TW202229319A

TW202229319A - 具有乳酸菌之胞外多醣之免疫賦活活性之提升作用之蛋白質、以及使用其之發酵乳及其製造方法

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Publication number: TW202229319A
Application number: TW110137551A
Authority: TW
Inventors: 藤原慎; 牧野聖也
Original assignee: 日商明治股份有限公司
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2021-10-08
Publication date: 2022-08-01
Also published as: JPWO2022080245A1; CN116367726A; WO2022080245A1; US20230371536A1

Abstract

本發明係關於一種選自由下述(a)~(d)的蛋白質所成群的至少1種蛋白質。 (a)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列而成的蛋白質 (b)對於SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，第334~338位的絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外的胺基酸之1或者複數個經取代、欠缺、插入及/或加成的胺基酸序列所成，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質 (c)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上同一性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質 (d)由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴苛條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質。

Description

具有乳酸菌之胞外多醣之免疫賦活活性之提升作用之蛋白質、以及使用其之發酵乳及其製造方法

本發明係關於具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質、使用其之發酵乳及其製造方法，更詳細為有關於具有在乳酸菌表現時所產生的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質、DNA、載體、乳酸菌及乳酸菌組成物，以及使用其之發酵乳、免疫賦活劑，及此等製造方法、提升發酵乳之免疫賦活活性的方法，及乳酸菌之評估方法。

發酵乳為廣泛地一般食用的食品，對於日本之「乳及乳製品的成分規格等相關條例(乳等條例)」，定義為「將含有乳或與此同等以上之無脂乳固體成分的乳等以乳酸菌或酵母進行發酵，成為糊狀或液狀者，或將此經冷凍者」。作為發酵乳之代表例，例如可舉出固體型優格(固體成分狀發酵乳)、軟型優格(糊狀發酵乳)及飲料型優格(液狀發酵乳)之優格。近年來，隨著消費者的健康志向的提高，對於發酵乳亦有的多樣化功能的期待之傾向。

例如對於優格等之發酵乳的製造中，於原料乳播種乳酸菌，使其發酵而調製者為主流，但對於某些種的乳酸菌所產生之胞外多醣(Exopolysaccharide：EPS)中已知具有NK細胞之活化等免疫賦活活性。例如在日本特開2005-194259號公報(專利文獻1)中記載含有作為有效成分的來自乳酸菌的酸性多醣類之NK細胞活化劑，在國際公開第2011/065300號(專利文獻2)中記載含有作為有效成分的Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus(例如OLL1073R-1株)之乳酸菌所產生的中性多醣類之抗病毒劑。又，於牧野們在2013年, Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria, Vol. 24, No. 1, p.10-17(非專利文獻1)中記載Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1所產生的胞外多醣之免疫賦活作用、感染防御效果。

然而，對於上述Lctobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1或其他乳酸菌，何等基因或蛋白質與免疫賦活活性高之胞外多醣的產生有關則尚未解明，對於產生具有優異免疫賦活活性的胞外多醣之乳酸菌的選抜必須花更多時間與勞力。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1] 日本特開2005-194259號公報 [專利文獻2] 國際公開第2011/065300號 [非專利文獻]

[非專利文獻1]牧野們, 2013年, Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria, Vol. 24, No. 1, p.10-17

[發明所解決的問題]

本發明係有鑑於上述過去技術所具有課題而成者，以提供具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之新穎蛋白質、含有具有優異免疫賦活活性的胞外多醣之發酵乳及其製造方法作為目的。 [解決課題的手段]

本發明者們欲達成上述目的而進行詳細研究，解明了提高乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的蛋白質及編碼此的基因。即，如上述，雖已知Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1073R-1(寄存號碼：FERM BP-10741)(以下依據情況有時稱為「R-1株」)可高產生具有優異免疫賦活作用的胞外多醣，但對於R-1株的何等基因或蛋白質可提高胞外多醣之免疫賦活活性尚未解明。因此，本發明者們必須解明具有該胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之新穎蛋白質，首先與Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 2038(以下依據情況有時稱為「2038株」)所產生的胞外多醣相比，R-1株所產生的胞外多醣確實顯示具有較高免疫賦活活性。

其次，將EPS基因群聚的序列以2038株的序列與R-1株的序列進行比較。已知被認為與免疫賦活活性相關的IFN-γ之產生量，與中性胞外多醣(NPS)相比在酸性胞外多醣(APS)上為高(牧野們, 2013年, Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria, Vol. 24, No. 1, p.10-17，圖3)。已揭示當比較NPS的結構與APS的結構時，僅於APS確認到微量磷以外，構成糖之組成幾乎共通(UEMURA et al.,” Chemical characterization of exocellular polysaccharide from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1”, Milchwissenschaft 53(8)1998, p.443-446)，故在APS中，於多醣已藉由糖轉移安置磷。因此，在EPS基因群聚之中，著重於有關糖轉移之基因，比較兩者序列。其結果，發現在R-1株與2038株中，在有關糖轉移之基因中，僅在epsF基因確認到核苷酸序列的差異性，該R-1株的epsF基因所編碼的蛋白質為具有胞外多醣的免疫賦活活性之提升作用的蛋白質。

又，於2020年2月5日對R-1株的epsF之核苷酸序列進行查詢，對於NCBI之nt數據進行web Blast(參數：預設值)後，高搜尋之序列為2038株的epsF基因，查詢覆蓋率(Query Cover)為100%，Per. Ident為99.9%。且，該鹼基之差異亦反映於胺基酸之差異。因此，本發明者們發現R-1株的epsF基因之核苷酸序列及其產物的蛋白質為新穎者，而完成本發明。

即，本發明係關於具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質，使用其之發酵乳及其製造方法等，更詳細係如以下所示。 [1] 選自由下述(a)~(d)的蛋白質所成群的至少1種蛋白質。 (a)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列而成的蛋白質 (b)對於SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，由第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外的胺基酸之1或者複數個經取代、欠缺、插入及/或加成的胺基酸序列所成，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質 (c)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上同一性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質 (d)由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴苛條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質。 [1’] 含有選自由前述(a)~(d)的蛋白質所成群之至少1種蛋白質的組成物(較佳為欲使用於乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升之組成物)。 [2] 編碼如[1]所記載的蛋白質之DNA。 [2’] 含有選自由編碼前述(a)~(d)的蛋白質中任一的DNA所成群的至少1種DNA之組成物(較佳為欲使用於乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升之組成物)。 [3] 含有如[2]所記載的DNA之載體。 [3’] 含有選自由編碼前述(a)~(d)的蛋白質中任一的DNA所成群之至少1種DNA之載體。 [4] 含有選自由如[1]所記載的蛋白質、如[2]所記載的DNA及如[3]所記載的載體所成群的至少1種之組成物。 [5] 導入選自由如[2]所記載的DNA及如[3]所記載的載體所成群的至少1種之乳酸菌。 [5’] 導入如[3’]所記載的載體之乳酸菌(較佳為胞外多醣的免疫賦活活性高之乳酸菌)。 [6] 具有如[2]所記載的DNA之乳酸菌。 [7] 胞外多醣的免疫賦活活性高之如[6]所記載的乳酸菌。 [8] 含有如[5]~[7]中任一項所記載的乳酸菌之乳酸菌組成物。 [8’] 含有如[5’]所記載的乳酸菌之乳酸菌組成物(較佳為欲使用於發酵乳的免疫賦活活性之提升的乳酸菌組成物)。 [9] 發酵乳之如[8]或[8’]所記載的乳酸菌組成物。 [10] 含有來自如[5]~[7]中任一項或如[5’]所記載的乳酸菌之胞外多醣的如[8]、[8’]或[9]所記載的乳酸菌組成物。 [11] 含有於含有原料乳的調乳液中，添加如[5]~[7]中任一項或者如[5’]所記載的乳酸菌或如[8]~[10]中任一項或者如[8’]所記載的乳酸菌組成物而使其發酵，得到含有胞外多醣的發酵物之發酵步驟的發酵乳之製造方法。 [12] 含有於含有原料乳的調乳液中，添加如[5]~[7]中任一項或者如[5’]所記載的乳酸菌或如[8]~[10]中任一項或者如[8’]所記載的乳酸菌組成物而使其發酵，得到含有胞外多醣的發酵物之發酵步驟的提升發酵乳之免疫賦活活性的方法。 [13] 將選自由編碼下述(a)~(d)的蛋白質中任一者的DNA所成群之至少1種DNA作為指標，評估胞外多醣的免疫賦活活性之乳酸菌的評估方法。 (a)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列而成的蛋白質 (b)對於SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，由第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外的胺基酸之1或者複數個經取代、欠缺、插入及/或加成的胺基酸序列所成，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質 (c)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上同一性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質 (d)由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴苛條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質。 [14] 含有以如[13]所記載的乳酸菌之評估方法評估乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之評估步驟，與得到於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌之步驟的乳酸菌之製造方法。 [15] 含有以如[13]所記載的乳酸菌之評估方法評估乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之評估步驟，與於含有原料乳之調乳液中，添加於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌而使其發酵，得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟發酵乳之製造方法。 [16] 含有以如[13]所記載的乳酸菌的評估方法評估乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之評估步驟，與於含有原料乳的調乳液中，添加於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌而使其發酵，得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟之提升發酵乳的免疫賦活活性之方法。 [17] 含有作為有效成分的來自如[5]~[7]中任一項或如[5’]所記載的乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活劑。 [17’] 使用於免疫賦活之來自如[5]~[7]中任一項或如[5’]所記載的乳酸菌的胞外多醣之使用。 [17’’] 使用於免疫賦活劑之製造的如來自如[5]~[7]中任一項或如[5’]所記載的乳酸菌的胞外多醣之使用。 [17’’’] 將如來自[5]~[7]中任一項或如[5’]所記載的乳酸菌的胞外多醣作為對象而投與之免疫賦活方法。 [18] 含有於含有將葡萄糖及/或葡萄糖作為構成糖之糖的培養基中，添加如[5]~[7]中任一項或者如[5’]所記載的乳酸菌或如[8]~[10]中任一項或者[8’]所記載的乳酸菌組成物並使其發酵，採取含於發酵物的胞外多醣之步驟的乳酸菌之胞外多醣的製造方法。 [19] 含有以如[13]所記載的乳酸菌之評估方法評估乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的評估步驟，與於含有將葡萄糖及/或葡萄糖作為構成糖之糖的培養基中，添加於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌而使其發酵，採取含於發酵物的胞外多醣之步驟的乳酸菌之胞外多醣的製造方法。 [20] 含有於含有將葡萄糖及/或葡萄糖作為構成糖之糖的培養基中，添加如[5]~[7]中任一項或者如[5’]所記載的乳酸菌或如[8]~[10]中任一項或者如[8’]所記載的乳酸菌組成物並使其發酵，得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟，與得到含有作為有效成分的前述胞外多醣之免疫賦活劑的步驟之免疫賦活劑的製造方法。 [21] 含有以如[13]所記載的乳酸菌的評估方法評估乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之評估步驟，與於含有將葡萄糖及/或葡萄糖作為構成糖之糖的培養基中，添加於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌而使其發酵，得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟，與得到含有作為有效成分的前述胞外多醣之免疫賦活劑的步驟之免疫賦活劑的製造方法。 [發明之效果]

依據本發明，可提供具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之新穎蛋白質、含有具有優異免疫賦活活性的胞外多醣之發酵乳，及其製造方法。更詳細為可提供具有在乳酸菌表現時產生的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之新穎蛋白質、編碼前述蛋白質之DNA、含有前述DNA的載體、含有前述DNA或前述載體的乳酸菌及其乳酸菌組成物、使用此等發酵乳、免疫賦活劑、此等製造方法、提升發酵乳之免疫賦活活性的方法，及乳酸菌之評估方法。

