JP3031716B2 - ストレプトコッカステルモフィルスからのバクテリオシン - Google Patents

ストレプトコッカステルモフィルスからのバクテリオシン

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の主題は、ストレプトコッカス（S.）テルモフ
ィルス（Streptococcus thermophilus）からの２種のバ
クテリオシン、これらのバクテリオシンを産生するS.テ
ルモフィルスの菌種、これらの菌種からのこれらのバク
テリオシンの製造方法、ならびにこれらのバクテリオシ
ンおよび（または）この菌種を食品または化粧品の製造
に使用することにある。
従来技術の状態 バクテリオシンは、抗バクテリア効果または抗生物質
効果を含むバクテリアに対して活性な蛋白質部分を含有
する抗バクテリア物質もしくは抗バクテリア薬剤であ
る。バクテリオシンは一般に、狭い範囲の活性スペクト
ルまたは抑制スペクトルを有し、この活性はしばしば、
当該バクテリオシンを産生するバクテリアの菌種に近い
菌種に制限される。
現在、４種のS.テルモフィルスバクテリオシンが公知
である。
このうちの１種は、特に10−20KDの分子量を有し、90
℃で耐熱性を示し、かつまたペプシンに対して感受性で
ある（Smaczny等によるDeutsche Molkerei−Zeitung,10
5:15,460−464,1984）。
第二のバクテリオシンは、EP443543にそのバクテリア
抑制スペクトルが主として記載されているものであっ
て、特にストレプトコッカス種およびプソイドモナス種
（Pseudomonas）のバクテリアの増殖を抑制する能力を
有するが、ラクトコッカス（Lactococcus）およびエン
テロコッカス（Enterococcus）種の、ならびにバシルス
セレウス（Bacillus cereus）種のバクテリアの増殖
を抑制する能力は有していない。
第三のバクテリオシンは、Pulusani等により開示され
たバクテリオシンであって（J.of Food Science,44:2,5
75−578,1979）、このバクテリオシンは、プソイドモナ
スを強力に抑制し、ペプシンに対して感受性ではなく、
かつまた糖残基を含有する。
さらにまた、最後のバクテリオシンは、Gilano等によ
り開示されたバクテリオシンであって（Microbiologie
−Aliment−Nutrition,8,21−30,1990）、このバクテリ
オシンは、ペプシンに対して感受性ではなく、糖残基を
含有し、かつまた100KDの孔度を有する膜を通過するこ
とができない。
現在、S.テルモフィルスは食品分野、特に例えばヨー
グルトおよび数種のチーズなどの乳製品の製造を包含す
る分野で、格別の重要性を有する。さらにまた、バシル
ス、クロストリジウム（Clostridium）およびリステリ
ア（Listeria）に対して同時に活性である非常に少ない
種類のバクテリオシンが存在する。従って、この菌種は
非常に有用であることができ、換言すれば、特にこの種
の製品の観点から、特により広い抗バクテリア活性スペ
クトルを有するバクテリオシンを得るために、この菌種
の代表的菌種により産生される広範囲のバクテリオシン
が求められている。
本発明の目的は、この要求に答えることにある。
発明の要旨 本発明の主題の一つは、２種の新規S.テルモフィルス
バクテリオシンのアミノ酸配列の特徴およびまたそれ
らの分泌を可能にするそれらのシグナルペプチドの特徴
を確認することにある。
これらの２種のバクテリオシンをコードするヌクレオ
チド配列はまた、本発明のもう一つの主題である。
本発明に係わる少なくとも１種のバクテリオシンを産
生するストレプトコッカス テルモフィルス菌種、特に
以下で説明するS.テルモフィルスの菌種CNCM I−1351は
また、本発明のもう一つの主題であり、この菌種は本発
明に係わる２種のバクテリオシンを産生することができ
る。
本発明に係わる少なくとも１種のバクテリオシンのエ
キスの製造方法はまた、本発明のもう一つの主題であ
る。
さらにまた、本発明の最後の主題は、本発明に係わる
バクテリオシンの使用およびまたそれらの核酸配列の使
用、ならびにそれらのシグナル配列の使用にある。
発明の詳細な説明 S.テルモフィルスの菌種CNCM I−1351はチェコスロバ
キア国からの発酵乳製品から単離され、驚くべきこと
に、広範囲のバクテリアの増殖を抑制する格別の性質を
有することが見出だされた。この菌種は、ブタペスト条
約に従い、05.08.93に、Collection Nationale de Cult
ures de Microorganismes,PASTEUR INSTITUTE,25,Rue d
u Ducteur Roux,F−75724 PARIS CEDEX 15,フランス国
に寄託され、No.I−1351と命名されている。
この菌種に係わる、特にその形態学的特徴、糖の発酵
などに係わる詳細を以下に示す： 形態学的特徴： −無鞭毛鎖−形成性の球菌。胞子は形成しない。
−グラム陽性微生物、カタラーゼ陰性および通性嫌気性
菌。
糖発酵： Ｄ−グルコース、乳糖、庶糖、ラフィノースから乳酸
を生成する。マンノース、フラクトース、ガラクトース
からは乳酸を生成しない。
その他： この菌種は少なくとも２種のバクテリオシン、バクテ
リオシンに対する免疫に係わる１種の蛋白質、および組
織形成性を有するエクソポリサライドを産生する。
従って、CNCM I−1351菌種の培養上澄液は、比較的広
い抗バクテリア活性スペクトルを有する。この上澄液に
対して感受性の細菌の中には、次のバクテリアが包含さ
れるうる：ストレプトコッカス テルモフィルス、ラク
トコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）、ラク
トコッカス ラクティス ビオバル ジアセチルラクチ
ス（Lactococcus lactis biovar diacetilactis）、ラ
クトコッカス クレモリス（Lactococcus cremoris）、
エンテロコッカス ファエカリス（Entrococcus faecal
is）、エンテロコッカス ファエシウム（Entrococcus
faecium）、ラクトバシルス フェルメンタム（Lactoba
cillus fermentum）、ラクトバシルス ヘルベチクス
（Lactobacillus helveticus）、ラクトバシルス ブル
ガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバシル
ス アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、
ラクトバシラス ブレビス（Lactobacillus brevis）、
ロイコノストック クレモリス（Leuconostoc cremori
s）、ロイコノストック メセンテロイデス（Leuconost
oc mesenteroides）、ビフィドバクテリウム ブレベ
