CN100584940C - 一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用 - Google Patents

一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN100584940C
CN100584940C CN200710107822A CN200710107822A CN100584940C CN 100584940 C CN100584940 C CN 100584940C CN 200710107822 A CN200710107822 A CN 200710107822A CN 200710107822 A CN200710107822 A CN 200710107822A CN 100584940 C CN100584940 C CN 100584940C
Authority
CN
China
Prior art keywords
adi
strain
arginine
arginine deiminase
pseudomonas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN200710107822A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101121925A (zh
Inventor
孙志浩
郑璞
倪晔
刘咏梅
刘宇鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN200710107822A priority Critical patent/CN100584940C/zh
Publication of CN101121925A publication Critical patent/CN101121925A/zh
Priority to PCT/CN2008/000954 priority patent/WO2008141523A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100584940C publication Critical patent/CN100584940C/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

一种筛选产精氨酸脱亚氨酶(ADI)菌株及其应用，属于生物工程技术领域。具体涉及一种快速筛选产ADI菌株的方法，发酵产ADI的微生物变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)CGMCC No.2039，以及利用该微生物生产ADI的方法。该微生物在好氧条件并维持pH6.5-8.0的环境下，发酵培养20-24小时，酶活可达到1.6U/mL发酵液。该菌所产ADI对肝癌细胞株HepG2有很强的抑制作用。从该菌的染色体DNA中钓取ADI基因，并得到该基因序列。

Description

一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用
技术领域
一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用，属于生物工程技术领域。具体涉及用一种变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)CGMCC.2039发酵生产精氨酸脱亚氨酶(ADI)的菌种和方法，以及保留此活性的该菌的传代株、变异株和衍生株生产的酶在医药方面的应用。
背景技术
精氨酸脱亚氨酶(Arginine deiminase)简称ADI。很多微生物利用ADI水解精氨酸以获得能量，在精氨酸脱亚氨基酶代谢途径中，第一步反应即为ADI水解精氨酸生成瓜氨酸和氨气。精氨酸对于人类是一种非必需氨基酸。正常的细胞核组织可通过瓜氨酸，在尿素循环酶精氨酸-琥珀酸(ASS)合成酶以及精氨酸-琥珀酸化酶作用下合成。一些人类癌细胞不表达ASS，从而不能从瓜氨酸合成精氨酸。因此，精氨酸降解酶有可能从根本上消灭或控制精氨酸缺陷型癌细胞。
1930年，Gilroy第一次论证，使用富含精氨酸的饲料喂养小鼠，与使用通常饲料喂养的小鼠相比，其肿瘤增殖加速以及肿瘤个体增大。Schimke等发现支原体产生的精氨酸降解作用是由一种新型酶引起的，称作ADI，它可以使精氨酸转化为瓜氨酸和氨，而不是像精氨酸酶那样使精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。
1992年，Takaku等人第一次从支原体中分离得到ADI并发现这种酶在体内以及体外都存在活性。但是需要大剂量的经常的输入到体内以达到有效的抗癌效果。1999年，Hong Gong等从Mycoplasma arginini中提取的低浓度精氨酸脱亚氨酶的作用下，可将细胞周期停止于G1和S期，以抑制多种细胞的增殖；在高浓度精氨酸脱亚氨酶作用下，可引起并发的细胞凋亡。他们的研究证明了精氨酸脱氨酶对于细胞增殖的抑制不仅仅通过对精氨酸的降解，也通过包括细胞周期和凋亡信号的相关机制。
2002年，美国肯塔基州大学的Charles Mark Ensor，等，将聚乙二醇化精氨酸脱亚氨酶(ADI-PEG)用于老鼠实验，HPLC检测发现ADI只转化精氨酸，同时证明了黑素瘤以及肝细胞瘤缺乏精氨(基)琥珀酸合成酶mRNA，没有合成精氨酸的能力，ADI对精氨酸缺陷型癌细胞有抑制效果。2004年，他们将ADI-SS PEG用于临床实验，感染了HCC的患者血浆中检测不到精氨酸的存在，对于一些患者，该疗法有效。
众所周知的也是临床上使用最多的抑制肿瘤生长的天(门)冬酰胺酶，在治疗急性淋巴白血病和相关恶性肿瘤时该药得到了成功的应用。但是，伴随天冬酰胺酶治疗会产生如过敏性休克，凝血紊乱，肝脏和胰腺中毒等严重副作用。天冬酰胺酶在降解天冬酰胺的同时也降解谷氨酰胺。研究显示这个酶的抗癌的活力是由于它降解天冬酰胺，而它的一些副作用是由于时，表明精氨酸脱氨酶的副作用较少，它在临床上具有更好的应用价值。在使用天冬氨酰酶产生不良反应发生时，作为天冬氨酰酶的替代品。
