WO2001079500A2 - Operons de streptococcus thermophilus impliques dans la synthese des exopolysaccharides (eps) - Google Patents

Operons de streptococcus thermophilus impliques dans la synthese des exopolysaccharides (eps) Download PDF

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WO2001079500A2
WO2001079500A2 PCT/FR2001/001199 FR0101199W WO0179500A2 WO 2001079500 A2 WO2001079500 A2 WO 2001079500A2 FR 0101199 W FR0101199 W FR 0101199W WO 0179500 A2 WO0179500 A2 WO 0179500A2
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orf
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nucleic acid
protein
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PCT/FR2001/001199
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Fabien Rallu
Iris Besancon-Yoshpe
Christophe Fremaux
Jérôme MENGAUD
Pierre Renault
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Compagnie Gervais Danone
Rhodia Chimie
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Definitions

  • EPS Exopolysaccharides
  • exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria play a major role in the development of the texture, perception in the mouth and the rheology of fermented products.
  • EPS produced by Streptococcus thermophilus play a role of thickener, and also make it possible to give the end product a stringy character and / or a creamy texture, appreciated by consumers.
  • EpsA The group of genes called epsABCD located at the start of the operon encodes proteins (EpsA, EpsB, EpsC, and EpsD) that are highly homologous from one eps operon to another.
  • EpsA probably has a function of regulating the production of EPS; the proteins EpsC and EpsD appear to be involved in the polymerization of basic repeating units and their export; the function of the EpsB protein has not yet been elucidated.
  • the epsABCD group is followed by a sequence at which a very strong homology is also observed between the various known eps operons; this sequence codes for a protein which is probably a glycosyl-1-phosphate transferase, involved in the first step of the synthesis of the basic unit.
  • the next region of the operon is more variable; it includes ORFs probably encoding the various glycosyltransferases involved in the assembly of the sugars forming the basic repeating unit.
  • ORFs coding for proteins potentially involved in the transport of the repetitive unit in the extracellular medium have been located.
  • the inventors have now identified and isolated eight new operons involved in the biosynthesis of EPS in S. thermophilus.
  • the structural analysis of these operons shows that they have an organization similar to that of the already known eps operons, and that they include: a) ORFs (open reading frame) whose translation product has a significant homology (identity greater than or equal to 80%) with that of ORFs involved in the synthesis of exopolysaccharides or capsule polysaccharides in gram + bacteria, in particular the EpsA-D proteins of S. thermophilus, the EpsE protein of S.
  • the percentage identity of a sequence with a reference sequence is defined here as the percentage of residues of this sequence which are • identical with those of the reference sequence when the 2 sequences are aligned for maximum correspondence between the positions of the residues.
  • a polypeptide whose amino acid sequence has at least X% identity with a reference sequence can thus comprise up to 100-X modifications per 100 amino acids of the reference sequence. These modifications include the deletion, substitution, or insertion of amino acid residues, consecutive or not.
  • FIG. 1 diagrams the structure of the operons according to the invention (Types III, IN, N, NI, Nile, IX, X, and XI) as well as the structure of 3 operons of S. thermophilus described in the prior art, in PCT Application WO 99/62316 (here called “Type I operon”), by STI ⁇ GELE et al. (here called “Type II operon”), and by BOURGOI ⁇ et al. (here called "NUI Type operon”)
  • the operon called “type III operon” is located on a sequence of approximately chromosomal DNA from the Streptococcus thermophilus strain deposited according to the Budapest Treaty on April 5, 2000 by the company RHODIA FOOD SAS, ZA de Buxines, 86220 DANGE -SAiNT-ROMAIN, at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), under the number 1-2425.
  • a partial sequence of this 13 kb fragment is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1; the complete sequence of the type III operon carried by this fragment is represented under the number SEQ ID NO: 9.
  • the positions and characteristics of the ORFs identified on this sequence are indicated in Table I below.
  • type IV operon is located on a sequence of approximately 16 kb of chromosomal DNA from the strain of Streptococcus thermophilus deposited according to the Budapest Treaty on April 5, 2000 by the company RHODIA FOOD SAS, ZA de Buxines, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), under the number 1-2432.
  • a partial sequence of this 16 kb fragment is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 2; the complete sequence of the type IV operon carried by this fragment is represented under the number SEQ ID NO: 10.
  • the positions and characteristics of the ORFs identified on this sequence are indicated in Table II below.
  • type N operon is located on a sequence of approximately 14 kb of chromosomal DNA from the strain of Streptococcus thermophilus deposited according to the Budapest Treaty on April 5, 2000 by the company RHODIA FOOD SAS, ZA de Buxines, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), under the number 1-2431.
  • a partial sequence of this 14 kb fragment is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 3; the complete sequence of the N-type operon carried by this fragment is represented under the number SEQ ID ⁇ O: 11.
  • NI type operon The operon called “NI type operon” is located on a sequence of approximately 20 kb of chromosomal DNA from the Streptococcus thermophilus strain deposited on February 24, 1999 according to the Budapest Treaty with the C.N.C.M. (National Collection of Cultures of Microorganisms, 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), under the number 1-2130.
  • a partial sequence of this 20 kb fragment is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 4; the complete sequence of the NI type operon carried by this fragment is represented under the number SEQ ID ⁇ O: 12.
  • the operon called “type VII operon” is located on a sequence of approximately 16 kb of chromosomal DNA from the strain of Streptococcus thermophilus deposited according to the Budapest Treaty on April 5, 2000 by the company RHODIA FOOD SAS, ZA de Buxines, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris CEDEX 15 , France), under number 1-2429; other strains of Streptococcus thermophilus containing this operon were also deposited according to the Budapest Treaty by the company RHODIA FOOD SAS, ZA de Buxines, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, with the CNCM on April 5, 2000, under the numbers 1 -2430 and 1-2437.
  • a partial sequence of this 16 kb fragment is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 5; the more complete sequence of the type VII operon carried by this fragment is represented under the number SEQ ID NO: 13.