（Bifidbacterium breve）、ビフィドバクテリウム ロ
ンガム（Bifidbacterium longum）、ビフィドバクテリ
ウム ビフィダム（Bifidbacterium bifidum）、ビフィ
ドバクテリウム インファンチス（Bifidbacterium inf
antis）、プロピオニバクテリウム（Propionibacteriu
m）、リステリア イノクア（Listeria innocua）、リ
ステリア モモサイトゲネス（Listeria momocytogene
s）、ミクロコッカス変種（Micrococcus variants）お
よび、例えばクロストリジウム ボツリナム（Clostrid
ium botulinum）、クロストリジウム チロブチリクム
（Clostridium tyrobutyricum）、クロストリジウム
ビフェルメンタンス（Clostridium bifermentans）、ク
ロストリジウム スプロゲネス（Clostridium sporogen
es）、バシルス サブチリス（Bacillus subtilis）、
バシルス パミルス（Bacillus pumilus）およびバシル
ス セレウス（Bacillus cereus）の胞子および植物性
細胞（Bacteries lactigues,vol.1,1994,Lorica編
集）。
このCNCM I−1351菌種から、バクテリオシンと称され
る、２種の蛋白質因子を単離することができ、これらの
因子はこの抗バクテリア活性に責任のあるものである。
この目的に対して、本発明に係わる第一のバクテリオ
シン（本明細書の記載において、これを「テルモフィリ
ン 1」と命名する）は、下記の配列リストに記載の配列
SEQ ID NO:1を有する。
さらにまた、このバクテリオシンは、例えばそのアミ
ノ酸の少なくとも１つの置き換え、欠失および（また
は）挿入によって、配列SEQ ID NO:1とは相違する配列
を有する場合に、テルモフィリン 1により示されるスペ
クトルに比較して、一つの菌種または一つの細菌種に係
わりより広い、もしくはより特異的なスペクトルを有す
る抗バクテリア活性を有することができるものと見做す
ことができる。確実なこととして、ナイシン（nisin）
Ｚはアミノ酸の置き換えによってのみナイシンＡと相違
しているが、このナイシンＺはナイシンＡに比較して、
さらに有利な活性を有することがEP521240からすでに知
られている。
従って、それらのオリジナル配列SEQ ID NO:1におい
て、そのアミノ酸の少なくとも１つの置き換え、欠失お
よび（または）挿入を有する全てのバクテリオシンが、
本発明に係わるバクテリオシンであると考えることがで
きる。
本発明に係わる第二のバクテリオシンは、本明細書に
おいて、「テルモフィリン 2」と称されており、このバ
クテリオシンは、下記の配列リストに記載の配列SEQ ID
NO:2を有する。このバクテリオシンはまた、例えばそ
のアミノ酸の少なくとも１つの置き換え、欠失および
（または）挿入によって配列SEQ ID NO:2とは相違する
配列を有する場合にも、抗バクテリア活性を有すること
ができるものと見做すことができる。この目的に対し
て、それらのオリジナル配列SEQ ID NO:2において、上
記の変更の少なくとも１つを有する全てのバクテリオシ
ンはまた、本発明に係わるバクテリオシンとして考える
ことができる。
さらにまた、テルモフィリン 1およびテルモフィリン
2をコードするヌクレオチド配列はまた、本発明のもう
一つの主題であり、これはこれらの配列がそれぞれ、例
えばバクテリア、イーストまたは植物に、或る種の細菌
に対する抑制能力を、形質転換により付与するために使
用することができるからである。従って、これらのヌク
レオチド配列はまた、その遺伝子コードの依存性によっ
て、比較的有用であることができ、かつまた特に下記の
配列リストに記載の核酸配列SEQ ID NO:3を有するSMCM
I−1351種のオペロン内に包含させることができる。
特に、配列SEQ ID NO:3を有するヌクレオチド221−47
5からなる核酸配列を使用することができ、この核酸配
列はそのシグナルペプチドによりテルモフィリン 1をコ
ードすることができる。しかしながら、配列SEQ ID NO:
3のヌクレオチド221−288からのシグナルペプチドをコ
ードする配列のみを使用すると有利であり、この配列を
目的の遺伝子に融合させて、この目的遺伝子によりコー
ドされる蛋白質を、ストレプトコッカス テルモフィル
ス菌種により分泌させることができる。同様に、テルモ
フィリン 1をS.テルモフィルス以外の微生物で発現させ
るために、配列SEQ ID NO:3のヌクレオチド289−475か
ら、分泌テルモフィリン 1をコードする配列のみを使用
し、この配列を発現プラスミド中でシグナル配列と融合
させると有利であり、これにより、テルモフィリン 1を
S.テルモフィルス以外の微生物で発現させることができ
る。
同様に、そのシグナルペプチドによりテルモフィリン
2をコードする配列SEQ ID NO:3のヌクレオチド495−68
6からなる核酸配列も使用することができる。しかしな
がら、配列SEQ ID NO:3のヌクレオチド495−557から、
シグナルペプチドをコードする配列のみを使用するとさ
らに有利であり、これによりこのペプチドに融合したい
づれかの蛋白質を、ストレプトコッカス テルモフィル
ス種により分泌させることができる。同様に、配列SEQ
ID NO:3のヌクレオチド558−686から、分泌テルモフィ
リン２をコードする配列のみを使用し、この配列を発現
プラスミド中のシグナル配列に融合させるとさらに有利
であり、これによりテルモフィリン 2をS.テルモフィル
ス以外の微生物中で発現させることができる。
さらにまた、菌種CNCM I−1351以外の或る種のS.テル
モフィルスが、菌種CNCM I−1351により示される抑制ス
ペクトルと同様の抑制スペクトルを示し、かつまた菌種
CNCM I−1351（特に下記の種Sfil2および25）に対して
耐性であることが見出だされたことから、これらの菌種
はこの耐性に関与する免疫蛋白質と同時に、本発明のバ
クテリオシンの少なくとも１種を産生することができる
ことが大いに予想される。このために、上記バクテリオ
シンの少なくとも１種を産生することができる菌種の全
部が本発明に包含される。
本発明に係わるバクテリオシンの少なくとも１種を含
有する分泌物を産生させる方法においては、当該バクテ
リオシンの少なくとも１種を産生するS.テルモフィルス
菌種を、S.テルモフィルスの増殖に好適な培地中でおよ
び好適な条件の下に、培地1m1当たり菌種107−109の微
生物を含有するまで培養し、得られた培養物を遠心分離
し、次いで当該バクテリオシンの少なくとも１種を含有
する上澄液のエキスを製造する。
従って、このエキスを生成するためには、本発明に係
わる当該バクテリオシンの少なくとも１種を産生するS.
