CZ284978B6 - Bakteriociny, sekvence nukleotidového řetězce pro tyto látky, produkční kmeny, způsob výroby bakteriocinů a jejich použití - Google Patents

Bakteriociny, sekvence nukleotidového řetězce pro tyto látky, produkční kmeny, způsob výroby bakteriocinů a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ284978B6
CZ284978B6 CZ951139A CZ113995A CZ284978B6 CZ 284978 B6 CZ284978 B6 CZ 284978B6 CZ 951139 A CZ951139 A CZ 951139A CZ 113995 A CZ113995 A CZ 113995A CZ 284978 B6 CZ284978 B6 CZ 284978B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
bacteriocins
seq
strain
thermophilin
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
CZ951139A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ113995A3 (en
Inventor
Jacques Edouard Germond
Olivier Marciset
Beat Mollet
Original Assignee
Société des Produits NESTLE S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Société des Produits NESTLE S.A. filed Critical Société des Produits NESTLE S.A.
Publication of CZ113995A3 publication Critical patent/CZ113995A3/cs
Publication of CZ284978B6 publication Critical patent/CZ284978B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0323—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin using only lactic acid bacteria, e.g. Pediococcus and Leuconostoc species; Bifidobacteria; Microbial starters in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/097—Preservation
    • A23C19/10—Addition of preservatives
    • A23C19/11—Addition of preservatives of antibiotics or bacteriocins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1238—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt using specific L. bulgaricus or S. thermophilus microorganisms; using entrapped or encapsulated yoghurt bacteria; Physical or chemical treatment of L. bulgaricus or S. thermophilus cultures; Fermentation only with L. bulgaricus or only with S. thermophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/21—Streptococcus, lactococcus
    • A23V2400/249—Thermophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/885—Streptococcus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Seasonings (AREA)

Abstract

Dva nové bakteriociny mikroorganismu Streptococcus thermophilus mající sekvence aminokyselin SEQ id. č. 1 a SEQ id. č. 2, signálních peptidů těchto dvou bakteriocinů, nukleotidových sekvencí, k'odujících tyto bakteriociny a zvláště operonu, k'odujícího tyto bakteriociny, které má sekvenci SWQ id. č. 3, dále pak kmenů, produkujících alespoň jeden z těchto bakteriocinů a zvláště kmene CNCM l-1351, způsobu výroby supernatantového extraktu, obsahujícího alespoň jeden z těchto dvou bakteriocinů a použití těchto bakteriocinů jako aktivního činidla vůči patogenům při výrobě potravinářských výrobků, zvláště sýrů a zakysaného mléka, stejně jako při výrobě kosmetických výrobků. ŕ

Description

Oblast techniky
Předmětem předkládaného vynálezu jsou dva bakteriociny ze Streptococcus (S.) thermophilus, dále bakteriální kmen (S.) thermophilus, který produkuje tyto bakteriociny, způsob výroby uvedených bakteriocinů z daného kmene a jejich použití, a/nebo použití tohoto kmene, k přípravě potravinářských nebo kosmetických výrobků.
Dosavadní stav techniky
Bakteriocin je antibakteriální látka (substance) nebo činidlo, působící vůči bakteriím, obsahující bílkovinnou část, jež se účastní antibakteriálního nebo antibiotického účinku. Bakteriocin má obecně úzký rozsah aktivity nebo spektrum inhibice, často omezené na druhy, jež jsou blízké druhu bakterií, produkujících bakteriocin.
Běžně jsou známy čtyři bakteriociny S. thermophilus.
První z nich o molekulární hmotnosti 10 až 20 kD je termolabilní při 90 °C a citlivý vůči pepsinu (Smaczny a spoluautoři, Deutsche Molkerei-Zeitung 105 (15), 460-464, 1984).
Druhý z nich, který je v EP 443543 popsán hlavně svým rozsahem inhibice bakterií, má schopnost inhibovat růst bakterií rodů Staphylococcus a Pseudomonas, a nedokáže inhibovat růst bakterií rodů Lactococcus a Enterococcus, stejně jako druhu Bacillus cereus.
Třetí z nich, popsaný Pulusanim se spolupracovníky (J. of Food Science 44 (2), 575-578, 1979) silně inhibuje Pseudomonas, není citlivý vůči pepsinu a obsahuje cukerné zbytky.
Konečně čtvrtý z nich, popsaný Gilanem se spolupracovníky (Microbiologie-Aliment-Nutrition 8, 21-30, 1990), není citlivý vůči pepsinu, obsahuje cukerné zbytky a neprochází membránou o velikosti pórů 100 kD.
(S.) thermophilus má nyní velký význam v potravinářství, neboť se používá zvláště při výrobě mléčných výrobků, jako jsou například jogurty a některé sýry. Kromě toho pak existuje jen velmi málo bakteriocinů, současně působících proti kmenům Bacillus, Clostridium a Listeria. Může být tedy mnohem užitečnější, nebo jinak řečeno, existuje potřeba mít k dispozici širší řadu bakteriocinů, vytvářených představiteli těchto druhů, tak aby existovalo spektrum o širší antibakteriální aktivitě, konkrétně v souvislosti s uvedeným druhem výrobků.
Cílem předkládaného vynálezu je odpovědět na tuto potřebu.
Podstata vynálezu
Jedním z předmětů tohoto vynálezu je charakterizace aminokyselinové sekvence (pořadí aminokyselin) dvou nových bakteriocinů. S. thermophilus, stejně jako signálního peptidů těchto bakteriocinů, který umožňuje jejich sekreci.
Jiným předmětem tohoto vynálezu jsou také nukleotidové sekvence, kódující tyto dva bakteriociny.
- 1 CZ 284978 B6
Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou také kmeny Streptococcus thermophilus, vytvářející alespoň jeden z bakteriocinů podle tohoto vynálezu, zvláště pak níže popsaný kmen S. thermophilus CNCM 1-1351, který je schopen produkovat dva bakteriociny podle vynálezu.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je také způsob výroby extraktu alespoň jednoho z bakteriocinů podle tohoto vynálezu.
Konečně posledním předmětem předkládaného vynálezu je použití bakteriocinů podle vynálezu a použití jejich nukleotidové sekvence.
Kmen CNCM 1-1351 mikroorganismu S. thermophilus byl isolován ze zakvašeného mléčného výrobku z Československa a překvapivě bylo pozorováno, že má značnou schopnost inhibovat růst širokého spektra bakterií. Tento kmen byl uložen 5. 8. 1993, v souladu s Budapešťskou dohodou, v Národní sbírce kultur mikroorganismů (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) Pasteurova ústavu v Rue du docteur Roux č. 25, F-75724 Paris Cedex 15, ve Francii, kde pak byl označen jako č. 1-1351.
Dále jsou uvedeny podrobnosti o tomto kmeni, týkající se zvláště jeho morfologie, schopnosti kvašení cukrů a podobně:
Morfologie:
- Bezbičíkaté koky tvořící řetězec. Nedochází k tvorbě spor.
- Gram-positivní mikroorganismy, negativní vzhledem ke kataláze a fakultativně anaerobní.
Zkvašování cukrů:
- Tvorba kyseliny mléčné z D-glukózy, laktózy, sacharózy, rafinózy. K tvorbě kyseliny mléčné nedochází z mannózy, fruktózy a galaktózy.
Jiné:
- Kmen, vytvářející nejméně dva bakteriociny, jednu imunitní bílkovinu vůči bakteriocinům a exopolysacharidy, mající strukturační (tvarovací) vlastnosti.
Supematant z kultury kmene CNCM 1-1351 má proto poměrně široké spektrum antibakteriální aktivity. K bakteriím, citlivým vůči tomuto supematantu, patří například Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis biovar diacetilactis, Lactococcus cremoris, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc mesenteroides, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobcaterium infantis,Propionibacterium, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Micrococcus varians a spory a vegetativní buňky mikroorganismu Clostridium botulinum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium bifermentans, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus a Bacillus cereus (dle knihy Bactéries lactiques, díl 1, 1994, vydání Lorica).
Z tohoto kmene CNCM 1-1351 bylo tedy možné isolovat dva bílkovinné faktory nazývané bakteriociny, které odpovídají za uvedenou antibakteriální aktivitu.
První bakteriocin podle vynálezu, kteiýje v tomto popisu nazýván „termofilin 1“, má sekvenci SEQ identifikační č. 1, popsanou v dále uvedeném seznamu sekvencí.
-2CZ 284978 B6
Dále je možné předpokládat, že tento bakteriocin může mít antibakteriální aktivitu se širším nebo specifičtějším spektrem vůči jednomu rodu nebo jednomu bakteriálnímu druhu, než jakou prokázal termofilin 1, pokud se jeho sekvence bude lišit od sekvence SEQ id. č. 1 substitucí, delecí a/nebo insercí například nejméně jedné aminokyseliny. Z EP 521240 je již skutečně známo, že nisin Z má mnohem výhodnější spektrum aktivity než nisin A, zatímco se odlišuje pouze substitucí jedné aminokyseliny.
Druhý bakteriocin podle vynálezu, který je v tomto popisu nazýván „termofilin 2“, má sekvenci SEQ id. č. 2, popsanou v dále uvedeném seznamu sekvencí. Je rovněž možné předpokládat, že tento bakteriocin může mít antibakteriální aktivitu, pokud se jeho sekvence bude lišit o sekvence SEQ id č. 2 substitucí, delecí a/nebo insercí například nejméně jedné aminokyseliny.