  • the operon called “type IX operon” is located on a sequence of approximately 12.5 kb of chromosomal DNA from the Streptococcus thermophilus strain deposited according to the Budapest Treaty on April 5, 2000 by the company RHODIA FOOD SAS, ZA de Buxines, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), under the number 1-2427.
  • the operon called “type X operon” is located on a sequence of approximately 15.5 kb of chromosomal DNA from the Streptococcus thermophilus strain deposited according to the Budapest Treaty on April 5, 2000 by the company RHODIA FOOD SAS, ZA de Buxines, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), under the number 1-2428.
  • a partial sequence of this 15.5 kb fragment is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 7; the complete sequence of the type X operon carried by this fragment is represented under the number SEQ ID NO: 15.
  • the positions and characteristics of the ORFs identified on this sequence are indicated in Table VII below.
  • the operon called “type XI operon” is located on a sequence of approximately 14.5 kb of chromosomal DNA from the Streptococcus thermophilus strain deposited on September 22, 1994 according to the Budapest Treaty with the CNCM (National Collection of Cultures de Microorganismes, 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), under the number 1-1477.
  • a partial sequence of this 14.5 kb fragment is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 8; the complete sequence of the type XI operon carried by this fragment is represented under the number SEQ ID NO: 16.
  • the present invention therefore provides new genes and / or new combinations of genes involved in the biosynthesis of EPS in lactic acid bacteria, and in particular in S. thermophilus. These genes and / or combinations of genes can be used to optimize the production of EPS in lactic acid bacteria, in particular in S. thermophilus.
  • one or more of the new S. thermophilus eps operons described above can be expressed in a host bacterium, in order to produce the EPS or EPS associated with this or these operon (s). It is also possible, from the new genes involved in the synthesis of EPS highlighted by the Inventors, to construct, by genetic recombination, functional eps operons allowing the synthesis of new EPS.
  • the expression “functional eps operon” is intended to mean a nucleic acid sequence constituting a transcription unit comprising at least: - a group of epsABCD genes, as defined above;
  • said EPS operon may further comprise one or more genes encoding a protein involved in the modification of the precursor sugars of an EPS.
  • the subject of the present invention is a nucleic acid fragment constituting an eps operon functional in S. thermophilus, and characterized in that it comprises at least: a) an epsA gene chosen from:
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 92% identity, preferably at least 95% identity, and advantageously at least 99% identity, with the translation product of said ORF;
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 86% identity, preferably at least 90% identity, advantageously at least 95% identity, and very preferably at least 99% identity, with the translation product of said ORF; - the EPS6D ORF of the sequence SEQ ID NO: 4 or of the sequence SEQ ID
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 86% identity, preferably at least 90% identity, advantageously at least 95% identity, and very preferably at least 99% identity, with the translation product of said ORF; - the EPS7D ORF of the sequence SEQ ID NO: 5 or of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 86% identity, preferably at least 90% identity, advantageously at least 95% identity, and very preferably at least 99% identity, with the translation product of said ORF; - the EPS9D ORF of the sequence SEQ ID NO: 6 or of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 95% identity, preferably at least 99% identity, with the translation product of said ORF; and / or at least one gene coding for a glycosyl-1-phosphate transferase chosen from:
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 94% identity, preferably at least 95% identity, and advantageously at least 99% identity, with the translation product of said ORF;
  • the EPS3H ORF of the sequence SEQ ID NO: 1 or of the sequence SEQ ID NO: 9 any fragment of nucleic acid encoding a protein having at least 30% identity, at least 70% identity, advantageously at least 80% identity, and most preferably at least 90% to 99% identity, with the translation product of said ORF;
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 30% identity, preferably at least 70% identity, advantageously at least 80% identity, and very preferably at least 90% to 99% identity, with the translation product of said ORF; - the EPS6K ORF of the sequence SEQ ID NO: 4 or of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 70% identity, preferably at least 80% identity, advantageously at least 90% to 99% identity, with the translation product of said ORF;
  • EPS9F ORF of the sequence SEQ ID NO: 6 or of the sequence SEQ ID NO: 14 or any fragment of nucleic acid encoding a protein having at least 54% identity, preferably at least 70% identity , advantageously at least 80% identity, and very preferably at least 90% to 99% identity, with the translation product of said ORF;
  • said eps operon further comprises at least one gene chosen from:
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 90% identity, preferably at least 95% identity, and advantageously at least 99% identity, with the translation product of said ORF;
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 57% identity, preferably at least 70% identity, advantageously at least 80% identity, and very preferably at least 90% to 99% identity, with the translation product of said ORF; - the epslOI ORF of the sequence SEQ ID NO: 7 or of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid fragment encoding a protein having at least 70% identity, advantageously at least 80% identity, and very preferably at least 90% to 99% identity, with the translation product of said ORF;
  • EPSL 1Q ORF of the sequence SEQ ID NO: 16 or any nucleic acid fragment encoding a protein having at least 50% identity, preferably at least 70% identity, advantageously at least 80% of identity, and most preferably at least 90% to 99% identity, with the translation product of said ORF.
  • EPSL 1T ORF of the sequence SEQ ID NO: 16 or any nucleic acid fragment encoding a protein having at least 70% identity, advantageously at least 80% identity, and very preferably in the minus 90% to 99% identity, with the translation product of said ORF.
  • the present invention encompasses in particular any eps operon carried by one of the nucleic acid fragments identified in the sequence list under the numbers SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO : 16.
  • the subject of the present invention is also:
  • nucleic acid fragment as defined above, for obtaining a functional chimeric eps operon.
  • said fragment will be used in combination with other ORFs originating from one or more eps operon (s). They may be nucleic acid fragments in accordance with the invention, and / or nucleic acid fragments carrying ORFs originating from other eps operons.
  • a recombinant vector will be constructed comprising a nucleic acid fragment associated with appropriate transcription and translation control sequences.