テルモフィルス菌種、特にS.テルモフィルスの菌種CNCM
I−1351を、S.テルモフィルスの増殖に好適な培地中で
および好適な条件の下に培養する。特に、例えばMSK培
地（イーストエキスが補給されているウシスキムミル
ク）中で、またはHJ培地（イーストエキスおよびソイト
ンが補給されている牛乳限外濾過透過液）中で、培養す
ることができる。好ましくは、ストレプトコッカスに係
わり選択的である培地、例えばS.テルモフィルスにより
発酵させることができる糖、例えば特に、庶糖、乳糖ま
たはグルコース0.5−２％が補給されている、M17培地
（これはP.E.Terzaghi等によりJ.Appl.Microbiol.,29,8
07−813（1975）に記載されている）で培養する。
この培地は、水100ml当たりで、基礎培地95mlと発酵
性糖10g含有溶液5mlとを混合することによって調製する
ことができる。この発酵性糖および基礎培地の溶液はそ
れぞれ別々に、121℃で15分間殺菌し、また基礎培地は
沸騰水950ml中に下記の成分を溶解することにより調製
される： −ペプシン カゼイン加水分解物 2.5g −ペプシン 肉加水分解物 2.5g −ペプシン 大豆加水分解物 5.0g −イーストエキス 2.5g −肉エキス 5.0g −ベータ−グリセロホスフェート 19g −Mg硫酸塩 0.25g −アスコルビン酸 0.5g 上記菌種は、S.テルモフィルスの増殖に好適な上記培
地において、例えば37−48℃で２−８時間にわたり、こ
の培地が1m1当たりで菌種約107−109の微生物を含有す
るまで培養することができる。この約108/mlの微生物の
数値は、一方で600nmで測定して（OD600）、約3.6の光
学密度に相当し、他方で培養菌種により生じる酸性化の
作用の下において牛乳が凝固する点に達する菌種濃度に
相当する。
当該上澄液の粗製エキスを調製するためには、三塩化
酢酸による沈殿、「塩析出」または溶媒沈殿などのいづ
れか適当な沈殿方法を使用することができる。好ましく
は、この粗製エキスを調製するためには、上澄液のpH
を、H3PO4により1.0−2.0に調整し、沈殿を分離し、次
いで三塩化酢酸による沈殿を１回または２回以上順次行
い、各沈殿処理の後にそれぞれ、その水性懸濁液に三フ
ッ化酢酸により再懸濁させる。
本発明に係わるバクテリオシンおよび（または）これ
を産生するストレプトコッカス テルモフィルス種を使
用して、食品または化粧品を製造することができる。
上記ストレプトコッカス テルモフィルス種の培養物
は、特にチーズ、中でもモッツァレーラ型のチーズの製
造において（この使用によって、その胞子が発酵で生き
残る、バシルス ポリミキサ（Bacillus polymixa）に
よる孔の生成が回避される）、スイス型のチーズ（例え
ばグリエールまたはエーメンタールチーズの製造におい
て（この使用によって、クロストリジウム チロブチリ
クム（Clostridium tyrobutyricum）による汚染と戦う
ことができる）、バチェリン型のチーズの製造において
（この使用によって、リステリア モノサイトゲネス
（Listeria monocytogenes）による汚染と戦うことがで
きる）、およびまた「セレ（sere）」型（これはソフト
チーズまたはクリームチーズのフランス語名である）の
製造において、あるいはまた酸性化乳、特にヨーグルト
またはベビー用粉ミルクの製造において、スターターと
して使用することができる。
特に、当該ストレプトコッカス テルモフィルスは、
ラクトバシルス ブルガリクス（Lactobacillus bulgar
icus）によるヨーグルトの後酸性化を回避するために、
テルモフィリンに対して温和な感受性を有する種のL.ブ
ルガリクス（例えば、以下で記載する菌種YL5）と組み
合わせて、牛乳中で培養することができる。
上記バクテリオシン、特に粗製または精製エキスの形
態のバクテリオシン、あるいは当該菌種はまた、病原性
バクテリアに対する添加物または活性薬剤として、特に
ムース類などの肉製品の製造において、クロストリジア
胞子の増殖、特にクロストリジウム ボツリナム（Clos
tridium botulinum）の増殖に対する活性薬剤として、
またはクリームまたはローションの製造における皮膚の
病原性バクテリアに対する活性薬剤として、あるいはま
た口腔健康製品の製造における、口腔内のバクテリア、
特に例えばストレプトコッカス ソブリヌス（Streptoc
occus sobrinus）に対する活性薬剤として、使用するこ
とができる。
以下でさらに詳細に説明するように、本発明に係わる
バクテリオシンの特徴は、それらの性質を表わす、種々
の微生物学的、生化学的および遺伝子学的データにより
確認される。パーセンテージはいずれも、重量で示す。
抗バクテリア活性の単位−「寒天ウエル試験」 本発明の構成内において、抗バクテリア活性は、特殊
単位を用いて表わす。
１任意単位（au）は、「寒天ウエル試験」（agar wel
l test）の名称で当業者に知られている試験において、
試料が依然として抗バクテリア活性を示す、最高稀釈率
の逆数であると定義される。この試験の英語表現は、寒
天中に切り込まれたウエル（凹部）を使用することを実
際的に意味している。
例１に例示されている標準条件の下に調製された、本
発明に係わるS.テルモフィルス培養上澄液の標準試料
は、代表的には、70μｌの容量について、32auの活性を
示す。従って、これは460au/mlの活性を意味する。
例１に例示されている培養上澄液から、それぞれ三フ
ッ化酢酸による水性懸濁液中への再懸濁を伴う、２回の
三塩化酢酸による順次沈殿操作により分別することによ
り得られた、バクテリオシンの標準粗製エキスは、代表
的に約1.4×105au/mlの活性を有する。
上記寒天ウエル試験の目的は、指定の稀釈率におい
て、試料が依然として抗バクテリア活性を示すか否かを
測定することにある。
このためには、M17培地35mlを、ペトリ皿中に注ぎ入
れ、ここに庶糖１％および寒天1.5％を添加する。
前夜のうちに調製した、S.テルモフィルスの当該バク
テリオシン（代表的インディケーター）に対して典型的
に感受性である菌種、この場合には例えば種Sfi3、の培
養物を、庶糖１％および寒天0.75％を添加した、M17培
地5mlに接種する。
この5mlを、前記35ml上に注ぎ入れ、層流の下に、15
分間乾燥させる。この培養培地に、直径5mmの孔を開け
る。
被験試料を、この孔中に、70μl/孔の量で注ぎ入れ
る。空気を排除した条件の下に42℃で６時間、インキュ
ベーションを行う。このインキュベーション期間中に、
この代表的インディケーター菌種は増殖し、抑制ハロー
を見ることができる。試料がもはや抗バクテリア活性を
示さない稀釈率は、抑制ハローがもはや区別できない稀
釈率である。
酵素による不活性化 上記寒天ウエル試験を補助するためにまた、上記の代
表的インディケーター菌種を接種した寒天上において、
当該バクテリオシンが種々の酵素により不活性化される
か否かを測定する。
リパーゼ以外の使用酵素の場合はいずれも、酵素供給
業者により推薦された緩衝液中で33×に稀釈した上記標
準粗製エキスに、酵素１μg/ml−10mg/mlを添加して、3
00auの試料70μｌを得る。酵素を次いで、供給者により
推薦された温度において、30分間働かせ、次いでこの全
体を寒天ウエル試験のウエルに入れる。
他方、市販リパーゼの場合は、インヒビターの混合物
［1.25M EDTA;0.25％ペプスタチン（pepstatin）Ａ（p4
265 Sigma）;0.25％Ｅ−64（E3132 Sigma）;0.25％アプ
ロチニン（aprotinin）（Al153 Sigma）］を先ず、リパ
ーゼ200μg/mlを含有する溶液100μｌに添加し、このイ
ンヒビターを室温で45分間働かせ、次いで稀釈した標準
粗製エキス５μｌ（450au）を添加し、次いで37℃で30
分間反応させ、次いでこの混合物70μｌを寒天ウエル試
験のウエルに沈着させる。この稀釈に使用する緩衝液を
以下に示す： −pH2.0:NaOHにより調節された100mMマレイン酸、 −pH7.0:100mMリン酸塩緩衝液（K2HPO4／KH2PO4）、 −pH7.5:100mMリン酸塩緩衝液（K2HPO4／KH2PO4）、 −pH7.75:100mMトリス（Tris）−Cl。