例如藉由將編碼本發明之新穎蛋白質的DNA導入於種種乳酸菌中，藉由該乳酸菌，可容易製造出免疫賦活活性優異的胞外多醣，及含有此的發酵乳或免疫賦活劑。又，藉由將編碼本發明之新穎蛋白質的DNA之序列作為選擇基準，可容易選出可製造出免疫賦活活性優異的胞外多醣，及含有此的發酵乳或免疫賦活劑之乳酸菌。

[實施發明的型態]

以下藉由較佳實施形態而詳細說明本發明。

＜蛋白質、DNA、載體及含有此等的組成物＞本發明之蛋白質為具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質，即為選自由下述(a)~(d)之蛋白質所成群的至少1種蛋白質。 (a)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列而成的蛋白質、 (b)對於SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，由第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外之胺基酸的1或者複數個經取代、欠缺、插入及/或加成的胺基酸序列所成，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質、 (c)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上同一性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質，及 (d)由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴苛條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質。

本發明之蛋白質為具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質(以下依據情況有時稱為「免疫賦活活性提升蛋白質」)。

對於本發明，所謂「乳酸菌之胞外多醣」表示，藉由乳酸菌而產生的胞外多醣(Exopolysaccharide；本說明書中依據情況依據情況有時稱為「EPS」)，該EPS中含有中性胞外多醣(NPS)、酸性胞外多醣(APS)、兩離子性胞外多醣(ZPS)及此等混合物。

又，對於本發明，所謂「乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性」表示，將藉由乳酸菌所產生的胞外多醣投與於對象時，使該對象的免疫起活化的作用(本說明書中依情況有時僅稱為「免疫賦活活性」)，較佳表示可提高前述對象的NK細胞活性(使其活化)之作用。且，對於本發明，所謂「乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用」表示，在乳酸菌使其表現時，對於在該乳酸菌所產生的胞外多醣，可賦予或提升前述免疫賦活活性之作用(本說明書中依情況稱為「免疫賦活活性提升作用」)。雖對於本發明之蛋白質具有前述免疫賦活活性提升作用之理由尚未解明，但本發明者們對於EPS之生合成過程，特別在糖轉移之過程中，推測可能為本發明之蛋白質發揮作用，生成免疫賦活活性高之結構的EPS之故。

對於本發明，藉由乳酸菌所產生的胞外多醣之免疫賦活活性，例如可藉由將該胞外多醣投與於對象時的NK細胞活性進行評估。前述NK細胞活性在本發明中，例如可依據竹田們的方法(Takeda, K. et al., J. Immunol., 156：3366, 1996)或鉻釋放法(Chromium release method)進行測定。對於前述NK細胞活性高之結果的對象進行投與的胞外多醣，其更能評估為免疫賦活活性優異者。

本發明之DNA為編碼前述免疫賦活活性提升蛋白質之DNA(以下依情況有時稱為「免疫賦活活性提升DNA」)。即，本發明之DNA為選自由下述(a’)~(d’)的DNA所成群之至少1種DNA。 (a’)編碼由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列而成的蛋白質之DNA、 (b’)編碼對於SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，由第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外的胺基酸之1或者複數個經取代、欠缺、插入及/或加成的胺基酸序列所成，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質的DNA、 (c’)編碼由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上同一性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質之DNA，及 (d’)編碼由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴苛條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質的DNA。

「(a)SEQ ID NO:1所示胺基酸序列」為，編碼為Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1073R-1(寄存號碼：FERM BP-10741)(R-1株)之epsF基因的胺基酸序列。作為「(a’)編碼SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的DNA」，若為編碼該胺基酸序列即可，並無特別限制，但以SEQ ID NO:2所示核苷酸序列者為佳。SEQ ID NO:2所示核苷酸序列為R-1株之epsF基因的核苷酸序列。本發明者們如上述，發現R-1株的epsF基因所編碼的蛋白質，特別具有上述免疫賦活活性提升作用。對於SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，特別為第334~338位之胺基酸為自N末端側起的絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸者為重要。此等胺基酸由其他胺基酸進行取代時(例如實施例中之2038株)，即使與其他序列共通，對於乳酸菌所產生的胞外多醣亦無法發揮優異免疫賦活活性。以下依據情況，將SEQ ID NO:1所示胺基酸序列稱為「R1-EpsF」，將SEQ ID NO:2所示核苷酸序列稱為「R1-epsF」。

又，對於自然界，藉由核苷酸序列之變異，會使該序列所編碼的蛋白質之胺基酸序列引起變異。且，對於現在之技術水準，若為斯業者，例如獲得R-1株之epsF基因的核苷酸序列(R1-epsF)情報或此所編碼的蛋白質之胺基酸序列(R1-EpsF)情報時，改變該核苷酸序列，雖與該編碼的胺基酸序列相異，但亦可調製出維持免疫賦活活性提升作用或更提升的免疫賦活活性提升蛋白質。

因此，有關本發明之「免疫賦活活性提升蛋白質」的其他態樣，亦含有「(b)對於SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，由第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外的胺基酸之1或者複數個經取代、欠缺、插入及/或加成的胺基酸序列所成，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質」。又，有關本發明之「免疫賦活活性提升DNA」的其他態樣，亦含有「(b’)編碼對於SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，由第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外的胺基酸之1或者複數個經取代、欠缺、插入及/或加成的胺基酸序列所成，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質的DNA」。其中，所謂「複數」表示經取代、欠缺、插入及/或加成(以下依據情況有時將此等總稱為「改變」)後的蛋白質(改變體)為具有免疫賦活活性提升作用之範圍中的胺基酸之改變數，通常100個以內，1~80個，以1~40個為佳，較佳為1~20個，更佳為1~數個(例如1~10個、1~8個、1~4個、1~2個)。

編碼如此改變體的核苷酸，若為斯業者，例如依據R-1株之epsF基因的核苷酸序列(R1-epsF)情報，使用公知部位特異性變異誘發(site-directed mutagenesis)法等而調製。

且，對於現在之技術水準，若為斯業者，得到R-1株之epsF基因的核苷酸序列(R1-epsF)情報的情況，藉由雜交技術(Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98：503, 1975)或，聚合酶連鎖反應(PCR)技術(Saiki, R. K., et al. Science, 230：1350-1354, 1985、Saiki, R. K. et al. Science, 239：487-491, 1988)等，由R-1株以外的其他微生物，可取得編碼免疫賦活活性提升蛋白質之核苷酸(相同基因)。因此，有關本發明之「免疫賦活活性提升蛋白質」的態樣中，亦含有「(d)由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴苛條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質」。又，有關本發明之「免疫賦活活性提升DNA」的其他態樣中亦含有「(d’)編碼由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴苛條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質的DNA」。且，對於本發明，所對「對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸」表示，使用核苷酸序列及胺基酸序列解析軟體(GENETYX-MAC、Sequencher等)或BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(美國國立生物學情報中心之基本的局部比對搜索工具))等(例如，參數：預設值(即初期設定值))，整列為SEQ ID NO:1所示胺基酸序列(R1-EpsF)時，與於R1-EpsF中之第334~338位的絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸成為同列的位置之胺基酸。

欲分離相同基因時，通常在嚴苛條件下進行雜交反應。作為「嚴苛條件」表示將雜交後的膜片之洗淨操作在高溫下低鹽濃度溶液中進行者，例如可舉出2×SSC濃度(1×SSC：15mM檸檬酸3鈉、150mM氯化鈉)、0.5% SDS溶液中的60℃，且20分鐘之洗淨條件。又，雜交例如可依據公知的ECL直接DNA/RNA標記･檢測系統(Amersham Pharmacia Biotech公司製)所添付的使用說明書所記載的方法而進行。雜交的條件越嚴苛，更可期待具有高同一性之DNA的分離。但，上述條件為例示，藉由適宜地組合DNA之濃度、DNA之長度、雜交之反應時間等，可實現必要嚴苛性(嚴苛條件)。

且，如此方法等所取得的相同基因所編碼的蛋白質，通常具有與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列(R1-EpsF)之高同一性。因此，有關本發明之「免疫賦活活性提升蛋白質」的態樣中，亦含有「(c)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上同一性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質」。又，有關本發明的「免疫賦活活性提升DNA」之態樣中亦含有「(c’)編碼由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上同一性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質的DNA」。

胺基酸序列之同一性，例如可使用前述BLAST等(例如參數：預設值(即初期設定值))決定。又，與SEQ ID NO:2所記載的胺基酸序列(R1-EpsF)之同一性通常為80%以上即可，以90%以上為佳，較佳為95%以上(例如96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)。

相同基因所編碼的免疫賦活活性提升蛋白質可為由與乳酸菌相異的微生物分離的基因所編碼的蛋白質，但以自乳酸菌經分離者為佳。作為前述乳酸菌，例如可舉出鏈球菌科(Streptococcuaceae科)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae科)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)等，更具體可舉出乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳酸桿菌屬(Lacticaseibacillus)、植物乳桿菌屬(Lactiplantibacillus)、利闊里乳桿菌屬(Liquorilactobacillus)、矽酸乳桿菌屬(Limosilactobacillus)、左旋乳桿菌屬(Levilactobacillus)、扁豆乳桿菌屬(Lentilactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)等乳酸桿菌；片球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)等乳酸球菌；雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等。此等中亦以乳桿菌屬(Lactobacillus)為佳，以布魯克乳桿菌(含亞種)為較佳，以布魯克乳桿菌･亞種･保加利亞為更佳。

對於本發明，對於各蛋白質具有前述免疫賦活活性提升作用，例如可由下述得到確認，對於將使用具有編碼各蛋白質的DNA之乳酸菌所產生的胞外多醣類投與於老鼠(較佳BALB/c老鼠)之情況時的NK細胞活性而言，使用亦不具有編碼前述(a)~(d)的蛋白質中任一之1種DNA，例如使用亦不具有前述(a’)~(d’)之1種DNA的乳酸菌(例如、布魯克乳桿菌･亞種･保加利亞2038株(2038株))所產生的胞外多醣類，投與於同樣老鼠時的NK細胞活性作為1時，其成為1.03以上，以成為1.05以上為佳，較佳為成為1.10以上而可確認。作為對前述老鼠的投與條件，以每1日以50~200μg/老鼠之投與量經1週以上者為佳，投與期間之上限雖無特別限制，例如可12週以下。前述NK細胞活性之測定方法如上述所示。且前述2038株可藉由將明治保加利亞優格LB81(明治股份有限公司製)的稀釋液塗抹於BCP加寒天培養基，在37℃經48小時培養後，採取粗糙型之群體而分離。

又，前述具有編碼各蛋白質的DNA之乳酸菌亦不具有編碼前述(a)~(d)的蛋白質中任一之DNA，即亦不具有前述(a’)~(d’)之1種DNA的乳酸菌(例如布魯克乳桿菌，較佳為選自由布魯克乳桿菌･亞種･保加利亞所成群的至少1種乳酸菌)中，若為可表現而導入前述DNA或含有前述DNA的載體之乳酸菌(轉形體)的情況時，對於使用該乳酸菌所產生的胞外多醣類藉由與上述同樣方式測定的NK細胞活性可藉由下述得到確認，對於使用前述轉形前之乳酸菌而產生的胞外多醣類與上述同樣方式測定的NK細胞活性作為1時，其成為1.03以上，以成為1.05以上為佳，較佳為成為1.10以上。