  • the vector into which the nucleic acid fragment according to the invention is inserted, as well as the sequences making it possible to control its expression will be chosen for example according to the host cell selected and / or of the type (for example constitutive expression or conditional expression) and the level of expression that one wishes to obtain; many vectors, and many expression control sequences, usable in a variety of host cells, are known per se.
  • these expression control sequences can be those of an eps operon, and in particular the promoter sequences of the eps operons of type III, IN, N, NI, Nile, IX, X, and XI in accordance with the invention.
  • the inventors have found that the amount of EPS produced varies from one strain to another, and it has been hypothesized that this variation could be due, at least in part, to the transcription of the eps operon. . They also found that the promoter located upstream of the epsA gene varies from one type of operon to another. In particular, there is an area of high variability (insertions or deletions) a few bases upstream of the box -35. This insertion can have effects on the regulation of transcription of the operon genes.
  • the location of the promoters of the eps operons on the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 is as follows: - Type III: from 488 to 827 of the sequence SEQ ID NO: 1
  • Type VII from 530 to 880 of the sequence SEQ ID NO: 5
  • Type IX from 490 to 831 of the sequence SEQ ID NO: 6
  • the promoters of the eps operons in accordance with the invention can be used in particular to regulate the expression, either of the genes with which they are respectively naturally associated, or of the genes of any other eps operon.
  • the vector thus obtained is used to transform the chosen host cell.
  • This can be a eukaryotic cell, for example a yeast cell, or a prokaryotic cell; in the latter case, it may in particular be a lactic acid bacterium, and in particular S. thermophilus.
  • the present invention also encompasses any recombinant vector comprising a fragment in accordance with the invention, as well as any host cell transformed with a nucleic acid fragment in accordance with the invention.
  • Cells transformed with a nucleic acid fragment in accordance with the invention can in particular be used for the biosynthesis of EPS, or, in particular in the case of lactic acid bacteria, for the preparation of fermented products comprising an EPS having the desired structure .
  • S. thermophilus by introducing all or part of the genes described in this invention.
  • genes belonging to different operons in particular the genes coding for glycosyltransferases
  • the present invention provides tools making it possible to determine the type of EPS produced by a strain of lactic acid bacteria, in particular a strain of S. thermophilus, by detection, in said strain, of the presence of genes or combinations of genes involved in the synthesis of said EPS.
  • the determination of the EPS produced by a strain of S. thermophilus required the isolation and then the biochemical analysis of the EPS produced. This technique consumes a great deal of time and labor, and is not applicable in practice, to the typing of a large number of strains. Thanks to the present invention, it is now possible to determine the nature of EPS thanks to the genes involved in its biosynthesis, and in particular to establish a relationship between the properties of a strain of S. thermophilus and the presence of a determined eps operon, or certain genes of this operon.
  • the subject of the present invention is therefore a method of selecting at least one oligonucleotide allowing the specific detection of a gene for an eps operon present in a strain of S. thermophilus, characterized in that it comprises: a) the alignment of the ORFs present on the sequences identified in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID ⁇ O: 1 to 8, or SEQ ID NO: 9 to 16, between them and, possibly with ORFs of other sequences let us operate eps, in particular type I, II and VIII eps operons; b) the identification, in at least one of said ORFs, of at least a portion of size greater than 12 bp, and preferably between 15 and
  • the present invention also relates to any oligonucleotide specific for a gene of an eps operon, capable of being obtained by the process defined above. above, and in particular any oligonucleotide specific for a gene of an eps operon chosen from the operons of Type I to XI.
  • oligonucleotide specific for a gene of an eps operon any oligonucleotide for which it is possible to define hybridization conditions in which, in the presence of eps operons of types I to XI, said oligonucleotide does not hybrid only with a single gene carried by only one of said operons.
  • Oligonucleotides in accordance with the invention can in particular be obtained from the sequence of at least one ORF chosen from eps3F, eps3G, eps3H, eps3I, eps3J, eps3K, eps4L, eps5F, eps5G, eps5H, eps5I, eps6F, eps6G, eps6H, eps ⁇ l, eps6J, eps6K, eps6L, eps6M, eps7F, eps9F, eps9G, eps9H, eps9I, eps9J, eps9K, eps 10F, epslOG, epsl 0H, eps 101, epsl IF, epsl 1
  • the present invention also relates to any pair of oligonucleotide primers allowing the amplification of a nucleic acid fragment specific for a gene of an eps operon, and in particular any pair of oligonucleotide primers specific for a d gene '' an eps operon chosen from Type I to XL operons This includes in particular:
  • any pair of oligonucleotides comprising at least one oligonucleotide specific for a gene of an eps operon, as defined above;
  • oligonucleotides which can be used as primers for the amplification of a specific nucleic acid sequence of an eps operon, in particular of an eps operon chosen from operons of Type I to XL
  • the present invention also relates to any pair of oligonucleotide primers allowing the amplification of a nucleic acid fragment specific for an eps operon, and in particular any pair of oligonucleotide primers allowing the amplification of a fragment of nucleic acid specific for an eps operon chosen from Type I to XL operons
  • any pair of oligonucleotide primers allowing the amplification of a fragment of nucleic acid specific for an eps operon chosen from Type I to XL operons
  • any pair of oligonucleotides comprising at least one oligonucleotide specific for a gene of an eps operon, as defined above;
  • Any pair of oligonucleotides which, although capable of hybridizing jointly with several eps operons, generate for each of these operons, an amplification product of different size.
  • nucleotide primers can be obtained by a process comprising: a) aligning the sequences identified in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID NO: 1 to 8, or SEQ ID NO: 9 to 16, between them and, possibly with sequences of other eps operons; b) the identification, in the sequence representing the type of eps operon which it is desired to detect of at least one specific region, by its size and / or its sequence, of said operon; c) the identification of primers allowing the specific amplification of said region to be obtained.
  • the present invention also relates to the use of at least one oligonucleotide or at least one pair of primers as defined above for determining the type of EPS produced by a strain of S. thermophilus.
