KR100654383B1

KR100654383B1 - 락토코커스 락티스로부터 분리된 ａｄｉ 분획물을 유효성분으로 함유하는 암세포 증식 억제용 식품 조성물

Info

Publication number: KR100654383B1
Application number: KR1020060012106A
Authority: KR
Inventors: 김서영; 이기원; 이형주
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-02-08
Filing date: 2006-02-08
Publication date: 2006-12-06
Also published as: KR20060026082A

Abstract

본 발명은 락토코커스 락티스로부터 분리된 ADI(arginine deiminase)를 유효 성분으로 함유하는 암세포 증식 억제용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 락토코커스 락티스로부터 분리된 ADI(arginine deiminase)는 암 세포주 특히, 위암 또는 대장암 세포주의 증식을 매우 효과적으로 억제하므로, 항암용 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 독성을 제거하기 위한 별도의 정제 과정 없이도 항암 효과를 갖는 기능성 식품 조성물로도 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 락토코커스 락티스의 세포질 분획으로부터 ADI만을 분리하여 제제화하면 되므로, 기존의 항생제를 포함하는 여러 종류의 항암제들에 비하여 생산 원가를 낮출 수 있다는 장점이 있다.

락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 암, ADI(arginine deiminase)

Description

락토코커스 락티스로부터 분리된 ＡＤＩ 분획물을 유효성분으로 함유하는 암세포 증식 억제용 식품 조성물{Food composition comprising ADI fraction separated from Lactococcus lactis for inhibiting proliferation of tumor cell}

도 1은 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 가열 온도에 따른 위암 세포주 증식 억제 활성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 pH에 따른 위암 세포주 증식 억제 활성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 농도에 따른 위암 세포주 증식 억제 활성 및 ADI 활성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 ADI(arginine deiminase)의 분리 방법에 의해 분리된 분획의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 사진을 나타낸 것이다(A 레인: 분자량을 나타내는 마커, B 레인: 음이온 교환 크로마토그래피 수행 후 얻어진 ADI 분획물, C 레인: B의 분획물에 대해 추가의 겔 투과 크로마토그래피 수행 후 얻어진 ADI 분획물, D 레인: C의 분획물에 대해 추가의 겔 투과 크로마토그래피 수행 후 얻어진 ADI 분획물).

도 5는 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 ADI 분획을 농도별로 위암 세포주인 SNU-1에 처리하여 MTT 어세이를 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 SNU-1에 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 ADI 분획을 첨가하고 배양한 후에 암세포의 세포사멸(apoptosis) 현상을 관찰한 전자 현미경 사진이다.

도 7은 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 농도별로 대장암 세포주 SNU-C2A에 처리하여 MTT 어세이를 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 ADI 분획을 농도별로 대장암 세포주 SNU-C2A에 처리하여 MTT 어세이를 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 다양한 젖산균주들의 세포질 분획의 ADI 활성을 조사한 결과를 나타낸 것이다(Blon: 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium , longum), Bbre: 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), Lcas: 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이(Lactobacillus casei), Lpla: 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), Sthe: 스트렙토코쿠스 써모모필러스(Streptococcus thermophilus), Lbul: 락토바실러스 불가리쿠스(lactobacillus bulgaricus), Bado: 비피도박테리움 아돌레선트(bifidobacterium adolescent), Llac: 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스(Lactococcus lactis ssp . lactis).

본 발명은 식품 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 락토코커스 락티스로부터 분리된 ADI를 유효성분으로 함유하는 암세포 증식 억제용 식품 조성물에 관한 것이다.

락토코커스 락티스는 젖산균(lactic acid bacteria)의 일종이다. 젖산균은 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 젖산을 생산하는 미생물로 자연계에 널리 분포하는 미생물이다. 젖산균은 중성 및 알칼리성에서 잘 생육하는 부패성 미생물의 생육을 억제하여 동서양을 막론하고 식품의 중요한 보존 수단으로 응용되어 왔으며, 특히, 우유, 유제품, 육제품, 침채류 및 각종 젓갈류의 가공에 이용되어 왔다. 젖산균은 이들의 대사산물인 여러 종류의 유기산에 의해 pH를 감소시키면서 식품의 보존성을 증진시키는데, 젖산 및 초산과 같은 유기산은 대부분의 미생물에 대하여 살균작용(bacteriocide)이 있기 때문이다.