抑制ハローの直径を、各緩衝液および各インキュベー
ション温度で、約14mmである酵素を添加しないで得られ
たハローの対照直径と比較する。
下記の表Ｉは、各被験酵素により得られた結果を示し
ている。この表において、酵素はその種類、供給者名お
よび供給者のアイテム番号により示されている。バクテ
リオシンの不活性化は、添加された酵素の濃度の関数と
して示されている。数値０は、いかなるハローもそこに
存在しないことを意味する。換言すれば、当該バクテリ
オシンの抗バクテリア活性が、酵素を用いて行われたイ
ンキュベーションによって損なわれたことを意味してい
る。数値14は、当該バクテリオシンの完全抗バクテリア
活性に相当する、14mmのハローが依然として存在するこ
とを表わす。
プロテアーゼはいずれも、この上澄液の抗バクテリア
活性を抑制する。これは蛋白質部分が、この活性に関与
していることを証明している。
バクテリオシンの抗バクテリア活性に対する、カタラ
ーゼの影響が見られないという事実はまた、代表的イン
ディケーター菌種の増殖の抑制が、バクテリオシンの抗
バクテリア活性と同様の活性を有することが知られてい
る、H2O2の抗バクテリア活性によるものではないことを
証明している。何故ならば、H2O2は、カタラーゼにより
分解されるからである。
同様に、α−アミラーゼによる抗バクテリア活性の不
活性化が見られないという事実は、この抗バクテリア活
性に含まれるα−アミラーゼ−加水分解性糖が存在して
いないことを証明している。
さらにまた、リパーゼが抗バクテリア活性に対して影
響を与えないという事実はまた、この活性に含まれる脂
質部分が存在していないことを証明している。
抑制スペクトル 上記寒天ウエル試験を補助するためにまた、各種菌種
の胞子または細菌を接種した寒天上において、本発明に
係わる２種のバクテリオシンを産生する菌種CNCM I−13
51の培養上澄液が、これらの各種細菌の増殖を抑制する
活性を有するか否かを測定する。換言すれば、この上澄
液の抑制スペクトルを測定する。
このためには、pH7.0で300auの活性を示す上澄液の試
料により生じる、被験菌種の増殖に対する抑制効果を観
察する。この観察は、プロテイナーゼK 5μg/mlの存在
の下に、37℃で30分間インキュベートすることにより予
め不活性化されている同一試料の効果（この効果は通
常、０である）に関連させて行う。
これらの分析を行うために、FALCON3046マルチウエル
組織培養プレートを使用する。乳糖１％および寒天1.5
％をさらに含有するM17培地（M17L培地）6mlを、前夜の
うちに調製され、0.1のCD600に稀釈されている、被験菌
種の培養物１％が接種されており、乳糖１％および寒天
0.6％をさらに含有するM17培地700μｌにより覆う。
被験菌種を胞子から増殖させねばならない場合には、
胞子105−106／被覆培地mlを用いて、上記接種を行う。
被験菌種が、ラクトコッカス、ストレプトコッカスま
たはエンテロコッカスではない場合には、M17L培地の代
わりに、目的バクテリアの増殖に好ましい標準的培地を
使用する、特にラクトバシルス、プソイドコッカス、ロ
イコノストックおよびビフィドバクテリウム用には、グ
ルコース２％をさらに含有するMRS培地（Sonofi Diagno
stics Pasteur,仏国）を、クロストリジウムの胞子また
は植物性細胞用には、RCM培地（Oxoid,英国）を、およ
びまたその他の被験バクテリア用には、BHI培地（Difc
o,米国）を使用する。
各プレート毎に、直径5mmおよび深さ5mmの孔を２個作
る。本発明に係わるバクテリオシン300auの試料70μｌ
をこれらの孔の１個に入れ、他の１個には、予め脱活性
化した同一試料を入れる。被験菌種の増殖に好ましい温
度において、プレートが目に見えるバクテリアのローン
により覆われるのに必要な時間にわたり、インキュベー
ションを行う。
抑制度または抑制効果は、観察される抑制ハローの直
径により確認する。このハローが直径16−18mmを有する
場合には、抑制は非常に高い（＋＋＋＋）ものと見做
し、直径11.5−15.5mmの場合には、抑制は高い（＋＋
＋）ものと、見做し、直径7.5−11mmの場合には、抑制
は平均（＋＋）であると見做し、直径５−7.5mmの場合
には、抑制は弱い（＋＋）ものと見做し、そしてハロー
が見られない場合には、抑制はゼロ（−）であると見做
す。
乳酸菌の各種菌種および亜菌種のうちの74菌種以上を
試験し、これらのうちの約７％のみが、この上澄液に対
して耐性であることが見出だされる。これらの試験結果
の詳細を、下記表IIに示す。この表IIにおいて、以後の
表と同様に、菌種名または指示番号は、ネッスルコレク
ションにおいて、これらの菌種に与えられた番号である
（住所:NESTEC S.A.,Research Centre,Vers−chez−les
−Blanc,CH−1000 Lausanne 26,スイス国）。示されて
いる温度は、試験中のインキュベーション温度である。
この表IIにおいて、上記上澄液の抑制スペクトルは、
例えばラクトバシルス アシドフィルス、ラクトバシル
ス ブレビスおよびラクトバシルス ブルガリクスなど
の、或る種のラクトバシルス菌種の場合に、この抑制度
が雑多であるという観点から見て、狭いことが見出ださ
れる。しかしながら、その他の菌種、例えばL.フェルメ
ンタム、L.ヘルベチクムおよびラクトコッカスの場合に
は、この抑制程度は均一である。
この事実は、同一菌種内の１種を他種から区別するこ
とが非常に困難であることから、有利である。従って、
工業的菌種間の区別に、この上澄液または精製バクテリ
オシンを有利に使用することができる。
培地中で生成されるバクテリオシン（１種または２種
以上）に対して、天然で耐性もしくは僅かに感受性であ
るもう一種の乳酸菌種を含有する培地において、本発明
に係わるバクテリオシンの少なくとも１種を産生する菌
種を使用することができる。これにより、例えばヨーグ
ルト、特に減少された後−酸性化を示すヨーグルトを製
造することができる。
上記上澄液はまた、L.ラクティスの６種のナイシン産
生性菌種の増殖を抑制することが見出だされる。この事
実は、本発明に係わるバクテリオシンがナイシンではな
いことを証明している。この事実は、本発明に係わるバ
クテリオシンが、10μg/mlのトリプシンにより不活性化
されるという事実により確認される（表Ｉ参照）。この
現象は、ナイシンの場合には見られない。
しかしながら、本発明の２種のバクテリオシンを生成
する培養上澄液の抑制スペクトルはまた、乳酸菌の菌種
には制限されず、グラム陽性バクテリアの別の菌種に対
して、特に食品バクテリアであるバフィドバクテリウム
（Bifidobscterium）に対して、望ましくないまたは病
原性のバクテリアである、プロピオニバクテリウム（Pr
opionibacterium）、リステリア イノキュア（Listeri
a innocua）、リステリア モノサイトゲネス（Listeri
a monocytogenes）およびミクロコッカス変種（Microco
ccus varians）に対して、およびまた例えばクロストリ
ジウムおよびバシルス種の多数の病原性細菌に対して、
まで及ぶという観点からは広範囲である。この事実は、
下記の表IIIに示されている結果から証明される。
この表IIIに示されている結果は、中でも、この上澄
液または精製バクテリオシンを、食品の製造における添
加物として、病原性調製物に対する薬剤として、特に肉
製品におけるクロストリジウム、チーズにおけるリステ
リア モノサイトゲネス、または生パスタまたは生パス
タ用ソースにおけるバシルス（これらの細菌はこれらの
製品で確実に発生する）に対する薬剤として、有利に使
用できることを示している。
さらにまた、本発明のバクテリオシンは、以下の表IV
に例示されている結果から明白なように、グラム−バク
テリアの増殖に対して抑制効果を及ぼさない。
耐熱性、安定性 例１に例示されている条件の下に得られたエキス中に
存在するバクテリオシンは、このエキスが予め加熱され