  • the present invention also relates to a kit allowing the determination of the type of EPS produced by a strain of S. thermophilus, characterized in that it comprises at least one oligonucleotide specific for a gene of an eps operon, and / or at least one pair of oligonucleotide primers allowing the amplification of a specific nucleic acid fragment of an eps operon, in accordance with the invention.
  • the oligonucleotides in accordance with the invention make it possible to rapidly screen a collection of strains of S. thermophilus in order to know the type of EPS produced by these strains. They make it possible to determine, without the need to purify and analyze the EPS concerned, the relationship between the presence of a type of EPS and the characteristics of a product, for example the organoleptic qualities, the texture , possible probiotic effects, etc. They also make it possible to select the ferments according to their capacity to produce a determined EPS.
  • the present invention also includes strains of Streptococcus thermophilus comprising at least one eps operon according to the invention, and in particular strains of Streptococcus thermophilus comprising: - a type III eps operon, represented by the strain CNCM 1-2425;
  • kits 1 for specifically amplifying the operons of type I, II, III, IV, VI NUI and X (kit 1) or of type N, IX and XI (kit 2) are described below by way of example.
  • Kit 1 includes: - a primer 364 (GGGCACATTTGCCATTAGTG) specific for orfl4.9, present in all types of known operon, except for Type XI;
  • a primer 532 (GCACTACTATTAATGATTCCG) specific to Type III; a primer 366 (GCTACGTAGGCTATAGAAGC) specific for Type IN and
  • primers 523 (GACGACTACTCCACGTGATCC), and 524 (GAGAGGCACTTTCCACACTCG) specific for the epsA gene present in all types of eps
  • Kit 2 includes primers 364, 523, and 524, as well as:
  • the PCR is carried out on total AD ⁇ of Streptococcus thermophilus in the presence of all the primers of kit 1 or all of the primers of kit 2, under the following conditions: 94 ° C 5 min, followed by 30 amplification cycles (94 ° C 30 sec, 50 ° C 30 sec, 72 ° C 3 min) then storage at 4 ° C until deposit on 1% agarose gel.
  • Primers 523 and 524 serve as an amplification control and make it possible to obtain a band of 600 bp (internal fragment at eps A) whatever the type of the operon.
  • kit 1 there is an additional band at 1.5 kb, 0.5 kb, 2.8 kb, 2.5kb, 1.4 kb, 2.1 kb or 0.3kb if the strain of S. thermophilus contains a type I, II eps operon, III, IN, NI, NUI or X.
  • kit 2 two bands at 2.1 kb and 1.9 kb are observed for a Type N operon, a single band at 1.9 kb in the case of Type X and a band at 2.5 kb in the case of Type XL
  • EXAMPLE 2 CORRELATION BETWEEN THE PRESENCE OF A TYPE OF EPS OPERON AND THE TEXTURE OF A FERMENTED PRODUCT.
  • the product is characterized after storage for 24 hours at + 6 ° C.

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Abstract

L'invention concerne des opérons eps impliqués dans la biosynthèse des exopolysaccharides chez des bactéries lactiques, et notamment chez S. thermophilus. Des séquences de ces opérons sont utilisables notamment pour la construction de nouveaux opérons eps, ainsi que pour la détection, chez les bactéries lactiques de la présence de gènes ou de combinaisons de gènes participant à la synthèse d'un exopolysaccharide.

Description

OPERONS DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS IMPLIQUES DANS
LA SYNTHESE DES EPS L'invention est relative au contrôle et à l'optimisation de la production d' exopolysaccharides par des bactéries lactiques. Les exopolysaccharides (EPS) sont des polysaccharides extracellulaires, produits et relargués dans le milieu par de nombreuses espèces bactériennes. Ils résultent de la polymérisation d'une unité répétitive de sucres.
Les exopolysaccharides produits par les bactéries lactiques jouent un rôle majeur dans l'élaboration de la texture, de la perception en bouche et de la rhéologie des produits fermentes. Par exemple, dans le cadre de la fabrication des yaourts, des EPS produits par Streptococcus thermophilus jouent un rôle d'épaississant, et permettent en outre de conférer au produit final un caractère filant et/ou une texture crémeuse, appréciés des consommateurs.
En outre, il a été observé que certains EPS possédaient des activités biologiques par lesquelles ils pourraient exercer divers effets bénéfiques sur la santé.
Toutefois, la production des EPS par les bactéries lactiques est très variable quantitativement et/ou qualitativement, non seulement d'une espèce à l'autre, mais également d'une souche à l'autre au sein d'une même espèce. En outre, même dans le cas des souches productrices d'EPS, cette production est très instable, et peut varier considérablement au cours de la culture et de la fermentation, ce qui aboutit à une variation qualitative et/ou quantitative du contenu en EPS des produits fermentes, rendant problématique l'obtention d'une qualité constante. Ceci oblige les industriels à effectuer des contrôles permanents de la capacité des souches qu'ils utilisent à produire des EPS.
Il apparaît donc souhaitable de disposer d'outils permettant de mieux contrôler et d'optimiser la production d'EPS par les bactéries lactiques. Dans ce but différentes équipes ont entrepris de rechercher les fonctions enzymatiques impliquées dans la synthèse des EPS, et les gènes correspondants.
Les observations effectuées jusqu'à présent par montrent que les gènes impliqués dans la synthèse d'un polysaccharide extracellulaire sont regroupés au sein d'un opéron (opéron eps).
Plusieurs opérons eps ont précédemment été mis en évidence chez des bactéries lactiques [pour revue, cf. DE VUYST, et DEGEEST, FEMS Microbiology Reviews, 23, 153-177, (1999)]. Par exemple, dans le cas de S. thermophilus, on citera notamment l'opéron de S. thermophilus Sfι6 [STINGELE et al, J. Bacteriol., 178, 1680- 1690, (1996) ; Demande EP 750043 au nom de SOCIETE DES PRODUITS NESTLE], celui de S. thermophilus CNRZ368 [BOURGOIN et al, Gène, 233, 151-161, (1999)], ou celui de S. thermophilus Sfι39 [Demande EP 9575168 au nom de SOCIETE DES PRODUITS NESTLE]. La comparaison des différents opérons eps connus fait apparaître une organisation très conservée.