최근에, 섭취되는 젖산균이 대장에서 종양을 억제할 수 있다는 내용이 보고된 이후로, 암과 같은 식생활과 연관된 만성적인 질병들의 치료에 있어서 젖산균의 중요성이 부각되게 되었다. 예컨대, 설치류에서 화학적으로 유발된 암세포가 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이(Lactobacillus casei ssp . casei)를 투여함으로써 저해되었다(Tomita et al., Nihon Hinyoukika Gakkai, 85:655-663, 1994; Yokokura, Intestinal Flora and Human Health, 72-88, 1994).

또한, 젖산균이 숙주 세포의 면역 작용을 촉진시키는 기작에 의한 항암 효과 이외에도 암세포에 대한 직접적인 세포독성효과가 있다는 것이 보고 되었고, 이러 한 활성의 본체는 펩티도글라이칸이라고 보고된 바 있다(Fichera, G. A., and Giese, G., Cancer Lett., 85:93-103, 1994). 또한, 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 세포벽 성분이 종양세포 증식억제 효과가 있다고 보고된 바 있다(Nomoto, K., Biotherapy, 1:169-177, 1989; Park, S.J. et al., Kor . J. Appl . Microbiol. Biotechnol. 27:8-14, 1999).

한편, 본 출원의 발명자들은 종래 세포벽 분획 중의 펩티도글라이칸 성분이 생체내 종양의 억제에 효과가 있었다고 보고된 바와 달리, 균주내에 존재하는 세포질 분획이 펩티도글라이칸보다 더 효과적으로 암 세포주의 증식을 억제하는 것을 보고하였다(특허 등록 제 10-0411198호).

본 발명자들은 암 세포주에 대해 증식 억제 활성을 나타내는 균주의 세포질 분획에 있어서, 세포질 분획 중 어떠한 성분이 암 세포주 증식 억제 활성을 나타내는지를 밝히기 위하여 연구를 계속하던 중, 락토코커스 락티스의 세포질 분획 중에 존재하는 ADI(arginine deiminase)가 암 세포주의 증식 억제의 유효성분임을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 젖산균주로부터 분리된 ADI를 유효성분으로 함유하는 암세포 증식 억제용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 분리된 ADI(arginine deiminase)를 포함하는 암세포 증식 억제용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

종래에 암 세포주에 대해 증식 억제 활성을 나타내는 몇몇 균주에 있어서, 균주의 전체 세포(whole cell) 또는 균주의 세포벽을 구성하는 펩티도글라이칸이 암 세포주 증식 억제 효과를 나타낸다고 보고된 바가 있었다. 하지만, 본 발명자들은 특허 등록 제 10-0411198호에서, 균주의 전체 세포 및 펩티도글라이칸 성분보다 균주내에 존재하는 세포질 분획(cytoplasmic fraction)이 훨씬 강력한 암 세포주 증식 억제 효과를 나타낸다는 것을 입증하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 암 세포주에 대해 증식 억제 활성을 나타내는 젖산균의 세포질 분획 중 활성 성분을 확인하기 위하여, 활성 성분의 특성을 분석하였다. 그 결과, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 열처리하는 경우 열처리하지 않는 경우에 비해 항암 활성이 급격히 떨어졌다(도 1 참조). 또한, 상기 세포질 분획은 pH 5-7에서는 항암활성이 유지되었지만 나머지 pH에서는 활성이 20% 정도 떨어졌다(도 2 참조). 상기 결과로부터, 암 세포주 증식 억제 활성을 갖는 성분은 효소의 일종임을 알 수 있다.

효소로 추정되는 활성 성분을 확인하기 위하여, 락토코커스 락티스 에스에스 피의 세포질 분획의 농도 증가에 따른 암 세포주 증식 억제 활성을 상기 세포질 분획에 포함되어 있는 효소들의 활성과 비교하였다. 그 결과, 락토코커스 락티스 에스에스피의 세포질 분획의 농도가 증가함에 따라 ADI의 활성도 증가하였고, 상기 ADI의 활성도는 세포질 분획의 암 세포주 증식 억제율과 상관관계가 있음이 확인되었다(도 3 참조). 반면, ADI 외의 나머지 효소들의 활성은 상기 세포질 분획의 암 세포주 증식 억제율과 상관관계가 존재하지 않았다(결과 미도시). 상기 결과로부터, 락토코커스 락티스의 세포질 분획에 함유되어 있는 ADI가 암 세포주 증식 억제의 활성 성분인 것으로 추정하였다.

