JP4440999B2 - Micrococcus varians 由来のバクテリオシン - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明はバクテリオシン、このバクテリオシンを産生する菌株、このバクテリオシンの産生方法およびこのバクテリオシンおよび/またはこのバクテリオシンを産生する菌株の食品および香粧品における使用に関する。
【0002】
【従来の技術】
バクテリオシンは多数のグラム陽性菌およびグラム陰性菌から単離されている。バクテリオシンは事実上本質的にタン白性で、殺菌効果を有する分子であり、このためバクテリオシンはこれを産生する細菌と1種以上の異る細菌種間に拮抗反応を起こさせる。さらに、バクテリオシンの阻害スペクトルはしばしばこれを産生する細菌種に密接に関連する種に限定される。
【0003】
特に、バクテリオシンは乳酸菌において実証された。例えば、EP0643136号明細書(ネスレ社)はStreptococcus thermophilus由来の2種のバクテリオシンの識別を記載する。同様に、バクテリオシンはLactococcus lactisから単離されている(App.andEnv.Microbio.58,279〜284,1992;J.of Bio.Chem.268,16361〜16368,1993)。
【0004】
しかし、現在までMicrococcus varians由来のバクテリオシンは未知である。Micrococcus variansは現在食品分野で、特に例えばサラミソーセージやソーセージのような調整品を製造する目的で肉の発酵に多く使用される。従って、病原性作因と闘うためにバクテリオシン生産菌株を利用することはきわめて有用である。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はこの要求に応答することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
このため、本発明のバクテリオシンはMicrococcus varians由来のもので、このバクテリオシンはアミノ酸配列SEQ ID NO:1または1〜4のアミノ酸のうち1個の置換、1個の欠失および/または1個の挿入により配列SEQ ID NO:1と異る任意のアミノ酸配列を示す。
【0007】
さらに、このバクテリオシンをコードする任意のヌクレオチドフラグメント、特に配列SEQ ID NO:2を示すヌクレオチドフラグメントも本発明の範囲内にある。
【0008】
同様に、本発明の菌株はこのバクテリオシンを生産するMicrococcus varians菌株、特にMicrococcus varians菌株CNCM I−1586およびCNCM I−1587である。
【0009】
本発明のバクテリオシンの生産方法では、バクテリオシンを産生するMicrococcus varians菌株、特に菌株CNCM I−1586または菌株CNCM I−1587を107 〜1011菌株を含有する培養培地を得るように、生育に有利な培地および條件下で培養し、その後、生成培養物を遠心分離し、バクテリオシン含有上澄抽出物を調整する。
【0010】
最後に、本発明のMicrococcus variansバクテリオシンの使用はそのヌクレオチド配列およびそのシグナル配列およびバクテリオシンを含有する上澄抽出物およびバクテリオシンを産生するMicrococcus varians菌株を食品および香粧品の製造に使用することを含む。
【0011】
以下の記載で、本発明のバクテリオシンは「バリアシン」と称する。
【0012】
本発明において、任意単位(au)は当業者に「寒天ウェル試験」として知られる試験で試料が尚殺菌効果を示す最大稀釈値の逆数として規定される。
【0013】
本発明において、「フラグメント」または「DNAフラグメント」とは、部分的または全体の遺伝暗号を含み、例えば既知ポリメラーゼ連鎖反応方法により試験管内で複製され、または例えば生体内でEscherichia coli型の細菌に複製、合成されうる一重鎖または二重鎖DNAフラグメントを意味する。
【0014】
本発明において、「相同フラグメント」とは、少数の塩基の置換、欠失または挿入により本発明のフラグメントと僅かに異る任意のフラグメントを意味する。これに関連して、遺伝暗号の縮重により1つのポリペプチドおよび同一のポリペプチドをコードする2個のDNAフラグメントは特に、相同性であると見做される。このフラグメントも相同フラグメントであると見做され、これは本発明フラグメントと80%以上の相同を示す。後者の場合、相同は相同性フラグメントの塩基数と本発明フラグメント数間の比により決定される。
【0015】