Le groupe de gènes dénommé epsABCD situé au début de l'opéron code des protéines (EpsA, EpsB, EpsC, et EpsD) fortement homologues d'un opéron eps à un autre. La protéine EpsA possède vraisemblablement une fonction de régulation de la production d'EPS ; les protéines EpsC et EpsD apparaissent impliquées dans la polymérisation des unités répétitives de base et leur exportation ; la fonction de la protéine EpsB n'a pour l'instant pas été élucidée. Le groupe epsABCD est suivi d'une séquence au niveau de laquelle on observe également une très forte homologie entre les différents opérons eps connus ; cette séquence code une protéine qui est vraisemblablement une glycosyl-1 -phosphate transférase, impliquée dans la première étape de la synthèse de l'unité de base. La région suivante de l'opéron est plus variable ; elle comprend des ORFs codant probablement les différentes glycosyltransférases impliquées dans l'assemblage des sucres formant l'unité répétitive de base. A la fin de certains opérons eps ont été localisés des ORFs codant des protéines potentiellement impliquées dans le transport de l'unité répétitive dans le milieu extracellulaire.
Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence et isolé huit nouveaux opérons impliqués dans la biosynthèse d'EPS chez S. thermophilus. L'analyse structurale de ces opérons montre qu'ils possèdent une organisation similaire à celle des opérons eps déjà connus, et qu'ils comprennent : a) des ORFs (open reading frame = cadre ouvert de lecture) dont le produit de traduction possède une homologie importante (identité supérieure ou égale à 80%) avec celui d'ORFs impliqués dans la synthèse des exopolysaccharides ou de polysaccharides de capsule chez des bactéries gram+, notamment les protéines EpsA-D de S. thermophilus, la protéine EpsE de S. sάlivarius; b) des ORFs dont le produit de traduction est apparenté (identité supérieure ou égale à 20% et inférieure à 80%) avec celui d'ORFs impliqués dans la synthèse des exopolysaccharides ou de polysaccharides de capsule chez des bactéries gram+ ; il s'agit principalement d'ORFs codant pour des glycosyltransférases. c) des ORFs dont le produit de traduction possède une homologie importante (identité supérieure ou égale à 80%) avec des transposases connues de Streptococcus thermophilus.
Le pourcentage d'identité d'une séquence avec une séquence de référence est défini ici comme le pourcentage de résidus de cette séquence qui sont • identiques avec ceux de la séquence de référence lorsque les 2 séquences sont alignées pour une correspondance maximale entre les positions des résidus. Un polypeptide dont la séquence en acides aminés possède au moins X% d'identité avec une séquence de référence peut ainsi comprendre jusqu'à 100-X modifications pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Ces modifications incluent la délétion, la substitution, ou l'insertion de résidus d'acides aminés, consécutifs ou non.
Les caractéristiques respectives de chacun des opérons eps de S. thermophilus caractérisés par les Inventeurs sont décrites plus en détail ci-après. Les tableaux I à IX résument les caractéristiques des ORFs identifiés sur chaque opéron. Dans chaque tableau, la dénomination donnée à chaque ORF est mentionnée dans la lere colonne (ORF) ; la position de la région comprenant cet ORF (par rapport à la séquence de l'opéron telle qu'indiquée dans la liste de séquences) est mentionnée dans les deuxième et troisième colonnes (Position) ; la fonction putative de la protéine correspondante est mentionnée dans la quatrième colonne (Fonction putative).
La figure 1 schématise la structure des opérons conformes à l'invention (Types III, IN, N, NI, Nil, IX, X, et XI) ainsi que la structure de 3 opérons de S. thermophilus décrits dans l'art antérieur, dans la Demande PCT WO 99/62316 (dénommé ici « opéron de Type I »), par STIΝGELE et al. (dénommé ici « opéron de Type II »), et par BOURGOIΝ et al. (dénommé ici « opéron de Type NUI »)
L'opéron dénommé « opéron de type III » est localisé sur une séquence de environ d'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus thermophilus déposée selon le traité de Budapest le 5 avril 2000 par la société RHODIA FOOD S.A.S., Z.A. de Buxières, 86220 DANGE-SAiNT-ROMAIN, auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le numéro 1-2425.
Une séquence partielle de ce fragment de 13 kb est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:l ; la séquence complète de l'opéron de type III porté par ce fragment est représentée sous le numéro SEQ ID NO:9. Les positions et les caractéristiques des ORFs identifiés sur cette séquence sont indiqués dans le tableau I ci-après.
Tableau I
Figure imgf000005_0001
L'opéron dénommé « opéron de type IV » est localisé sur une séquence de 16 kb environ d'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus thermophilus déposée selon le traité de Budapest le 5 avril 2000 par la société RHODIA FOOD S.A.S., Z.A. de Buxières, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le numéro 1-2432.
Une séquence partielle de ce fragment de 16 kb est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:2 ; la séquence complète de l'opéron de type IV porté par ce fragment est représentée sous le numéro SEQ ID NO:10. Les positions et les caractéristiques des ORFs identifiés sur cette séquence sont indiqués dans le tableau II ci après.
Tableau II
Figure imgf000006_0001
L'opéron dénommé « opéron de type N » est localisé sur une séquence de 14 kb environ d'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus thermophilus déposée selon le traité de Budapest le 5 avril 2000 par la société RHODIA FOOD S.A.S., Z.A. de Buxières, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le numéro 1-2431.
Une séquence partielle de ce fragment de 14 kb est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3 ; la séquence complète de l'opéron de type N porté par ce fragment est représentée sous le numéro SEQ ID ΝO: 11.
Les positions et les caractéristiques des ORFs identifiés sur cette séquence sont indiqués dans le tableau III ci après.
Tableau
Figure imgf000007_0001
L'opéron dénommé « opéron de type NI » est localisé sur une séquence de 20 kb environ d'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus thermophilus déposée le 24 février 1999 selon le traité de Budapest auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le numéro 1-2130.