Nukleotidové sekvence, kódující termofilin 1 a termofilin 2 jsou navíc dalším předmětem předkládaného vynálezu, neboť každá z nich může být prostřednictvím transformace použita k přenesení schopnosti inhibice některých bakterií například na bakterie kvasinky nebo rostliny. Tyto nukleotidové sekvence tedy musejí být s ohledem na degeneraci genetického kódu poměrně variabilní a zvláště mohou být zahrnuty do jednoho operonu kmene CNCM 1-1351 o nukleotidové sekvenci SEQ id. č. 3, popsané v dále uvedeném seznamu sekvencí.
Zejména je možné použít nukleotidovou sekvenci, obsahující nukleotidy 221 až 475 ze sekvence SEQ id. č. 3, která kóduje termofilin 1 a jeho signální peptid. Je ovšem výhodnější použít pouze sekvenci signální peptidů, kódovanou nukleotidy 221 až 288 sekvence SEQ id. č. 3, a spojit ji s genem o nějž se jedná, tak aby bylo umožněno vylučování proteinu, kódovaného tímto genem, prostřednictvím kmene Streptococcus thermophilus. Obdobně je mnohem výhodnější použít pouze sekvenci, kódující vylučovaný termofilin 1, tvořenou nukleotidy 289 až 475 sekvence SEQ id. č. 3, k připojení na signální sekvenci například plazmidu exprese, což umožní její expresi v organismu, odlišném od S. thermophilus.
Podobně lze použít nukleotidovou sekvenci, obsahující nukleotidy 495 až 686 sekvence SEQ id. č. 3, která kóduje termofilin 2 s jeho signálním peptidem. Je ovšem mnohem výhodnější použít pouze sekvenci signálního peptidů, kódovanou nukleotidy 495 až 557 sekvence SEQ id. č. 3, tak aby bylo umožněno vylučování jakékoli bílkoviny, připojené na tento peptid, prostřednictvím kmene Streptococcus thermophilus. Obdobně je mnohem výhodnější použít pouze sekvenci, kódující vylučovaný termofilin 2, tvořenou nukleotidy 558 až 686 sekvence SEQ id. č. 3, k připojení na signální sekvenci například plazmidu exprese, tak aby byla umožněna její exprese v organismu, odlišném od S. thermophilus.
Konečně, neboť bylo pozorováno, že některé kmeny S. thermophilus, odlišné od kmenu CNCM 1-1351, vykazují podobné inhibiční spektrum jako vykazuje kmen CNCM 1-1351 a odolnost vůči posledně uvedenému (zvláště kmeny Sfí 12 a 25 popsané dále), je vysoce pravděpodobné, že tyto kmeny mohou produkovat nejméně jeden z bakteriocinů podle předkládaného vynálezu současně s imunitní bílkovinou, zajišťující tuto odolnost.
Při způsobu výroby extraktu, obsahujícího alespoň jeden bakteriocin podle předkládaného vynálezu, se kmen S. thermophilus, který produkuje nejméně jeden z uvedených bakteriocinů, pěstuje v médiu za podmínek vhodných k růstu S. thermophilus tak dlouho, dokud médium neobsahuje 107 až 109 mikroorganismů tohoto kmene v 1 mililitru, poté se získaná kultura odstředí a připraví se extrakt supematantu, obsahující alespoň jeden z uvedených bakteriocinů.
K výrobě tohoto extraktu může být kmen S. thermophilus, produkující alespoň jede bakteriocin podle předkládaného vynálezu, zvláště kmen CNCM 1-1351 S. thermophilus, pěstován v médiu za podmínek vhodných pro růst S. thermophilus. Může být pěstován zejména v médiu MSK (odstředěném kravském mléku, doplněném kvasničným extraktem), nebo například v médiu HJ (ultrafiltrátu kravského mléka, doplněného kvasničným a sojovým extraktem). S výhodou se
-3CZ 284978 B6 pěstuje v médiu, které je selektivní pro Streptococcus, jako je médium M 17, které popsal P. E. Terzaghi se spoluautory v J. Appl. Microbiol. 29, 87-813, 1975, doplněném 0,5 až 2 % cukru, který může být zkvašován kmenem S. thermophilus, zvláště například sacharózou, laktózou nebo glukózou.
Takové médium může být připraveno smísením 95 ml základního média a 5 ml roztoku, obsahujícího 10 g zkvasitelného cukru na 100 ml vody, přičemž roztoky zkvasitelného cukru a základního média byly každý nejprve odděleně sterilizovány při 121 °C po dobu 15 minut a základní médium bylo připraveno rozpuštěním následujících složek v 950 ml vroucí vody:
- trypsinový hydrolyzát kaseinu 2,5g
- pepsinový masový hydrolyzát 2,5g
- pepainový hydrolyzát sojových bobů 5,0g
- kvasničný extrakt 2,5g
- masový extrakt 5,0g
- beta-glycerofosfát19 g
- síran hořečnatý 0,25 g
- kyselina askorbová 0,5g
Uvedený kmen může být pěstován ve zmíněném médiu, vhodném pro růst S. thermophilus, při 37 až 48 °C, například po 2 až 8 hodin, dokud médium neobsahuje přibližně 107 až 109 mikroorganismů tohoto kmene v 1 ml; hodnota asi 108 mikroorganismů/ml odpovídá na jedné straně hodnotě asi 3,6 optické density média, měřené při 600 nm (OD 600), a na druhé straně koncentraci dosažené v kravském mléku v okamžiku, kdy se mléko sráží (koaguluje) účinkem okyselování, vyvolaného pěstovaným kmenem.
K přípravě surového extraktu uvedeného supematantu je možné použít jakékoli vhodné precipitační metody, jako je například srážení kyselinou trichloroctovou, „vysolování“ nebo srážení rozpouštědlem. K přípravě tohoto surového extraktu se pH extraktu s výhodou upravuje na 1,0 až 2,0 pomocí kyseliny fosforečné, sraženina se odstraní a provede se jedno či více vysrážení kyselinou trichloroctovou, následované vždy opakovaným rozmícháním ve vodné suspenzi s kyselinou trifluoroctovou.
Použití bakteriocinů a/nebo kmene Streptococcus thermophilus, produkujícího tyto bakteriociny podle předkládaného vynálezu, umožňuje výrobu potravinářských výrobků nebo kosmetických výrobků.
Kultura uvedeného kmene Streptococcus thermophilus může být použita zvláště jako zákvas při výrobě sýrů, zejména pak sýrů typu „mozzarella“ (k zabránění vzniku otvorů, vytvářených mikroorganismem Bacillus polymixa, jehož spory přežívají kvašení), sýrů švýcarského typu (jako je „Gruyere“ nebo „Emmental“, kboji s kontaminací mikroorganismem Clostridium tyrobutyricum), sýrů typu vacherin (k zabránění kontaminace mikroorganismy Listeria monocytogenes) a sýrů typu „žervé“ (francouzské označení měkkého nebo smetanového sýra), nebo při výrobě zakysaných mléčných výrobků, zvláště jogurtů, nebo například sušeného mléka pro dětské přípravky.
Konkrétně může být uvedený kmen Streptococcus thermophilus pěstován v mléce v kombinaci s kmenem Lactobacillus bulgaricus, který je slabě citlivý vůči tepmofilinu (například níže popsaný kmen YL5), k zabránění pozdějšího okyselování jogurtů, vyvolaného L. bulgaricus.
Zmíněné bakteriociny, zvláště ve formě surového nebo vyčištěného extraktu, anebo uvedený kmen, lze rovněž použít jako přídavné nebo účinné činidlo vůči patogenním bakteriím, zvláště při výrobě masových výrobků jako jsou pěny (mousses), jako aktivní činidla vůči růstu spor klostridií, zvláště rodu Clostridium botulinum, nebo při výrobě krémů a emulsí, jako aktivní
-4CZ 284978 B6 činidlo vůči patogenním bakteriím kůže, anebo při výrobě prostředků ústní hygieny, jako aktivní činidla vůči patogenním bakteriím v ústní dutině, zvláště například proti Streptococcus sobrinus. Bakteriociny podle předkládaného vynálezu jsou níže velmi podrobně charakterizovány různými mikrobiologickými, biochemickými a genetickými údaji, které dokládají jejich vlastnosti. Procentní údaje jsou uvedeny v hmotnostních procentech.
Jednotka antibakteriální aktivity - „Jamkový agarový test“
V rámci předkládaného popisu je antibakteriální aktivita definována v termínech arbitrámích jednotek.
Jedna arbitrámí jednotka (au, arbitrary unit) je definována jako převrácená hodnota nejvyššího zředění, při němž vzorek stále ještě vykazuje antibakteriální aktivitu v testu, který je odborníkům známý pod názvem Jamkový agarový test“ (Agar Well-Test), což je anglický výraz pro test, využívající jamku, vyříznutou do agaru.
Standardní vzorek supematantu kultury S. thermophilus podle předkládaného vynálezu, připravený za standardních podmínek, doložených v Příkladu 1, typicky vykazuje aktivitu 32 au na objem 70 μΐ. To znamená aktivitu 460 au/ml.
Standardní surový extrakt bakteriocinu, získaný z kultivačního supematantu, uvedeného v Příkladu 1, pročištěním s následným opakovaným srážením kyselinou trichloroctovou, po němž bylo vždy provedeno opětné rozmíchání ve vodnou suspenzi s kyselinou trifluoroctovou, typicky vykazuje aktivitu přibližně 1,4 x 105 au/ml.
Pomocí zmíněného agarového testu se stanovuje má-li vzorek při dané hodnotě zředění stále ještě antibakteriální aktivitu.