ていない場合には、４℃における保存に対して良好な安
定性を示さない。これに対して、エキスを、例えば90−
121℃で少なくとも15分間鋭く加熱した場合には、これ
らは良好な保存安定性を示す。
このようなエキスを、例えば水浴上で94℃において20
分間予め加熱した場合に、このエキスの活性の50％以上
が４℃における５ヶ月の保存の後にも保持されること
が、特に見出だされた。上記エキスを100℃で60分間予
め加熱した後に、このエキスの活性が100％保持される
ことがまた見出だされた（試験は、本発明の方法による
S.テルモフィルス菌種の培養からの、濃縮状態もしくは
その他の状態の上澄液1m1において、温度調節した油浴
上で行った）。
他方で、本発明のバクテリオシンは、121℃で30分間
殺菌処理した後に、それらの活性の約1/3のみを保持す
る（試験は、本発明の方法によるS.テルモフィルス菌種
の培養からの非濃縮上澄液40mlにおいて行った）。
さらにまた、アミコン（Amicon）フィルター上におけ
る限外濾過、引き続くゲル−電気泳動（SDS−PAGE）試
験により、S.テルモフィルスの培養上澄液中の、特に例
１で得られた標準的培養上澄液中の、本発明のバクテリ
オシンは10KDaより大きい分子量（MW）の凝集体を形成
して存在し、この凝集体の67％が100KDaより小さいMWを
示し、そして33％が100KDaより大きいMWを示すことが見
出だされた。
バクテリオシンの精製 以下の記載において、三フッ化酢酸およびアセトニト
リルのパーセンテージは、容量により示されている。
CNCM I−1351菌種の培養物１リットルを、１％庶糖が
補給されているM17培地において、６時間、42℃および
空気を排除した条件の下に、製造する。
この培養物に、XAD−７樹脂（Sigma）20gを直接に添
加し、全体を、１時間４℃で穏やかに撹拌する。この混
合物を次いで、Schleicher＆Schvellフィルター（ドイ
ツ国）No.604に通して濾過し、次いでこのフィルター上
に保有された樹脂を50mM酢酸溶液（pH5.2）１リットル
により洗浄して、細菌を除去する。この樹脂を次いで、
カラムに入れ、アセトニトリル70％および三フッ化酢酸
（TFA）0.1％を含有する溶液45mlにより溶出する。両方
のバクテリオシンを含有する溶出液が得られる。
これらの２種の溶出されたバクテリオシンを次いで、
下記の方法により分離する。
先ず、溶出液の体積を遠心分離／凍結乾燥（Speedva
c,Savant Instrument）により、24mlに減少させ、得ら
れた体積を次いで2M NaClおよび250mMトリス−Cl,pH8の
濃度になるように調整して50mlの体積にし、この量を50
mMトリス−Cl,pH8および2M NaClからなる緩衝液により
予め平衡にした、疎水性相互作用のPhenyl Superose HR
16/10カラム（Pharmacia）中に注入する。このカラム
に、前記緩衝液200ml、前記緩衝液から出発し、50mMト
リス−Cl,pH8に終わる線状勾配緩衝液100ml、前記緩衝
液100ml、純水60ml、50mMトリス−Cl,pH8 60ml、最後に
純水60mlを順次、4ml/分の速度で通す。
このカラムの出口で採取した各フラクション50μｌを
次いで、0.1％TFA50μｌ中で稀釈し、次いで各混合物の
抗バクテリア活性を前記の寒天ウエル試験により試験す
る。
これにより、470−490ml目のフラクションが抗バクテ
リア活性を示すことが見出だされる。これらのフラクシ
ョンを次いで、混合し、この混合物の容積を遠心分離／
凍結乾燥により、1mlに減少させ、この減少された容積
の混合物を0.1％TFA溶液（この溶液をここで「溶液Ａ」
と記す）により予め平衡にしたPep. RPC HR5/5カラム
（Pharmacia）中に注入する。アセトニトリル70％およ
びTFA0.097％からなる溶出溶液「Ｂ」をまた調製する。
次いでこのカラムに、溶液A 1ml、溶液Ａから出発し
て、溶液Ａと溶液Ｂとの50/50混合物で終わる線状勾配
溶液9ml、この後者の混合物2ml、この後者の混合物から
出発して、溶液Ａと溶液Ｂとの20/80混合物で終わる線
状勾配溶液7ml、この第二の混合物から出発して、溶液
Ｂで終わる線状勾配溶液2ml、次いでこの後者の溶液2ml
を、順次1ml/分の速度で通す。
このカラムの出口で採取したフラクションの抗バクテ
リア活性を次いで、前記の寒天ウエル試験により試験す
る。14−22ml目のフラクションはいずれも、抗バクテリ
ア活性を示す。他方、215mnの光学密度で見出だされ
る、２つの主要蛋白質ピークは、フラクション15mlとフ
ラクション21mlとで相違している。
バクテリオシンの配列分析 フラクション15、18、20、21および22で得られた蛋白
質のＮ−末端部分をApplied Biosystem4774自動式シー
クエンサーを用いて、配列分析する。
これにより、そのＮ−末端部分に係わり配列SEQ ID N
o:1の配列と同一である48個のアミノ酸配列を有するペ
プチドの存在が、フラクション15に見られる。フラクシ
ョン21に主として存在する、もう一種のペプチドは、そ
のＮ−末端部分に係わり配列SEQ ID No:2の配列と同一
である23個のアミノ酸配列を有する。
従って、これらの結果は、菌種CNCM I−1351が、抗バ
クテリア活性を有する２種のペプチドを産生することを
証明している。しかしながら、フラクション15とフラク
ション21との間では、得られる抑制ハローの外観が相違
しており、これにより、本発明のテルモフィリン１とテ
ルモフィリン２との間では、抗バクテリア活性が相違し
ていることを知ることができる。
他方、6N HClにより100℃で24時間加水分解した後
の、フラクション15とフラクション21とのアミノ酸組成
を、公知の「ダブシル クロライド（dabsyl chlorid
e）誘導体化」方法により分析する。この結果は、各フ
ラクションのアミノ酸組成が、それぞれのペプチド配列
に相当するものとすでに見做されることを示す。
さらにまた、フラクション15およびフラクション21
を、質量スペクトル分析に付し、テルモフィリン１につ
いて、5800ダルトン程度の分子量が見出だされ、テルモ
フィリン２について、3900ダルトン程度の分子量が見出
だされる。
バクテリオシンに係わる遺伝子の配列分析 下記の配列リストに記載されているSEQ ID No:6およ
びSEQ ID No:7の縮重核酸配列（この配列は、予め配列
決定されているテルモフィリン１ペプチドのＮ−末端部
分およびＣ−末端部分に相当する）を、慣用の方法で製
作する。
SEQ ID No:6配列の混合物の一部を次いで、実験室マ
ニュアル「分子クローニング、実験室マニュアル」（Mo
lecular cloning,a laboratory manual）（Sambrook等
によるCold Spring Harbor,Laboratory出版社、第二
版）に記載のとおりに、T4ポリヌクレオチドキナーゼの
作用により放射性にする。このマニュアルをここで「マ
ニアティス」（Maniatis）と称する。
マニュアル「PCRテクノロジイ」（H.A.Erdlich編集、
M stockton出版社、ロンドン）に記載のとおりにして、
菌種CNCM I−1351からのクロモゾームDNA標本におい
て、縮重配列SEQ ID No:6およびSEQ ID No:7の２種の非
放射性混合物を使用して、PCR（「ポリメラーゼ連鎖反
応」）を、次いで行う。
これにより、128塩基対（pb）のバンドが電気泳動ゲ
ルに見出だされる。これを次いでマニアティスに従い溶
出する。この一部を供給業者の推薦にしたがい、プラス
ミドpGEM−Ｔ（Promega）中に直接にクローン形成さ
せ、次いでマニアティスに従い、「ジデオキシヌクレオ
チド」法により一般的pU19プローベを用いて、配列す
る。これにより、テルモフィリン１のアミノ酸９−47を
コードする配列に相当する、下記の配列リストに記載の
SEQ ID No:8を有するプローベが得られる。最後に、128
pbの溶出バンドの他の部分を、マニアティスに従い「ラ
ンダムプライミング」と称される方法により放射性にす
る。