目前国内外的报道中，产ADI酶的有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(A.Galkin，J.Biol.Chem..279，14001-14008，2004)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(T.Kakimoto，Appl.Microbiol.，.1971，.992-999)，支原体(Mycoplasma homnisi)(H.Gong Biochem.Biophy.Res.Comm.261，10-14 1999)；支原体(Mycoplasma arginini)(C.M.Ensor Cancer Research62，5443-5450，，2002；F.Izzo J.Clinical Oncology，22，2004)等。1971年，日本的T Kakimoto等人，筛选出恶臭假单胞菌作为生产瓜氨酸的菌种，通过30℃摇瓶发酵生产，这个菌种的ADI酶活达到9.2U/ml。J.B.Jones(1981)首先使用从Pseudomonas pudita中提纯的ADI作为一种抗癌制剂。尽管这种酶在体外抑制肿瘤细胞，但是在体内没有观察到明显的活性。1992年，H.Takaku等人第一次从支原体中分离得到ADI并发现这种酶在体内以及体外都存在活性(H.Takaku，et al.J.Cancer，51：244-249，1992.)。随后，很多研究有关于支原体产ADI，并且研究证明该菌产ADI有抗癌效果。但是铜绿假单胞菌为致病菌，恶臭假单胞菌为条件致病菌，而支原体是有很高毒性的病原体。目前没有关于变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)为人类致病菌的报道，也尚未有变形假单胞菌发酵生产ADI的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵产精氨酸脱亚氨酶的菌株和方法，该菌株是一株能有效生产精氨酸脱亚氨酶的新菌株、我们对其进行鉴定、发酵产酶以及抗癌活性研究。
以下是本发明技术方案的详细描述。
微生物菌株的筛选与鉴定：
在本发明中，建立了一个快速高效的筛选产精氨酸脱亚氨酶菌株的模型。根据产精氨酸脱亚氨酶的菌株催化精氨酸产瓜氨酸和氨的特点，设计出以精氨酸为碳源的选择性平板，筛选出利用精氨酸的菌株。由于精氨酸脱亚氨酶催化精氨酸产氨，因此在含有苯酚红显色剂的酸性平板中能够产生红色变色圈。
本发明从无锡惠山、锡惠公园、京杭运河无锡段等处取土样5份，植物体样品2份，水样2份，一共9份样品。取完后在12h之内迅速筛选菌种。筛选的具体方法是：将样品在富集培养基中富集培养24h后，再涂布筛选培养基平板。经过平板筛选，共分离获得54株产精氨酸脱亚氨酶的菌株。进一步进行复筛，用二乙酰一肟硫氨脲法测定ADI酶活，最终筛选出目标菌株SW-P1。
本发明筛选得到的产精氨酸脱亚氨酶的菌株SW-P1，经16S rRNA基因测定和按《常见细菌系统鉴定手册》以及《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》生理生化鉴定，认为属假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)的变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)。该菌的细胞呈杆状，可运动，无芽孢，电镜观察有的有偏端丛毛，有的没有鞭毛。革兰氏阴性，好氧。该菌株在LB培养基24h的菌落呈圆形、淡黄色、不透明，表面光滑、边缘整齐，直径约1mm；在发酵培养基菌落也呈淡黄色，直径约为1.5mm。
生物样品材料保藏：本发明筛选得到的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株SW-P1已于2007年5月11日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号CGMCC No.2039。
微生物菌株的培养：
斜面培养基的组成为：酵母膏1-5g/L，蛋白胨1-5g/L，，牛肉膏1-5g/L，NaCl 1-10g/L，琼脂15-20gg/L，pH 6.0-7.5。
种子和发酵培养基的组成为：葡萄糖5-20g/L，酵母膏1-5g/L，蛋白胨1-5g/L，L-精氨酸盐酸盐5-20g/L，Na2HPO4·12H2O 6-15g/L，NaH2PO4·2H2O 1-5g/L，(NH3)2HPO4 1-5g，pH6.5-7.5；
培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。葡萄糖单独灭菌后分装。
按常规方法制作斜面，用筛选得到的CGMCC 2039菌株接种，28-35℃，培养20-40小时。将斜面上的菌株接种到种子培养基中，250ml三角瓶装液40-100ml，于28-35℃好氧条件下培养18-28小时。按1％-10％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度28-35℃，好氧培养20-40小时。
ADI酶活测定方法：
ADI酶活测定是通过检测以L-精氨酸盐酸盐为底物的转化液中生成的瓜氨酸的量来确定的。具体方法：取5mL发酵液，离心收集菌体，生理盐水洗涤两次，加5ml 0.1％CTAB，于37℃培养箱静置10min，离心收集沉淀，加入5mL 0.1mol/L L-精氨酸盐酸盐-磷酸缓冲液pH 6.0，混匀，于37℃培养箱静置0.5h转化，冰浴终止反应。于10mL比色管中依次加入混酸3mL，二乙酰一肟硫氨脲0.5mL，将转化反应液稀释一定倍数后，加入2mL。沸水浴10min，迅速冷却，于530nm测OD值。
酶活定义：37℃时，每分钟转化1μmol精氨酸盐酸盐生成瓜氨酸的酶量。二乙酰一肟硫氨脲溶液：1g二乙酰一肟，30mg硫氨脲，蒸馏水定容至100mL；十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB)：1g CTAB，蒸馏水定容至1000mL；混酸：量取70mL浓磷酸，160mL浓硫酸，缓缓加子600mL蒸馏水中，冷却后加入10mL 10g/L的三氯化铁溶液，加蒸馏水定容至1000mL；L-精氨酸盐酸盐-磷酸缓冲液：0.5mol/L pH6.0磷酸钠缓冲液1L加0.1mol L-精氨酸盐酸盐。