且，各乳酸菌亦具有或不具有前述(a’)~(d’)的1種DNA，可依據此等DNA之核苷酸序列而經公知方法或依據此的方法做適當確認，例如可藉由下述＜乳酸菌之評估方法＞的評估步驟所記載的免疫賦活活性提升DNA之檢測方法而確認。且，編碼前述蛋白質的DNA或載體對前述乳酸菌的導入方法，可適宜地選擇公知方法或依據此的方法，例如對於下述[免疫賦活活性提升蛋白質]所記載的方法，可舉出作為宿主細胞使用前述乳酸菌的方法。

[免疫賦活活性提升蛋白質] 有關本發明的免疫賦活活性提升蛋白質可適宜地使用公知方法或依據此的方法而得。例如可藉由含有培養導入有選自由編碼前述免疫賦活活性提升蛋白質的DNA及含有前述DNA的載體所成群之至少1種的宿主細胞，取出表現於前述宿主細胞的蛋白質之步驟的製造方法而得。更具體為，首先藉由自R-1株等具有前述(a’)~(d’)的DNA中至少1種之目的微生物藉由慣用方法，得到作為分離DNA的編碼前述免疫賦活活性提升蛋白質的DNA(免疫賦活活性提升DNA)。作為前述分離DNA，亦可為人工方式將前述免疫賦活活性提升DNA經化學合成的化學合成DNA。其次，可藉由調製DNA(前述分離DNA)或含有此的表現載體，培養將此導入於宿主細胞的轉形體，於同轉形體使本發明之免疫賦活活性提升蛋白質表現後，可自培養物得到作為重組蛋白質的相同蛋白質。

作為自目的微生物得到前述分離DNA之方法，例如可舉出將自前述微生物萃取的基因組DNA，或自前述微生物萃取的mRNA作為基礎所合成的cDNA，與質粒載體、噬菌體載體、黏粒載體、BAC載體、PAC載體等載體進行連結而製造出DNA基因庫或cDNA基因庫，藉由使用依據免疫賦活活性提升DNA之核苷酸序列(例如R1-epsF)所作成的探針之雜交，自前述基因庫分離出所望基因組DNA或cDNA的方法；使用依據免疫賦活活性提升DNA之核苷酸序列(例如R1-epsF)所作成的引子，實施將目的微生物之基因組DNA或前述cDNA作為模板的PCR，視必要將增幅的DNA片段與適當載體連結而分離所望基因組DNA的方法。

前述表現載體為，可在宿主細胞內進行複製者，且該核苷酸序列所編碼的蛋白質在宿主細胞內可表現之狀態下含有的載體。該表現載體為自身複製載體，即作為染色體外之獨立體而存在，該複製並未依賴染色體之複製，例如可基本地構築質體。又，前述表現載體在導入於宿主細胞時，整合於該宿主細胞之基因組中，亦可基本地構築與該整合染色體共同複製的噬菌體DNA。作為前述質體，可舉出來自大腸菌的質體(pET22、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、來自酵母菌的質體(YEp13、YEp24、YCp50等)、來自枯草菌的質體(pUB110、pTP5等)、大腸菌與乳酸菌之穿梭載體(pGMβ1等)。作為前述噬菌體DNA，可舉出λ噬菌體(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)。

前述表現載體的構築之程序及方法可適宜地採用公知方法或依據此的方法。例如可採用在將前述免疫賦活活性提升DNA插入於載體時，首先以適當限制酶切斷前述分離DNA，插入於適當質體之限制酶部位或多克隆位點而連結於前述質體之方法等。

前述表現載體在欲使將此實際導入於宿主細胞的免疫賦活活性提升蛋白質進行表現時，於編碼本發明之免疫賦活活性提升蛋白質的DNA(免疫賦活活性提升DNA)以外，可含有欲選擇控制該表現的核苷酸序列、誘導導入控制前述表現的核苷酸序列以外之表現的核苷酸序列，及細胞之基因標識物等者為佳。

作為控制前述表現的核苷酸序列，例如可舉出編碼啟動子、終結者及信號肽之核苷酸序列，可為此等中之1種，亦可為2種以上之組合。前述啟動子若在宿主細胞中顯示轉印活性者即可，並無特別限定，可為控制編碼與宿主細胞為同種或者異種之蛋白質的基因之表現的核苷酸序列。作為誘導前述表現之核苷酸序列，宿主細胞為細菌時，例如可舉出藉由異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)之添加，可誘導配置於下游的基因之表現的乳糖操縱子。作為前述基因標識物，可配合轉形體之選擇方法而適宜選擇，例如可使用編碼藥劑耐性之基因或輔助營養要求性之基因。

作為前述宿主細胞，雖無特別限制，以微生物者為佳，例如可舉出絲狀菌、酵母、大腸菌、放線菌、乳酸菌等。使用於本發明之免疫賦活活性提升蛋白質的製造方法時，作為前述宿主細胞雖無特別限制，在將導入前述DNA之宿主細胞直接使用於下述＜發酵乳之製造方法＞、＜發酵乳之免疫賦活活性提升方法＞、＜乳酸菌之胞外多醣的製造方法＞或＜免疫賦活剤的製造方法＞時，以乳酸菌者為佳。作為前述宿主細胞，視必要亦可為以轉形為欠缺特定功能者或突變體。

作為於此等宿主細胞導入前述DNA或表現載體之方法，可適宜地採用公知方法或依據此的方法，例如可舉出熱衝擊法、電穿孔法、球狀體法、乙酸鋰法，作為對乳酸菌之導入方法，亦可舉出接合法。又，作為對植物細胞之導入時的方法，可舉出使用農桿菌(Agrobacterium)的方法或粒子槍法，作為導入於昆蟲細胞時的方法，可舉出使用桿狀病毒(Baculovirus)之方法或電穿孔法，作為導入於動物細胞時的方法，可舉出磷酸鈣法、脂質體轉染法、電穿孔法。

本發明之免疫賦活活性提升蛋白質可藉由將如此對宿主細胞導入前述DNA或表現載體的轉形體在適當培養基中進行培養，由該培養物(例如培養微生物細胞)採取。因此，本發明亦可提供含有培養前述轉形體，採取表現於該轉形體的免疫賦活活性提升蛋白質之步驟的本發明之免疫賦活活性提升蛋白質的製造方法。

作為前述轉形體之培養條件，例如可適用宿主細胞之培養條件，若為斯業者，可配合宿主細胞之種類、使用的培養基等，適宜地調整溫度、空氣之添加有無、氧之濃度、二氧化碳之濃度、培養基之pH、培養溫度、培養時間、濕度等而設定。又，作為自培養物採取前述免疫賦活活性提升蛋白質之方法，例如亦可使用將免疫賦活活性提升蛋白質在宿主細胞(例如大腸菌)內表現，經轉形體之培養終了後，將培養細胞藉由離心分離或過濾等回收，將細胞破碎而得之液體作為粗純化物而得的方法。進一步可將該澄清液藉由極限過濾法等進行濃縮，加入防腐劑等而成為濃縮粗純化物。又，將前述粗純化物或前述濃縮粗純化物，例如可藉由單獨使用鹽析法、有機溶劑沈澱法、膜分離法、色譜分離方法或組合2種以上而進行純化。或者亦可將加成純化用標籤之免疫賦活活性提升蛋白質在宿主細胞(例如大腸菌)內表現，將該粗萃取液通過附有標籤之蛋白質的純化用管柱後，溶離附有標籤之蛋白質而純化。

於本發明之免疫賦活活性提升蛋白質中，可將其他化合物直接或間接地加成。作為該加成並無特別限制，可在基因水準下加成，亦可為化學性加成。又對於經加成的部位亦無特別限制，可為本發明之免疫賦活活性提升蛋白質之胺基末端(以下本說明書中亦稱為「N末端」)及羧基末端(以下本說明書中亦稱為「C末端」)中任一者，亦可為該雙方。在基因水準下的加成，可藉由於編碼本發明之免疫賦活活性提升蛋白質的DNA(免疫賦活活性提升DNA)，使用編碼其他蛋白質的DNA配合讀框(reading frame)加成者而達成。作為如此加成的「其他蛋白質」並無特別限制，例如使本發明之免疫賦活活性提升蛋白質的純化變得容易的目的之情況時，使用聚組胺酸(His-)標籤(tag)蛋白質、FLAG-標籤蛋白質(註冊商標，Sigma-Aldrich社)、穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)等純化用標籤蛋白質為佳，又例如在使本發明之免疫賦活活性提升蛋白質的檢測變得容易的目的之情況時，使用GFP等螢光蛋白質、熒光素酶等化學發光蛋白質等檢測用標籤蛋白質為佳。化學性加成可為共價鍵，亦可為非共價鍵。作為「共價鍵」並無特別限制，例如可舉出胺基與羧基之醯胺鍵、胺基與烷基鹵化物基之烷基胺結合、硫醇彼此間之二硫鍵、硫醇基與馬來醯亞胺基或烷基鹵化物基之硫代醚鍵。作為「非共價鍵」，例如可舉出生物素-抗生素蛋白間之鍵結。

[免疫賦活活性提升DNA] 本發明之免疫賦活活性提升DNA僅為編碼前述本發明之免疫賦活活性提升蛋白質的胺基酸序列，可為於天然DNA中導入變異的DNA，亦可為經人工設計的核苷酸序列所成的DNA，又可由非天然型核苷酸構成該一部分或全部。對於該形態雖無特別限制，例如含有上述[免疫賦活活性提升蛋白質]中作為分離DNA所舉出的cDNA、基因組DNA及化學合成DNA。

本發明之免疫賦活活性提升DNA在宿主細胞中進一步提高編碼的免疫賦活活性提升蛋白質之表現效率的觀點來看，可配合該宿主細胞之種類，達到使密碼子最適化的編碼本發明之免疫賦活活性提升蛋白質的DNA之態樣。

[載體] 作為本發明之免疫賦活活性提升DNA，欲可將該DNA在宿主細胞內進行複製，亦可為插入該DNA之載體的態樣。因此，本發明亦提供含有本發明之免疫賦活活性提升DNA的載體。作為本發明之載體，亦含有該較佳態樣，可舉出上述[免疫賦活活性提升蛋白質]中所舉出的表現載體。

[組成物] 本發明為提供含有上述本發明之免疫賦活活性提升蛋白質、免疫賦活活性提升DNA及載體中至少1種之組成物。本發明之組成物係將本發明之免疫賦活活性提升蛋白質、免疫賦活活性提升DNA及載體中至少1種作為有效成分而含有之使用於乳酸菌的胞外多醣的免疫賦活活性之提升的組成物，例如將本發明之組成物導入於種種乳酸菌而作為下述本發明之乳酸菌，藉由使用其而製造出胞外多醣或發酵乳，可得到比過去更優異免疫賦活活性的胞外多醣或含有此的發酵乳。

作為本發明之組成物，可進一步含有其他成分。作為前述其他成分，雖無特別限制，例如可舉出滅菌水、生理食鹽水、植物油、界面活性劑、脂質、溶解補助劑、緩衝劑、DNase阻礙劑、保存劑，可僅為此等中之1種，亦可2種以上之組合。

＜乳酸菌及乳酸菌組成物＞本發明亦提供上述本發明之免疫賦活活性提升DNA，或含有前述免疫賦活活性提升DNA的本發明之載體導入於前述宿主細胞之轉形體。作為前述轉形體，可舉出上述[免疫賦活活性提升蛋白質]中所舉出的轉形體。