他方で、菌種CNCM I−1351からのクロモゾールDNA標
本の消化を、酵素供給業者の推薦に従い、EcoRIおよびH
indIIIを用いて行う。この消化生成物10μｇを次いで、
電気泳動ゲルにより分析し、DNAを、「ゼータプロー
ベ」（Zeta probe）膜（Biorad）上のゲルからアルカリ
性媒質に移し、この膜を6xSSC、１％SDSおよび１％スキ
ムミルクからなる媒質において、54℃で一夜にわたり予
備ハイブリド形成する。次いで、この膜を、前記ハイブ
リド形成媒質において、先ず54℃で18時間、次いで温度
を３時間毎に２℃づつ減少させ、次いで42℃で24時間、
放射性縮重プローベSEQ ID No:6にハイブリド形成させ
る。この膜を次いで、室温において6X SSC中で各回２分
間として連続３回、次いで47℃において6X SSC中で１分
間、洗浄する。この膜を最後に、オートラジオグラフィ
フィルムにさらす。これらの工程はいずれも、マニアテ
ィスのマニュアルに従って行う。
3.6kbバンドを次いで、観察する。これにより、前記
と同一の条件の下に行われた菌種CNCM I−1351のクロモ
ゾールDNA（300μｇ）の調整用電気泳動ゲルにおける位
置決定が可能にされる。このゲル部分は、問題のDNAノ
断片を含有する。このゲル部分を切り取り、慣用の方法
により溶出する。この溶出されたDNAを、EcoRIおよびHi
ndIIIにより予めハイブリド形成させたベクターpUC19
（Messing等による、Methods Enzymol.,101:20,1983）
にリゲートする。これらの工程はマニアティスのマニュ
アルに従って行う。
予め受容能を有するようにされているエシェリシア
コリ（Escherichia coli）の菌種BZ234（Biocentre col
lection,University of Bale,スイス国）を次いで、リ
ゲーション媒質に適当に移す。この形質転換された細胞
を次いで、α−相補性により選択する。次いで、マニア
ティスに従い、「コロニイ リフト」（colony lift）
と呼ばれる方法により、300形質転換コロニイを、フィ
ルターに移し、これらを溶解し、これらを放射性配列SE
Q ID No:8にハイブリド形成させ、次いでこのフィルタ
ーをオートラジオグラフィフィルムにさらす。
配列SEQ ID No:8とハイブリド形成することができる
プラスミドを有する13のコロニイを次いで、このフィル
ムで観察する。これらのコロニイのうちの２つを次い
で、選択し、このプラスミドDNAをそこから適当に抽出
し、次いでこの２種の選択されたpU19プラスミド中に、
クローン形成したDNA断片を一般的pUC19プローベを用い
て、「ジデオキシヌクレオチド」法により配列させる。
これにより、下記の配列リストに記載されている核酸
配列SEQ ID No:3が得られる。これは２種の選択された
プラスミドに係わり同一である。従って、この配列は、
成熟前のテオフィリン１に相当するアミノ酸配列SEQ ID
No:4および成熟前のテオフィリン２に相当するアミノ
酸配列SEQ ID No:5を有する２種の蛋白質をコードする
オペロンを有する（下記の配列リスト参照）。第三の読
取り枠はまた、この配列のヌクレオチド679から出発す
るものであり、これは免疫に係わる遺伝子に確実に相当
していなければならない。
精製バクテリオシンのＮ−末端ペプチド配列とオペロ
ンSEQ ID No:3のコーティング枠によりコードされる蛋
白質のアミノ酸配列とを比較することによって、アミノ
酸配列SEQ ID No:4の蛋白質（テオフィリン１）が、乳
酸菌からの１群のバクテリオシンの特徴であるグリシン
−グリシン単位を有する、23アミノ酸のリーダーペプチ
ドを有することを決定することができる。さらにまた、
テオフィリン１の分子質量は、その核酸配列から計算し
て、スペクトル分析により見出だされたものに相当す
る、すなわち5800ダルトン程度である。
同様に、アミノ酸配列SEQ ID No:5の蛋白質（テオフ
ィリン２）は、乳酸菌からの１群のバクテリオシンの特
徴であるグリシン−グリシン単位を有する、21アミノ酸
のリーダーペプチドを有する。さらにまた、テオフィリ
ン２の分子質量は、その核酸配列から計算して、スペク
トル分析により見出だされたものに相当する、すなわち
3900ダルトン程度である。
相違するバクテリオシンの役割 「ラクトコセイン（lactococein）Ｍ」オペロン（Kla
enhammer等によるFEMS Micro.Rew.,12,39−86,1993）の
第一ペプチドとの相同が、テルモフィリン１の配列につ
いて見出だされた。この相同は、GA単位の反復に関連し
ている。同様に、「ラクタシン（lactacin）Ｆ」オペロ
ン（Klaenhammer等による上記刊行物）に係わる遺伝子
との相同が、GCGからのTFASTAプログラムを使用するGen
EMBLデータバンクにおいて、テルモフィリン２について
見出だされた。
これら２種のラクトコセインＭおよびラクタシンＦオ
ペロンは実際に、数種のペプチドを包含するポレーショ
ンコンプレックス（poration complex）をコードする。
従って、前記のオペロンはポレーションコンプレックス
で共同して作用するペプチドをコードすることができ
る。
しかしながら、これら２種のバクテリオシンが独立し
て作用することも除外されない。これは、前記寒天ウエ
ル試験において、上記２種のテルモフィリンの間には、
幾分相違する抑制ハローが見られるからである。
下記の例は、本発明に係わるバクテリオシンの製造方
法およびその使用を例示するものである。これらの例に
おいて、示されているパーセンテージは、別段の記載が
ないかぎり、重量による。
例１ 庶糖１％が添加されているM17培養培地に、1mlあたり
で108のS.テルモフィルスの菌種CNCM I−1351の微生物
を含有する培養物１％（容量／容量）を接種する。空気
を排除した条件のもとに、42℃で６時間、インキュベー
ションを行う。このインキュベーションの後に、この培
地は、1mlあたりで約108の上記菌種の微生物を含有し、
かつまた3.6のOD600を有する。
このようにして得られた標準培養物を遠心分離する。
その上澄液（標準）を採取する。H3PO4によりpH1.5に酸
性化し、得られた沈殿を遠心分離により分離し、酸性沈
殿上澄液を採取する。
この後者の上澄液中に含有されているバクテリオシン
を10％三塩化酢酸により沈殿させる。この沈殿したバク
テリオシンを採取し、次いで0.2％（容量／容量）三フ
ッ化酢酸を用いて、水性懸濁液に再懸濁させる。
このバクテリオシンを10％三塩化酢酸により再沈殿さ
せる。沈殿したバクテリオシンを採取し、100％アセト
ンにより洗浄し、次いでこれらを0.2％（容量／容量）
三フッ化酢酸を用いて、水性懸濁液に再懸濁させる。
1.4105au/mlの活性を有する、本発明に係わるバクテ
リオシンの標準粗製エキスが得られる。
下記の表VIに、標準上澄液１リットルの特徴および標
準粗製エキス18ml（すなわち、標準上澄液から得られた
濃縮物）の特徴、特に蛋白質含有量および抗バクテリア
活性に関して幾分詳細に示す。
例２ 本発明に係わる菌種S.テルモフィルスCNCM I−1351お
よびS.テルモフィルスの菌種STl1（これは本発明に係わ
るバクテリオシンに対しては耐性であるが、抗バクテリ
ア活性は示さない）および前記L.ブルガリクスのYL5を
含有するセット型（set−style）ヨーグルトを製造す
る。
3.7％脂肪および2.5％スキムミルク粉末を含有する全
乳を基材とするミルクを製造する。このミルク40リット
ルを92℃で６分間、低温殺菌し、次いで75℃および150
バールでホモジネートし（２回）、次いで約42℃の温度
にまで冷却させる。
凍結乾燥されている菌種S.テルモフィルスCNCM I−13
51、S.テルモフィルスの菌種STl1およびL.ブルガリクス
YL5を次いで、無菌MSK培地（0.1％市販イーストエキス
を含有する10％再構成粉末スキムミルク）において、数
回、連続して予備培養することによって、再活性化す
る。
上記培地の凝固段階で得た、各S.テルモフィルス菌種
の３回予備培養物１％（容量／容量）および培地の凝固