最後に、本発明の意味内で、「ハイブリド化するフラグメント」とはサザン法(Sambrook等、Molecular Cloning,A laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,U.S.A.,1989,chapter 9.31 to 9.58)により本発明フラグメントとハイブリド化できる任意のフラグメントを意味する。好ましくは、ハイブリド化は厳重または厳格な條件下で行ない、非特異性ハイブリド化または比較的不安定なハイブリド化を回避する。
【0016】
たん白因子、この場合強力な殺菌効果を有するバクテリオシンは菌株CNCMI−1586およびCNCM I−1587から単離された。このバクテリオシンはMicrococcus varians由来で、従ってアミノ酸配列SEQ ID NO:1を示し、これは下記配列リストに示すが、バリアシンと呼ぶ。
【0017】
バリアシンが提供する興味を考慮して、本発明は1〜4アミノ酸のうち1個の置換、1個の欠失および/または1個の挿入により配列SEQ ID NO:1と異るアミノ酸配列を有する任意のバクテリオシンにも関する。こうして1〜4アミノ酸のうち1個の置換、1個の欠失および/または挿入により配列SEQID NO:1と異るアミノ酸配列を示すこのバクテリオシンは、例えばバリアシンのものより一層広い阻害スペクトルを細菌属または細菌種に対し有することができる。
【0018】
本発明バリアシンをコードする染色体ヌクレオチドフラグメントを2種の菌株CNCM I−1586およびCNCM I−1587から選択することもできる。このフラグメントは下記配列リストに示す配列SEQ ID NO:2を示す。
【0019】
本発明により供される興味を考慮して、本発明は本発明バリアシンをコードする任意のヌクレオチドフラグメント、特に配列SEQ ID NO:2と相同であり、またはハイブリド化するヌクレオチドフラグメントにも関する。
【0020】
特に、本発明はバクテリアシンのシグナルペプチドをコードする配列SEQID NO:2のヌクレオチド88〜153、本発明の分泌バリアシンをコードする配列SEQ ID NO:2のヌクレオチド154〜228、および/またはそのシグナルペプチドに融合したバクテリオシンをコードする配列SEQ ID NO:2のヌクレオチド88〜228に関する。
【0021】
分泌バリアシンをコードするフラグメントは有利には本発明バリアシンを植物またはMicrococcus varians以外の微生物に発現するために使用できる。このため、配列SEQ ID NO:2のヌクレオチド154〜228は読み枠に十分注意しながらプロモータまたはシグナル配列の下流およびターミネータの上流で発現ベクターにクローン化できる。次にこのベクターは植物、細菌または酵母に導入して例えば或る種の細菌に対しその阻害スペクトルを増大できる。
【0022】
読み枠に十分注意しながら、配列SEQ ID NO:2のヌクレオチド88〜153を問題の遺伝子に融合し、次に全体をMicrococcus varians発現ベクターにクローン化して問題の遺伝子によりコードされたタン白を例えばMicrococcus variansに発現および分泌できるように本発明シグナル配列を使用できる。
【0023】
配列SEQ ID NO:2のヌクレオチド88〜228はMicrococcus varians発現ベクターにクローン化し、Micrococcusvariansの別の菌株に導入することができ、その結果この後者の菌株は本発明バリアシンを産生する。
【0024】
さらに、そのゲノムに組みこまれ、または発現ベクターにより本発明バリアシンをコードするDNAフラグメントを含有するMicrococcus varians菌株も本発明の主題の一部である。特に、ブダペスト條約に従ってNational collection of microorganism cultures,INSTITUT PASTEUR,25 Rue de Docteur Roux,F−75724 PARSI CEDEX 15,Franceに1995年6月7日に寄託し、そこで寄託番号CNCM I−1586およびCNCM I−1587を与えられたMicrococcus varians菌株は本発明の主題の部分である。
【0025】
Micrococcus varians細菌はグラム陽性、カタラーゼ陽性で、永久に非移動性の好気性細菌である。これらは球形で、配列が不規則の四連球形で見出される。Micrococcus variansコロニーはBHI培地で黄色である。本菌株の最適生育温度は25〜37℃である。本発明主題の部分である菌株CNCM I−1586およびCNCM I−1587はグルコースおよびフラクトースの双方を代謝する。さらにCNCM I−1587菌株はシユクロースおよびフラノーズを代謝する。さらに、菌株CNCM I−1586は4および12kbの2つのプラスミドを持つが、菌株CNCM I−1587は単に7kbの1つのプラスミドを持つに過ぎない。