본 발명에 따른 락토코커스 락티스로부터 분리된 ADI(arginine deiminase)가 암 세포주 증식 억제 활성을 갖는지 여부를 실제로 확인하기 위하여, 본 발명의 방법에 따라 분리된 ADI 분획 및 기존에 암 세포주 증식 억제 활성을 갖는다고 알려져 있는 젖산균주의 세포질 분획을 사용하여 MTT 어세이를 수행하였다.

그 결과, 위암 세포주에 대하여, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 250 ug/ml까지 첨가하여도 위암 세포주의 증식을 50%까지 억제하지 못하였으나(도 3 참조), 그로부터 분리된 본 발명의 ADI 분획의 경우 2 ug/ml를 첨가하면 위암 세포주의 증식이 50% 억제되었다(ADI 분획의 IC₅₀=2 ug/ml; 도 5 참조).

마찬가지로, 대장암 세포주에 대하여, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 250 ug/ml까지 첨가하여도 대장암 세포주의 증식을 50%까지 억제하지 못하였지만(도 7 참조), 그로부터 분리된 본 발명의 ADI 분획의 경우 5 ug/ml 에서 대장암 세포주의 증식을 50% 억제시켰다(ADI 분획의 IC₅₀=5 ug/ml; 도 8 참조).

상기 결과에 의하면, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획에 비하여 그로부터 분리된 ADI 분획의 암 세포주 증식 억제 효과가 현저히 우수한 것을 알 수 있다. 따라서, 공지의 암 세포주 증식 억제제인 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획 중 ADI가 상기 암 세포주 증식 억제에 대한 유효 성분임을 알 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 ADI 분획이 암 세포주의 증식을 억제하는 기작을 확인하기 위하여, 상기 ADI 분획을 위암 세포주에 처리하여 전자 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 암 세포주에서 세포사멸(apoptosis) 과정 중 일부인 염색질 응축(chromatin condensation) 현상이 일어나는 것을 확인하였다(도 6 참조). 상기 결과에 의하여, 본 발명에 따른 ADI 분획의 암 세포주 증식 억제 과정 중 일부로서 염색질 응축(chromatin condensation) 현상이 일어나고, 결국 암 세포주의 세포사멸이 발생함을 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 락토코커스 락티스 외의 다른 젖산균주의 세포질 분획에도 ADI가 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위하여, 각종 젖산균주의 세포질 분획에 대하여 ADI 활성을 조사하여 비교하였다. 그 결과, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스 외의 젖산균주들의 세포질 분획은 ADI 활성을 거의 갖지 않았다(도 9 참조). 상기 결과로부터, ADI는 젖산균주들 중 특히 락토코커스 락티 스에 다량으로 포함되어 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 분리된 ADI(arginine deiminase)를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.

상기 암은 위암, 대장암, 백혈병, 폐암, 신장암, 방광암, 자궁 경부암, 유방암, 간암 또는 전립선암 등을 포함할 수 있지만, 위암 또는 대장암인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 ADI는 젖산균으로부터 분리되어 사용될 수 있지만, 락토코커스 락티스로부터 분리되는 것이 바람직하며, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스로부터 분리되는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 항암용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 분리된 ADI(arginine deiminase)를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 “약학적으로 유효한 양”이란 암을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 분리된 ADI(arginine deiminase)의 약학적으로 유효한 양은 0.1 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 1 ~ 10 mg/day/체중kg이다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 암의 종류 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

상기 항암용 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 항암용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 항암용 조성물은 암을 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 락토코커스 락티스로부터 분리된 ADI는 암의 예방 또는 치료 목적으로 식품에 첨가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 락토코커스 락티스로부터 분리된 ADI를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용한 젖산균주는 식품 등급으로 사용할 수 있어 독성을 제거하기 위한 별도의 정제 과정 없이도 안전하게 섭취할 수 있는 잇점이 있으므로, 암 세포주 억제 활성을 갖는 락토코커스 락티스의 세포질 분획에서 분리된 ADI 분획을 식품에 첨가하여 섭취하게 되면 항암효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강 식품으로는 본 발명의 ADI 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 ADI를 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 락토코커스 락티스로부터 분리된 ADI를 식품 첨가제의 형태 로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 락토코커스 락티스로부터 분리된 ADI의 바람직한 함유량으로는 식품 100g당 약 0.1 ~ 10 mg이다.