CGMCC 2039菌株的ADI酶基因测序
从该菌株中分离提取染色体的方法，是采用已知的技术(Frederich MA，Roger B，RobertE K，et al.Short Protocols in Molecular Biology.(4th Edition).John Wiley&Sons，Inc.，1999.)。重组质粒的精氨酸脱亚氨酶基因是通过PCR方法从总的染色体DNA中扩增得到的。两个引物是根据已报道的假单胞菌的精氨酸脱亚氨酶基因序列设计的。Primer-F：ATGTCCGCTGAAAAACAGAAGTACG；Primer-R：TTAGTAGTTGATCGGGTCGCGCACG。用PCR方法钓取酶的基因，纯化后连接克隆载体，转化进大肠杆菌JM109，培养后提取质粒、纯化、测序。
ADI的提取
将已培养24hr，约250mL的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)发酵液于8000rpm离心20min→弃去上清液，菌体加100mL，pH为6.0的磷酸盐缓冲液洗涤→仍按上述条件离心，并再重复洗涤一遍→弃去上清液，菌体加50mL，pH为6.0的磷酸盐缓冲液洗涤，尽量将菌体打散→置于超声波破碎仪，于10℃，强度10％的条件下破碎5min→将该液体于12000rpm离心20min，取上清液(约45ml)，于4℃冰箱保存，待用
检测了该提取液的ADI酶活性。取该待用上清液0.5mL，另加入5mL 0.2mol/L，pH为6.0的精氨酸盐酸盐-磷酸盐缓冲液，于37℃转化30min，将其稀释100倍，分别取此液以及纯水(做空白)各2mL于10mL比色管中，各加入0.5mL二乙酰一肟-硫氨脲溶液以及3mL混酸，沸水浴中反应10min，于530nm处以上述空白为标准测其OD。结果为5.1U/mL。
ADI抗癌活性试验
将已复苏的HepG2细胞株与L02细胞置于1640培养基(添加10％～20％的小牛血清)中培养。培养条件为37℃，5％CO2。其中L02细胞生长约2-3天；HepG2细胞株生长一周。细胞培养期间2天换液一次。
将培养好的HepG2细胞株和作为阳性对照的L02细胞，加入96孔板，使得每个孔的细胞数约为7000个，培养液的体积均为每孔100μL。仍按上述条件培养24hr。
将发酵并提取得到的ADI，以及作为阴性对照的未接种发酵培养基，经0.2μm过滤器过滤灭菌，配成不同浓度梯度，加入到96孔板中，使得每个孔的培养液体积最终均为200μL。其中，阳性对照中，于L02细胞培养液各加入稀释过的ADI，使其最终浓度为1/10，1/100，1/1000，1/10000；阴性对照中，于HepG2细胞培养液中各加入100μL空白培养基；于HepG2细胞培养液中加入稀释过的ADI，使其最终浓度为1/10，1/20，1/40……1/163840，1/327680。仍按上述条件培养72hr。
将上述加药并培养72hr后的96孔板取出，采用常规SRB法测定，测540nmOD。
结果表明，ADI对HepG2的生长有较强的抑制能力，这也验证了HepG2不能自身合成生长所必需的精氨酸。而对于正常肝细胞L02而言，由于自身具备合成精氨酸的能力，ADI对其的抑制能力就没有如此强烈，这说明ADI可作为一种新型的治疗肝癌的药物，具有广泛的应用前景。
有益效果
本发明的特点是从大量微生物中筛选得到产精氨酸脱亚氨酶的变形假单胞菌CGMCC2039，其在适合条件下，能产精氨酸脱亚氨酶，酶活最高达到1.6U/ml发酵液以上。
变形假单胞菌CGMCC 2039为一种新的产精氨酸脱亚氨酶菌株，目前国内外的报道中，产ADI酶的有铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌，支原体等。但是铜绿假单胞菌为致病菌，恶臭假单胞菌为条件致病菌，而支原体是有很高毒性的病原体，而且它在大肠杆菌中表达的ADI形成包含体，因此重组ADI还需要再折叠；目前没有关于变形假单胞菌为人类致病菌的报道。
我们将变形假单胞菌产ADI用于抗肝癌细胞HEPG2实验，结果表明，肝癌细胞HEPG2对该菌产ADI极为敏感，说明该菌产的ADI可作为一种新型的治疗肝癌的药物，具有广泛的应用前景。
以下是变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)CGMCC 2039筛选、鉴定及发酵生产ADI以及ADI抗癌活性研究的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。
具体实施方式
实施例1
产ADI菌种的筛选
从无锡惠山、锡惠公园、京杭运河无锡段等处取土样5份，植物体样品2份，水样2份，一共9份样品。取完样后在12h之内迅速筛选菌种。将样品接种于富集培养基中，30℃，160rpm，培养24hr后，稀释，涂布于筛选平板，30℃，培养72hr后，挑选有红色变色圈的菌落。共挑出54株有红色变色圈的菌株。挑选变色圈大的菌落18株，接种至装有5mL发酵培养基的试管中，30℃，160rpm培养24小时，采用二乙酰一肟-硫氨脲法对初筛出来的菌株进行ADI酶活测定，挑选出酶活高的菌株。
富集培养基：L-精氨酸盐酸盐15g/L，生物素3mg/L，硫胺素20mg/L，混合盐溶液10mL，pH 6.0。
平板筛选培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨2g/L，NaCl 1g/L，L-精氨酸盐酸盐10g/L，苯酚红0.1g/L，NH4Cl 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，混合盐溶液10mL，琼脂20g/L，pH 6.0。
初筛发酵培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨2g/L，NaCl 1g/L，L-精氨酸盐酸盐10g/L，NH4Cl 1.5g/L，K2HPO41g/L，混合盐溶液10mL，pH 7.0。