【0026】
菌株CNCM I−1586およびCNCM I−1587の培養上澄は他の細菌の生育に関し比較的広い阻害スペクトルを示す。この上澄に過敏の細菌のうち例として次のものを挙げることができる:Lactococcus lactis,Lactobacillus helveticus,Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus,Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis,Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii,Laetobacillus acidophilus,Lactobacillus johnsonii.Lactobacillus plantarum,Lactobacillus sake,Lactobacillus curvatus,Leuconostoc carnosum,Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides,Streptococcus thermophilus,Listeria monocytogenes,Enterococcus faecalis subsp.faecalis,Bacillussubtilisの胞子および増殖細胞、Bacillus cereus,Bacillus polymyxa,Bacillus circulans,Bacillus pumnlusおよびBacillus liqueniformis、およびClostridia。
【0027】
好ましくは、バリアシンの生産方法では、バクテリオシンを産生するMicrococcus varians菌株は、生育に有利な培地および條件下で培養して、107 〜1011菌株/mlを含有する培養培地を得、その後生成した培養物を遠心分離し、バクテリオシンを含有する上澄抽出液を調整する。
【0028】
この抽出液を調整するために、バリアシンを産生する本発明のMicrococcus varians菌株、特に菌株CNCM I−1586または菌株CNCM I−1587はMicrococcus variansの生育に有利な培地および條件下で培養できる。このため、例えばBHI培地で25〜37℃で好気條件下で振盪しながら107 〜1011微生物濃度/ml培地を得るまで培養を行なうことができる。こうして得た標準培養物は4000〜6000gで遠心分離し、バクテリオシンを含有する上澄抽出液を集める。
【0029】
本発明はバリアシン、特に抽出物形、またはこのバクテリオシンを産生するMicrococcus varians菌株を食品および香粧品の製造に対し使用することにも関する。
【0030】
本発明のMicrococcus varians菌株の1種の培養物は、例えばサラミの製造で肉を発酵する際Clostridiaによる汚染と闘うために使用できる。
【0031】
粗抽出物または精製形のバリアシンは、バリアシンに耐性のある細菌を使用して得られる発酵物、例えばチーズ、特にモザレラ型チーズの製造に、胞子が発酵後まで生き残るBacillus polymixaが形成する孔を回避するために、およびバヘリン型のチーズの製造に、Listeria monocytogenesによる汚染と闘うために、添加、使用できる。
【0032】
特に粗抽出物また精製形のバリアシン、または2種の菌株のうち1種は殺菌カスタードのようなデザートムースの製造に、例えばClostridiaおよびBacillus cereusなどの胞子、またはListeriaのような細菌菌株の発育と闘うために病原菌に対し活性である添加物または剤として使用できる。
【0033】
さらに、粗抽出物または精製形のバリアシン、または2種の菌株のうち1種は例えば加湿用クリームまたは脱臭剤などの香粧品の製造に、皮膚の病原菌と闘うために病原菌に対し活性である添加物または剤として使用できる。
【0034】
本発明のバリアシンはその性質を説明する各種微生物的、生化学的および遺伝的発見により以下に一層詳細に特徴化される。%は重量による。
【0035】
抗菌活性単位−「寒天ウェル試験」
本発明の記述において、殺菌活性は任意単位として規定される。
本発明のMicrococcus varians標準培養物の上澄(例えば例1記載の条件下で調整する)は一般的には640au/mlの活性を示す。同様に、例えば例2記載の條件下で調整する上澄濃縮物は一般的には約24000au/mlの活性を示す。