또한, 본 발명은 락토코커스 락티스로부터 ADI(arginine deiminase)를 분리하는 방법을 제공한다.

상기 특정 균주로부터 ADI(arginine deiminase)를 분리하는 방법은 (a) 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 세포벽을 분리하여 세포질 분획을 얻는 단계; 및 (b) 상기 세포질 분획으로부터 크로마토그래피를 통해 ADI 분획을 얻는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

보다 바람직하게, 상기 (a)의 세포질 분획을 얻는 단계는 세포를 파쇄하고, 상기 파쇄된 세포를 원심분리하여 침전물을 제거함으로써 수행된다.

또한, 상기 (b)의 ADI 분획을 얻는 단계는 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 및 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)를 차례로 수행하는 것이 보다 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획 중 항암 활 성 물질의 특성 분석

<1-1> 단백질 및 당 함량 측정

락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 단백질 함량 및 당 함량 분석은 공지된 방법인 로리(Lowry) 및 황산 반응법을 이용하여 측정하였다. 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 단백질 함량 및 당 함량은 각각 약 47%와 약 24% 로 나타났다.

<1-2> 열 안정성 분석

락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 각각 60℃, 70℃, 80℃, 90℃ 및 100℃에서 1시간 열처리 한 후, 사람의 위암 세포주인 SNU1에 처리하여 항암 활성의 변화를 비교하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 결과로부터, 열처리된 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 경우 열처리 되지 않는 경우에 비해 항암 활성이 급격히 떨어짐을 확인하였다.

<1-3> pH 안정성 분석

락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 각각 pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9에서 1시간 처리한 SNU1에 대한 항암활성 검증하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 세포주 증식 억제 활성은 pH 5-7에서는 유지되었지만, 나머지 pH에서는 20% 정도 떨어짐을 확인 하였다.

상기 결과들로부터, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획 중 항암 활성의 유효 성분은 효소의 일종이라고 예측되었다.

< 실시예 2> 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 농도 증가에 따른 암 세포주 증식 억제 활성 및 ADI 활성의 비교

락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 암 세포주 증식 억제 활성은 실시예 <5-1>의 방법과 동일하게 측정하였다.

또한, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 ADI 활성도 측정은 L-시트룰린(L-citrulline)의 양을 측정하는 방법을 사용하는 공지 방법인 오긴스키(Oginsky) 법을 응용하였다. 즉, ADI는 L-아르기닌(L-arginine)을 L-시트룰린 및 암모니아로 분해시키므로, L-시트룰린의 생성량을 확인함으로써 ADI 활성을 측정할 수 있다. 먼저, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 10 mM 아르기닌 및 50 mM 트리스(Tris; pH 7.0)에 용해하여 최종 부피가 1.0 ㎖되게 하였다. 그 후, 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음, 여기에 H₂SO₄와 H₃PO₄가 1:3 (v/v) 비율로 혼합된 용액 0.5 ㎖을 넣어 L-시트룰린의 생성반응을 멈추게 한 후, 디아세틸 모노옥심(diacetyl monooxime)을 넣어 색깔 변화 정도를 확인하였다. 1 유닛의 ADI 활성은 1시간 동안 1 mol의 L-아르기닌을 1 mol의 L-시트룰린으로 변화시키는 효소의 작용이다. 단백질 양은 BCA 어세이 키트(Pierce Co, USA)를 이용하여 측정하였다.

상기에서 측정된 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 결과로부터, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 농도 증가에 따른 ADI 활성의 증가도와 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획의 농도 증가에 따른 세포 증식 억제 효과의 증가도가 유사하여, 상관성이 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 3> ADI 의 특성 분석

<3-1> 최적 pH 분석

ADI 분획을 각각 pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9에서 1시간 처리한 다음, 상기 세포질 분획의 ADI 활성을 측정하였다. ADI 활성의 측정은 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 수행하였다. 그 결과, pH 7에서 가장 활성이 높게 나타났다.

<3-2> 최적 버퍼 분석

트리스(Tris) 버퍼 및 기존 문헌의 대부분에서 사용되는 인산칼륨 버퍼(potassium phosphate buffer)에서의 ADI 활성을 조사한 결과, ADI 활성은 트리스(Tris) 버퍼에서 더 높게 유지되었다.