K tomu se do Petriho misky nalije 35 ml média M 17 a přidá se k němu 1% sacharózy a 1,5% agaru.
ml média M 17 s 1% sacharózou a 0,75% agarem se naočkuje 5 μΐ kultury, připravené během předchozí noci, kmene S. thermophilus, který je typicky citlivý vůči přítomnému bakteriocinu (typický indikátor), v tomto případě se například používá kmen Sfi3.
ml se nalije na 35 ml a ponechá zaschnout po dobu 15 minut v podmínkách laminámího proudění. Do kultivačního média se vyříznou jamky (dírky) o průměru 5 mm.
Testované vzorky jsou nality do jamek v množství 70 μΐ na jamku. Inkubace probíhá po dobu hodin v anaerobních podmínkách při 42 °C. Během této inkubace se napěstuje typický indikační kmen a inhibiční kruhové zóny jsou viditelné. Zředění, při němž vzorek již nevykazuje antibakteriální aktivitu, je takové zředění, od kterého už nelze rozeznat inhibiční kruhovou zónu.
Inaktivace enzymů
Pomocí uvedeného jamkového agarového testu, v agaru naočkovaném zmíněným typickým indikátorovým kmenem jak bylo popsáno výše, se stanovuje, zda jsou předkládané bakteriociny inaktivovány různými enzymy.
U všech používaných enzymů kromě lipázy se přidává 1 μg/ml až 10 mg/ml enzymu k uvedenému standardními surovému extraktu, zředěnému 33x v pufru, doporučeném dodavatelem enzymu, tak, aby byly získány vzorky o objemu 70 μΐ a aktivitě 300 au. Poté je enzym, před
-5CZ 284978 B6 umístěním celku do jamky v agarové testovací plotně, ponechán působit 30 minut při teplotě doporučované jeho dodavatelem.
Naproti tomu se u komerční lipázy nejprve přidá 1 μΐ směsi inhibitorů (1,23 M EDTA; 0,25% pepstatin A (p4265 Sigma); 0,2% E-64 (E3132 Sigma); 0,25% aprotinin (AI 153 Sigma) ke 100 μΐ roztoku, obsahujícího 200 μg/ml lipázy, inhibitory jsou ponechány účinkovat 45 minut při laboratorní teplotě, poté se přidá 5 μΐ (450 au) zředěného standardního surového extraktu a ponechá se reagovat 30 minut při 37 °C a pak je do jamky v testovacím agaru přeneseno 70 μΐ směsi. K naředění se používají následující pufry:
- pH 2,0: 100 mM kyselina maleinová upravená pomocí NaOH,
- pH 7,0: 100 mM fosfátový pufr (K2HPO4/KH2PO4),
- pH 7,5: 100 mM fosfátový pufr (K2HPO4/KH2PO4),
-pH 7,75: lOOmMTris-Cl
Průměr inhibiční kruhové zóny je srovnáván s kontrolním průměrem kruhové zóny, vzniklé bez přídavku enzymu, který má pro každý pufr a pro každou teplotu inkubace hodnotu přibližně 14 mm.
Níže uvedená Tabulka I předkládá výsledky, získané pro testované enzymy. V této tabulce jsou enzymy popsány svým typem, jménem svého dodavatele a číslem položky u tohoto dodavatele. Inaktivace bakteriocinu je udána jako funkce koncentrace přidaného enzymu. Hodnota 0 znamená, že již nevzniká žádná kruhová zóna, jinými slovy, že antibakteriální aktivita předkládaného bakteriocinu byla zničena inkubací s enzymem. Hodnota 14 znamená, že stále přetrvává kruhová zóna o průměru 14 mm, odpovídající plné antibakteriální aktivitě předkládaného bakteriocinu.
Tabulka I
enzymy koncentrace (pg/ml) pH pufru inkubační teplota (°C) inaktivace (mm)
pepsin (Sigma P-700) 10 2,0 37 0
proteináza K (Měrek 1000 144) 4 7,0 37 0
ficin (Sigma P-3266) 10 7,0 37 0
pronáza E (Sigma P-8038) 10 7,5 37 0
nagaráza (Sigma P-4789) 10 7,5 37 0
trypsin (Sigma T-8128) 10 7,5 25 0
α-chymotrypsin (Sigma C-7762) 1 7,75 25 0
kataláza (Sigma C-10) 10 000 7,75 25 14
α-amyláza (Sigma A-0521) 1 7,75 25 14
lipáza (Sigma L-0382) + inhibitory proteázy 1 7,75 25 14
Všechny proteázy inhibují antibakteriální aktivitu supematantu, což ukazuje, že část bílkoviny je zapojena v této aktivitě.
Skutečnost, že nebyl pozorován žádný účinek katalázy na antibakteriální aktivitu bakteriocinů také ukazuje, že inhibice růstu typického indikačního kmene není způsobena antibakteriální aktivitou H2O2, o němž je známo, že vykazuje aktivitu podobnou bakteriocinům, neboť H2O2 by bylo možné rozkládat katalázou.
Podobně skutečnost, že nebyla pozorována žádná inaktivace antibakteriální aktivity účinkem α-amylázy prokazuje nepřítomnost cukrů, hydrolyzovatelných α-amylázou, které by se účastnily této antibakteriální aktivity.
Kromě toho skutečnost, že lipáza neovlivňuje antibakteriální aktivitu, také prokazuje nepřítomnost lipidového podílu, který by se účastnil této aktivity.
Inhibiční spektrum
Pomocí jamkového agarového testu, prováděného na agaru, naočkovaném různými kmeny spor nebo bakterií, se určí, zda kultivační supematant kmene CNCM 1-1351, produkujícího dva bakteriociny podle vynálezu, vykazuje inhibiční aktivitu vůči růstu těchto různých bakterií. Jinak řečeno se pro tento supematant určí inhibiční spektrum.
Kjeho určení se inhibiční účinek na růst testovaného kmene, způsobený vzorkem supematantu, který vykazuje aktivitu 300 au při pH 7,0, sleduje v závislosti na účinku stejného vzorku, předem deaktivovaného 30 minutovou inkubací při 37 °C v přítomnosti 5 pg/ml proteinázy K, který je obvykle nulový.
K provádění těchto stanovení se používají mnohajamkové destičky pro tkáňové kultury (Multiwell tissue culture plates) FALCON 3046. 6 ml média M17, obsahujícího navíc 1% laktózy a 1,5 % agaru (médium M17L) se překryje 700 μΐ média Ml7, doplněného 1 % laktózy a 0,6 % agaru, naočkovaným 1 % kultury testovaného kmene, připravené během předcházející noci a naředěné na OD6oo o hodnotě 0,1.
Pokud má testovaný kmen růst ze spor, k očkování se používá 105 až 106 spor na 1 ml krycího média.
Pokud není testovaným kmenem Lactococcus Streptococcus nebo Enterococcus, je médium M17L nahraženo standardním médiem, vhodným pro růst příslušných bakterií, zvláště médiem MRS, doplněným 2% glukózou v případě mikroorganismu Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc a Bifidobacterium (Sanofi Diagnostics Pasteur, Francie), médiem RCM v případě spor a vegetativních buněk bakterie Clostridium (Oxoid, Anglie) a médiem BHI (Difco, USA) v případě jiných testovaných bakterií.
Do plotny jsou vyříznuty dvě jamky o průměru 5 mm a hloubce rovněž 5 mm. Do jedné z nich se umístí vzorek přítomného bakteriocinu o objemu 70 μΐ a aktivitě 300 au a do druhé jamky se umístí stejný vzorek, předem dezaktivovaný. Inkubace se provádí při teplotě, vhodné pro růst testovaného kmene po dobu, která je nutná k pokrytí plotny viditelným bakteriálním nárůstem.
Účinek nebo stupeň inhibice je charakterizován průměrem pozorované kruhové inhibiční zóny. Inhibice je považována za velmi silnou (++++), pokud má kruhová zóna průměr 16 až 18 mm, za silnou (+++) při průměru zóny 11,5 až 15,5, za průměrnou (++) při průměru 7,5 až 11, za slabou (+) při průměru 5 až 7,5 a za nulovou (-), pokud není pozorována žádná kruhová zóna.
Testováno bylo více než 74 kmenů bakterií kyseliny mléčné různých druhů a poddruhů a bylo zjištěno, že pouze asi 7% z nich je odolných vůči supematantu. Podrobné výsledky těchto testů jsou uvedeny níže v Tabulce II. V Tabulce II, stejně jako v následujících tabulkách, je jméno kmene nebo číselné označení číslem, které se vztahuje k údaji ve sbírce Nestlé (adresa: NESTEC S.A., Research Centre, Vers-chez-les-Blanc, CH-1000 Lausanne 26, Švýcarsko). Udaná teplota označuje inkubační teplotu během testování.