其中：混合盐溶液：MgSO4·7H2O 5％，MnSO4·4H2O 1％，FeSO4·7H2O 0.05％，NaCl 0.2％。
初筛复筛结果见表1，菌株SW-P1变色圈出现最快，变色圈数最多，该菌株来源于运河水样。
表118株较大酚红变色圈菌株的复筛结果
Figure C20071010782200081
(注：SW为发明人实验室的编号，P为假单胞菌代号，1～9为流水号)。
实施例2
SW-P1菌株的鉴定
对实施例1筛选得到的菌株SW-P1按《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》，以及《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化特性鉴定(见表2)，并按精编分子生物学实验指南方法提取染色体DNA，委托大连宝生物科技公司对该菌16S rDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rRNA基因序列，并进行同源性比对(表3)。基于形态、生理生化特征和16S rDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，将菌株SW-P1鉴定为变形假单胞菌，拟命名为变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)SW-P1，此株菌已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2039。
表2菌株CGMCC 2039与假单胞菌属部分成员生理生化特性鉴定结果对照
Figure C20071010782200091
注：+90％以上阳性，-90％以上阴性，d  10％-89％为阳性
CGMCC 2039菌株的16S rDNA序列(1457bp)
1      ATTGACGCTG GCGGCAGGCC TAACACATGC AAGTCGAGCG GATGACGGGA GCTTGCTCCT
61     TGATTCAGCG GCGGACGGGT GAGTAATGCC TAGGAATCTG CCTGGTAGTG GGGGACAACG
121    TTCCGAAAGG GGCGCTAATA CCGCATACGT CCTACGGGAG AAAGTGGGGG ATCTTCGGAC
181    CTCACGCTAT CAGATGAGCC TAGGTCGGAT TAGCTAGTTG GTGAGGTAAT GGCTCACCAA
241    GGCGACGATC CGTAACTGGT CTGAGAGGAT GATCAGTCAC ACTGGAACTG AGACACGGTC
301    CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA TATTGGACAA TGGGCGAAAG CCTGATCCAG
361    CCATGCCGCG TGTGTGAAGA AGGTCTTCGG ATTGTAAAGC ACTTTAAGTT GGGAGGAAGG
421    GCAGTAAGTT AATACCTTGC TGTTTTGACG TTACCGACAG AATAAGCACC GGCTAACTCT
481    GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACAGAGGGTG CAAGCGTTAA TCGGAATTAC TGGGCGTAAA
541    GCGCGCGTAG GTGGTTCGTT AAGTTGGATG TGAAAGCCCC GGGCTCAACC TGGGAACTGC
601    ATCCAAAACT GGCGAGCTAG AGTATGGTAG AGGGTGGTGG AATTTCCTGT GTAGCGGTGA
661    AATGCGTAGA TATAGGAAGG AACACCAGTG GCGAAGGCGA CCACCTGGAC TGATACTGAC
721    ACTGAGGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA
781    AACGATGTCA ACTAGCCGTT GGAATCCTTG AGATTTTAGT GGCGCAGCTA ACGCATTAAG
841    TTGACCGCCT GGGGAGTACG GCCGCAAGGT TAAAACTCAA ATGAATTGAC GGGGGCCCGC
901    ACAAGCGGTG GAGCATGTGG TTTAATTCGA AGCAACGCGA AGAACCTTAC CAGGCCTTGA
961    CATGCAGAGA ACTTTCCAGA GATGGATGGG TGCCTTCGGG AACTCTGACA CAGGTGCTGC
1021   ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGTAACG AGCGCAACCC
1081   TTGTCCTTAG TTACCAGCAC GTCATGGTGG GCACTCTAAG GAGACTGCCG GTGACAAACC
1141   GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA CGGCCTGGGC TACACACGTG
l201   CTACAATGGT CGGTACAGAG GGTTGCCAAG CCGCGAGGTG GAGCTAATCT CACAAAACCG
1261   ATCGTAGTCC GGATCGCAGT CTGCAACTCG ACTGCGTGAA GTCGGAATCG CTAGTAATCG
1321   CGAATCAGAA TGTCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA
1381   TGGGAGTGGG TTGCACCAGA AGTAGCTAGT CTAACCTTCG GGAGGACGGT TACCACGGTG
1441   TGATTCATGA CTGGGGG
其中，组成为A25.0％；C22.5％；G31.7％；T20.8％。