Une séquence partielle de ce fragment de 20 kb est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:4 ; la séquence complète de l'opéron de type NI porté par ce fragment est représentée sous le numéro SEQ ID ΝO:12.
Les positions et les caractéristiques des ORFs identifiés sur cette séquence sont indiqués dans le tableau IN ci après.
Tableau IV
Figure imgf000007_0002
L'opéron dénommé « opéron de type VII » est localisé sur une séquence de 16 kb environ d'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus thermophilus déposée selon le traité de Budapest le 5 avril 2000 par la société RHODIA FOOD S.A.S., Z.A. de Buxières, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le numéro 1-2429 ; d'autres souches de Streptococcus thermophilus contenant cet opéron ont également été déposées selon le traité de Budapest par la société RHODIA FOOD S.A.S., Z.A. de Buxières, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, auprès de la C.N.C.M. le 5 avril 2000, sous les numéros 1-2430 et 1-2437.
Une séquence partielle de ce fragment de 16 kb est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:5 ; la séquence plus complète de l'opéron de type VII porté par ce fragment est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 13.
Les positions et les caractéristiques des ORFs identifiés sur cette séquence sont indiqués dans le tableau V ci après.
Tableau V
Figure imgf000008_0001
L'opéron dénommé « opéron de type IX » est localisé sur une séquence de 12,5 kb environ d'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus thermophilus déposée selon le traité de Budapest le 5 avril 2000 par la société RHODIA FOOD S. A. S., Z.A. de Buxières, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le numéro 1-2427.
Une séquence partielle de ce fragment de 12,5 kb est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:6 ; la séquence complète de l'opéron de type IX porté par ce fragment est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 14. Les positions et les caractéristiques des ORFs identifiés sur cette séquence sont indiqués dans le tableau VI ci après. Tableau VI
Figure imgf000009_0001
L'opéron dénommé « opéron de type X » est localisé sur une séquence de 15,5 kb environ d'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus thermophilus déposée selon le traité de Budapest le 5 avril 2000 par la société RHODIA FOOD S.A.S., Z.A. de Buxières, 86220 DANGE-SAINT-ROMAIN, auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le numéro 1-2428.
Une séquence partielle de ce fragment de 15,5 kb est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 7 ; la séquence complète de l'opéron de type X porté par ce fragment est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 15. Les positions et les caractéristiques des ORFs identifiés sur cette séquence sont indiqués dans le tableau VII ci après.
Tableau VII
Figure imgf000010_0001
L'opéron dénommé « opéron de type XI » est localisé sur une séquence de 14,5 kb environ d'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus thermophilus déposée le 22 septembre 1994 selon le traité de Budapest auprès de la C.N.C.M.(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le numéro 1-1477.
Une séquence partielle de ce fragment de 14,5 kb est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 8 ; la séquence complète de l'opéron de type XI porté par ce fragment est représentée sous le numéro SEQ ID NO:16.
Les positions et les caractéristiques des ORFs identifiés sur cette séquence sont indiqués dans le tableau NUI ci après. Tableau VIII
Figure imgf000011_0001
La présente invention fournit donc de nouveaux gènes et/ou de nouvelles combinaisons de gènes impliqués dans la biosynthèse des EPS chez les bactéries lactiques, et notamment chez S. thermophilus. Ces gènes et/ou combinaisons de gènes peuvent être utilisés pour optimiser la production d'EPS chez des bactéries lactiques, en particulier chez S. thermophilus. Par exemple, on peut exprimer chez une bactérie hôte un ou plusieurs des nouveaux opérons eps de S. thermophilus décrits ci-dessus, afin de produire le ou les EPS associé(s) à cet ou ces opéron(s). On peut également, à partir des nouveaux gènes impliqués dans la synthèse des EPS mis en évidence par les Inventeurs, construire par recombinaison génétique des opérons eps fonctionnels permettant la synthèse de nouveaux EPS.
Au sens de la présente invention on entend par opéron eps fonctionnel, une séquence d'acide nucléique constituant une unité de transcription comprenant au moins, : - un groupe de gènes epsABCD, tel que défini ci-dessus ;
- au moins un gène codant une undécaprényl glycosyl- 1 -phosphate transférase ;
- un ou plusieurs gènes codant une glycosyltransférase ;
- généralement, un ou plusieurs gènes codant une protéine impliquée dans le transport d'un EPS dans le milieu extracellulaire. Eventuellement, ledit opéron EPS peut comprendre en outre un ou plusieurs gènes codant une protéine intervenant dans la modification des sucres précurseurs d'un l'EPS.