對於本發明，作為前述轉形體之宿主細胞，以乳酸菌為佳，在「本發明之乳酸菌」中含有導入選自由上述本發明之免疫賦活活性提升DNA，及含有前述免疫賦活活性提升DNA的本發明之載體所成群之至少1種的乳酸菌；以及具有上述本發明之免疫賦活活性提升DNA的乳酸菌。進一步「本發明之乳酸菌」中亦含有導入本發明之免疫賦活活性提升蛋白質自體的乳酸菌。本發明之乳酸菌因此而可達成所產生的胞外多醣的免疫賦活活性。

又，本發明之乳酸菌可為乳酸菌組成物之態樣，本發明亦提供含有此等本發明之乳酸菌中至少1種的乳酸菌組成物。前述乳酸菌組成物除使用於前述免疫賦活活性提升蛋白質之製造上，亦可作為使用於發酵乳的製造、發酵乳之免疫賦活活性的提升、免疫賦活活性可提升之胞外多醣的製造，或免疫賦活劑之製造的乳酸菌組成物。

[乳酸菌] 作為本發明之免疫賦活活性提升蛋白質、免疫賦活活性提升DNA，或導入載體之宿主細胞的乳酸菌，並無特別限制，例如可舉出鏈球菌科(Streptococcuaceae科)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae科)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)等，更具體可舉出乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳酸桿菌屬(Lacticaseibacillus)、植物乳桿菌屬(Lactiplantibacillus)、利闊里乳桿菌屬(Liquorilactobacillus)、矽酸乳桿菌屬(Limosilactobacillus)、左旋乳桿菌屬(Levilactobacillus)、扁豆乳桿菌屬(Lentilactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)等乳酸桿菌；片球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)等乳酸球菌；雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等。此等中，亦以乳桿菌屬(Lactobacillus)為佳，以布魯克乳桿菌(含有亞種)為較佳，以布魯克乳桿菌･亞種･保加利亞為更佳。作為前述宿主細胞之乳酸菌可為具有已如前述(a)~(d)的蛋白質中至少1種，或前述(a’)~(d’)之DNA中至少1種者。將該乳酸菌作為宿主細胞時，可期待更一層免疫賦活活性提升作用。

作為對於此等乳酸菌中導入前述免疫賦活活性提升蛋白質、前述免疫賦活活性提升DNA或前述載體的方法，可適宜地採用作為上述[免疫賦活活性提升蛋白質]中導入DNA或表現載體之方法所舉出的方法，例如以使用選自由熱衝擊法、電穿孔法、球狀體法、乙酸鋰法及接合法所成群的至少1種而導入前述免疫賦活活性提升DNA或前述載體者為佳。

又，作為本發明之乳酸菌，作為具有上述本發明之免疫賦活活性提升DNA的乳酸菌，例如作為前述宿主細胞所舉出的乳酸菌中，可舉出具有前述(a’)~(d’)之DNA中至少1種DNA之乳酸菌。

且，本發明之乳酸菌具有上述本發明之免疫賦活活性提升蛋白質或免疫賦活活性提升DNA(較佳為含有經導入者)者，可藉由公知方法或依據此的方法而適宜地確認，例如可藉由下述＜乳酸菌之評估方法＞之評估步驟所記載的免疫賦活活性提升DNA的檢測方法進行確認。因此，於「本發明之乳酸菌」中亦含有藉由下述本發明之乳酸菌的評估方法評估胞外多醣具有免疫賦活活性或胞外多醣的免疫賦活活性高的乳酸菌(含有高度評估為具有免疫賦活活性或免疫賦活活性高之可能性者)、藉由本發明之乳酸菌的製造方法所得之乳酸菌。

本發明之乳酸菌所具有(含有經導入者)DNA在該乳酸菌內，可以該基因組DNA的方式保持，又若為載體，亦可以作為該基因組DNA外之獨立體而經複製方式保持。作為導入於乳酸菌的DNA，可藉由無規地插入於基因組DNA而保持，亦可藉由相同重組而保持。又，作為本發明之乳酸菌，對於具有免疫賦活活性提升作用的範圍內，可為上述乳酸菌之同株或該傳繼株之人工變異株、自然變異株或基因重組株。

作為本發明之乳酸菌，以產生免疫賦活活性被提升的胞外多醣者為佳。對於本發明，前述免疫賦活活性提升蛋白質、前述免疫賦活活性提升DNA，或導入有前述載體之乳酸菌可產生可提高免疫賦活活性之胞外多醣，例如對於使用該乳酸菌所產生的胞外多醣類，與確認上述蛋白質是否具有免疫賦活活性提升作用之方法同樣下所測定的NK細胞活性可由下述得到確認，對於使用不具有前述(a’)~(d’)的1種DNA之乳酸菌所產生的胞外多醣類進行測定的NK細胞活性作為1，其成為1.03以上，以成為1.05以上為佳，較佳為成為1.10以上而得到確認。或例如前述NK細胞活性可確認為21%以上，以22%以上為佳，更佳為22.5%以上。

[乳酸菌組成物] 本發明之乳酸菌組成物為含有上述本發明之乳酸菌的組成物。作為本發明之乳酸菌組成物，可進一步含有其他成分，作為前述其他成分，雖無特別限制，例如含有前述乳酸菌之培養終了後的培養澄清液、培養基成分等培養物；前述培養物之濃縮物、粗純化物、純化物、稀釋物、乾燥物(噴霧乾燥物、冷凍乾燥物等)、冷凍物等；保護劑、發酵促進劑等，可為此等中僅1種，亦可為2種以上之組合。

又，本發明之乳酸菌組成物若為含有本發明之乳酸菌(即選自由免疫賦活活性提升蛋白質、免疫賦活活性提升DNA，及含有免疫賦活活性提升DNA的本發明之載體所成群的至少1種經導入的乳酸菌；具有免疫賦活活性提升DNA的乳酸菌；藉由本發明之乳酸菌的評估方法評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣的免疫賦活活性高的乳酸菌(含有評估具有免疫賦活活性或免疫賦活活性高之可能性高者)；本發明之乳酸菌的製造方法所得之乳酸菌)的組成物，下述本發明之發酵乳亦含於此。

＜乳酸菌之評估方法、乳酸菌之製造方法＞本發明之乳酸菌的評估方法為，對於上述本發明之免疫賦活活性提升蛋白質，即將選自由編碼下述(a)~(d)的蛋白質中任一的DNA所成群的至少1種DNA(即，本發明之免疫賦活活性提升DNA)作為指標，評估乳酸菌所產生的胞外多醣之免疫賦活活性的方法。 (a)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列而成的蛋白質、 (b)對於SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，由第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外的胺基酸之1或者複數個經取代、欠缺、插入及/或加成的胺基酸序列所成，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質、 (c)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上同一性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質、及 (d)由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴苛條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸，自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質。

[評估步驟] 對於本發明之乳酸菌的評估方法，將本發明之免疫賦活活性提升DNA作為指標，即將乳酸菌是否具有本發明之免疫賦活活性提升DNA作為指標，評估乳酸菌所產生的胞外多醣是否具有免疫賦活活性，或同胞外多醣之免疫賦活活性是否為高(評估步驟)。具有前述免疫賦活活性提升DNA時，評估為該乳酸菌所產生的胞外多醣具有免疫賦活活性，或評估為同免疫賦活活性高(含有具有同免疫賦活活性之可能性高，或同免疫賦活活性為高的可能性高之評估結果)，另外不具有前述DNA時，評估為該乳酸菌所產生的胞外多醣不具有免疫賦活活性，或評估為同免疫賦活活性低(含有不具有同免疫賦活活性的可能性高，或同免疫賦活活性為低的可能性高之評估結果)。藉此，具有免疫賦活活性，或者產生免疫賦活活性高的胞外多醣，或產生可能性高的乳酸菌之選擇變得可能。對於本發明之乳酸菌的評估方法，作為成為評估對象的乳酸菌，並無特別限制，可將所望的乳酸菌作為適宜對象。

乳酸菌是否具有本發明之免疫賦活活性提升DNA，可藉由檢測該DNA而判斷。作為免疫賦活活性提升DNA之檢測方法，可適宜地採用公知方法或依據此的方法。

例如，首先自評估對象之乳酸菌萃取出基因組DNA。作為基因組DNA之萃取方法，並無特別限制，可採用公知方法或依據此的方法，例如可舉出PCI法、GuSCN/Silica法、SDS酚法、CTAB法、鹼處理法。又，可適宜地使用販售之套組。

作為前述免疫賦活活性提升DNA之檢測方法，可藉由其次的分離對應免疫賦活活性提升DNA之DNA，決定經分離的DNA之核苷酸序列而實施。該DNA之分離，例如至少可使用設計為夾住對應前述免疫賦活活性提升DNA的DNA之一對寡核苷酸引子，藉由將基因組DNA作為模板的PCR等而進行。經分離的DNA之核苷酸序列的決定可藉由桑格法(Sanger method)及馬克薩姆-吉爾伯特測序法(Maxam-Gilbert method)等斯業者公知的方法而進行。又，亦可藉由前述基因組DNA，使用新世代定序器(Next generation sequencer)等直接決定對應前述免疫賦活活性提升DNA的DNA之核苷酸序列。

作為對應前述免疫賦活活性提升DNA的DNA，以至少含有編碼對應R1-EpsF之第334~338位的胺基酸之部位者為佳，將此夾住的一對寡核苷酸引子可依據前述免疫賦活活性提升DNA之核苷酸序列(例如R1-epsF)及公共數據(Genbank等)而各自設計即可。如此寡核苷酸若為斯業者可以公知方法或依據此的方法而設計。

作為前述免疫賦活活性提升DNA之檢測方法的其他方法，例如可舉出PCR-SSP(PCR-序列特異的引子)法。對於該方法，構成引子的一對寡核苷酸中之單方寡核苷酸的3’末端為前述免疫賦活活性提升DNA之特定鹼基，例如在檢測的DNA為前述(a’)時，設計成與編碼R1-EpsF之第334~338位的絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸之部位為互補的鹼基種。藉由使用如此設計的一對寡核苷酸引子之PCR的增幅，僅在將本發明之免疫賦活活性提升DNA作為模板之情況時，編碼第334~338位絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸的部位中任一在編碼其他胺基酸的基因組DNA作為模板時不會增幅。因此，將如此增幅之有無作為指標，可檢測前述DNA。

又，作為前述免疫賦活活性提升DNA之檢測方法的其他方法，在編碼R1-EpsF之第334~338位或對應此的絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸、及天冬胺酸之部位上可設計限制酶片段長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)時，將此等RFLP標識物作為指標，例如可藉由PCR-RFLP法(或CAPS[Cleaved Amplified Polymorphic Sequence]法)等檢測。

作為前述免疫賦活活性提升DNA的檢測方法之其他方法，例如可舉出PCR-SSCP(PCR-單股高次結構多型)法。將藉由使用設計成夾住前述免疫賦活活性提升DNA之一對寡核苷酸引子的PCR進行增幅的雙股DNA，藉由熱或鹼等處理而使其變性，使其成為單股DNA後，施行未含有變性劑的聚丙烯醯胺凝膠電氣泳動時，在凝膠中單股DNA會因分子內相互作用而折疊，形成高次結構。折疊結構的相互作用因會藉由鹼基種之相異而產生變化，故經分離的該單股DNA藉由銀染色或放射性同位素而進行檢測，在該單股DNA的凝膠上之移動度作為指標下，可檢測前述免疫賦活活性提升DNA之檢測。