表316S rDNA序列同源性(或相似性)比较
Figure C20071010782200101
实施例3
CGMCC 2039菌株的发酵产酶
斜面培养：按培养基配方：蛋白胨2.5g/L，酵母膏2.5g/L，牛肉膏2.5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g，pH 7.0。按常规方法制作斜面，用实施例1筛选得到的CGMCC 2039菌株接种，30℃，培养24小时。
种子与发酵培养基配方：葡萄糖15g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨3g/L，L-精氨酸盐酸盐5g/L，Na2HPO4·12H2O 12g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH3)2HPO4 2g/L，pH 7.0；
种子培养基装液量60ml/250ml三角瓶。接一环培养好的斜面菌种于三角瓶中，30℃，190转/分，摇瓶培养14-18小时。
采用5升发酵罐，将已培养好的摇瓶种子接入发酵罐中，接种量为2％，30℃，转速300转/分，风量1∶2体积/体积/分，消泡剂0.02％的条件下，培养20小时；发酵罐培养发酵效价为1.67U/ml。表4为发酵罐培养实验结果。
表4CGMCC 2039菌株的发酵产酶
Figure C20071010782200111
实施例4
CGMCC 2039菌株的ADI酶基因测序
(1)引物设计和用PCR方法钓取酶基因制备重组质粒
重组质粒的精氨酸脱亚氨酶基因是通过PCR方法从总的染色体DNA中扩增得到的。两个引物是根据已报道的假单胞菌的精氨酸脱亚氨酶基因序列设计的。
Primer-F：ATGTCCGCTGAAAAACAGAAGTACG
Primer-R：TTAGTAGTTGATCGGGTCGCGCACG
方法如下：染色体DNA模板200ng，2.5单位Tag聚合酶，100nmol引物，10mmol dNTP1.25uL，终体积50uL，PCR程序：94℃变性5min，每循环94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，最后一次循环延伸10min，共30个循环。
我们选用PGEM-T-easy作为克隆载体，将钓取的酶基因连接到该载体上，方法参照该载体使用说明。
(2)转化，筛选阳性克隆
培养大肠杆菌JM109，采用钙盐法制备感受态细胞；采用热转化法将克隆载体转化至大肠杆菌JM109，蓝白筛选挑选出阳性克隆。
(3)质粒提取、纯化、测序
将克隆阳性菌单菌落，接入LB/Amp 5ml培养基中，37℃，200rpm过夜培养。收集菌体，提取质粒，并纯化。采用T7与SP6为测序引物(Primer T7：TATA CGACT CACTATAGGG；Primer SP6：ATTTAGGTGACACTATAGAA)，由上海基康生物科技公司进行测序，测得该酶基因为1254bp。
CGMCC 2039产精氨酸脱亚氨酶基因序列(1254bp)
1      ATGTCCGCTG AAAAACAGAA GTACGGTGTC CACTCCGAAG CAGGCAAGCT GCGCAAGGTA
61     ATGGTCTGCG CTCCGGGACT GGCGCACAAG CGCCTGACCC CGAGCAACTG CGACGAGCTG
121    CTGTTCGACG ATGTGATCTG GGTCGACCAG GCCAAGCGCG ACCACTTCGA CTTCGTCACC
181    AAGATGCGCG AGCGCGGCGT GGATGTGCTG GAAATGCATA ACCTGCTCAC CGACATCGTG
241    CAGAACCCCG AGGCCCTGAA GTGAATCCTC GACCGCAAGA TCACCCCTGA CACCGTCGGG
301    GTGGGCCTGA CCAACGAAGT GCGCAGCTGG CTGGAGGGCC AGGAGCCACG CCACCTCGCC
361    GAGTTCCTGA TCGGCGGCGT GGCCGGCCAG GACCTGCCGG AGAGCGAAGG TGCCAGCGTG
421    GTCAAGATGT ACAACGACTA CCTGGGCCAC TCCAGCTTCA TCCTGCCGCC GCTGCCCAAC
481    ACCCAGTTCA CCCGCGACAC CACCTGCTGG ATCTACGGCG GCGTGACCCT CAACCCGATG
541    TACTGGCCGG CGCGACGCCA GGAAACCCTG CTGACCACCG CCATCTACAA GTTCCACCCC
601    GAGTCCACCA AGGCCGACTT CCAGGTCTGG TACGGCGACC CGGACCAAGA GCACGGCCAG
661    GCCACCCTCG AAGGCGGCGA CGTCATGCCG ATCGGCAAGG GCATCGTGCT GATCGGCATG
721    GGTGAGCGCA CCTCGCGCCA GGCCATCGGC CAACTGGCAC AGAACCTCTT CGCCAAGGGC
781    GCAGTGGAGC AAGTGATCGT CGCCGGGCTG CCGAAGTCCC GTGCGGCCAT GCACCTGGAC
841    ACCGTGTTCA GCTTCTGCGA CCGCGACCTG GTCACGGTTT TCCCGGAAGT GGTGCGCGAG
901    ATCGTGCCGT TCATCATCCG CCCGGACGAA AGCAAGCCCT ACGGCATGGA CGTACGCCGC
961    GAGAACAAGT CGTTCATCGA GGTGGTCGGT GAGCAGCTGG GCGTCAAGCT GCGTGTGGTC
1021   GAGACCGGCG GCAACAGCTT CGCCGCCGAG CGCGAGCAGT GGGATGACGG CAACAACGTG
1081   GTGGCGCTGG AGCCAGGTGT GGTCATCGGC TACGACCGCA ACACCTACAC CAATACCTTG