< 실시예 4> 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스로부터 ADI 분획의 제조

<4-1> 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 배양

젖산균인 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스(Lactococus lactis ssp . lactis: 기탁번호 ATCC 7962)를 5% 글루코스가 첨가된 M17 액체 배지(Difco) 3 ℓ에 접종하여 30℃로 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm, 4℃로 원심분리(Vision, Korea)하여 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스를 회수하였고, 증류수로 3회 세척한 후 동결 건조시켜 보관하였다.

<4-2> 세포질 분획의 분리

상기 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 분리하기 위하여, 실시예 <4-1>에서 동결 건조시킨 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스를 증류수에 10 ㎎/㎖ 농도로 현탁하였다. 현탁한 세포를 세포 파쇄기(Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA)를 이용하여 30분간 파쇄하되, 발생되는 열을 얼음으로 냉각시키면서 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 5℃에서 800 g로 30분간 원심분리하여 세포 침전물을 제거하였다. 파쇄된 세포의 상층액으로부터 세포벽을 분리하기 위하여, 70,000 g로 30분간 초고속 원심분리(Ultracentrifuge, Hitach, Tokyo, Japan)하여 세포벽이 포함된 침전물을 제거함으로써 상층액인 세포질 분획을 분리하였다.

<4-3> 세포질 분획으로부터 ADI 분획의 분리 및 확인

상기 실시예 <4-2>에서 분리된 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획으로부터 ADI 분획을 분리 및 확인하였다.

먼저, 하이트랩 큐 세파로스 칼럼(HiTrap Q sepharose Fast Flow 5ml prepacked column; Amersham Co., USA)을 사용하여 음이온 교환 크로토그래피(anion exchange chromatography)를 수행하였다. 이 때, 용출 버퍼로서 10mM 트리스 버퍼(Tris buffer; pH 7.0; A 버퍼) 및 1M NaCl이 포함된 10mM 트리스 버퍼(Tris buffer; pH 7.0; B 버퍼)를 사용하였다. 먼저 A 버퍼를 흘리면서 상기 실시예 <4-2>에서 분리된 세포질 분획을 주입하여 충분히 세척한 후, 3ml/min 의 용출 속도로 50분 동안 100% A 버퍼에서 100% B 버퍼가 되도록 농도 구배를 주었다. 시간별로 분획을 받아 ADI 활성이 나타나는 분획만을 모았다. ADI 활성의 측정은 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 수행하였다.

이후, 상기 수집된 ADI 활성을 나타내는 분획을 다시 세파크릴 칼럼(Sephacryl 200 16/26 column; Amersham Co., USA)을 이용하여 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)를 수행하였다. 용출 버퍼로서 0.15M NaCl이 포함된 10mM 트리스 버퍼(Tris buffer; pH 7.0)를 사용하였고, 용출 속도는 0.4㎖/min였다. 시간별로 분획을 받아 ADI 활성을 나타내는 분획만을 모았다. ADI 활성의 측정은 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 수행하였다.

상기에서 분리된 분획이 ADI를 포함하는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 분획을 농축하여 12% SDS-PAGE 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 C 및 D에 나타낸 바와 같이, 상기 2단계의 크로마토그래피에 의해 분리된 분획은 ADI를 고농도로 포함하고 있음을 알 수 있다.

< 실시예 5> 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포 분획으로부터 분리한 ADI 의 암 세포주 증식 억제 정도 측정

<5-1> 위암 세포주에 대한 ADI 의 증식 억제도 측정

암 세포주로는 인간 유래 위암 세포주인 SNU-1(KCLB 00001)을 사용하였다. 상기 암 세포주의 배양은 RPMI-1640에 FBS를 10%로 첨가하고, 페니실린(penicillin) 100 IU/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/㎖을 첨가한 배지를 이용하여, 5% CO₂, 37℃ 배양기(Forma Scientific Co., Marjetta, OH, USA)에서 수행되었다. 세포 배양에 사용한 배지 조성물들은 모두 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다.

락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획 중 암 세포주의 증식 억제 효과를 나타내는 물질이 ADI 분획인지 여부를 확인하기 위하여, 상기 배양한 SNU-1 암 세포주를 96 웰 플레이트(well plate)에 1 x 10⁴개 세포를 분주하고, 실시예 <4-2> 및 <4-3>에서 각각 분리한 세포질 분획 및 ADI 분획을 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 48시간 동안 배양하였다.