-7 CZ 284978 B6
Tabulka II
druh číslo t(°C) inhibice
Streptococcus thermophilus YS3 42 +++
(Kmeny Sfi 12 a 25 vykazují YS4 42 +++
odolnost vůči kmenu CNCM YS11 42 +++
1-1351 a podobné spektrum YS7 42 +++
antibakteriální aktivity jako YS8 42 +++
tento kmen) YS20 42 +++
(Kmen STU vykazuje odolnost Sfi3 42 +++
pouze vůči kmenu CNCM Sfi 18 42 +++
1-1351; zdá se však, že Sfi 19 42 +++
prokázat takovou odolnost je Sfi20 42 +++
schopno méně Sfi 16 42 +++
než 5% streptokoků) ST11 42 -
Sfil2 42 —
Sfi25 42 —
Lactococcus lactis SL2 30 ++
(producenti nisinu) SL13 30 ++
SL16 30 ++
SL25 30 ++
SL31 30 ++
SL63 30 ++
Lactococcus lactis SLP26 30 ++
SLP29 30 ++
SLP24 30 ++
SL64 30 ++
SL58 30 ++
SL40 30 ++
Lactococcus lactis biovar diacetylactis SD39 30 ++
SD80 30 ++
SD57 30 ++
SD11 30 ++
SD113 30 ++
Lactococcus cremoris SC20 30 ++
SC15 30 ++
SC11 30 ++
SC145 30 ++
SC63 30 ++
SC28 30 ++
Enterococcus faecalis SFS1 30 +
SFS2 30 +
SFS10 30 +
Enterococcus faeciuum SFM1 30 ++
SFM3 30 ++
SFM6 30 ++
SFM10 30 ++
SFM14 30 ++
SFM9 30 +
-8CZ 284978 B6
Tabulka II - pokračování
druh číslo t(°C) inhibice
Lactobacillus fermentum L26 30 ++
L50 30 ++
L28 30 ++
LF16 30 -H-
LF15 30 ++
Lactobacillus helveticus LH92 40 -H-H-
LH2 40 +++
LH3 40 +++
LH1 40 +++
Lactobacillus acidophilus LQ1 40 ++
LQ3 40 +
LQ10 40 -H-
LQ21 40 +
LQ23 40 -H-H-
LQ26 40 -
Lactobacillus brevis LB2 30 +++
LB10 30 -
LB13 30 +++
Lactobacillus bulgaricus YL12 40 ++++
YL2 40 +
YL5 40 ++
YL32 40 +++
Leuconostoc cremoris LCC1 30 ++
LCC7 30 ++
LCC2 30 ++
Leuconostoc mesenteroides LCM9 30 ++
LCM10 30 ++
LCM18 30 ++
Z uvedené Tabulky lije zřejmé, že inhibiční spektrum supematantu je úzké v tom smyslu, že pro určité druhy Lactobacillus, jako je například Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis a Lactobacillus bulgaricus je stupeň inhibice rozdílný, heterogenní. Avšak pro jiné druhy jako je například L. fermentum, L. helveticus a Lactococcus je stupeň inhibice stejný.
To je výhodné vzhledem ke skutečnosti, že je velmi obtížné rozlišit jeden kmen od druhého v rámci stejného druhu. Je tedy možné předpokládat výhodné použití supematantu nebo vyčištěných bakteriocinů pro rozlišení průmyslových kmenů.
Rovněž je možné předpokládat využití kmene, produkujícího alespoň jeden bakteriocin podle předkládaného vynálezu, v kultuře spolu s jinou bakterií kyseliny mléčné, která je přirozeně odolná, nebo jen slabě citlivá vůči bakteriocinů (bakteriocinům), vytvářenému v médiu. Takto například mohou být vyráběny zvláště jogurty, které vykazují snížené pozdní okyselování (acidifikaci).
Rovněž bylo pozorováno, že supematant inhibuje růst šesti kmenů L. lactis, produkujících nisin, což prokazuje, že předkládaným bakteriocinem není nisin. Potvrzuje to i skutečnost, že
-9CZ 284978 B6 předkládaný bakteriocin je inaktivován trypsinem v koncentraci 10 pg/ml (viz Tabulka I), což neplatí v případě nisinu.
Inhibiční spektrum supematantu kultury, vytvářející dva bakteriociny podle vynálezu, je však 5 široké také v tom smyslu, že není omezeno jen na druhy bakterií mléčného kvašení, ale že zahrnuje i jiné druhy Gram-positivních bakterií, zejména potravinářské bakterie Bifidobacterium, nežádoucí nebo patogenní bakterie Propionibacterium, Listeria innocua, Listeria monocytogenes a Micrococcus varian, a spory a buňky mnoha patogenních bakterií například rodu Clostridium a Bacillus, jak ukazují výsledky uvedené v Tabulce III.
Tabulka III
druh číslo t(°C) inhibice
Bifidobacterium breve BBR27 37 +++
BBR4 37 +++
BBR39 37 -H-+
Bifidobacterium longum BL20 37 +++
BL18 37 +++
BL22 37 +++
Bifidobacterium bifidum BB7 37 +++
BB9 37 +++
BB12 37 +++
Bifidobacterium infantis B16 37 +++
Bil 37 +++
Propionibacterium PPI 30 +++
Clostridium botulinum CB1 37 -H-
(spory a vegetativní buňky) CB2 37 ++
Clostridium tyrobutyricum 107001 30 +
(spory a vegetativní buňky) 107002 30 +
SMĚS SPÓR mikroorganismů:
Clostridium sporogenes 100021
Clostridium fermentum 100022 30 -H-
Clostridium botulinum A-69; B-213; BKA40; B-73-211;
(6 kmenů) A-80-124clovis; B-l- -NCA
Listeria innocua 24 30 +
25 30 +
27 30 -1-
39 30 +
40 30 +
41 30 +
Listeria monocytogenes 57 30 ++
58 30 ++
59 30 ++
60 30 ++
61 30 ++
62 30 ++
- 10CZ 284978 B6
Tabulka III - pokračování
druh číslo t(°C) inhibice
Bacillus subtillis A2 30 ++
(spory a vegetativní buňky) A3 30 ++
A13 30 ++
A14 30 ++
A15 30 ++
Bacillus pumilus (spory a vegetativní buňky) B2 30 ++
Micrococcus varians MCV1 30 ++
Micrococcus luteus (indikátor nisinu) MCL1 30 —
Výsledky uvedené v Tabulce III umožňují, kromě jiného, předpokládat výhodné použití tohoto supematantu nebo vyčištěných bakteriocinů v podobě přídavných složek při přípravě potravinářských výrobků, kde budou působit jako aktivní činidla vůči patogenním agens, zvláště pak vůči Clostridiu v masných výrobcích, vůči Listerii monocytogenes a C. tyrobutyricum v sýrech, nebo například vůči Bacillu v čerstvých těstovinách či omáčkách pro čerstvé těstoviny, z nichž výše uvedené kmeny ve skutečnosti pocházejí.
Konečně přítomné bakteriociny nevykazují žádný inhibiční účinek na růst Gram-negativních bakterií, jak lze vidět z dále uvedené Tabulky IV.
Tabulka IV
druh číslo t(°C) inhibice
Escherichia coli BZ234 37 _
Salmonella thyphimurium 274 37 _
273 37 —
Pseudomonas aeruginosa 5 37 _
13 37
Pseudomonas fluorescens 11 37 —
12 37 -
Tepelná odolnost, stabilita
Bakteriociny přítomné v extraktu, který byl získán za podmínek, popsaných v Příkladu 1, nevykazují dobrou stabilitu při uchovávání ve 4 °C, pokud extrakt nebyl předem zahříván. Vykazují však dobrou stabilitu, pokud se extrakt ostře zahřeje alespoň po dobu 15 minut například na teplotu 90 až 121 °C.
Zvláště bylo potvrzeno, že se více než 50 % aktivity takového extraktu zachová po 5 měsících uchovávání při 4 °C, pokud byl předem zahříván 20 minut při 94 °C například ve vodní lázni. Rovněž bylo potvrzeno, že 100% aktivity je uchováno po zahřátí uvedeného extraktu na 60 minut při 100 °C (test byl prováděn v olejové lázni s termostatem za použití 1 ml koncentrovaného supematantu, nebo v kultuře kmene S. thermophilus podle předkládaného postupu).
- 11 CZ 284978 B6
Na druhou stranu si však předkládané bakteriociny uchovávají jen asi třetinovou aktivitu po sterilizaci, probíhající například 30 minut při 121 °C (test byl prováděn se 40 ml nekoncentrovaného supematantu kultury kmene S. thermophilus podle předkládaného postupu).
Konečně bylo pomocí ultrafiltračních testů na filtrech Amicon, po nichž následovala elektroforéza v gelu (SDS-PAGE), zjištěno, že bakteriociny podle předkládaného vynálezu v supematantu kultury S. thermophilus, a zvláště v supematantu standardní kultury, získaném v Příkladu 1, existují ve formě agregátů o molekulové hmotnosti (Mw) větší než 10 kDa, z nichž 67 % vykazuje Mw menší než lOOkDa a 33 % vykazuje Mw větší než 100 kDa.
Vyčištění bakteriocinů
V následujícím popisu jsou procentní údaje, týkající se kyseliny trifluoroctové a acetonitrilu, uvedeny v objemových procentech.
Jeden litr kultury kmene CNCM 1-1351 je vytvářen v médiu M17, doplněném 1 % sacharózy, 6 hodin při 42 °C a v anaerobních podmínkách.
Potom se přímo do kultury přidá 20 g pryskyřice XAD-7 (Sigma) a celá směs se mírně míchá 1 hodinu při 4 °C. Poté se zfiltruje přes filtr firmy Schleicher & Schvell (SRN) č. 604 a pryskyřice zachycená filtrem se následně promyje 1 litrem 50 mM roztoku kyseliny octové o pH 5,2 k odstranění bakterií. Pak se pryskyřice nalije do sloupce a bakteriociny se vymývají 45 ml roztoku, obsahujícího 70% acetonitrilu a 0,1 % kyseliny trifluoroctové (TFA). Tím je získán eluát, obsahující oba bakteriociny.
Tyto dva eluované bakteriociny jsou dále rozděleny následujícím způsobem.
Objem eluátu se nejprve zmenší odstředěním a lyofilizací (na přístroji Speedvac, Savant Instrument) na 24 ml; získaný objem se potom upraví pomocí 2M NaCl a 250 mM Tris.Cl o pH 8,0 na objem 50 ml, který je pak nanesen na sloupec tvořený „Phenyl Superose HR 16/10“ (Pharmacia) s hydrofobními interakcemi, předem ekvilibrovaný pufrem, obsahujícím 50 mM Tris.Cl o pH 8,0 a 2M NaCl. Potom se sloupec postupně promývá 200 ml ekvilibračního pufru, 100 ml lineárního gradientového roztoku o výchozím složení ekvilibračního pufru a konečném složení roztoku 50 mM Tris.Cl o pH 8,0, opět 100 ml předcházejícího roztoku, 60 ml čisté vody, 60 ml roztoku 50 mM Tris.Cl o pH 8,0 a konečně 60 ml čisté vody, vždy rychlostí 4 ml/minutu.