1141   CTGCGCAAGG CCGGGATAGA GGTCATCACC ATCAGTGCCG GCGAACTGGG CCGGGGCCGT
1201   GGCGGCGGCC ACTGCATGAC CTGCCCGATC GTGCGCGACC CGATCAACTA CTAA
其中：20.4％A；33.2％C；31.3％G；15.1％T；
实施例5
CGMCC 2039菌株的ADI抗癌活性初步实验
所用细胞
(1)正常细胞：L02(人体正常肝细胞株)
(2)肿瘤细胞：HepG2(肝癌细胞株)
在含有10％小牛血清的1640培养基中，分别添加作为阴性对照的空白培养基，以及经超声波处理后，悬浮于磷酸缓冲溶液(PBS)的变形假单胞菌制剂，使得该制剂稀释至一定浓度，添加到已于37℃(5％CO2)的环境中生长24小时的所用细胞中(最终每孔细胞个数约为7000个/300微升)，继续培养72小时。培养结束后，采用SRB法为细胞染色，并在酶标仪上530nm处测其OD值。结果见表5。
表5ADI对不同细胞的抑制率
Figure C20071010782200131
由表5表明，使用本发明中实验剂量的变形假单胞菌ADI制剂，经72小时引起了HepG2肿瘤细胞相当明显的抑制，而对正常L02肝细胞则无显著影响。

Claims (4)

1、一株产精氨酸脱亚氨酶的微生物菌株，其分类属假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)的变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)，保藏号为CGMCC No.2039。
2、一种微生物发酵产精氨酸脱亚氨酶的方法，其特征是：
(1)发酵菌株为CGMCC No.2039；
(2)发酵培养基的组成为：葡萄糖5-20g/L，酵母膏1-5g/L，蛋白胨1-5g/L，L-精氨酸盐酸盐5-20g/L，Na2HPO4·12H2O 6-15g/L，NaH2PO4·2H2O 1-5g/L，(NH4)2HPO41-5g/L，pH 6.5-8.0；
(3)发酵培养：按1％-5％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度28-35℃，好氧条件，培养18-28小时。
3、如权利要求1所述的产精氨酸脱亚氨酶的微生物菌株，其ADI基因总长为1254bp，其序列信息如下：
1      ATGTCCGCTG AAAAACAGAA GTACGGTGTC CACTCCGAAG CAGGCAAGCT GCGCAAGGTA
61     ATGGTCTGCG CTCCGGGACT GGCGCACAAG CGCCTGACCC CGAGCAACTG CGACGAGCTG
121    CTGTTCGACG ATGTGATCTG GGTCGACCAG GCCAAGCGCG ACCACTTCGA CTTCGTCACC
181    AAGATGCGCG AGCGCGGCGT GGATGTGCTG GAAATGCATA ACCTGCTCAC CGACATCGTG
241    CAGAACCCCG AGGCCCTGAA GTGAATCCTC GACCGCAAGA TCACCCCTGA CACCGTCGGG
301    GTGGGCCTGA CCAACGAAGT GCGCAGCTGG CTGGAGGGCC AGGAGCCACG CCACCTCGCC
361    GAGTTCCTGA TCGGCGGCGT GGCCGGCCAG GACCTGCCGG AGAGCGAAGG TGCCAGCGTG
421    GTCAAGATGT ACAACGACTA CCTGGGCCAC TCCAGCTTCA TCCTGCCGCC GCTGCCCAAC
481    ACCCAGTTCA CCCGCGACAC CACCTGCTGG ATCTACGGCG GCGTGACCCT CAACCCGATG
541    TACTGGCCGG CGCGACGCCA GGAAACCCTG CTGACCACCG CCATCTACAA GTTCCACCCC
601    GAGTCCACCA AGGCCGACTT CCAGGTCTGG TACGGCGACC CGGACCAAGA GCACGGCCAG
661    GCCACCCTCG AAGGCGGCGA CGTCATGCCG ATCGGCAAGG GCATCGTGCT GATCGGCATG
721    GGTGAGCGCA CCTCGCGCCA GGCCATCGGC CAACTGGCAC AGAACCTCTT CGCCAAGGGC
781    GCAGTGGAGC AAGTGATCGT CGCCGGGCTG CCGAAGTCCC GTGCGGCCAT GCACCTGGAC
841    ACCGTGTTCA GCTTCTGCGA CCGCGACCTG GTCACGGTTT TCCCGGAAGT GGTGCGCGAG
901    ATCGTGCCGT TCATCATCCG CCCGGACGAA AGCAAGCCCT ACGGCATGGA CGTACGCCGC
961    GAGAACAAGT CGTTCATCGA GGTGGTCGGT GAGCAGCTGG GCGTCAAGCT GCGTGTGGTC
1021   GAGACCGGCG GCAACAGCTT CGCCGCCGAG CGCGAGCAGT GGGATGACGG CAACAACGTG
1081   GTGGCGCTGG AGCCAGGTGT GGTCATCGGC TACGACCGCA ACACCTACAC CAATACCTTG
1141   CTGCGCAAGG CCGGGATAGA GGTCATCACC ATCAGTGCCG GCGAACTGGG CCGGGGCCGT
1201   GGCGGCGGCC ACTGCATGAC CTGCCCGATC GTGCGCGACC CGATCAACTA CTAA。
4、如权利要求1所述的产精氨酸脱亚氨酶的微生物菌株生产的精氨酸脱亚氨酶在制备抗肿瘤药物方面的应用。