암세포의 증식 억제 정도를 측정하기 위하여, 공지의 방법(Mosmann, J. Immunol. Method, 65:55-63, 1983)에 따라 MTT 어세이를 실시하였다. 배양된 세포를 인산 완충용액으로 2회 세척하였다. 96 웰 플레이트에 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; MTT, Sigma)를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 96 웰 플레이트를 800 g로 실온에서 25분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 파란색의 포르마잔(formazan) 생성물에 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 0.1 ㎖을 첨가하여 교반기(shaker) 위에서 80 rpm으로 30분 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 본 실시예에 따라 3회 반복 실험을 수행하였으며, ADI 분획의 세포 증식 억제 정도를 %로 계산하여 도 3 및 도 5에 나타냈다.

도 5에 나타낸 바와 같이, ADI 분획은 농도 의존적으로 암세포 증식을 억제하는 것을 알 수 있다. 본 발명의 ADI 분획의 경우 2 ug/ml에서 위암 세포주의 증식을 50% 억제시켰다.

상기 결과에 의하여, 세포질 분획 전체에 비해 ADI 분획의 위암 세포주에 대한 증식 억제 효과가 현저히 우수함을 알 수 있다.

<5-2> 대장암 세포주에 대한 ADI 의 증식 억제도 측정

상기 실시예 <5-1>의 위암 세포 증식 억제를 측정한 방법을 이용하여, 대장암 세포주 SNU-C2A(KCLB0000C2A)에 대하여, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스 의 세포질 분획 및 그로부터 분리된 ADI 분획의 증식 억제도를 측정하였다. 상기 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, ADI 분획은 농도 의존적으로 대장암 세포의 증식을 억제하고, 5 ug/㎖의 농도에서 대장암 세포주의 증식을 50% 억제시켰다.

상기 결과에 의하여, 세포질 분획 전체에 비해 ADI 분획의 대장암 세포주에 대한 증식 억제 효과가 현저히 우수함을 알 수 있다.

<5-3> 세포사멸 확인

위암 세포주 SNU-1의 배양시 ADI 분획을 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 48시간 동안 배양하고 원심분리하여 세포를 모은 후, 4% 파라포름알데히드로 고정시킨다. 슬라이드에 옮겨 실온에서 건조시킨 후, 1 ug/㎖ 농도의 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 15분간 염색한 다음 전자 현미경(Olympus 1x70, Japan)으로 관찰하였다. 상기 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, ADI 분획을 암 세포주에 처리하는 경우, 세포사멸(apoptosis) 과정 중 일부인 염색질 응축(chromatin condensation) 현상이 일어나는 것을 확인하였다.

< 실시예 6> 젖산균별 ADI 활성 비교

상기 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스 외의 다른 젖산균주의 세포질 분 획에도 ADI가 다량 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위하여, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium , longum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코쿠스 써모모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(lactobacillus bulgaricus), 비피도박테리움 아돌레선트(bifidobacterium adolescent) 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스(Lactococcus lactis ssp. lactis)의 세포질 분획의 ADI 활성을 각각 조사하여 비교하였다.

그 결과를 도 9에 도시하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스 외의 젖산균주의 세포질 분획은 ADI 활성을 거의 갖지 않음을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 락토코커스 락티스의 세포질 분획 중 ADI 성분이 암 세포주, 특히 위암 및 대장암 세포주에 대해 현저히 우수한 증식 억제 효과를 가졌다. 따라서, 본 발명에 따라 락토코커스 락티스로부터 분리된 ADI(arginine deiminase)는 암 세포주 특히, 위암 또는 대장암 세포주의 증식을 매우 효과적으로 억제하므로, 항암용 약학적 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 독성을 제거하기 위한 별도의 정제 과정 없이도 항암 효과를 갖는 기능성 식품 조성물로도 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 락토코커스 락티스의 세포질 분획으로부터 ADI만을 분리하여 제제화하면 되므로, 기존의 항생제를 포함하는 여러 종류의 항암제들에 비하여 생산 원가를 낮출 수 있다는 장점이 있다.

Claims

락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 세포질 분획으로부터 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 및 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)를 순차적으로 수행함으로써 분리된 ADI(arginine deiminase) 분획물을 포함하는 암세포 증식 억제용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)가 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스(Lactococcus lactis ssp. lactis)인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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