La présente invention a pour objet un fragment d'acide nucléique constituant un opéron eps fonctionnel chez S. thermophilus, et caractérisée en ce qu'elle comprend au moins : a) un gène epsA choisi parmi :
- l'ORF eps3A de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 87% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4A de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 92% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5A de la séquence SEQ ID NO:3 ou de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 87% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6A de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 87% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps7A de la séquence SEQ ID NO:5 ou de la séquence SEQ ID NO: 13 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 87% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9A de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 86% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslOA de la séquence SEQ ID NO:7 ou de la séquence SEQ ID NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 86% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl 1 A de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 86% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; et/ou un gène epsB choisi parmi :
- l'ORF eps3B de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO: 9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 92% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps4B de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID
NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 92% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5B de la séquence SEQ ID NO:3 ou de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 92% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6B de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 92% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps7B de la séquence SEQ ID NO:5 ou de la séquence SEQ ID NO: 13 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 92% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9B de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 91% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epslOB de la séquence SEQ ID NO:7 ou de la séquence SEQ ID
NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 91% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epsl 1B de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 91% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; et/ou un gène epsC choisi parmi :
- l'ORF eps3C de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO: 9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 88% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4C de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 89% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5C de la séquence SEQ ID NO:3 ou de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 88% d'identité, de de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsόC de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO.T2 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 88% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps7C de la séquence SEQ ID NO:5 ou de la séquence SEQ ID NO: 13 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 88% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9C de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 77% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, avantageusement au moins 90% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins de 95% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslOC de la séquence SEQ ID NO:7 ou de la séquence SEQ ID NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 77% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, avantageusement au moins 90% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins de 95% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl 1C de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 77% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, avantageusement au moins 90% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins de 95% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; et/ou un gène epsD choisi parmi :
- l'ORF eps3D de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 86% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4D de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps5D de la séquence SEQ ID NO:3 ou de la séquence SEQ ID
NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 86% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps6D de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID
NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 86% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps7D de la séquence SEQ ID NO:5 ou de la séquence SEQ ID
NO: 13 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 86% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps9D de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID
NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epslOD de la séquence SEQ ID NO:7 ou de la séquence SEQ ID NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epsl ID de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID
NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; et/ou au moins un gène codant une glycosyl- 1 -phosphate transférase choisi parmi :
- l'ORF eps3E de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 87% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps3M de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps4E de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID
NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 94% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5E de la séquence SEQ ID NO:3 ou de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 96% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5M de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6E de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 93% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps7E de la séquence SEQ ID NO: 5 ou de la séquence SEQ ID NO: 13 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 93% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9E de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 96% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9K de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 65% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslOE de la séquence SEQ ID NO:7 ou de la séquence SEQ ID NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 96% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl lE de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 96% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; et/ou au moins un gène codant une glycosyltransférase choisi parmi :
- l'ORF eps3F de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 82% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps3H de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO:9tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité, au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps3K de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO: 9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 32% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4F de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 92% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4G de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 92% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4J de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5F de la séquence SEQ ID NO:3 ou de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 74% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, avantageusement au moins 90% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins de 95% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5G de la séquence SEQ ID NO:3 ou de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 38% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5I de la séquence SEQ ID NO:3 ou de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 87% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5J de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps5K de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5O de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80%) d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps6F de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 78%> d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, avantageusement au moins 90% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins de 95% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6G de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 74% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, avantageusement au moins 90% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins de 95% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6H de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps6J de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID
NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps6K de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID
NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, avantageusement au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6O de la séquence SEQ ID NO:12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps7F de la séquence SEQ ID NO:5 ou de la séquence SEQ ID NO: 13 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80%> d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9F de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 54% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps9G de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID NO :14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 38% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9H de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 81% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9I de la séquence SEQ ID NO:6 ou l'ORF eps9I + I' de la séquence. SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps9J de la séquence SEQ ID NO:6 ou de la séquence SEQ ID
NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 77% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, avantageusement au moins 90% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins de 95% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps9N de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslOF de la séquence SEQ ID NO:7 ou de la séquence SEQ ID NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 77% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, avantageusement au moins 90% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins de 95% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslOH de la séquence SEQ ID NO:7 ou de la séquence SEQ ID NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 94% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslON de la séquence SEQ ID NO:15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslOP de la séquence SEQ ID NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl IF de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 62% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsllK de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl IL de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 35% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl 1M de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF. - l'ORF epsl 1Q de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit opéron eps comprend en outre au moins un gène choisi parmi :
- l'ORF eps3G de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO: 9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 67% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps3I de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 27% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps3J de la séquence SEQ ID NO:l ou de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 46% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps3L de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps3N de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps3O de la séquence SEQ ID NO:9 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps4H de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID
NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4I de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 96% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4K de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4L de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 28% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4M de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 84% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4N de la séquence SEQ ID NO:2 ou de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4O de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4P de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps4Q de la séquence SEQ ID NO: 10 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps5H de la séquence SEQ ID NO:3 ou de la séquence SEQ ID
NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 36% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF eps5L de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 87% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, avantageusement au moins 95% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps5N de la séquence SEQ ID NO: 11 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6I de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 40% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6L de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 93% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité, et avantageusement au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6M de la séquence SEQ ID NO:4 ou de la séquence SEQ ID NO :12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 40% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps6N de la séquence SEQ ID NO: 12 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière* tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps7U de la séquence SEQ ID NO:13 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80%> d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9L de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF eps9M de la séquence SEQ ID NO: 14 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80%> d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epslOG de la séquence SEQ ID NO:7 ou de la séquence SEQ ID
NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 57% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epslOI de la séquence SEQ ID NO:7 ou de la séquence SEQ ID
NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 32% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epslOJ de la séquence SEQ ID NO:15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslOK de la séquence SEQ ID NO:15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epslOL de la séquence SEQ ID NO:15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epslOM de la séquence SEQ ID NO:15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslOO de la séquence SEQ ID NO:15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epslOQ de la séquence SEQ ID NO:15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl OR de la séquence SEQ ID NO.T5 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl OS de la séquence SEQ ID NO: 15 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epsl 1G de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID
NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl 1H de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl II de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 50% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epsl 1 J de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 25% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl IN de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 45% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF. - l'ORF epsl 1O de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 25% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl lP de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité, de préférence au moins
70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl 1Q de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 50% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl lR de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl lS de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité, de préférence au moins 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl 1T de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
La présente invention englobe en particulier tout opéron eps porté par l'un des fragments d'acide nucléique identifiés dans la liste de séquences sous les numéros SEQ ID NO:l à SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:9 à SEQ ID NO:16.