CN200710107822A 2007-05-17 2007-05-17 一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用 Expired - Fee Related CN100584940C (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200710107822A CN100584940C (zh) 2007-05-17 2007-05-17 一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用
PCT/CN2008/000954 WO2008141523A1 (zh) 2007-05-17 2008-05-19 一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200710107822A CN100584940C (zh) 2007-05-17 2007-05-17 一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101121925A CN101121925A (zh) 2008-02-13
CN100584940C true CN100584940C (zh) 2010-01-27

Family

ID=39084424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200710107822A Expired - Fee Related CN100584940C (zh) 2007-05-17 2007-05-17 一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN100584940C (zh)
WO (1) WO2008141523A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102061283A (zh) * 2010-12-05 2011-05-18 江南大学 一株产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建及其定向改造方法
CN102433290A (zh) * 2012-01-16 2012-05-02 江南大学 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100584940C (zh) * 2007-05-17 2010-01-27 江南大学 一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用
EP2295560A1 (en) 2009-09-14 2011-03-16 RWTH Aachen University Directed evolution of arginine deiminase for increased activity at physiological pH
CN101935626B (zh) * 2010-06-12 2011-12-21 南京农业大学 一种二甲基甲酰胺降解菌及其生产的菌剂
CN102433289B (zh) * 2012-01-16 2013-02-27 江南大学 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法
CN103468664B (zh) * 2013-10-11 2015-04-15 山东大学 一种促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法
CN103923898A (zh) * 2014-04-17 2014-07-16 江南大学 一种peg修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用
CN104312953B (zh) * 2014-10-17 2018-08-28 江南大学 一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法
CN108265068B (zh) * 2016-12-31 2021-06-15 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 重组精氨酸脱亚胺酶及其产业化制备方法和应用
CN110452862B (zh) * 2019-07-22 2022-06-07 山东大学 一种荧光假单胞菌菌株及其应用
CN111018130B (zh) * 2019-12-11 2022-06-03 福建大北农水产科技有限公司 一种水产微生态制剂及其在降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的应用
CN113430129A (zh) * 2021-05-28 2021-09-24 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基
CN113881724B (zh) * 2021-09-30 2024-08-16 新泰市佳禾生物科技有限公司 一种精氨酸转瓜氨酸的提取纯化方法
CN114381402B (zh) * 2022-01-20 2022-12-16 广州大学 一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌、菌剂及其应用
CN115851540B (zh) * 2022-12-13 2023-06-06 广州大学 具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4915794B2 (zh) * 1971-11-26 1974-04-17
IT1298918B1 (it) * 1998-02-20 2000-02-07 Mendes Srl Uso di batteri dotati di arginina deiminasi per indurre apoptosi e/o ridurre una reazione infiammatoria e composizioni farmaceutiche