μΐ každého podílu, jímaného při výstupu ze sloupce, se potom zředí 50 μΐ 0,1% TFA a antibakteriální aktivita každé směsi se testuje dříve popsaným jamkovým testem v agaru.
Po zjištění, že podíly 470 až 490 (v ml) vykazují antimikrobiální aktivitu, se tyto frakce smíchají, objem vzniklé směsi se sníží odstředěním a lyofilizací na 1 ml a je nanesen na sloupec „Pep RPC HR 5/5 (Pharmacia), předem ekvilibrovaný roztokem 0,1% TFA, označovaným v tomto popisu jako „roztok A“. Dále je připraven eluční roztok „B“, obsahující 70 % acetonitrilu a 0,097 % TFA. Potom se sloupec podstatně promývá 1 ml roztoku A, 9 ml lineárního gradientového roztoku o výchozím složení roztoku A a o konečném složení, odpovídajícím směsi roztoků A a B v poměru 50:50, 2 ml lineárního gradientového roztoku o výchozím složení, odpovídajícím posledně uvedené směsi a o konečném složení odpovídajícím „druhé“ směsi roztoků A a B v poměru 20:80, 2 ml lineárního gradientového roztoku o výchozím složení totožném s „druhou“ směsí a o konečném složení roztoku B a konečně 2 ml tohoto posledního roztoku, vždy rychlostí 1 ml/minutu.
Antibakteriální aktivita frakcí, jímaných při výstupu ze sloupce se určuje jamkovým testem v agaru podle předchozího popisu. Aktivitu vykazují všechny podíly 14 až 22 (v mililitrech). Na
- 12CZ 284978 B6 druhou stranu dvě hlavní maxima bílkoviny, pozorované při optické densitě 215 nm, lze rozlišit v podílech 15 a 21 (v mililitrech).
Sekvenování bakteriocinů
N-koncová část bílkovin, obsažených v podílech 15, 18, 20, 21 a 22, se sekvenuje za použití automatického sekvenátoru Applied Biosystems 4774.
Přítomnost peptidu o sekvenci 48 aminokyselin, která je pro N-koncovou část shodná se sekvencí SEQ id. č. 1, byla nalezena v podílu 15. Jiný peptid, přítomný převážně v podílu 21, rovněž vykazoval sekvenci 23 aminokyselin, shodnou pro N-koncovou část se sekvencí SEQ id. č.2.
Tyto výsledky proto ukazují, že kmen CNCM 1-1351 produkuje dva peptidy s antibakteriální aktivitou. Avšak odlišný výskyt inhibičních kruhových zón, získaných mezi podíly 15 a 21, umožňuje uvažovat možnost odlišné antibakteriální aktivity mezi termofilinem 1 a termofilinem 2 podle tohoto vynálezu.
Na druhé straně aminokyselinové složení podílů 15 a 21, předem hydrolyzovaných 6NHC1 při 100 °C po dobu 24 hodin, bylo stanovováno známou metodou „derivatizace dansylchloridem“. Výsledky ukazují, že složení aminokyselin každého podílu zřejmě odpovídá jejich příslušné peptidové sekvenci.
Konečně byly podíly 15 a 21 testovány také pomocí hmotnostní spektrometrie. Pro termofilin 1 byla nalezena molekulová hmotnost v řádu 5 800 Daltonů a pro termofilin 2 molekulová hmotnost řádově 3 900 Daltonů.
Sekvenace genů pro bakteriociny
Degenerované nukleotidové sekvence SEQ id. č. 6 a SEQ id. č. 7, popsané v níže uvedeném seznamu sekvencí, které odpovídají N-koncové části a C-koncové části dříve sekvenovaného peptidu termofilinu 1, se vyrábějí běžným způsobem.
Jedné části směsi sekvencí SEQ id. č. 6 je poté účinkem T4 polynukleotidkinasy dodána radioaktivita, jak je popsáno v laboratorní příručce „Molecular cloning, a laboratory manual“ (druhé vydání, Sambrook se spoluautory, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989), nazývané v tomto popisu „Maniatis“.
Poté se provádí polymerázová řetězová reakce (PCR, polymerace chain reaction), za pomoci dvou neradioaktivních směsí degenerovaných sekvencí SEQ id. č. 6 a SEQ id. č. 7, na preparátu chromozomální DNA kmene CNCM 1-1351, tak jak je popsáno v příručce „PCR technology“ (editor H. A. Erdlich, M stockton press, Londýn).
V elektroforézovém gelu se pak objeví pruh 128 párů bází (pb), který se vymývá podle Maniatise. Část se klonuje přímo do plazmidu pGEM-T (Promega) podle pokynů dodavatele a je pak sekvenována „dideoxynukleotidovou“ metodou podle Maniatise, za použití universálních sond pUC 19. Získá se tak sonda o sekvenci SEQ id. č. 8, popsaná v dále uvedeném seznamu sekvencí, odpovídající sekvenci, která kóduje aminokyseliny 9 až 47 termofilinu 1. Nakonec je dodána radioaktivita i druhé části vymytého pruhu 128 pb způsobem nazývaným „náhodné primování“ (random priming) podle Maniatise.
Na druhé straně se provádí digesce (vymývání) chromozomálního preparátu DNA z kmene CNCM 1-1351 enzymy EcoRI a HindlII podle pokynů dodavatele enzymů, poté se 10 pg
- 13 CZ 284978 B6 produktu digesce nechá projít analytickým elektroforézovým gelem, DNA se v alkalickém médiu převede z gelu do membrány „sondy Zeta“ (Biorad), membrána se prehybridizuje přes noc při 54 °C v médiu obsahujícím 6 x SSC, 1 % SDS (dodecylsulfát sodný) a 1 % odstředěného mléka a poté se hybridizuje s radioaktivní degenerovanou sodnou SEQ id. č. 6 v předchozím hybridizačním médiu; nejprve 18 hodin při 54 °C a za snižování teploty o 2 °C každé 3 hodiny, poté 24 hodin při 42 °C. Membrána se pak promývá 2 minuty, třikrát po sobě, v 6 x SSC při laboratorní teplotě a 1 minutu v 6 x SSC při 47 °C a nakonec je exponována na autoradiografický film. Všechna tyto kroky se provádějí podle příručky Maniatis.
Poté se objeví pás 3,6 kb, který autorům umožňuje lokalizovat v preparativním elektroforézovém gelu s chromozomální DNA (300 pg) z kmene CNCM 1-1351, připraveného za stejných podmínek jako bylo popsáno dříve, tu část gelu, která obsahuje část DNA, o níž se jedná. Tato část gelu se potom vyřízne, obvyklým způsobem eluuje a eluovaná DNA je navázána na vektor pUC19 (Messing se spoluautory, Methods Enzymol. 101, 20, 1983) předem hydrolyzovaný enzymy EcoRI a HindlII. Tyto kroky se provádějí podle příručky Maniatis.
Kmen Escherichia coli BZ234 (sbírka Biocentre na universitě v Bále, Švýcarsko), předem učiněný kompetentním, je potom obvykle transformován pomocí ligačního média (spojovacího). Transformované buňky jsou tříděny alfa-komplementací. Potom se 300 transformovaných kolonií přenese na filtr metodou nazývanou „colony lift“ podle příručky Maniatis, na filtru jsou lisovány, hybridizovány k radioaktivní sekvenci SEQ id. č. 8 a filtr je exponován na autoradiografický film.
Na filmu lze vidět 13 kolonií majících plasmid schopný hybridizace se sekvencí SEQ id. č. 8. Zvoleny jsou dvě z těchto kolonií, plasmid DNA je z nich obvyklým způsobem extrahován a DNA fragment, klonovaný do dvou zvolených pUC19 plasmidů, je sekvenován „dideoxynukleotidovou“ metodou pomocí universálních sond pUC19; takto jsou pak získány sondy založené na sekvencích.
Tímto způsobem se získá nukleotidová sekvence SEQ id. č. 3, popsaná v dále uvedeném seznamu sekvencí, která je identická pro dva zvolené plasmidy. Tato sekvence tedy obsahuje operon, kódující dvě bílkoviny o sekvenci aminokyselin SEQ id. č. 4, odpovídající před dozráním termofilinu 1, a sekvenci SEQ id. č. 5, před dozráním odpovídající termofilinu 2 (viz dále uvedený seznam sekvencí). Třetí otevřený čtecí rámec začíná rovněž nukleotidem 679 této sekvence a může zajisté odpovídat genu pro imunitu.
Srovnáním N-koncových peptidových sekvencí vyčištěných bakteriocinů a aminokyselinových sekvencí bílkovin, kódovaných kódovými rámci operonu SEQ id. č. 3, lze zjistit, že bílkovina o sekvenci aminokyselin SEQ id. č. 4 (termofilin 1) má vedoucí peptid o 23 aminokyselinách, nesoucí jednotku glycin-glycin, charakteristickou pro třídu bakteriocinů z bakterií kyseliny mléčné. Konečně molekulární hmotnost termofilinu 1, vypočítaná z jeho nukleotidové sekvence, odpovídá spektrometricky zjištěné hodnotě, tedy řádově činí 5 800 Daltonů.