寒天ウェル試験は所定稀釈値で試料が尚殺菌活性を示すかどうかを測定するために使用する。
これを行なうために、105 〜106 CFU/ml濃度の指示菌株を含有する15mlのMRS寒天培地をペトリ皿に接種する。バリアシンに過敏の菌株、この場合、例えば菌株Lactobacillus bulgaricus(YL5)または菌株Lactobacillus helveticus(N2)は指示菌株として使用する。
直径5mmの凹みを培養培地にあける。上澄または上澄濃縮物の試験試料は50μl/凹みの割合で凹みに注入する。皿は4℃で2時間予備インキュベートし、次に使用指示菌株により30℃または37℃で一夜インテュベートする。インキュベーション後、指示菌株は発育し、阻害環を見ることができる。試料がもはや殺菌活性を示さない稀釈値が、阻害環をもはや見出せない稀釈値である。
【0036】
酵素による失活
寒天ウェル試験は本発明により単離したバリアシンがタン白加水分解酵素の存在で、またはカタラーゼの存在で失活するかどうかを測定するために使用する。
これを行なうために、例2記載の培養物上澄濃縮物に5mg/mlの割合で酵素を添加する。酵素は試料が寒天ウェル試験に十分沈積する前にインキュベーション温度で60分作用させる。
対照は平行してpH7で同じ濃縮物を使用し、酵素を添加しないものを準備する。この対照試料は、酵素の存在で得られる阻害環と対照の阻害環とを比較する目的で、寒天ウェル試験で沈積する前に37℃で60分インキュベートする。対照阻害環の直径は27mmである。
表1は指示菌株Lactobacillus helveticus(N2)を使用し、酵素を加えて得た試験結果を示す。表2と同様に、この表では酵素はその型、供給者名および供給者のカタログ番号により示す。零の数字はもはや環がないことを示し、換言すればバリアシンの殺菌活性は後者を酵素と一緒にインキュベートすることにより失活したことを示す。27の数字はバリアシンの完全な殺菌活性に相当する尚27mmの環があることを示す。
表2は酵素により得たもので指示菌株Lactobacillus bulgaricus(YL5)を使用して試験した結果を示す。
表1および表2で得た結果はすべてのタン白加水分解酵素はバリアシンの殺菌活性を抑制することを示す。これらの結果はバリアシンは現実にタン白質であり、このタン白部位は殺菌活性に関与していることを実証する。
カタラーゼはバリアシンの殺菌活性に何の影響をも及ぼさない事実は2種の指示菌株の生育阻害はH2 O2 の抗菌活性(バクテリオシンに似た活性を有することが既知である)によるものではないことも実証する。H2 O2 はカタラーゼにより分解するからである。
【0037】
バリアシンを含有する培養上澄の阻害スペクトル
寒天ウェル試験は本発明のバリアシシンを含有する培養上澄の殺菌活性が胞子および細菌の異る菌株の生育に阻害的活性を示すかどうかを測定するために使用する。上澄の阻害スペクトルをこうして測定する。
これらの分析を実施するために、前夜中準備した、15μlの試験菌株培養物を接種した15mlの標準培地をペトリ皿に注入し、105 〜106 細菌濃度/ml標準培地を得る。標準培地は試験菌株の生育に有利な培地である。
さらに、試験菌株が胞子から発育しなければならない場合、105 〜106 胞子/ml被覆培地を接種する。
直径5mmの凹みを各ペトリ皿に開ける。例1記載の50μlの培養上澄試料をそこに入れる。皿は4℃で2時間予備インテキュベートし、次に見ることができる細菌芝生でプレートを菌株が被覆するのに必要な時間試験下で菌株の生育に有利な温度でインキュベートする。
阻害効果、または阻害程度は認められる阻害環の直径により特徴化される。阻害は環が18〜28mmの直径を示す場合、非常に強い(++++)、10〜17mmの直径の場合、強い(+++)、5〜9mm直径の場合平均(++)、直径が1〜4mmの場合弱い(+)、および環が認められない場合零(−)であると見做される。
異る種および亜種の乳酸菌の32の菌株をこの方法で試験し、これらすべてが上澄に対し耐性がないことは注目される。これらの試験の詳細の結果は表3に示す。この表3では、以下の表におけると同様に、菌株の名称または示した菌株番号はネスレコレクション(住所:NESTEC S.A.,Centre deRecherche,Vers−chez−les−Blanc,CH−1000 Lausanne 26,Switzerland)のものの番号である。示す温度は試験中のインキュベーション温度である。示す培地は試験菌株の生育に有利な標準培地である。
この表3では、上澄の阻害スペクトルは阻害程度が異る試験種に対し畧畧同一レベルであるという意味で広汎であることは注目される。