KR100654383B1 (ko) * 2006-02-08 2006-12-06 재단법인서울대학교산학협력재단 락토코커스 락티스로부터 분리된 ａｄｉ 분획물을 유효성분으로 함유하는 암세포 증식 억제용 식품 조성물
CN100584940C (zh) * 2007-05-17 2010-01-27 江南大学 一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102061283A (zh) * 2010-12-05 2011-05-18 江南大学 一株产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建及其定向改造方法
CN102061283B (zh) * 2010-12-05 2012-08-22 江南大学 一株产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建及其定向改造方法
CN102433290A (zh) * 2012-01-16 2012-05-02 江南大学 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008141523A8 (zh) 2009-07-30
CN101121925A (zh) 2008-02-13
WO2008141523A1 (zh) 2008-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100584940C (zh) 一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用
CN101560478B (zh) 一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种及其应用
CN102517235B (zh) 一种枯草芽孢杆菌
CN104403978B (zh) 沼泽红假单胞菌菌株、菌剂及菌剂的制备方法、胞外蛋白及其提取方法和应用
CN113308392B (zh) 一株诺尼内生暹罗芽胞杆菌的应用
CN110129216A (zh) 一种适于固体发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌诱变菌株及其培养方法
CN106754530A (zh) 一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用
CN104531565B (zh) 反硝化无色杆菌zjut1104及其应用
CN115960762B (zh) 一种极端东方假单胞菌及其应用
CN103667097B (zh) 一种海洋芽孢杆菌及其具有抗肿瘤作用的活性组分
EP3892715A1 (en) Strain for producing nattokinase and production method therefor
CN114196564B (zh) 一株嗜盐四联球菌及其在生产抗癌胞外多糖中的应用
CN108165506B (zh) 一种金黄链霉菌及其应用
CN109913386A (zh) 一株高产茶氨酸的茶树内生菌CsE7及其应用
Sharma et al. Evaluation of antitumor activity of glutaminase-free periplasmic asparaginase from indigenous bacterial isolates as candidates for cancer therapy
CN104962507B (zh) 一株粘细菌菌株及其抗肿瘤活性代谢产物
Hassan et al. DEVELOPMENT OF BIOPROCESSES FOR PRODUCTION AND PURIFICATION OF L-ASPARAGINASE FROM STAPHYLLOCOCCUS AUREUS, AND IN VITRO EFFECACY AGAINST HUMAN BREAST CNCER CELL LINE
KR20150101789A (ko) 복합 효소 생산능 및 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 bk418 균주 및 이의 용도
Muslim Production, purification and characterization of a novel L-asparaginase from Acinetobacter baumannii with anticancerous activity
CN108823118A (zh) 一株能抑制α-葡萄糖苷酶活性的勒克菌及其应用
CN102433289B (zh) 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法
CN109652479A (zh) 一种提高石斛多糖抗氧化能力的方法
Gupta et al. Frankia: a promising N-fixing plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) improved drought tolerance in crops at higher altitude
CN102424802B (zh) 一种短小芽孢杆菌和菌株培养方法及应用
Frediansyah et al. Lactobacillus pentosus isolated from Muntingia calabura shows inhibition activity toward alpha-glucosidase and alpha-amylase in intra and extracellular level

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20100127

Termination date: 20120517