Podobně má bílkovina aminokyselinové sekvence SEQ id. č. 5 (termofilin 2) vedoucí peptid o 21 aminokyselinách, nesoucí jednotku glycin-glycin, charakteristickou pro třídu bakteriocinů z bakterií kyseliny mléčné. Konečně molekulární hmotnost termofilinu 2, vypočítaná z jeho nukleotidové sekvence, odpovídá spektrometricky zjištěné hodnotě, tedy řádově činí 3 900 Daltonů.
Role různých bakteriocinů
U sekvence termofilinu 1 byla nalezena homologie s prvním peptidem operonu „laktokoceinu M“ (Klaenhammer se spoluautory, FEMS Micro. Rew. 12, 39-86, 1993). Tato homologie se týká
- 14CZ 284978 B6 opakování jednotky GA. Obdobně byla v případě termofilinu 2 nalezena v GenEMBL databance za použití programu TFASTA homologie s genem pro operon „laktacinu F“, začínající tripletem GCG (Klaenhammer se spoluautory, viz předchozí citace).
Dva opery laktokoceinu M a laktecinu F ve skutečnosti kódují porační komplex, obsahující několik peptidů. Je tedy možné, že výše popsaný operon může kódovat peptidy, které působí společně v poračním komplexu.
Nelze ovšem vyloučit, vzhledem k poněkud odlišným inhibičním kruhovým zónám, pozorovaným u obou termofilinů v dříve popsaném jamkovém agarovém testu, že oba bakteriociny působí nezávisle.
Příklady provedení vynálezu
Níže uvedené příklady jsou předkládány k dokreslení způsobu tvorby a použití bakteriocinů podle tohoto vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, procentní údaje jsou zde udávány v hmotnostních procentech.
Příklad 1
Kultivační médium M17 s přídavkem 1 % sacharózy se naočkuje 1 % (objem/objem) kultury, obsahující 108 mikroorganismů kmene S. thermophilus CNCM 1-1351 v 1 ml. Inkubace se provádí po 6 hodin při teplotě 42 °C za anaerobních podmínek a po jejím skončení médium obsahuje přibližně 108 mikroorganismů tohoto kmene v 1 ml a vykazuje OD60o 3,6.
Takto získaná standardní kultura se odstředí a shromáždí se (standardní) supematant. Ten se okyselí pomocí H3PO4 na pH 1,5, vzniklá sraženina se odstraní odstředěním a shromáždí se supematant tohoto kyselého srážení.
Bakteriociny v něm obsažené se sráží 10% kyselinou trichloroctovou. Vysrážené bakteriociny se shromáždí a poté se znovu rozmíchají ve vodnou suspenzi s 0,2 % kyselinou trifluoroctovou (objem/objem).
Bakteriociny se opět vysráží 10% kyselinou trichloroctovou. Vysrážené bakteriociny se shromáždí, promyjí 100% acetonem a poté se znovu rozmíchají ve vodnou suspenzi s 0,2% kyselinou trifluoroctovou (objem/objem).
Takto se získá standardní surový extrakt uvedených bakteriocinů, mající aktivitu 1,4 x 105 au/ml.
Dále uvedená Tabulka VI poskytuje podrobnější údaje charakterizující jeden litr standardního supematantu a získaných 18 ml standardního surového extraktu, jinými slovy koncentrátu, který byl ze supematantu získán, pokud se jedná o obsah bílkovin a antibakteriální aktivitu.
Tabulka VI
objem (ml) celková bílkovina (set PIERCE) (mg) au/ml au/mg bílkoviny au/mg suché váhy celková aktivita (au)
supematant surový extrakt 1 000 18 6 700 83 4,6 x 102 1,4 x 105 68 2,5 x 105 1,4 x 105 4,6 x 103 2,1 x 106
- 15CZ 284978 B6
Příklad 2
Zakysané jogurty se připravují s obsahem kmene S. thermophilus CNCM 1-1351 podle vynálezu a výše uvedených kmenů S. thermophilus ST11 (který je odolný vůči bakteriocinům podle vynálezu, ale nevykazuje žádnou antibakteriální aktivitu) a L. bulgaricus YL5.
Připraví se tak plné mléko, obsahující 3,7 % tuku a 2,5 % odstředěného sušeného mléka. 40 1 tohoto mléka se pasterizuje 6 minut při 92 °C, poté se homogenizuje při 75 °C a tlaku 150 barů (ve dvou stupních) a nakonec se ochladí na teplotu asi 42 °C.
Lyofilizované kmeny S. thermophilus CNCM 1-1351, S. thermophilus STÍ 1 a L. bulgaricus YL5 se pak reaktivují několika následnými prekultivacemi ve sterilním médiu MSK (10% rekonstituované sušené odstředěné mléko, obsahující 0,1 % komerčního kvasného extraktu).
Sterilní mléko se pak naočkuje 1 % (objem/objem) třetí prekultivační směsi každého z kmenů S. thermophilus, odebrané ve stádiu srážení média, a 2 % (objem/objem) třetí prekultivační směsi kmene L. bulgaricus, odebrané ve stádiu srážení média. Mléko se pak při teplotě 42 °C inkubuje až do pH asi 4,65 a pak se ochladí na 4 °C.
Pro srovnání, tradiční zakysaný jogurt se připravuje stejným způsobem, jaký byl popsán výše, za pomoci dříve uvedených kmenů YS8 a SFi3 mikroorganismu S. thermophilus, a kmene YL18 mikroorganismu L. bulgaricus, které se tradičně používají k výrobě jogurtů.
Další tabulka dokresluje charakteristiky získaných výrobků, zejména jejich pH během skladování při 4 °C.
příklady čas k okyselení na pH 4,65 pH výrobku po 1 dnu (při 4 °C) pH výrobku po 24 dnech (při 4 °C)
Příklad 2 8 hodin 30 minut 4,6 4,6
srovnávací příklad 6 hodin 4,34 4,3
Příklad 3
Sýr „mozzarella“ se vyrábí tradičním způsobem pomocí kultury S. thermophilus CNCM 1-1351.
Příklad 4 litrů kultury kmene CNCM 1-1351 S. thermophilus se vytvoří v médiu M17, doplněném 1 % sacharózy, za 6 hodin při 42 °C v anaerobních podmínkách. Pak se přímo ke kultuře přidá 200 g pryskyřice XAD-7 (Sigma) a celá směs se mírně míchá 1 hodinu při 4 °C. Pak se směs přefiltruje filtrem Schleicher and Schvell (SRN) č. 604 a pryskyřice zachycená na filtru se promyje 10 litry 50 mM roztoku kyseliny octové o pH 5,2 k odstranění bakterií. Pak se k pryskyřici přidá 450 ml roztoku, obsahujícího 100% ethanol a 20 mM octan amonný, celá směs se zfiltruje k odstranění pryskyřice a filtrát se lyofilizuje, dokud se nezíská prášek, obsahující bakteriociny podle vynálezu, který lze použít v potravinářském průmyslu.
Antibakteriální aktivita tohoto prášku, předem rozpuštěného ve vodě, se stanovuje jamkovým agarovým testem, popsaným výše. Tento prášek vykazuje aktivitu 107 au/g prášku.
-16CZ 284978 B6
Nakonec se 0,5 g/kg tohoto prášku přidá k masové pěně během její přípravy tradičním způsobem. Získá se tak masová pěna, obsahující 5 x 103 au/g bakteriocinů, schopných zcela inhibovat vývoj patogenních bakterií, zejména rodu Clostridium.
Příklad 5
Tento příklad se týká výroby hydratačního pleťového krému, obsahujícího 0,05 g/kg prášku, popsaného v Příkladu 4, to znamená 5 x 102 au/g bakteriocinů, schopných inhibovat vývoj nežádoucích bakterií na pokožce.
K. výrobě této emulze se smísí složky lipidové fáze A a zahřejí se na 75 °C. Připraví se vodná fáze B a zahřeje se rovněž na 75 °C, poté se za pomalého míchání přidá k lipidové fázi A a směs se ochladí, stále za pomalého míchání, na laboratorní teplotu, to znamená asi na 25 °C. Při této teplotě se pomalu přidají složky C v pořadí podle receptu.
lipidová fáze A
Peg-6-stearát, glycerát a peg-20-cetylether (peg:polyethylenglykol) 15 % vaselinový olej 5 % olej z pšeničných klíčků, stabilizovaný 0,1% fenylindans (antioxidační činidlo) a 1 % fosfolipidy ze sojových bobů (viz EP94109355.1) 3 % oleje ze sladkých mandlí 2 % cetylalkohol 1 % isostearylisostearát 2 %
2-oktyldodecylmyristát 1 % lanolinový vosk 1 % vodná fáze B methylisothiazolin 0,1 % demineralizovaná voda 59,6 % bílkovina z lidské placenty 2,0 % přídavná činidla C propylenglykol a měsíčkový extrakt 2,0 % % rozpustný kolagen v demineralizované vodě 5,8 % parfém 0,3 %
2,5 % bakteriocinový prášek podle Př. 4 v demineralizované vodě 0,2 %
Příklad 6
0,5 g/kg bakteriocinového prášku podle Příkladu 4 se přidá ke kapalnému prostředku na čištění zubů. Ten je pak schopný inhibovat vývoj pateogenních bakterií v ústní dutině, zvláště pak Streptococcus sobrinus.
Příklad 7
Roztok, obsahující bakteriocinový prášek podle Příkladu 4 rozpuštěný ve vodě v množství 1 %, je sprejově nanesen na potravinářské výrobky, které mají být sterilizovány k prevenci dodatečné kontaminace během jejich balení.