段階で得た、L.ブルガリクス菌種の３回予備培養物２％
（容量／容量）を、上記無菌ミルクに接種する。このミ
ルクを次いで、約4.65のpHまで42℃でインキュベート
し、次いで４℃に冷却する。
比較の目的で、ヨーグルトの製造に伝統的に使用され
る、S.テルモフィルスの前記菌種YS8およびSFi3ならび
にL.ブルガリクスの菌種YL18を使用して、上記と同様の
方法により、伝統的なセット型ヨーグルトを製造する。
下記の表に、得られた生成物の特徴、特にこれらの４
℃における保存期間の、それらのpHを示す。
例３ S.テルモフィルスCNCM I−1351培養物を用いて、伝統
的方法でモッツアレーロチーズを製造する。
例４ S.テルモフィルスの菌種CNCM I−1351の培養物10リッ
トルを、１％庶糖補給M17培地において、42℃で６時
間、空気を排除した条件の下に製造する。この培養物
に、XAD−７樹脂（Sigma）200gを次いで、直接に添加
し、この全体を４℃で１時間、穏やかに撹拌する。この
混合物を次いで、Schleicher＆Schvellフィルター（ド
イツ国）No.604に通して濾過し、次いでこのフィルター
上に保留されている樹脂を、50mM酢酸溶液、pH5、210リ
ットルにより洗浄して、細菌を除去する。100％エタノ
ールおよび20mM酢酸アンモニウムを含有する溶液450ml
を次いで、この樹脂に添加し、この全体を濾過して、樹
脂を除去し、次いでこの濾液を凍結乾燥させ、本発明に
係わるバクテリオシンを含有する粉末を得る。この粉末
は、食品工業で使用することができる。
この粉末の抗バクテリア活性を、水により稀釈した後
に、前記寒天ウエル試験により測定する。この粉末は、
107au/粉末ｇを示す。
さらにまた、上記粉末0.5g/kgを肉ムースに、それら
の伝統的製造方法中に、添加する。このようにして得ら
れた肉ムースは病原性バクテリア、特にクロストリジウ
ムの発現を完全に抑制することができる、５×103au/g
バクテリオシンを有する。
例５ この例はスキンケアー用のモイスチュアークリームの
製造に関するものであり、このクリームは例４に記載の
粉末0.05g/kgを含有しており、従って皮膚における望ま
しくない細菌の発現を完全に抑制することができる、５
×102au/gバクテリオシンを含有する。
このエマルジョンを製造するためには、脂質相Ａの成
分を混合し、次いで75℃に加熱する。水性相Ｂを調製
し、また75℃に加熱し、次いでゆっくり撹拌しながら、
脂質相Ａに添加し、この混合物を次いで、ゆっくり撹拌
しながら室温、すなわち約25℃まで冷却する。この温度
において、成分Ｃを常法に従い、ゆっくり添加する。脂質相A ％ peg−６−ステアレート、グリセレートおよびpeg−20−
セチルエーテル（peg＝ポリエチレングリコール） 15 ワセリン油 ５ 0.1％フェニルインダン（酸化防止剤）および１％大豆
リン脂質により安定化されている小麦穀物油（EP941093
55.1参照） ３ スイートアーモンド油 ２ セチルアルコール １ イソステアリルイソステアレート ２ ２−オクチル−ドデシル−ミリステート １ ラノリンワックス １ 水性相B ％ メチルイソチアゾリン 0.1 脱鉱物水 59.6 ヒト胎盤蛋白質 ２ 添加物C ％ プロピレングリコールおよびキンセンカエキス ２ 脱鉱物水中、50％可溶性コラーゲン 5.8 香料 0.3 脱鉱物水中の例４に記載の2.5％バクテリオシン粉末 0.2 例６ 例４に記載のバクテリオシン粉末0.5g/kgを、液状歯
磨剤に添加する。この歯磨剤は、口腔内の病原性細菌、
特にストレプトコッカス ソブリヌス（Streptococcus
sobrinus）の発現を抑制することができる。
例７ １％に水により稀釈した例４のバクテリオシン粉末を
含有する溶液を、殺菌しようとする食品上に噴霧して、
包装中の後汚染を防止する。
配列リスト （１）一般情報 （ｉ）出願人： （Ａ）名称:SOCIETE DES PRODUITS NASTLE S.A. （Ｂ）ストリート:Case postal 353 （Ｃ）市名:Vevey （Ｅ）国名：スイス国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:1800 （Ｇ）電話：（021）9244760 （Ｈ）テレファクス：（021）9242880 （ii）発明の名称：ストレプトコッカス テルモフィル
スからのバクテリオシン （iii）配列の数:8 （iv）コンピューター リーディング フォーム： （Ａ）メディウム タイプ：フロッピイデスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパーチブル （Ｃ）オペレーティング システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウエアー:PatentIn Release＃1.0,Version
＃1.25（EPO） （vi）優先出願データ： （Ａ）出願番号:CH2628/93−７ （Ｂ）出願日:1993年９月３日 （２）SEQ ID No:1に係わる情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:62アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の種類：蛋白質 （vi）起源： （Ａ）生物：ストレプトコッカス テルモフィルス（St
reptococcus thermophilus） （Ｂ）菌種:CNCM I−1351 （xi）配列説明:SEQ ID No:1: （２）SEQ ID No:2に係わる情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:43アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の種類：蛋白質 （vi）起源： （Ａ）生物：ストレプトコッカス テルモフィルス（St
reptococcus thermophilus） （Ｂ）菌種:CNCM I−1351 （xi）配列説明:SEQ ID No:2: （２）SEQ ID No:3に係わる情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:770塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖状態（strandedness）：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の種類:DNA（ゲノム） （vi）起源： （Ａ）生物：ストレプトコッカス テルモフィルス（St
reptococcus thermophilus） （Ｂ）菌種:CNCM I−1351 （ix）特徴： （Ａ）名前／キイ:CDS （Ｂ）位置:221…475 （ix）特徴： （Ａ）名前／キイ:sigペプチド （Ｂ）位置:221…289 （ix）特徴： （Ａ）名前／キイ:matペプチド （Ｂ）位置:290…475 （Ｃ）その他の情報:/機能＝「テルモフィリン１をコー
ドする」 （ix）特徴： （Ａ）名前／キイ:CDS （Ｂ）位置:495…686 （ix）特徴： （Ａ）名前／キイ:sigペプチド （Ｂ）位置:495…557 （ix）特徴： （Ａ）名前／キイ:matペプチド （Ｂ）位置:558…686 （Ｃ）その他の情報:/機能＝「テルモフィリン２をコー