本発明バリアシンを産生する培養物上澄の阻害スペクトルは乳酸菌種に限定されることなく、グラム陽性菌の他の種、特に望ましくない、または病原菌Listeria innocua,Listeria welhia,Listeria monocytogenesおよび表5に示す結果により証明されるように例えばBacilliの胞子にまで拡大されるという意味で広汎であると見做される。
表4に示す結果は、特にこの上澄または精製バリアシンが食品の製造における添加物として、病原菌、特に肉製品におけるClostridiaに対し、チーズのListeria monocytogenesに対し、デザートムースのBacillus cereusおよびListeriaに対し、または新鮮ペーストまたは新鮮ペースト用ソースのBacilliに対し、正確には例えば上記菌株の由来する細菌に対し魅力的使用を予測することができる。
最後に、バリアシンは表5に示す結果から注目できるようにグラム陰性菌の生育に対し阻害作用を全く示さない。
【0038】
バリアシンを含有する上澄濃縮物の阻害スペクトル
手順は例2記載のように得た上澄濃縮物により提示される胞子および細菌の異る菌株の生育に及ぼす阻害効果を測定することを除いて上記記載の通りである。同じ種および亜種は上記のように試験する。これらの試験結果は表6、7および8に示す。菌株名称または示す菌株番号はネスレコレクション(住所:NESTEC S.A.,Centre de Recherche,Vers−chez−les−Blanc,CH−1000 Lausanne 26,Switzerland)のものの番号である。示す温度は試験中のインキュベーション温度である。示す培地は試験菌株の生育に有利な標準培地である。
表6、7および8に示す結果は、上澄と比較して多数の試験菌株の生育を阻害することで上澄濃縮物の効果の高いことを実証する。阻害スペクトルは同一種および亜種に対し認められるが、阻害レベルは一層高い。
これは例2記載のバリアシン上澄濃縮物の製造および例えば食品および香粧品の製造で病原菌と闘うためにその使用を示唆する。
【0039】
pH耐性
寒天ウェル試験は、本発明により単離したバリアシンがpH依存性であるかどうかを測定するために使用する。
このため、上記「寒天ウェル試験」に記載のよに、寒天に指示菌株を接種する。Lactobacillus helveticus(N2)を指示菌株として使用する。
例2記載の培養上澄濃縮物の抽出物のpHは2N NaOHおよび/または2N HClにより2〜10のpHに調整し、抽出物は37℃で60分インキュベートし、次にpHを6〜7に再調整した後抽出物試料を寒天ウェル試験の凹みに入れる。
pH7の同じ上澄濃縮物を使用する対照を平行して設け、37℃で60分インキュベート後対照試料を寒天ウェル試験の凹みに入れて試験試料の阻害環と対照の阻害環とを比較する。対照の阻害環の直径は27mmである。
表9では、表10および11と同様に、27の数字はバリアシンの完全な殺菌活性に相当する27mmの環であることを示す。
上記表に示す結果はバリアシンの殺菌活性は失活しないことを実証する。従ってバリアシンの殺菌活性はpH依存性でないと結論できる。
【0040】
熱耐性
寒天ウェル試験は本発明に従って単離したバリアシンが熱依存性であるかどうかを測定するために使用する。
このため、上記寒天ウェル試験に記載のように寒天に指示菌株を接種する。Lactobacillus helveticus(N2)を指示菌株として使用する。
pH7に調整した例2記載の培養上澄の濃縮物抽出物は100℃で15〜60分インキュベート後寒天ウェル試験の凹みに入れる。
pH7の同じ上澄濃縮物を使用して得た対照を平行して設け、37℃で60分インキュベートする。これにより温度試験試料の阻害環を対照の阻害環と比較できる。対照の阻害環の直径は27mmである。
これらの結果はバリアシンが熱依存性でないことを実証する。こうして、バリアシンの殺菌活性は100℃、60分のインキュベーション後でさえ失活しない。
バリアシンの熱耐性は食品および香粧品の製造でバリアシンの使用に関連して非常に重要な生化学的特徴である。こうして、バリアシンは、特に粗抽出物または精製形で殺菌食品の製造に、例えば熱耐性のBacilliのような胞子の発育と闘うために使用できる。
【0041】
熱耐性およびpH耐性
さらに、pHおよび熱を組み合せた場合のバリアシンの安定性を試験する。
このため、上記「寒天ウェル試験」に記載のように寒天に指示菌株を接種する。Lactobacillus helveticus(N2)を指示菌株として使用する。