- 17CZ 284978 B6
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(1) Přihlašovatel:
(A) jméno: Société des Produits Nestlé S.A (B) ulice: Čase postale 353 (C) město: Vevey (E) země: Švýcarsko (F) poštovní kód (ZIP): 1800 (G) telefon (021) 924 47 60 (H) telefax: (021) 924 28 80 (ii) Název vynálezu: Bakteriociny, sekvence nukleotidových řetězců pro tyto látky, produkční kmeny, způsob výroby bakteriocinů a jejich použití (Bacteriocins from Streptococcus thermophilus) (iii) Počet sekvencí: 8 (iv) Počítačem zpracovatelná forma:
(A) typ média: pružný disk (B) počítač: IBM PCT kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: Patentln Release # 1.0, verse # 1.25 (EPO) (vi) data předběžné přihlášky:
(A) číslo přihlášky: CH 2628/93-7 (B) datum podání: 3. září 1993 (2) Informace o sekvenci SEQ id. č. 1:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 62 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) typologie: lineární (ii) molekulární typ: bílkovina (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Streptococcus thermophilus (B) kmen: CNCM1-1351 (xi) popis sekvence: SEQ id. č. 1:
Tyr 1 Ser Gly Lys Asp 5 Cys Leu Lys Asp Met 10 Gly Gly Tyr Ala Leu Ala
Gly Ala Gly Ser Gly Ala Leu Trp Gly Ala Pro Ala Gly Gly Val Gly
20 25 30
Ala Leu Pro Gly Ala Phe Val Gly Ala His Val Gly Ala Ile Ala Gly
35 40 45
Gly Phe Ala Cys Met Gly Gly Met Ile Gly Asn Lys Phe Asn
50 55 60
-18CZ 284978 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ id. č. 2:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 43 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) typologie: lineární (ii) molekulární typ: bílkovina (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Streptococcus thermophilus (B) kmen: CNCM 1-1351 (xi) popis sekvence: SEQ id. č. 2:
Gin 1 Ile Asn Trp Gly 5 Ser Val Val Gly His 10 Cys Ile Gly Gly Ala 15 Ile
Ile Gly Gly Ala Phe Ser Gly Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Cys Leu
20 25 30
Val Gly Ser Gly Lys Ala Ile Ile Asn Gly Leu
35 40
(2) Informace o sekvenci SEQ id. č. 3:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 770 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) typologie: lineární (ii) molekulární typ: DNA (genomová) (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Streptococcus thermophilus (B) kmen: CNCM 1-1351 (ix) znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 221..475 (ix) znak:
(A) název/klíč: sig_peptid (B) umístění: 221.289 (ix) znak:
(A) název/klíč: mat_peptid (B) umístění: 290..475 (D) jiné informace: /funkce = „kóduje termofilin 1“ (ix) znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 495..686
- 19CZ 284978 B6 (ix) znak:
(A) název/klíč: sig_peptid (B) umístění: 495..557 (ix) znak:
(A) název/klíč: mat_peptid (B) umístění: 558..686 (D) jiné informace: /funkce = „kóduje termofilin 2“ (xi) popis sekvence: SEQ id. č. 3:
AATGGCACGA TGAACGGTCG GTTCAAGAAA AACCCGACAA
ACGTCCTGAA CTTTCCCTTC TGGGGAAATT AATAAAAATA
TGGTTAAAAG TTGAATGGTA ATTTTTTGAA TTAGGTAGGA
ATATTTCGGA AAATTTTCCC GTAGTGCTAT GATATTTACA
TCTTCCTAAA ATTAGGAAAG ACTAGACTTG
AAATACATAC TTAAATGACT TCAAGGTTGC
ATG AAT ACA ATA ACT Met Asn Thr Ile Thr
-23 -20
120
180
235
ATT TGT AAA TTT GAT GTT TTA GAT GCT GAA CTT CTT TCG ACA GTT GAG 283
Ile Cys Lys Phe Asp Val Leu Asp Ala Glu Leu Leu Ser Thr Val Glu
-15 -10 -5
GGT GGA TAC TCT GGT AAG GAT TGT TTA AAA GAC ATG GGA GGA TAT GCA 331
Gly Gly Tyr Ser Gly Lys Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Gly Tyr Ala
1 5 10
TTG GCA GGA GCT GGA AGT GGA GCT CTG TGG GGA GCT CCA GCA GGA GGT 379
Leu Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Leu Trp Gly Ala Pro Ala Gly Gly
15 20 25
GTT GGA GCA CTT CCA GGT GCA TTT GTC GGA GCT CAT GTT GGG GCA ATT 427
Val Gly Ala Leu Pro Gly Ala Phe Val Gly Ala His Val Gly Ala Ile
35 40 45
GCA GGA GGC TTT GCA TGT ATG GGT GGA ATG ATT GGT AAT AAG TTT AAC 475
Ala Gly Gly Phe Ala Cys Met Gly Gly Met Ile Gly Asn Lys Phe Asn
50 55 60
TAAGGAAGGA GTTTATATC ATG AAG CAG TAT AAT GGT TTT GAG GTT CTA CAT 527
Met Lys Gin Tyr Asn Gly Phe Glu Val Leu His
-21 -20 -15
GAA CTT GAC TTA GCA AAT GTA ACT GGC GGT CAA ATT AAT TGG GGA TCA 575
Glu Leu Asp Leu Ala Asn Val Thr Gly Gly Gin Ile Asn Trp Gly Ser
-10 -5 1 5
GTT GTA GGA CAC TGT ATA GGT GGA GCT ATT ATC GGA GGT GCA TTT TCA 623
Val Val Gly His Cys Ile Gly Gly Ala Ile Ile Gly Gly Ala Phe Ser
10 15 20
GGA GGT GCA GCG GCT GGA GTA GGA TGC CTT GTT GGG AGC GGA AAG GCA 671
Gly Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Cys Leu Val Gly Ser Gly Lys Ala
25 30 35
ATC ATA AAT GGA TTA TAAAAGTCTT TTATCGCTTT TATTATTCAT AATTCCCCTT 726
Ile Ile Asn Gly Leu
(2) Informace o sekvenci SEQ id. č. 4:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 85 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) typologie: lineární (ii) molekulární typ: bílkovina
-20CZ 284978 B6 xi) popis sekvence: SEQ id. č. 4:
Met Asn Thr Ile Thr Ile Cys Lys Phe Asp Val Leu Asp Ala Glu Leu
-23 -20 -15 -10
Leu Ser Thr Val Glu Gly Gly Tyr Ser Gly Lys Asp Cys Leu Lys Asp
-5 1 5
Met Gly Gly Tyr Ala Leu Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Leu Trp Gly
10 15 20 25
Ala Pro Ala Gly Gly Val Gly Ala Leu Pro Gly Ala Phe Val Gly Ala
30 35 40
His Val Gly Ala Ile Ala Gly Gly Phe Ala Cys Met Gly Gly Met Ile
45 50 55
Gly Asn Lys Phe Asn
60
(2) Informace o sekvenci SEQ id. č. 5:
(i) charakteristika sekvence: (A) délka: 64 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) typologie: lineární
(•i) molekulární typ: bílkovina
xi) popis sekvence: SEQ id. č. 5
Met Lys Gin Tyr Asn Gly Phe Glu Val Leu His Glu Leu Asp Leu Ala
-21 -20 -15 -10
Asn Val Thr Gly Gly Gin Ile Asn Trp Gly Ser Val Val Gly His Cys
-5 1 5 10
Ile Gly Gly Ala Ile Ile Gly Gly Ala Phe Ser Gly Gly Ala Ala Ala
15 20 25
Gly Val Gly Cys Leu Val Gly Ser Gly Lys Ala Ile Ile Asn Gly Leu
30 35 40
(2) Informace o sekvenci SEQ id. č. 6:
(i) charakteristika sekvence: (A) délka: 17 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) typologie: lineární
(ii) molekulární typ: DNA (genomová)
(iii) hypotetická: ano xi) popis sekvence: SEQ id. č. 6:
GAYATGGGNG GNTAYGC (2) Informace o sekvenci SEQ id. č. 7:
-21 CZ 284978 B6 (1) charakteristika sekvence:
(A) délka: 17 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) typologie: lineární (ii) molekulární typ: DNA (genomová) (iii) hypotetická: ano xi) popis sekvence: SEQ id. č. 7:
GCTATNGCNC CNACGTG (2) Informace o sekvenci SEQ id. č. 8:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 128 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) typologie: lineární (ii) molekulární typ: DNA (genomová) (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Streptococcus thermophilus (B) kmen: CNCM 1-1351 xi) popis sekvence: SEQ id. č. 8:
GATTGTTTAA AAGACATGGG AGGATATGCA TTGGCAGGAG CTGGAAGTGG AGCTCTGTGG60
GGAGCTCCAG CAGGAGGTGT TGGAGCACTT CCAGGTGCAT TTGTCGGAGC TCATGTTGGG120
GCAATGC128

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Bakteriocin ze Streptococcus thermophilus kterým je thermofilin 1 s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 1 nebo thermofilin 2 s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2.
  2. 2. Sekvence nukleotidového řetězce kódující bakteriocin ze Streptococcus thermophilus podle nároku 1.
  3. 3. Sekvence nukleotidového řetězce podle nároku 2, která má genomovou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No. 3, kódující bakteriociny podle nároku 1.
  4. 4. Sekvence nukleotidového řetězce kódující thermofilin 1 sjeho signálním peptidem podle nároku 3, která obsahuje nukleotidy 221 až 475 genomové sekvence SEQ ID No. 3.
  5. 5. Sekvence nukleotidového řetězce kódující thermofilin 1 podle nároku 4, která obsahuje nukleotidy 289 až 475 genomové sekvence SEQ ID No. 3.
