种乳酸菌,其具有权利要求2所述的DNA。
7.根据权利要求6所述的乳酸菌,其胞外多糖的免疫激活活性高。
8.一种乳酸菌组合物,其含有权利要求5~7中任一项所述的乳酸菌。
9.根据权利要求8所述的乳酸菌组合物,其为发酵乳。
10.根据权利要求8或9所述的乳酸菌组合物,其含有来自权利要求5~7中任一项所述的乳酸菌的胞外多糖。
11.一种发酵乳的制造方法,其包括:向含有原料乳的调制乳液体中添加权利要求5~7中任一项所述的乳酸菌、或权利要求8~10中任一项所述的乳酸菌组合物而使其发酵,得到包含胞外多糖的发酵物的发酵步骤。
12.一种提高发酵乳的免疫激活活性的方法,其包括:向含有原料乳的调制乳液体中添加权利要求5~7中任一项所述的乳酸菌、或权利要求8~10中任一项所述的乳酸菌组合物而使其发酵,得到包含胞外多糖的发酵物的发酵步骤。
13.一种乳酸菌的评价方法,其以选自由编码下述(a)~(d)中的任意蛋白的DNA组成的组中的至少1种DNA为指标来评价胞外多糖的免疫激活活性,
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白;
(b)由序列号1所示的氨基酸序列中除第334~338位的丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸以外的氨基酸中的1或多个发生了置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列构成,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;
(c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白;
(d)由在严谨条件下与序列号2所示的核苷酸序列所构成的DNA的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成,与序列号1所示的氨基酸序列的第334~338位对应的氨基酸自N末端侧起为丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸及天冬氨酸,且具有乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性提高作用的蛋白。
14.一种乳酸菌的制造方法,其包括:
通过权利要求13所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;和
得到在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌的步骤。
15.一种发酵乳的制造方法,其包括:
通过权利要求13所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;和
向含有原料乳的调制乳液体中,添加在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌而使其发酵,得到包含胞外多糖的发酵物的发酵步骤。
16.一种提高发酵乳的免疫激活活性的方法,其包括:
通过权利要求13所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;和
向含有原料乳的调制乳液体中,添加在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌而使其发酵,得到包含胞外多糖的发酵物的发酵步骤。
17.一种免疫激活剂,其含有来自权利要求5~7中任一项所述的乳酸菌的胞外多糖作为有效成分。
18.一种乳酸菌的胞外多糖的制造方法,其包括下述步骤:
向含有葡萄糖和/或以葡萄糖为构成糖的糖的培养基中,添加权利要求5~7中任一项所述的乳酸菌或权利要求8~10中任一项所述的乳酸菌组合物而使其发酵,采集发酵物所含的胞外多糖。
19.一种乳酸菌的胞外多糖的制造方法,其包括:
通过权利要求13所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;和
向含有葡萄糖和/或以葡萄糖为构成糖的糖的培养基中,添加在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌而使其发酵,并采集发酵物所含的胞外多糖的步骤。
20.一种免疫激活剂的制造方法,其包括:
向含有葡萄糖和/或以葡萄糖为构成糖的糖的培养基中,添加权利要求5~7中任一项所述的乳酸菌或权利要求8~10中任一项所述的乳酸菌组合物而使其发酵,得到含有胞外多糖的发酵物的发酵步骤;和
得到含有所述胞外多糖作为有效成分的免疫激活剂的步骤。
21.一种免疫激活剂的制造方法,其包括:
通过权利要求13所述的乳酸菌的评价方法评价乳酸菌的胞外多糖的免疫激活活性的评价步骤;
向含有葡萄糖和/或以葡萄糖为构成糖的糖的培养基中,添加在所述评价步骤中评价为胞外多糖具有免疫激活活性或胞外多糖的免疫激活活性高的乳酸菌而使其发酵,得到含有胞外多糖的发酵物的发酵步骤;和
得到含有所述胞外多糖作为有效成分的免疫激活剂的步骤。
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