例2記載の培養上澄の抽出濃縮物は2N HClおよび/または2N NaOHによりpH4または7に調整し、115℃で20分インキュベートする。次に抽出物のpHは6〜7に再調整後寒天ウェル試験の凹みに入れる。
pH7で得た対照は平行して設け、37℃で20分インキュベートした後対照試料を寒天ウェル試験の凹みに入れ、試験試料の阻害環を対照の阻害環と比較する。対照の阻害環の直径は27mmである。
上記に示す結果はバリアシンの殺菌活性はpH4または7で、高温と組み合わせても低下しないことを実証する。
【0042】
バリアシンの精製
4リットルのBHI培地にMicrococcus variansの培養物を接種する。この培養物は本発明バリアシンを産生する。この標準培養物は好気條件下で、振盪しながら30℃で一夜インキュベートし、その後5000gで遠心分離して受器に上澄を集め、これに72gのXAD−7樹脂(アンバーライト(商標))を添加する。
混合物は25℃で30分攪拌してバリアシン分子が樹脂に粘着するのを有利にし、次に全体はガラス濾過器に移し、そこで上澄は真空濾過する。
樹脂はpH4の20mMクエン酸ナトリウムおよびインプロパノールを含有する3種の緩衝液で連続洗浄する。最初の緩衝液は10%イソプロパノール、第2の緩衝液は15%イソプロパノールおよび第3の緩衝液は20%イソプロパノールを含有する。
樹脂はカラムに移し、バリアシンはpH4の20mMクエン酸ナトリウムおよび25%イソプロパノールを含有する700mlの緩衝液で溶離する。バリアシンの殺菌活性は上記寒天ウェル試験を使用して監視する。
活性画分を混合し、イソプロパノールは蒸発させる。FPLC(Pharmacia)用の5mlのS−Resourceカラムを20mMクエン酸ナトリウム緩衝液と平衡して準備する。活性画分の蒸発混合物はこのカラムに装填し、次にカラム内容物は100mM〜400mMの勾配を有するNaCl緩衝液で溶離する。
画分を集め、こうして精製したバリアシンの殺菌活性は寒天ウェル試験を使用してチェックする。
【0043】
バリアシンの配列決定
菌株CNCM I−1586およびCNCM I−1587から精製したバリアシンのN−末端部分はApplied Biosystems 4774オートマチックシーケンサーを使用して配列を調べる。これは5個のアミノ酸のペプチド配列を示し、その配列は下記配列リストに記載の配列SEQ ID NO:1のN−末端部分のものと同一である。配列調査中5個以上のアミノ酸を有するペプチドの存在を実証することはできなかった。
さらに、菌株CNCM I−1586およびCNCM I−1587から精製したバリアシンは6N HClにより10分加水分解する。3個のペプチドを得る。これらはHPLCにより通例方法で単離する。単離した3個のペプチドのうち1個だけ配列を調べることができた。他の2個はペプチド修飾を間違いなく含むと思われたからである。この方法で単離したペプチドの配列は下記配列リストに記載の配列SEQ ID NO:1のアミノ酸19〜22を含むものと同一である。
最後に、菌株CNCM I−1586およびCNCM I−1587から精製したバリアシンを含有する画分はマススペクトロメトリにかけ、バリアシンは2659ダルトンの分子量を有することが分かった。
【0044】
相同
Lactococcus lactis由来のラクチシン481と本発明バリアシンの配列間に相同が実証された。この相同は特に、2種のバクテリオシンのN−末端部分の配列に関連する。こうして、バリアシンのN−末端配列アミノ酸1〜5は下記配列リストに記載したラクチシン481の配列SEQ ID NO:8のアミノ酸3〜7と同一である。それでも、これは部分相同であって、同一ではない。
さらに、分泌ラクチシンはマススペクトロメトリにより2900ダルトンの分子量を有することが示されるが、一方分泌バリアシンの分子量は上記のように2659ダルトンである。
ラクチシン481を産生するLactococcus lactis菌株は、上記阻害スペクトル試験で記載したバリアシン抽出物の存在で接種する場合、この菌株の生育は阻害されることが分かる。ラクチシン481を産生するLactococcus lactis菌株はそれ自身のバクテリオシン、ラクチシン481に対し免疫性を有するが、本発明の2種のMicrococcus varians各菌株が産生するバリアシンに免疫性がない。上記阻害スペクトル試験で得たこれらの結果は、これらの2種のバクテリオシンは異ることを確証する。
上記遺伝的発見は、ラクチシン481およびバリアシンは配列相同を示すが、その配列は同一ではないことを実証する。生化学的発見および微生物学的発見は、ラクチシン481およびバリアシンは2種の異るバクテリオシンであることを確証する。
【0045】
バリアシン遺伝子の配列決定