作為前述免疫賦活活性提升DNA的檢測方法其他方法，例如可舉出使用嵌入劑(Intercalator)的方法。該方法中，首先對於含有在DNA雙股間插入時會發出螢光的嵌入劑之反應系，將前述基因組DNA作為模板，增加對應前述免疫賦活活性提升DNA的DNA。然後，變化反應系的溫度，檢測嵌入劑所發出的螢光強度之變動，將隨著檢測的溫度之變化的螢光之強度的變動作為指標，可檢測前述免疫賦活活性提升DNA(特別R1-EpsF之第334~338位或編碼對應此的絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸之部位)。作為如此方法，可舉出高分解融解曲線解析(HRM)法。

作為前述免疫賦活活性提升DNA之檢測方法的其他方法，例如可舉出使用要檢測的DNA為上述(a’)時，含有編碼R1-EpsF的第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸的部位之區域上進行雜交的寡核苷酸探針之方法。對於該方法之一的態樣，首先對於編碼前述第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸的部位進行特異性雜交，調製出經報導螢光色素及淬滅劑螢光色素的標識之寡核苷酸探針。其次，將該寡核苷酸探針於前述基因組DNA進行雜交，進一步將寡核苷酸探針經雜交的DNA試料作為模板，增加含有編碼前述第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸、及天冬胺酸的部位之DNA。然後，藉由隨著增幅之寡核苷酸探針的分解，檢測藉由淬滅劑的抑制被解除之報導螢光色素所發出的螢光。作為如此方法，可舉出雙模探針法，所謂TaqMan(註冊商標)探針法。作為使用經報導螢光色素及淬滅劑螢光色素標識的寡核苷酸探針的其他態樣，可利用使用於前述免疫賦活活性提升DNA進行特異性雜交的嵌合體寡核苷酸(RNA與DNA之嵌合體)與RNase H等酵素的組合之循環探針法。

作為前述免疫賦活活性提升DNA的檢測方法之其他方法，例如可舉出LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法。在該方法中，於雙股DNA之目的部位的兩側上各設置3個，總共6個區域，使用含有此等區域的4種類(各側各2種類)之引子，藉由在鏈取代型酵素的存在下進行反應，於前述目的部位之兩側因可生成迴路結構之增幅起點，接下來同一鏈上生成彼此互補的序列重複結構，增幅前述目的部位。要檢測的DNA為前述(a’)時，將前述目的部位作為編碼R1-EpsF的第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸的部位時，藉由進行增幅產物之核苷酸序列的決定，可進行各改變之存在或不存在的檢測。又，將前述6個區域中之1個作為編碼前述第334~338位之絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸、及天冬胺酸的部位時，因有改變時前述目的部位未增幅，故將該增幅有無作為指標可檢測前述DNA。

前述免疫賦活活性提升DNA之檢測方法並非限定於上述態樣者。例如、變性劑濃度梯度凝膠電泳法(DGGE法)、侵入法(Invader method)、焦磷酸測序法(Pyro-sequencing method)、單核苷酸引子伸長(SNuPE)法、等位基因特異性寡核苷酸(Allele-specific oligonucleotide) (ASO)雜交法、核糖核酸酶A錯配截斷法(Mismatch cut-off method)、DNA微陣列法(Microarray method)、DNA陣列法(DNA陣列法)等其他公知技術亦可利用於本發明中。

進一步作為前述免疫賦活活性提升DNA之檢測，以檢測該表現者為亦佳。作為前述牽絲性提升DNA之表現的檢測方法，例如自對象的乳酸菌依據常法萃取mRNA或蛋白質，藉由公知手法或依據此的方法，或亦可藉由該免疫賦活活性提升DNA所編碼的mRNA或蛋白質(即免疫賦活活性提升蛋白質)之檢測而進行。

作為檢測前述免疫賦活活性提升DNA所編碼的Mrna之方法，例如可舉出RT-PCR法、北方印跡法(Northern blotting法)。

作為檢測前述免疫賦活活性提升DNA所編碼的蛋白質(免疫賦活活性提升蛋白質)之方法，首先自對象乳酸菌調製蛋白質試料，使用對前述免疫賦活活性提升蛋白質為特異性的抗體，即使用對至少第334~338位的絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸為特異性抗體而進行抗原抗體反應，檢測前述免疫賦活活性提升蛋白質。對於使用如此抗體之蛋白質的檢測法，例如對於前述蛋白質試料，添加對前述免疫賦活活性提升蛋白質為特異性的抗體而進行抗原抗體反應，檢測對免疫賦活活性提升蛋白質之前述抗體的結合。對免疫賦活活性提升蛋白質為特異性的抗體經標識時，可直接檢測免疫賦活活性提升蛋白質，但未經標識時，進一步使辨識該抗體的經標識之分子(例如二次抗體或蛋白質A)起作用，利用該分子之標識，可間接地檢測免疫賦活活性提升蛋白質。作為如此方法，例如可利用免疫組織化學(免疫染色)法、免疫印跡法、ELISA法、流式細胞儀(Flow cytometry)、成像細胞儀(Imaging cytometry)、放射免疫分析(Radioimmunoassay)、免疫沈澱法、使用抗體陣列的解析法等。作為前述抗體，可為多克隆性抗體亦可為單克隆性抗體，此等抗體之調製方法為斯業者周知者。

[使用於本發明之評估方法的套組] 如上述，藉由檢測本發明之免疫賦活活性提升DNA，可評估乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性提升。因此，本發明為提供一種使用於上述評估方法的含有選自由下述(i)~(ii)之藥劑的至少一種藥劑之套組， (i)含有對於本發明之免疫賦活活性提升DNA、該轉印產物或該互補核苷酸進行雜交的具有至少15個核苷酸之鏈長的寡核苷酸之藥劑，及 (ii)含有鍵結於本發明之免疫賦活活性提升蛋白質的抗體之藥劑。作為前述寡核苷酸為配合上述免疫賦活活性提升DNA之檢測方法，可為引子之態樣，亦可為探針之態樣。

作為前述引子，對於對應本發明之免疫賦活活性提升DNA或者免疫賦活活性提升DNA之DNA，或該互補核苷酸(含有cDNA、cRNA)，或免疫賦活活性提升DNA之轉印產物(mRNA)進行雜交，可檢測此等的增幅及檢測者即可並無特別限定。作為前述引子，亦可僅為DNA，又亦可為對於該一部分或全部，藉由交聯化核酸等人工核酸(修飾核酸)進行取代者。作為前述引子之尺寸，若為至少約15核苷酸長以上者即可，以15~100核苷酸長為佳，較佳為18~50核苷酸長，更佳為20~40核苷酸長。如此引子可配合上述檢測方法，若為斯業者即可藉由公知方法進行設計並製作。

作為前述探針，若為對於對應免疫賦活活性提升DNA或者免疫賦活活性提升DNA的DNA，或該互補核苷酸，或免疫賦活活性提升DNA之轉印產物進行雜交而可進行此等檢測者即可並無特別限定。作為前述探針，可為DNA、RNA、人工核酸或此等嵌合體分子等。作為前述探針，可為單股或雙股中任一者。作為前述探針之尺寸，若為至少約15核苷酸長以上即可，以15~1000核苷酸長為佳，較佳為20~500核苷酸長，更佳為30~300核苷酸長。如此探針若為斯業者即可藉由公知方法而設計並製作。又，前述探針可藉由如微陣列一般，固定於基板上之形態下而提供。

前述抗體僅可於本發明之免疫賦活活性提升蛋白質進行特異性鍵結者即可，並無特別限制。例如可為多克隆性抗體、單克隆性抗體中任一者，亦可為抗體之功能性片段(Fab、Fab’、scFv等)。如此抗體若為斯業者可藉由公知方法而製作。又，作為前述抗體可在凹必須使用於ELISA法或抗體陣列等，且固定於平板等基板上之形態下被提供。

又，含於前述套組的寡核苷酸或抗體可配合上述檢測方法而藉由標識用物質進行標識。作為前述標識用物質，例如可舉出FITC、FAM、DEAC、R6G、TexRed、Cy5等螢光物質、β-D-葡萄糖苷酶(Glucosidase)、熒光素酶、HRP等酵素、 ³H、 ¹⁴C、 ³²P、 ³⁵S、 ¹²³I等放射性同位體、生物素、鏈球菌抗生素蛋白等親和性物質、發光胺(luminol)、熒光素、光澤精(Lucigenin)等發光物質。

在本發明之乳酸菌的評估方法中，可進一步含有確認前述乳酸菌之胞外多醣具有免疫賦活活性或同免疫賦活活性是否高的確認步驟。作為如此確認方法，雖無特別限制，例如對於使用評估對象的乳酸菌而產生的胞外多醣類，將以與上述確認蛋白質具有免疫賦活活性提升作用之方法同樣下所測定的NK細胞活性為21%以上者，可評估為胞外多醣具有免疫賦活活性，以22%以上為佳，更佳為22.5%以上者，評估為高胞外多醣之免疫賦活活性。

[乳酸菌之製造方法] 本發明之乳酸菌的製造方法為在上述本發明之乳酸菌的評估方法中含有評估乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的評估步驟、得到於前述評估步驟評估為胞外多醣具有免疫賦活活性之或胞外多醣的免疫賦活活性高之乳酸菌的步驟。

對於本發明之乳酸菌的製造方法，作為前述評估步驟，可舉出述＜乳酸菌之評估方法＞的評估步驟。在有關本發明之乳酸菌的製造方法之評估步驟中，藉此可選出具有免疫賦活活性，或者可產生免疫賦活活性高的胞外多醣，或產生可能性高的乳酸菌。在本發明之乳酸菌的製造方法中，藉由前述評估步驟可得到胞外多醣具有免疫賦活活性或胞外多醣之免疫賦活活性被評估為高的乳酸菌(含有評估為具有免疫賦活活性或免疫賦活活性高的可能性高者)，例如亦可將所選出的乳酸菌在適當培養基進行培養後得到作為該培養物之前述乳酸菌。

又，作為以本發明之乳酸菌的製造方法所得的乳酸菌之態樣，可為該培養物等之乳酸菌組成物的態樣。因此，本發明之乳酸菌的製造方法中亦含有以下乳酸菌組成物的製造方法，該乳酸菌組成物的製造方法中含有以下得到乳酸菌組成物的步驟，該乳酸菌組成物含有藉由前述評估步驟評估為胞外多醣具有免疫賦活活性或胞外多醣的免疫賦活活性高之乳酸菌。作為於前述乳酸菌組成物可含有的前述乳酸菌以外的其他成分，如上述所示。

＜發酵乳之製造方法＞本發明之發酵乳的製造方法為含有於含有原料乳的調乳液中添加乳酸菌或乳酸菌組成物並使其發酵後得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟者。

有關本發明之發酵乳的製造方法之乳酸菌中含有上述本發明之乳酸菌(即導入選自由免疫賦活活性提升蛋白質、免疫賦活活性提升DNA及含有免疫賦活活性提升DNA的本發明之載體所成群的至少1種之乳酸菌；具有免疫賦活活性提升DNA的乳酸菌；藉由本發明之乳酸菌的評估方法評估為胞外多醣具有免疫賦活活性或胞外多醣之免疫賦活活性高的乳酸菌(含有評估為具有免疫賦活活性或免疫賦活活性高的可能性高者)；藉由本發明之乳酸菌的製造方法所得的乳酸菌)，此等可單獨使用1種，亦可使用2種以上組合。又，有關本發明之發酵乳的製造方法之乳酸菌組成物中含有上述本發明之乳酸菌組成物；及藉由本發明之乳酸菌的製造方法所得之乳酸菌組成物，此等可單獨使用1種，亦可使用2種以上組合。藉由使用此等乳酸菌或乳酸菌組成物，可得到含有具有免疫賦活活性或免疫賦活活性高的胞外多醣之發酵乳。且，作為前述乳酸菌，使用藉由本發明之乳酸菌的評估方法評估為胞外多醣具有免疫賦活活性或胞外多醣的免疫賦活活性高之乳酸菌時，作為本發明之發酵乳的製造方法，雖可含有前述評估步驟，作為該情況的該評估步驟可僅為最初1次。