ドする」 （xi）配列説明:SEQ ID No:3: （２）SEQ ID No:4に係わる情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:85アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の種類：蛋白質 （xi）配列説明:SEQ ID No:4: （２）SEQ ID No:5に係わる情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:64アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の種類：蛋白質 （xi）配列説明:SEQ ID No:5: （２）SEQ ID No:6に係わる情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:17塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖状態：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の種類:DNA（ゲノム） （iii）仮定：有り （xi）配列説明:SEQ ID No:6: （２）SEQ ID No:7に係わる情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:17塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖状態：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の種類:DNA（ゲノム） （iii）仮定：有り （xi）配列説明:SEQ ID No:7: （２）SEQ ID No:8に係わる情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:128塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖状態：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の種類:DNA（ゲノム） （vi）起源： （Ａ）生物：ストレプトコッカス テルモフィルス（St
reptococcus thermophilus） （Ｂ）菌種:CNCM I−1351 （xi）配列説明:SEQ ID No:8:
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 7/26 Ａ６１Ｋ 7/26 Ｃ０７Ｋ 1/30 Ｃ０７Ｋ 1/30 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 モレ，ビエ スイス国シーエッチ ― 1074 モリー ― マルゴ，ルート デ モリー ― マルゴ（番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/315,1/30 C12N 15/31 C12P 21/00 - 21/06 A61K 7/00 - 7/26 A23C 9/123 A23L 3/3526 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ酸配列SEQ ID NO:1を有する、スト
    レプトコッカス テルモフィルス（Streptococcus ther
    mophilus）バクテリオシン。
  2. 【請求項２】アミノ酸配列SEQ ID NO:2を有する、スト
    レプトコッカス テルモフィルス（Streptococcus ther
    mophilus）バクテリオシン。
  3. 【請求項３】配列SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2から、
    少なくとも１個のアミノ酸の置き換え、欠失および（ま
    たは）挿入により相違していることを特徴とする、同様
    の抗バクテリア活性を有する請求項１または２に記載の
    バクテリオシン。
  4. 【請求項４】請求項１−３のいづれか１項に記載のスト
    レプトコッカス テルモフィルス バクテリオシンの一
    種をコードするヌクレオチド配列。
  5. 【請求項５】請求項１および２に記載のバクテリオシン
    をコードするヌクレオチド配列SEQ ID NO:3を有する、
    請求項４に記載の配列。
  6. 【請求項６】配列SEQ ID NO:3のヌクレオチド221−475
    を含むことを特徴とする、請求項５に記載のヌクレオチ
    ド配列。
  7. 【請求項７】配列SEQ ID NO:3のヌクレオチド289−475
    を含むことを特徴とする、請求項６に記載のヌクレオチ
    ド配列。
  8. 【請求項８】配列SEQ ID NO:3のヌクレオチド495−686
    を含むことを特徴とする、請求項５に記載のヌクレオチ
    ド配列。
  9. 【請求項９】配列SEQ ID NO:3のヌクレオチド558−686
    を含むことを特徴とする、請求項８に記載のヌクレオチ
    ド配列。
  10. 【請求項１０】配列SEQ ID NO:3のヌクレオチド221−28
    8を含むことを特徴とする、請求項６に記載のヌクレオ
    チド配列。
  11. 【請求項１１】配列SEQ ID NO:3のヌクレオチド495−55
    7を含むことを特徴とする、請求項８に記載のヌクレオ
    チド配列。
  12. 【請求項１２】請求項10および11に記載のヌクレオチド
    配列によりコードされる、ストレプトコッカス テルモ
    フィルス シグナルペプチド。
  13. 【請求項１３】請求項１−３に記載のバクテリオシンの
    少なくとも１種を産生する、ストレプトコッカス テル
    モフィルスの菌種、特に請求項１および２に記載のバク
    テリオシンを産生する、ストレプトコッカス テルモフ
    ィルスの菌種CNCM I−1351。
  14. 【請求項１４】請求項１−３に記載のバクテリオシンの
    少なくとも１種の製造方法であって、当該バクテリオシ
    ンの少なくとも１種を産生する、ストレプトコッカス
    テルモフィルスの菌種を培地で、ストレプトコッカス
    テルモフィルスの増殖に好ましい条件の下に、この培地
    が1m1あたりで上記菌種の微生物107−109を含有するま
    で培養し、得られた培養物を遠心分離し、次いで当該バ
    クテリオシンの少なくとも１種を含有する、その上澄液
    の抽出液を製造する、上記製造方法。
  15. 【請求項１５】上記上澄液中に含有されている上記バク
    テリオシンの少なくとも１種の抽出液を製造するため
    に、上記上澄液のpHをH3PO4により1.0−2.0に調整し、
    沈殿を分離し、次いで各沈殿操作の後毎に、三フッ化酢
    酸による水性溶液中における再懸濁を行いながら、１回
    または２回以上、三塩化酢酸により順次沈殿操作を行
    う、請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】上記ストレプトコッカス テルモフィル
    スの菌種が、上記バクテリオシンを産生する、CNCM I−
    1351菌種である、請求項14に記載の方法。
  17. 【請求項１７】請求項１−３に記載のバクテリオシンの
    少なくとも１種を、請求項14に従い得られる抽出液の形
    態で、および（または）当該バクテリオシンの少なくと
    も１種を産生するストレプトコッカス テルモフィルス
    菌種の形態で使用することを特徴とする食品または化粧
    品の製造方法。
  18. 【請求項１８】上記ストレプトコッカス テルモフィル
    ス菌種の培養物を、チーズの製造または酸性化ミルクの
    製造においてスターターとして使用する請求項17記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】上記バクテリオシンの少なくとも１種ま
    たは上記菌種を、添加物または病原性細菌に対する活性
    薬剤として、ムースなどの肉製品の製造においてクロス
    トリジウム ボツリナム（Clostridium botulinum）に
    対する活性薬剤として、あるいはクリームまたはローシ
    ョンの製造において皮膚の病原性細菌に対する活性薬剤
    として、あるいは口腔健康製品の製造において口腔内の
    病原性細菌に対する、特にストレプトコッカス ソブリ
    ヌス（Streptococcus sobrinus）に対する活性薬剤とし
    て使用する請求項17に記載の方法。
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