下記配列リストに記載され、上記配列決定したバリアシンのペプチドのC−末端部分に相当する変性ヌクレオチド配列SEQ ID NO:4は通例方法で構築される。次にSEQ ID NO:4配列混合物はT4ポリヌクレオチドキナーゼの作用により放射活性にする。
染色体DNAの調整は菌株CNCM I−1586およびCNCM I−1587から通例方法で行なわれる。このDNA調整品は酵素供給者の勧告に従ってSal1,Sac1,Sph1およびBamH1により消化される。次に2μgの消化生成物をアガロースゲル上に流す。ゲル上のDNAは250mM HClで洗浄し、次いでアルカリ媒体の移動生成物はゲルから「Zetaprobe」(Biorad)膜に移される。次にZetaprole膜は55℃の温度で、6×SSC,1%SDSおよび0.25%脱脂乳を含む培地で、温度を40℃まで2時間毎に5℃づつ下げて予備ハイブリド化する。この膜は上記ハイブリド化培地で、同じ温度條件下で配列SEQ ID NO:4を示す変性放射性プローブによりハイブリド化する。次に40℃で4時間インキュベートし、その後膜は6×SSCで40℃で洗浄する。最後に、−80℃で16時間オートグラフィフィルムに暴露する。
ハイブリド化は各種の移動バンド:7kbのSal1バンド、1.4kbのSac1バンド、1.8kbのBamH1バンドおよび15kbより大きいSph1バンドを示す。
次に菌株CNCM I−1586由来の5μgのゲノムDNAは制限酵素BamH1により消化され、1.6〜2kbのフラグメントはアガロースゲルクロマトグラフィにより分離し、次いでフラグメントを含有するゲルの部分を溶離する。溶離DNAフラグメントは、予めBamH1により消化され、次に仔牛腸管ホスフアターゼにより処理された(ベーリンガン・マンハイム、part NO.713023)ベクター19に連結する(Gene,56(1987)309〜312)。
予めコンピテントになったEscherchia coli菌株BZ234(Biozentrum collection−バーゼル大学、スイス)は次に通例方法で連結媒体により形質転換される。インサートを含有するクローンは50μg/mlカナマイシン、60ng/ml IPTG(BoehringerMannheim,part NO.724815)および300ng/mlX−ガル(ベーリンガー・マンハイム,part NO.651745)を補充した寒天培地で、37℃で16時間インキュベートして確認される。
通常インサートを含有する白色コロニーは96個の凹みのミクロ量プレート中に採取する。各白色コロニーはこの凹みの1つに採取し、各凹みは50μg/mlのカナマイシンを補充した150μlのLB培地を含有し、37℃で20時間インキュベートしてミニ培養物を生産する。
反対の配向を有する2個のプライマーはベクターpK19の遺伝子の配向が未知であるので調整する。このため、プライマーは配列SEQ ID NO:5を示し、一部ラクチシン481をコードするヌクレオチドフラグメントからこれらを組み合わせて構築し、これはpUCベクターの1つまたは他の万能性プローブに連結し、このプローブは配列SEQ ID NO:6または配列SEQ IDNO:7を示す。
各凹みからの1μlは100pモルの1つのこのプライマー、6μlの2mMdNTPsおよび2.5μlのTaq緩衝液(P.H.Stehelin&Cie Ag.cat,No.TPO5b)と混合し、全体は1滴のDyna−wax(Finnzymes Oy,02201 Espoo,Finland)に被覆し、98℃で10分加熱して細菌を溶解する。次にPCRを行なう。
正のクローンは電気泳動で800bpのバンドを示す。
正のクローンはこの方法で選択し、これらのクローンのプラスミドDNAを抽出する。次にpK19ベクター中にクローン化されたDNAフラグメントは配列決定用キット(Pharmacia Biotech,part No.27−1682−01)および万能性プライマーを使用してジデオキシヌクレオチド方法により配列し、次いで配列に基づく特定プライマーをこうして得る。
これによりヌクレオチド配列が形成され、下記配列リストに記載のSEQ ID NO:2を得る。ヌクレオチド配列は配列SEQ ID NO:1をコードし、これは成熟前バリアシンのアミノ酸配列に相当する。
下記列は本発明バクテリオシンの生産方法および使用を説明するために提示する。例の%は特記しない限り重量により示す。
【0046】
【実施例】
例1
HBI培養基を準備し、Micrococcus varians菌株生体を含有する培養物をこれに添加する。全体は振盪しながら好気條件下で一夜30℃でインキュベートし、その後培地は108 菌株/mlを含有する。こうして得た標準培養物は遠心分離する。標準上澄を集める。
【0047】
例2