    -22CZ 284978 B6
  6. 6. Sekvence nukleotidového řetězce kódující thermofilin 2 sjeho signálním peptidem podle nároku 3, která obsahuje nukleotidy 495 až 686 genomové sekvence SEQ ID No. 3.
  7. 7. Sekvence nukleotidového řetězce kódující thermofilin 2 podle nároku 6, která obsahuje nukleotidy 558 až 686 genomové sekvence SEQ ID No. 3.
  8. 8. Sekvence nukleotidového řetězce kódující signální peptid thermofllinu 1 podle nároku 4, obsahující nukleotidy 221 až 288 genomové sekvence SEQ ID No. 3.
  9. 9. Sekvence nukleotidového řetězce kódující signální peptid thermofllinu 2 podle nároku 6, obsahující nukleotidy 495 až 557 genomové sekvence SEQ ID No. 3.
  10. 10. Signální peptid ze Streptococcus thermophilus, kódovaný sekvencí nukleotidového řetězce podle nároků 8 a 9.
  11. 11. Kmen Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351, který produkuje bakteriociny pole nároků 1 a 2.
  12. 12. Způsob výroby alespoň jednoho bakteriocinů podle nároku 1, vyznačující se tím, že se kmen Streptococcus thermophilus, který produkuje alespoň jeden z uvedených bakteriocinů, kultivuje v médiu za podmínek vhodných pro růst Streptococcus thermophilus, dokud médium neobsahuje 107 až 109 mikroorganismů uvedeného kmene v mililitru, získaná kultura se odstředí a poté se připraví extrakt supematantu, obsahující alespoň jeden z uvedených bakteriocinů.
  13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že se pro přípravu extraktu alespoň jednoho z uvedených bakteriocinů, obsažených ve zmíněném supematantu, upraví pH tohoto supematantu na hodnotu 1,0 až 2,0 pomocí H3PO4, sraženina se odstraní a provede se jedno nebo více následných srážení kyselinou trichloroctovou, vždy s následným opětným rozmícháním ve vodné suspenzi s kyselinou trifluoroctovou.
  14. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedeným kmenem Streptococcus thermophilus je kmen CNCM 1-1351, který produkuje uvedené bakteriociny.
  15. 15. Použití alespoň jednoho bakteriocinů podle nároku 1, zvláště ve formě extraktu, získaného podle nároku 14, a/nebo kmene Streptococcus thermophilus podle nároku 11 při výrobě potravinářských výrobků nebo kosmetických výrobků.
  16. 16. Použití podle nároku 15 kultury uvedeného kmene Streptococcus thermophilus jako zákvasu k přípravě sýrů nebo k výrobě zakysaných mlék.
  17. 17. Použití podle nároku 15 alespoň jednoho z uvedených bakteriocinů nebo uvedeného kmene jako přídavného nebo účinného činidla vůči patogenním bakteriím, zvláště při výrobě masových výrobků jako jsou pěny, jako účinného činidla vůči mikroorganismu Clostridium botulinum, nebo při výrobě krémů či emulzí, jako účinného činidla vůči patogenním bakteriím pokožky nebo při výrobě přípravků ústní hygieny, jako účinného činidla vůči patogenním bakteriím ústní dutiny, zvláště vůči Streptococcus sobrinus.
CZ951139A 1993-09-03 1994-08-24 Bakteriociny, sekvence nukleotidového řetězce pro tyto látky, produkční kmeny, způsob výroby bakteriocinů a jejich použití CZ284978B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH262893 1993-09-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ113995A3 CZ113995A3 (en) 1995-11-15
CZ284978B6 true CZ284978B6 (cs) 1999-04-14

Family

ID=4238040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ951139A CZ284978B6 (cs) 1993-09-03 1994-08-24 Bakteriociny, sekvence nukleotidového řetězce pro tyto látky, produkční kmeny, způsob výroby bakteriocinů a jejich použití

Country Status (26)

Country Link
US (1) US5683890A (cs)
EP (1) EP0643136B1 (cs)
JP (1) JP3031716B2 (cs)
KR (1) KR0183187B1 (cs)
CN (1) CN1065568C (cs)
AT (1) ATE207960T1 (cs)
AU (1) AU677100B2 (cs)
BR (1) BR9405576A (cs)
CA (1) CA2148223C (cs)
CZ (1) CZ284978B6 (cs)
DE (1) DE69428854T2 (cs)
ES (1) ES2165860T3 (cs)
FI (1) FI952080A (cs)
HU (1) HU217216B (cs)
MX (1) MX194616B (cs)
MY (1) MY113279A (cs)
NO (1) NO951688L (cs)
NZ (1) NZ273567A (cs)
PH (1) PH31943A (cs)
PL (1) PL308541A1 (cs)
RU (1) RU2153505C2 (cs)
SK (1) SK280696B6 (cs)
TR (1) TR27735A (cs)
UA (1) UA43326C2 (cs)
WO (1) WO1995006736A1 (cs)
ZA (1) ZA946620B (cs)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2193180T3 (es) * 1995-08-07 2003-11-01 Nestle Sa Bacteriocina.
WO1997023619A1 (en) * 1995-12-22 1997-07-03 Innogenetics N.V. Sequences coding for new bacteriocins
DE60236957D1 (de) 2001-11-29 2010-08-19 Univ Bruxelles Lantibiotikum von streptococcus macedonicus mit nahrungsmittelqualität und verwendungen
US7556833B2 (en) * 2003-11-26 2009-07-07 Kraft Foods Global Brands Llc Cheese flavoring systems prepared with bacteriocins
US7988958B2 (en) * 2005-04-05 2011-08-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Enterococcus and Streptococcus strains and bacteriocins
PL2034848T3 (pl) * 2006-06-16 2017-08-31 Dupont Nutrition Bioscences Aps Bakteria Streptococcus thermophilus
EP2099818A2 (en) * 2006-11-29 2009-09-16 Novozymes Inc. Bacillus licheniformis chromosome
ES2668552T3 (es) * 2007-03-21 2018-05-18 Nestec S.A. Sistema de seguridad para composiciones nutricionales en polvo
FR2916759B1 (fr) * 2007-05-29 2009-07-10 Adisseo France Sas Soc Par Act Peptide rumc presentant une activite antimicrobienne
EP2294926B1 (en) * 2008-06-30 2014-11-19 Meiji Co., Ltd. Process for producing fermented milk
DE202009011379U1 (de) * 2009-08-24 2010-12-30 Khalifa, Samir Orale Präparate zur Mund- und Zahnpflege und Bekämpfung von Mundgeruch
EP2701522B1 (en) * 2011-04-29 2019-10-02 Compagnie Gervais Danone Use of nisin resistant mutant strains of lactobacilli for reducing the post acidification in food products
RU2492231C2 (ru) * 2011-07-28 2013-09-10 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) Способ выделения бактериоцинов
LT6142B (lt) 2013-05-15 2015-04-27 Uab "Biocentras" Sėklinių grūdų ir sėklų apdorojimo būdas
CN106010996B (zh) * 2016-04-29 2020-04-24 周礼红 一种醋酸杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用
CN111248277A (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种高蛋白低脂肪酸奶及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0732702B2 (ja) * 1990-02-23 1995-04-12 雪印乳業株式会社 新規乳酸菌、その産生する抗菌物質、この乳酸菌を含有する発酵乳用スターター及びそれを用いた発酵乳の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE207960T1 (de) 2001-11-15
MY113279A (en) 2002-01-31
DE69428854D1 (de) 2001-12-06
CA2148223A1 (en) 1995-03-09
SK55295A3 (en) 1995-08-09
EP0643136A1 (fr) 1995-03-15
CZ113995A3 (en) 1995-11-15
US5683890A (en) 1997-11-04
BR9405576A (pt) 1999-05-25
ES2165860T3 (es) 2002-04-01
UA43326C2 (uk) 2001-12-17
MX194616B (es) 1999-12-15
ZA946620B (en) 1995-04-03
HU217216B (hu) 1999-12-28
NZ273567A (en) 1997-05-26
RU95109910A (ru) 1997-03-27
DE69428854T2 (de) 2002-04-11
AU677100B2 (en) 1997-04-10
RU2153505C2 (ru) 2000-07-27
WO1995006736A1 (en) 1995-03-09
HU9501259D0 (en) 1995-06-28
CN1114112A (zh) 1995-12-27
JP3031716B2 (ja) 2000-04-10
KR0183187B1 (ko) 1999-04-01
CN1065568C (zh) 2001-05-09
NO951688D0 (no) 1995-05-02
SK280696B6 (sk) 2000-06-12
NO951688L (no) 1995-05-02
AU7691194A (en) 1995-03-22
PL308541A1 (en) 1995-08-21
FI952080A0 (fi) 1995-05-02
EP0643136B1 (fr) 2001-10-31
CA2148223C (en) 2001-10-02
JPH08503140A (ja) 1996-04-09
PH31943A (en) 1999-05-14
FI952080A (fi) 1995-05-02
TR27735A (tr) 1995-07-07
KR950704499A (ko) 1995-11-20
HUT72547A (en) 1996-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0821736B1 (en) Bacteriocins
US5683890A (en) Bacteriocins from Streptococcus thermophilus
US5756665A (en) Peptide isolated from micrococcus varians and use thereof
MXPA96003127A (en) Bacterioc
US5173297A (en) Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis
US7449311B2 (en) Method of producing macedocin by culturing Streptococcus macedonicus
AU706127B2 (en) Process for the lysis of a culture of lactic acid bacteria by means of a lysin, and uses of the resulting lysed culture
US5232849A (en) Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis
De Vuyst Bacteriocins produced by Lactococcus lactis strains
Van der Vossen 4th Symposium on Lactic Acid Bacteria: Genetics, Metabolism and Applications

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20030824