對於本發明之發酵乳的製造方法，亦可使用進一步組合上述本發明之乳酸菌以外的其他乳酸菌。又，亦可進一步添加酵母。作為前述其他乳酸菌及酵母，可舉出自過去含於發酵乳的公知乳酸菌或酵母。

(調乳液) 有關本發明的調乳液含有原料乳。作為前述原料乳，以含有乳糖者為佳，例如可舉出鮮乳(例如牛、水牛、綿羊、山羊等乳)、殺菌乳、全脂乳、脫脂乳、乳清，及此等加工品(例如全脂粉乳、全脂濃縮乳、脫脂粉乳、脫脂濃縮乳、煉乳、乳清粉、酪乳、牛油、乳霜、起司、乳清蛋白質濃縮物(WPC)、乳清蛋白質分離物(WPI)、α-乳清蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg))，此等中可1種，亦可為2種以上之混合物。

作為有關本發明之調乳液，亦可僅由前述原料乳所成者，亦可前述原料乳之水溶液、稀釋液或濃縮液，前述原料乳以外，亦可視必要進一步含有其他成分者。作為如此其他成分，可舉出水；豆乳、砂糖為主的糖類或甜味料、香料、果汁、果肉、維他命、礦物質、油脂、神經醯胺、膠原、牛奶磷脂質、酵母萃取物、多酚等食品、食品成分、食品添加物；果膠、大豆多醣類、CMC(羧基甲基纖維素)、寒天、明膠、卡拉膠、膠類等安定化劑、增黏劑、凝膠化劑，此等中可1種，亦可為2種以上之混合物。前述調乳液視必要可一邊加溫及/或視必要一邊使其均質化，一邊藉由混合前述成分而調製。又，作為前述調乳液，可使用經加熱殺菌者。

(發酵) 作為於前述調乳液添加前述乳酸菌或乳酸菌組成物而使其發酵而得到發酵物的發酵步驟，可適宜地採用公知方法或依據此的方法，無特別限制，例如可舉出於前述調乳液將前述乳酸菌或乳酸菌組成物作為發酵啟動子而接種並使其發酵的方法。作為前述乳酸菌或乳酸菌組成物，可在前述乳酸菌組成物之形態，較佳為在培養物或培養物之濃縮物的形態下添加於前述調乳液中。

前述發酵啟動子之添加量為依據在公知發酵乳之製造方法中所採用的添加量而適宜地設定，例如對於前述調乳液之體積，經乳酸菌數(2種以上之組合時為此等合計菌數)換算下以1×10 ⁷~5×10 ⁹CFU/mL者為佳，以1×10 ⁸~2×10 ⁹CFU/mL者為較佳。又，對於前述調乳液之體積，以0.1~2%(wt/wt)者為佳，以0.5~1.5%(wt/wt)者為較佳，以0.5~1%(wt/wt)者為更佳。

前述發酵啟動子之接種方法雖無特別限制，可適宜地使用在發酵乳之製造方法中慣用的方法。作為前述發酵之條件，可配合所添加的乳酸菌之生育條件、前述調乳液之量等而適宜地選擇，並無特別限制，例如在溫度35~45℃，較佳在溫度38~43℃，且好氣或厭氣條件下，添加前述乳酸菌或乳酸菌組成物之調乳液的pH為4.8以下，較佳為至4.0~4.6，通常為3~24小時，較佳為3~8小時，更佳為4~6小時，經靜置或攪拌(較佳為靜置)者為佳。又，作為前述厭氣條件，例如可採用在氮通氣條件下的發酵。

藉由上述發酵，可得到本發明之發酵乳。前述發酵步驟後之發酵物(即，前述發酵步驟後之調乳液，及乳酸菌或乳酸菌組成物)可直接或視必要藉由濃縮、稀釋、乾燥或者冷凍等，成為本發明之發酵乳。又，亦可將前述發酵物中之乳酸菌經破碎或者加熱處理等，或視必要將此經濃縮、稀釋、乾燥或者冷凍等後成為本發明之發酵乳。

＜發酵乳＞作為本發明之發酵乳為提供含有選自由上述本發明之乳酸菌(即導入選自由免疫賦活活性提升蛋白質、免疫賦活活性提升DNA，及含有免疫賦活活性提升DNA的本發明之載體所成群的至少1種之乳酸菌；具有免疫賦活活性提升DNA的乳酸菌；藉由本發明之乳酸菌的評估方法評估為胞外多醣具有免疫賦活活性或胞外多醣的免疫賦活活性高之乳酸菌(含有評估為具有免疫賦活活性或免疫賦活活性高的可能性高者)；藉由本發明之乳酸菌的製造方法所得之乳酸菌)所成群的至少1種乳酸菌的發酵乳。作為本發明之發酵乳，以含有來自此等乳酸菌的免疫賦活活性提升蛋白質者為佳，以含有來自此等乳酸菌的胞外多醣者為較佳。又，作為本發明之發酵乳，可進一步含有除此以外的其他乳酸菌及酵母。

作為本發明之發酵乳，雖無特別限定，例如符合日本國厚生勞動省之乳及乳製品的成分規格等之條例(乳等條例)中的「發酵乳」之規格的發酵乳(更具體為無脂乳固體成分之含有量為8.0%以上，乳酸菌數或酵母數(較佳為乳酸菌數)為1,000萬/mL以上者)、符合「乳製品乳酸菌飲料」之規格者(更具體為無脂乳固體成分之含有量為3.0%以上，乳酸菌數或酵母數(較佳為乳酸菌數)為1000萬/mL以上者)、符合「乳酸菌飲料」之規格者(更具體為無脂乳固體成分之含有量未達3.0%，乳酸菌數或酵母數(較佳為乳酸菌數)為100萬/mL以上者)中任一者。且，所謂前述無脂乳固體成分表示全乳固體成分減去脂肪部分的殘留成分(主要為蛋白質、乳糖及礦物質等)，前述乳酸菌及酵母數在殺菌前藉由前述乳等條例所規定的檢査法進行測定。

作為本發明之發酵乳，可為前述發酵步驟後之發酵物，或者亦可為經前述發酵物經殺菌處理者，或亦可為將此等經濃縮、稀釋、乾燥或者冷凍等者，例如作為前述發酵乳，可為將上述發酵乳、乳製品乳酸菌飲料或乳酸菌飲料經殺菌處理者，此時上述乳酸菌數為活菌數換算者。含於本發明之發酵乳的乳酸菌中，除活菌以外，亦含有死菌，且亦含有乳酸菌之破碎物及加熱處理物、此等濃縮物、粗純化物、純化物、稀釋物、乾燥物(噴霧乾燥物、冷凍乾燥物等)、冷凍物，但作為含於本發明之發酵乳的乳酸菌，以至少含有活菌者為佳。

作為本發明之發酵乳，對於不阻礙本發明之效果的範圍內，作為乳酸菌可進一步含有前述其他乳酸菌或酵母。又，作為本發明之發酵乳，另外可進一步含有可含於飲食品的各種成分。作為如此成分，並無特別限制，例如可舉出水、糖類、糖醇類、礦物質類、維他命類、蛋白質、肽、胺基酸類、有機酸、pH調整劑、澱粉及加工澱粉、食物纖維、果實･蔬菜及其加工品、動物及植物生藥萃取物、天然由来高分子(膠原、玻尿酸、軟骨素等)、油脂、增黏劑、乳化劑、溶劑、界面活性劑、凝膠化劑、安定劑、緩衝劑、懸浮化劑、黏稠劑、賦形劑、崩壞劑、結合劑、流動化劑、保存料、著色料、香料、矯味劑、甜味劑等，可含有僅此等中1種，亦可含有組合2種以上者。

作為如此發酵乳，以優格、起司、發酵乳霜、發酵牛油等為佳，特佳為優格。作為前述優格，具體可舉出原味優格等固體型優格(固體成分狀發酵乳)、軟型優格(糊狀發酵乳)及飲料型優格(液狀發酵乳)，亦可為將此等作為材料使用的冷凍優格。又，本發明之發酵乳亦可作為起司、發酵乳霜、發酵牛油、開菲爾優格(Kefir)等發酵食品之材料使用。

本發明之發酵乳可藉由上述本發明之發酵乳的製造方法而得，因含有具有前述免疫賦活活性或免疫賦活活性高的胞外多醣，故可作為提升免疫賦活活性的發酵乳。

＜胞外多醣之製造方法＞本發明亦提供含有於含有將葡萄糖及/或葡萄糖作為構成糖之糖的培養基中，添加上述本發明之乳酸菌或乳酸菌組成物進行發酵，採取含於發酵物的胞外多醣之步驟的乳酸菌之胞外多醣的製造方法。

作為前述培養基，必須含有選自將葡萄糖及葡萄糖作為構成糖的糖之至少1種糖。作為將葡萄糖作為構成糖的糖，例如可舉出二糖(麥芽糖、蔗糖、乳糖等)、寡聚糖(低聚半乳糖、低聚果糖、甘露糖寡聚糖等)及多醣(澱粉(直鏈澱粉、支鏈澱粉)、糖原(glycogen)等)。作為含於前述培養基的糖，可為前述糖中之僅1種，亦可為2種以上之組合，但其中亦以含有乳糖者為佳。又，作為含於前述培養基的糖，例如可使用含於前述原料乳者，作為前述培養基，以含有前述原料乳者為佳，以含有前述原料乳之前述調乳液者為較佳，又作為前述原料乳，以脫脂粉乳為佳。

作為前述乳酸菌及乳酸菌組成物，以及發酵之方法，亦含有該較佳態樣，作為前述調乳液可使用前述培養基以外，與上述發酵乳之製造方法中的發酵步驟相同。作為自前述發酵乳採取前述胞外多醣之方法，並無特別限制，可適宜地採用過去公知方法或依據此的方法，例如對於發酵後的發酵物，視必要進行藉由蛋白質變性劑(三氯乙酸等)之添加或加熱處理的除蛋白質而成為粗純化物後，例如可舉出單獨使用鹽析法、有機溶劑沈澱法、膜分離法、色譜分離方法，或組合此等方法而進行純化的方法。

＜免疫賦活劑及其製造方法＞又，本發明亦提供作為有效成分含有來自選自由上述本發明之乳酸菌(即，導入選自由免疫賦活活性提升蛋白質、免疫賦活活性提升DNA及含有免疫賦活活性提升DNA的本發明之載體所成群的至少1種之乳酸菌；具有免疫賦活活性提升DNA的乳酸菌；藉由本發明之乳酸菌的評估方法評估為胞外多醣具有免疫賦活活性或胞外多醣的免疫賦活活性高之乳酸菌(含有評估為具有免疫賦活活性或免疫賦活活性高的可能性高者)；藉由本發明之乳酸菌的製造方法所得之乳酸菌)所成群的至少1種乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活劑。來自前述乳酸菌的胞外多醣係藉由前述胞外多醣之製造方法，將上述本發明之乳酸菌或乳酸菌組成物添加於前述培養基中使其發酵時在菌體外所產生者，含於前述發酵後的發酵物中。