750mlの例1記載のよに得たこの上澄から上澄濃縮物を得、これに15gのXAD−7樹脂(アンバーライト(商標))を添加する。混合物は4℃で60分振盪し、次にNo.604 Schleicher&Schuell(ドイツ)フィルターを通して濾過する。次にフィルターは1%クエン酸ナトリウムにより洗浄してすべての非吸着性タン白を溶離する。次に樹脂は単離し、クエン酸ナトリウムを含有する受器に移し、全体は2分間振盪する。クエン酸ナトリウムと一緒に樹脂はカラムに移し、クエン酸ナトリウムは50%アセトニトリルおよび0.1%TFAにより溶離する。溶出液は蒸発し、残留物はpH6.8の50mMリン酸塩緩衝液に再懸濁する。
【0048】
例3
Micrococcus variansの10リットルの培養物は振盪しながら、好気條件下で一夜30℃でBHI培地に生育させる。次に200gのXAD−7樹脂(アンバーライト)を直接培養物に添加し、全体は4℃で1時間温和に振盪する。次に混合物はNo.604 Schleicher&Schuell(ドイツ)フィルターを通して濾過し、フィルターに保留された樹脂は次に10リットルのpH5.2の50mM酢酸溶液で洗浄して細菌を除去する。その後、100%エタノールおよび20mM酢酸アンモニウムを含有する450mlの溶液を樹脂に添加し、全体は濾過して樹脂を除去する。次に濾液は凍結乾燥して本発明バリアシンを含有する粉末を得、これは食品工業で使用できる。
予め水に稀釈したこの粉末の殺菌活性は上記寒天ウェル試験により測定する。この粉末は少なくとも105 au/g粉末を有する。
最後に、上記粉末は伝統的方法で製造中肉フォームに0.5g/kgの割合で添加する。これによりその1gが50auのバクテリオシンを含有し、病原菌、特にClostridiaの発育を完全に阻害できる肉フォームを形成する。
【0049】
例4
本例は例3記載の粉末を0.05g/kgの割合で、すなわち、従って皮膚に望ましくない細菌、特にStaphylococcus aureusおよびStreptococcus pyogenesの発育を5au/gの割合で阻害しうるバリアシンを含有する皮膚ケア用加湿クリームの製造に関する。
このエマルジョンを製造するために、脂肪相Aの成分は混合し、75℃に加熱する。水性相Bを調整し、同様に75℃に加熱する。次に脂肪相Aをゆっくり混合しながら添加し、その後全体はゆっくり混合しながら環境温度、すなわち約25℃に冷却する。C成分は処方順序で、この温度でゆっくり添加する。
【0050】
例5
例3記載のバクテリオシン粉末は0.5g/kgの割合でうがい剤に添加する。その結果としてこのうがい剤は口腔の病原菌、特にStreptococcus sobrinus,Streptococcus sanguis,Streptococcus mutansおよびActinomyces viscosusの発育を阻害できる。
【0051】
例6
1%の割合で水に稀釈した例3のバクテリオシンを含む溶液を、滅菌して包装中の後−感染を予防するための食品に噴霧する。
Claims (10)
- アミノ酸配列SEQ ID NO:1を示すことを特徴とする、Micrococcus varians由来のバクテリオシン。
- 請求項1記載のMicrococcus varians由来のバクテリオシンをコードするヌクレオチドフラグメント。
- 配列SEQ ID NO:2のヌクレオチド88〜228を含む、請求項2記載のフラグメント。
- 配列SEQ ID NO:2のヌクレオチド154〜228を含む、請求項2または3記載のヌクレオチドフラグメント。
- 配列SEQ ID NO:2のヌクレオチド88〜153を含む、請求項2または3記載のヌクレオチドフラグメント。
- 菌株CNCM I−1586または菌株CNCM I−1587である、請求項1記載のバクテリオシンを産生するMicrococcus varians菌株。
- バクテリオシンを産生するMicrococcus varians菌株を発育に有利な培地および条件下で培養して、107〜1011菌株/mlを含有する培養培地を得、その後生成培養物を遠心分離し、バクテリオシンを含有する上澄抽出物を調製することを特徴とする、請求項1記載のバクテリオシンの生産方法。
- Micrococcus varians菌株は菌株CNCM I−1586または菌株CNCM I−1587である、請求項7記載の方法。
- 食品、香粧品および医薬品の製造における請求項1記載のバクテリオシンの使用。
- 請求項7により得た抽出物および/またはバクテリオシンを産生するMicrococcus varians菌株の形での請求項9記載の使用。
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