本發明之免疫賦活劑可對於對象之例如人類或非人類動物(較佳為哺乳動物)以經口或非經口中任一經路方式進行投與。藉此，主要為提升前述對象之NK細胞活性，而可能變得對於流感等感染預防、癌的預防或進行之阻礙有著貢獻能。因此，本發明亦提供一種含有將前述胞外多醣投與於對象的步驟之免疫賦活方法，較佳為NK細胞活性提升方法。且，對於本發明，對於經口投與亦含有飲食品組成物或飼料組成物之攝取。

本發明之免疫賦活劑可直接為前述發酵後的發酵物，亦可為前述發酵物之濃縮物、粗純化物、純化物、糊化物、乾燥物(噴霧乾燥物、冷凍乾燥物等)、造粒物、粉碎物、分散於媒體的液狀物及組合此等2種以上的處理物，又亦可僅由前述胞外多醣之製造方法所得的胞外多醣而成者。且，配合投與的目的、對象、方法、用量等，例如可為醫藥品組成物、準醫藥品組成物、飲食品組成物、飼料組成物等。

作為前述醫藥品組成物及準醫藥品組成物，例如可為製劑，該形態並無特別限定，例如可舉出錠劑、丸劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體成分劑；一般液劑、懸浮劑、乳劑、糖漿劑等液劑；凝膠劑；注射劑或點滴劑；經管投與劑或經鼻管投與劑；塞劑。前述製劑例如上述胞外多醣中可添加如溶劑、分散劑、乳化劑、增黏劑、凝膠化劑、界面活性劑、緩衝劑、安定劑、保存料、賦形劑、結合劑、崩壞劑、溶解助劑、滑澤劑、著色劑、矯味劑、甜味劑、塗布劑、香料之製劑補助劑中之1種或2種以上，藉由公知方法或依據此的方法而製造。

作為前述飲食品組成物的形態，雖無特別限定，例如可舉出如棒狀的固體狀、如飲料或流動食的液狀、糊狀、半液體狀、凝膠狀(膠狀)、凝膠狀油脂(半固體狀油脂)、粉末狀之形態。作為如此飲食品組成物之例子，雖無特別限制，例如可舉出上述本發明之發酵乳(含有乳酸菌飲料、優格等)，或飲料(茶類、碳酸飲料、可可亞、咖啡、豆乳飲料、果汁･蔬菜汁飲料、清涼飲料、營養飲料、酒精飲料等)、加工食品(巧克力、膠、軟糖、果凍、烤點心(麵包、蛋糕、曲奇餅、餅乾等)、糖果等)、乳製品(調製粉乳(粉末牛奶)、調整乳、乳飲料、冰淇淋、人造奶油、煉乳等)、調味料(調味醬、湯、沙拉醬、美乃滋、美乃滋型調味料、乳霜等)、補充劑、食用油、功能性食用油脂等。如此飲食品組成物，例如在本發明之發酵乳的情況時可藉由上述發酵乳之製造方法；於既存飲食品中添加上述發酵物或胞外多醣的方法；對於前述飲食品之製造過程添加上述發酵物或胞外多醣之方法等而製造。

作為前述飲食品組成物，對於其他不會阻礙本發明之效果的範圍內，亦可進一步含有可於飲食品中含有的各種成分。作為如此成分，並無特別限制，例如可舉出上述＜發酵乳＞中所舉出的各種成分、前述醫藥品組成物及準醫藥品組成物所舉出的製劑補助劑，可以適當量含有此等1種或組合2種以上者。

作為前述飼料組成物，可舉出配合賦予飼料組成物的目的、對象、方法、用量等而適宜地改變上述飲食品組成物者。

對於本發明之免疫賦活劑，有效成分之胞外多醣的含有量(若為2種以上之混合物時則為此等的合計量)因可配合劑型、投與量等而適宜決定者，故無法一概而論，相對於免疫賦活劑全體而言，以0.001~90質量%者為佳，以0.002~50質量%者為較佳，以0.003~10質量%者為更佳，以0.01~5質量%者為更較佳，以0.1~1質量%者或0.003~1質量%者為亦佳。

又，本發明之免疫賦活劑的投與量因考慮到對象種類、年齡、體重、性別、治療目的等，而配合個別情況而做適宜決定者，故無法一概而論，通常以有效成分的胞外多醣之量(若為2種以上混合物時其為此等合計量)，作為成人每1天的下限值，例如可設定為0.01mg/kg，以0.02mg/kg為佳，較佳為0.05mg/kg。又，作為前述投與量之上限值，雖無特別限制，成人每1日，例如可為1g/kg。

＜發酵乳之免疫賦活活性提升方法＞本發明之發酵乳的免疫賦活活性提升方法係為含有對於含有原料乳之調乳液中添加本發明之乳酸菌或乳酸菌組成物而使其發酵後得到含有胞外多醣的發酵物之發酵步驟的方法。藉此，可得到含有提升免疫賦活活性的胞外多醣之發酵乳，而可提升該發酵乳之免疫賦活活性。作為前述乳酸菌、乳酸菌組成物及發酵步驟，各對上述本發明之發酵乳的製造方法進行敘述。

對於本發明，發酵乳的免疫賦活活性優異表示，例如對於由評估對象的發酵乳藉由定法而純化的胞外多醣類，與確認上述蛋白質具有免疫賦活活性提升作用的方法同樣地進行測定的NK細胞活性為21%以上，以22%以上為佳，更佳為22.5%以上者為免疫賦活活性優異者。又，發酵乳的免疫賦活活性之提升，例如對於由評估對象的發酵乳藉由定法而純化的胞外多醣類，與確認上述蛋白質具有免疫賦活活性提升作用的方法同樣地進行測定的NK細胞活性，使用連一種的前述(a’)~(d’)之DNA亦不具有的乳酸菌，將同樣地對於所得的發酵乳經純化之胞外多醣類進行測定的NK細胞活性作為1，使其成為1.03以上，以成為1.05以上者為佳，較佳為成為1.10以上而得到確認。 [實施例]

以下依據實施例更具體說明本發明，但本發明並非受限於以下實施例者。

＜乳酸菌＞使用於以下試驗的乳酸菌如以下所示。 R-1株：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1(寄存號碼：FERM BP-10741) 2038株：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 2038 且2038株為，將明治保加利亞優格LB81(明治股份有限公司製)之稀釋液塗抹於BCP加寒天培養基中，在37℃進行48小時培養後，藉由取出粗糙型群體的經分離之菌株，2038株之完全長基因組在將基因組、蛋白質、化合物之情報以分子間之相互作用･反應、關係網路進行統合的生命系統情報統合數據之Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)中以登記號碼：T01957方式註冊。

＜免疫賦活活性評估＞ (1)胞外多醣之調製 (發酵乳之調製) 將R-1株對於以脫脂粉乳10%(wt/wt)、酵母萃取物0.1%(wt/wt)及蒸餾水所調製的10%脫脂粉乳培養基播種至1%(wt/wt)，在37℃中進行一整夜，且在厭氣條件下使其發酵而得到發酵乳。又，取代R-1株使用2038株以外，在相同條件下得到發酵乳。

(胞外多醣之純化) 於在上述所得之各發酵乳中，加入三氯乙酸至終濃度為10質量%，除去所生成的變性蛋白質而得到粗純化物。於所得的粗純化物中加入與此等量的冷乙醇，在4℃靜置16小時，進行乙醇沈澱，得到含有胞外多醣(EPS)之沈澱物1。將所得的沈澱物1使用透析膜(截留分子量：6~8kDa)對於MilliQ水進行透析，將核酸及殘蛋白質經酵素分解後，再度進行乙醇沈澱得到沈澱物2。將所得之沈澱物2溶解於MilliQ水，再度進行透析後，使其冷凍乾燥，得到各純化胞外多醣。將自使用R-1株所得之發酵乳進行純化的純化胞外多醣作為「R-1株EPS」，將自使用2038株所得的發酵乳進行純化的純化胞外多醣作為「2038株EPS」。

(2)NK細胞活性評估對於在上述(1)所得之各純化胞外多醣，測定作為免疫賦活活性評估之NK細胞活性。即，首先將BALB/c母老鼠(7週齡，Japan Claire股份有限公司)計20匹分為2群，將一方群作為R-1株EPS投與老鼠群(n=10)，另一群作為2038株EPS投與老鼠群(n=10)。對於兩群皆以100μg/老鼠/1日的投與量投與各純化胞外多醣，經3週的經口投與。投與期間終了後，摘出各老鼠之脾臟，得到各脾臟細胞。

其次對於各脾臟細胞，依據竹田們的方法(Takeda, K. et al., J. Immunol., 156：3366, 1996)，以鉻釋放法測定NK細胞活性。即，將效應子細胞作為各脾臟細胞，將目標細胞作為以 ⁵¹Cr標識的YAC-1細胞(老鼠淋巴瘤)，將E/T比(效應子細胞數/目標細胞數)設定在200：1而進行4小時培養後，測定培養基澄清液及全培養基的放射能，將在全培養基之放射能中的澄清液之放射能所佔比例作為NK細胞活性(NK活性(%))。結果如圖1所示。如圖1所示，與投與2038株EPS之老鼠相比，對於投與R-1株EPS之老鼠確認到顯著高NK細胞活性，R-1株EPS則確認到具有比2038株EPS更高免疫賦活活性。

＜EPS基因群聚區域之比較＞藉由註冊於KEGG的2038株基因組之核苷酸序列，對於2個EPS基因群聚區域：LBU1598-LBU1588(EPS基因群聚1)及LBU1630-LBU1618(EPS基因群聚2)，各萃取出-100bp~+100bp之區域。又，R-1株之完全長基因組藉由新世代定序器(Next generation sequencer)MiSeq(Illumina公司製)取得。使用Genetyx Ver.13(Genetics股份有限公司製)之Homology/Local BLASTN，藉由R-1株之基因組，萃取出2個與EPS基因群聚區域相同的核苷酸序列(E值閾值(E-value threshold )=0.00001，word size=11)。

對於2038株基因組及R-1株基因組之雙方，EPS基因群聚1、2在高度下保存。特別為EPS基因群聚1的整個全區域(11,569bp)，2038株之核苷酸序列與R-1株之核苷酸序列為完全一致。另一方面，對於EPS基因群聚2，在15,769 bp之中，對於epsC基因及epsF基因，以及epsM基因與Transposase基因之間的2處基因間區域，確認到合計4鹼基之差異。因考慮到epsC基因並非與糖轉移相關基因，又基因間區域中之變異自與任一基因無關，故可推測為與糖轉移相關的基因之epsF基因中的鹼基之差異及隨之的胺基酸組成之差異，與R-1株所產生的胞外多醣與2038株所產生的胞外多醣之免疫賦活活性的差異有關。於表1中表示在2038株基因組與R-1株基因組之間確認到差異的epsF基因之鹼基、該鹼基所含的密碼子、該密碼子所編碼的胺基酸，及其胺基酸之基因中的位置。又，對於epsF基因，因藉由該鹼基之差異而產生框位移，故於下述表2中表示，含有在2038株基因組與R-1株基因組之間確認到差異的鹼基之密碼子以下的核苷酸序列及其所編碼的胺基酸序列。又，表2所記載的2038株基因組之核苷酸序列以SEQ ID NO:3表示，將胺基酸序列以SEQ ID NO:4表示；將R-1株基因組的核苷酸序列以SEQ ID NO:5表示，將胺基酸序列以SEQ ID NO:6表示。

如表1所示，2038株基因組與R-1株基因組之差異為，2038株基因組之epsF基因的第999個鹼基之鳥嘌呤(G)在R-1株基因組中為欠缺(del)。藉此，在R-1株基因組中，框位移產生的密碼子之讀框(reading frame)雖有著偏差，含有該鹼基之密碼子所指定的胺基酸中，2038株基因組及R-1株基因組同時為第333位之甘胺酸(G)。因此，如表2所示，藉由框位移，自甘胺酸至C末端的胺基酸序列在兩株間相異，在2038株基因組中，其為N末端側-Gly-Leu-Ala-Ile-Leu-C末端側，在R-1株基因組中，其為N末端側-Gly-Ser-Leu-Phe-Ser-Asp-C末端側。藉由此等結果，在乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性提升作用中，R-1株之epsF基因所編碼的蛋白質之第334~338位的絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸為重要。 [產業上可利用性]

如以上說明，依據本發明可提供具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之新穎蛋白質，以及含有具有優異免疫賦活活性的胞外多醣之發酵乳及其製造方法。更詳細為提供具有在乳酸菌表現時所產生的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之新穎蛋白質、編碼前述蛋白質的DNA、含有前述DNA的載體、含有前述DNA或前述載體之乳酸菌及其乳酸菌組成物，以及使用此等的發酵乳、免疫賦活劑，及此等製造方法、使發酵乳之免疫賦活活性提升的方法、乳酸菌之評估方法。

例如藉由將編碼本發明之新穎蛋白質的DNA導入於種種乳酸菌中，經由該乳酸菌，可容易製造出免疫賦活活性優異的胞外多醣，及含有此的發酵乳或免疫賦活劑。又，將編碼本發明之新穎蛋白質的DNA之序列作為選出基準下，可容易地選出免疫賦活活性優異的胞外多醣，及含有此的發酵乳或可製造免疫賦活劑之乳酸菌。

[圖1]表示在＜免疫賦活活性評估＞所得的來自2038株的胞外多醣(2038株EPS)或來自R-1株的胞外多醣(R-1株EPS)之NK細胞活性(NK活性(%))的圖表。

序列表
          <![CDATA[<110>  明治股份有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  具有乳酸菌之胞外多醣之免疫賦活活性之提升作用之蛋白質、以及使用其之發酵乳及其製造方法]]>
          <![CDATA[<130>  IBPF21-535WO]]>
          <![CDATA[<150>  JP2020-172078]]>
          <![CDATA[<151>  2020-10-12]]>
          <![CDATA[<160>  6     ]]>
          <![CDATA[<170>  專利版本 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  338]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Ile Thr Gly Leu Gly Ile Leu Met Lys Glu Asn Ser Lys Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Tyr Phe Val Glu Ala Met Gly Gly Gly Val Phe Thr Tyr Ile 
                      20                  25                  30          
          Val Asp Leu Ala Asn Ser Leu Val Asp Asp Trp Asp Val Tyr Ile Gly 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Val Arg Asn Gln Thr Pro Gln Asn Tyr Arg Asp Tyr Phe Asp 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val His Leu Ile Glu Val Lys Asp Phe Ala Arg Ser Thr Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Met Lys Ala Ile Lys Ala Gly Gln Glu Met Lys Arg Ile Ala Lys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ile Arg Pro Asp Val Ile His Leu His Ser Ser Ile Ala Gly Ala 
                      100                 105                 110         
          Ile Gly Arg Val Val Phe Asn Thr Lys Lys Thr Pro Val Phe Tyr Thr 
                  115                 120                 125             
          Pro His Gly Tyr Ser Phe Leu Met Gln Gly Glu Ser Ser Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Leu Ala Tyr Lys Leu Val Glu Gln Phe Cys Gly Lys Ser Gln Ala Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Ile Ala Cys Ser Pro Gly Glu Tyr Gln Glu Ala Leu Lys Val Ser 
                          165                 170                 175     
          Lys His Ala Val Glu Val Asp Asn Gly Ile Asn Ile Glu Gln Leu Gln 
                      180                 185                 190         
          Glu Leu Ile Asp Thr Thr Asp Ala Ser Lys Ile Asp His Tyr Asp Val 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Leu Gly Arg Ile Ser Val Gln Lys Asn Pro Asn Val Phe Asn 
              210                 215                 220                 
          Glu Val Ala Leu Lys Leu Pro Asn Leu Lys Phe Leu Trp Ile Gly Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Glu Leu Arg Ser Glu Leu Thr Ala Pro Asn Ile Thr Val Thr Gly 
                          245                 250                 255     
          Trp Leu Thr Arg His Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Leu Asn Ser Asp Thr 
                      260                 265                 270         
          Phe Met Leu Thr Ser Leu Trp Glu Gly Leu Pro Met Ser Leu Leu Glu 
                  275                 280                 285             
          Ala Met Tyr Met Lys Lys Leu Cys Val Val Ser Asp Val Ile Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          His Asp Val Ile Asn Asp Gly Val Asn Gly Tyr Val Cys Gln Thr Val 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Val Phe Tyr Asn Arg Ile Ser Met Ile Gly Gly Gly Ser Leu Phe 
                          325                 330                 335     
          Ser Asp 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  1017]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          atgattacag ggttaggcat attaatgaaa gaaaacagta aacctcgcct gctctacttc       60
          gtcgaagcga tgggcggcgg ggtttttaca tatattgttg atctagcaaa tagcctagtg      120
          gatgattggg atgtctatat tggttatgct gtgcgcaatc aaacgcctca gaattatcga      180
          gactattttg atgagcgggt acatctgatc gaggttaaag attttgctcg tagtactagc      240
          atcatgaaag caatcaaagc aggacaagag atgaaaagga tagcaaaggc tattcggcca      300
          gacgttattc atctacattc tagtattgcg ggtgcaattg gacgtgttgt ctttaataca      360
          aagaaaacgc cggtctttta tactccacat ggttacagct tcttaatgca aggcgagagt      420
          agcaagaaac gcttggcgta taagttggtt gagcagtttt gcggcaagag ccaagcaacg      480
          accattgcat gtagccctgg tgagtatcaa gaagctttaa aagtctctaa acatgccgtg      540
          gaagttgata atggtatcaa cattgaacaa ttgcaagaat tgatagacac gacggacgct      600
          tcgaagattg atcattatga tgtttttaca ctggggcgta tctcagtaca gaagaatcca      660
          aatgttttca atgaggtcgc attgaagttg ccgaatttaa aatttttgtg gattggcgat      720
          ggtgaattac gttcagagct aactgctccg aatattactg ttaccggttg gttaacgcgt      780
          catgaggcgt taaagtactc acttaatagt gatactttta tgcttacctc actgtgggaa      840
          gggttaccga tgagcttgtt ggaagcaatg tacatgaaga aattatgtgt ggtcagcgat      900
          gtcatcggta accatgatgt aatcaatgat ggtgttaatg ggtatgtatg tcagaccgtt      960
          aatgtttttt ataatagaat atcaatgatc ggggggggct cgctattctc tgattga        1017
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
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          gggctcgcta ttctctga                                                     18
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          <![CDATA[<400>  4]]>
          Gly Leu Ala Ile Leu 
          1               5   
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          ggctcgctat tctctgattg a                                                 21
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213> 德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Gly Ser Leu Phe Ser Asp 
          1               5

Claims

一種蛋白質，其為選自由下述(a)~(d)的蛋白質所成群的至少1種蛋白質， (a)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列而成的蛋白質 (b)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列中，第334~338位絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外的胺基酸之1或者複數個經取代、缺失、插入及/或加成的胺基酸序列所成，且具有乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之提升作用的蛋白質 (c)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之提升作用的蛋白質 (d)由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴密條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質。
一種DNA，其為編碼如請求項1之蛋白質者。
一種載體，其中含有如請求項2之DNA。
一種組成物，其中含有選自由如請求項1之蛋白質、如請求項2之DNA，及如請求項3之載體所成群的至少1種。
一種乳酸菌，其係導入選自由如請求項2之DNA及如請求項3之載體所成群的至少1種者。
一種乳酸菌，其中具有如請求項2之DNA。
如請求項6之乳酸菌，其中胞外多醣之免疫賦活活性為高。
一種乳酸菌組成物，其中含有如請求項5~7中任一項之乳酸菌。
如請求項8之乳酸菌組成物，其為發酵乳。
如請求項8或9之乳酸菌組成物，其中含有來自如請求項5~7中任一項之乳酸菌的胞外多醣。
一種發酵乳之製造方法，其中含有於含有原料乳之調乳液中添加如請求項5~7中任一項之乳酸菌或如請求項8~10中任一項之乳酸菌組成物而使其發酵，得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟。
一種提升發酵乳之免疫賦活活性的方法，其中含有於含有原料乳之調乳液中添加如請求項5~7中任一項之乳酸菌或如請求項8~10中任一項之乳酸菌組成物而使其發酵，得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟。
一種乳酸菌之評估方法，其係將編碼選自由下述(a)~(d)之蛋白質中任一的DNA所成群的至少1種DNA作為指標，評估胞外多醣之免疫賦活活性， (a)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列而成的蛋白質 (b)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列中，第334~338位絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸以外的胺基酸之1或者複數個經取代、缺失、插入及/或加成的胺基酸序列而成，且具有乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之提升作用的蛋白質 (c)由與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列所成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之提升作用的蛋白質 (d)由藉由與由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列而成的DNA之互補鏈在嚴密條件下進行雜交的DNA所編碼的胺基酸序列而成，對應SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的第334~338位之胺基酸自N末端側起為絲胺酸、亮胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸及天冬胺酸，且具有乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的提升作用之蛋白質。
一種乳酸菌之製造方法，其中含有以如請求項13之乳酸菌的評估方法評估乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的評估步驟，與得到於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌的步驟。
一種發酵乳之製造方法，其中含有以如請求項13之乳酸菌的評估方法評估乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之評估步驟，與於含有原料乳之調乳液中，添加於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌而使其發酵，得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟。
一種提升發酵乳之免疫賦活活性的方法，其中含有以如請求項13之乳酸菌的評估方法評估乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之評估步驟，與於含有原料乳的調乳液中，添加於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌而使其發酵，得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟。
一種免疫賦活劑，其中含有作為有效成分的來自如請求項5~7中任一項之乳酸菌的胞外多醣。
一種乳酸菌的胞外多醣之製造方法，其中含有於含有將葡萄糖及/或葡萄糖作為構成糖之糖的培養基中，添加如請求項5~7中任一項之乳酸菌或如請求項8~10中任一項之乳酸菌組成物而使其發酵，採取含於發酵物的胞外多醣之步驟。
一種乳酸菌的胞外多醣之製造方法，其中含有以請求項13之乳酸菌的評估方法評估乳酸菌的胞外多醣之免疫賦活活性的評估步驟，與於含有將葡萄糖及/或葡萄糖作為構成糖之糖的培養基中，添加於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌而使其發酵，採取含於發酵物的胞外多醣之步驟。
一種免疫賦活劑之製造方法，其中含有於含有將葡萄糖及/或葡萄糖作為構成糖之糖的培養基中，添加如請求項5~7中任一項之乳酸菌或如請求項8~10中任一項之乳酸菌組成物而使其發酵，得到含有胞外多醣的發酵物之發酵步驟，與得到含有作為有效成分的前述胞外多醣之免疫賦活劑的步驟。
一種免疫賦活劑之製造方法，其中含有以如請求項13之乳酸菌的評估方法評估乳酸菌之胞外多醣的免疫賦活活性之評估步驟，與於含有將葡萄糖及/或葡萄糖作為構成糖之糖的培養基中，添加於前述評估步驟評估胞外多醣具有免疫賦活活性，或胞外多醣之免疫賦活活性為高的乳酸菌而使其發酵，得到含有胞外多醣之發酵物的發酵步驟，與得到含有作為有效成分的前述胞外多醣之免疫賦活劑的步驟。