La présente invention a également pour objet :
- tout fragment d'acide nucléique isolé essentiellement constitué par un ORF choisi parmi eps3A, eps3B, eps3C, eps3D, eps3E, eps3F, eps3G, eps3H, eps3I, eps3J, eps3K, eps3L, eps3M, eps3N, eps3O, eps4A, eps4B, eps4C, eps4D, eps4E, eps4F, eps4H, eps4I, eps4J, eps4K, eps4L, eps4M, eps4N, eps4O, eps4P, eps4Q, eps5A, eps5B, eps5C, eps5D, eps5E, eps5F, eps5G, eps5H, eps5I, eps5J, eps5K, eps5L, eps5M, eps5N, eps5O, eps6A, eps6B, eps6C, eps6D, eps6E, eps6F, eps6G, eps6H, eps6I, eps6J, eps6K, eps6L, eps6M, eps6N, eps6O, eps7A, eps7B, eps7C, eps7D, eps7E, eps7F, eps7U, eps9A, eps9B, eps9C, eps9D, eps9E„ eps9F, eps9G, eps9H, eps9I, eps9J, eps9K, , eps9L, eps9M, eps9N, epslOA, epslOB, epsl OC, epslOD, epslOE, eps 10F, epslOG, epsl OH, eps 101, epslOJ, epslOK, epslOL, epslOM, epslON, epslOO, epslOP, epslOQ, epslOR, epslOS, epsl lA, epsl lB, epsl lC, epsl lD, epsl lE, epsl IF, epsl lG, epsl lH, epsl II, epsl lJ, epsl lK, epsl IL, epsl lM, epsl IN, epsl 10, epsl lP, epsl lQ, epsl lR, epsl lS, epsl lT, définis ci- dessus, ou une séquence codant une protéine présentant avec le produit de traduction dudit ORF, le pourcentage d'identité défini ci-dessus, et impliquée dans la synthèse des EPS ;
- l'utilisation d'au moins un fragment d'acide nucléique tel que défini ci dessus, pour l'obtention d'un opéron eps chimérique fonctionnel. Dans ce cadre, ledit fragment sera utilisé en combinaison avec d'autres ORFs provenant d'un ou plusieurs opéron(s) eps. Il peut s'agir de fragments d'acide nucléique conformes à l'invention, et/ou de fragments d'acide nucléiques portant des ORFs provenant d'autres opérons eps.
L'expression, dans une cellule-hôte, par exemple dans une bactérie lactique, et notamment chez S. thermophilus, d'un opéron eps conforme à l'invention, permet de produire l'EPS correspondant. On peut également, si on le souhaite, exprimer au lieu d'un opéron eps complet, seulement un ou plusieurs des gènes intervenant dans la synthèse de l'EPS, notamment parmi ceux codant les glycosyltransférases, notamment afin de produire par génie génétique les protéines correspondantes, qui peuvent ensuite être utilisées, par exemple, pour la synthèse de polysaccharides. Dans tous les cas l'expression d'un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention peut s'effectuer selon les méthodes classiques, connues en elles-même de l'homme de l'art.
De manière générale, on construira un vecteur recombinant comprenant un fragment d'acide nucléique associé à des séquences de contrôle de la transcription et de la traduction appropriées. Le vecteur dans lequel on effectue l'insertion du fragment d'acide nucléique conforme à l'invention, ainsi que les séquences permettant de contrôler son expression seront choisis par exemple en fonction de la cellule-hôte sélectionnée et/ou du type (par exemple expression constitutive ou expression conditionnelle) et du niveau d'expression que l'on souhaite obtenir ; de nombreux vecteurs, et de nombreuses séquences de contrôle de l'expression, utilisables dans une variété de cellules-hôtes, sont connues en elles-mêmes.
Avantageusement, ces séquences de contrôle de l'expression peuvent être celles d'un opéron eps, et notamment les séquences des promoteurs des opérons eps de type III, IN, N, NI, Nil, IX, X, et XI conformes à l'invention. En effet, les Inventeurs ont constaté que la quantité d'EPS produit variait d'une souche à l'autre, et on émis l'hypothèse que cette variation pourrait être due, au moins en partie, à la transcription de l'opéron eps. Ils ont d'autre part constaté que le promoteur situé en amont du gène epsA varie d'un type d'opéron à l'autre. Notamment, il existe une zone de forte variabilité (insertions ou délétions) quelques bases en amont de la boîte -35. Cette insertion peut avoir des effets sur la régulation de la transcription des gènes de l'opéron.
La localisation des promoteurs des opérons eps sur les séquences SEQ ID NO:l à SEQ ID NO:8 est la suivante : - Type III : de 488 à 827 de la séquence SEQ ID NO:l
- Type IV : de 485 à 825 de la séquence SEQ ID NO:2
- Type V : de 499 à 844 de la séquence SEQ ID NO:3
- Type VI : de 496 à 844 de la séquence SEQ ID NO:4
- Type VII : de 530 à 880 de la séquence SEQ ID NO:5 - Type IX : de 490 à 831 de la séquence SEQ ID NO:6
- Type X : de 736 à 1104 de la séquence SEQ ID NO:7
- Type XI : de 470 à 820 de la séquence SEQ ID NO:8
Les promoteurs des opérons eps conformes à l'invention sont utilisables notamment pour réguler l'expression, soit des gènes auxquels ils sont respectivement naturellement associés, soit des gènes de tout autre opéron eps.
Le vecteur ainsi obtenu est utilisé pour transformer la cellule-hôte choisie. Celle-ci peut être une cellule eucaryote, par exemple une cellule de levure, ou une cellule procaryote ; dans ce dernier cas, il peut s'agir en particulier d'une bactérie lactique, et notamment de S. thermophilus. La présente invention englobe également tout vecteur recombinant comprenant un fragment conforme à l'invention, ainsi que toute cellule-hôte transformée par un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention.
Des cellules transformées par un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention peuvent notamment être utilisées pour la biosynthèse d'EPS, ou, en particulier dans le cas des bactéries lactiques, pour la préparation de produits fermentes comprenant un EPS ayant la structure souhaitée.
Il est donc maintenant possible de modifier le type d'EPS produit par
S. thermophilus en introduisant tout ou partie des gènes décrit dans cette invention. En particulier, il est envisageable d'utiliser des gènes appartenant à différents opérons (notamment les gènes codant pour les glycosyltransférases) afin de constmire un nouvel opéron permettant la synthèse d'un EPS ayant des propriétés nouvelles pour des applications dans le domaine de la texture ou des probiotiques. En outre, en procurant les séquences de nouveaux opérons eps, la présente invention fournit des outils permettant de déterminer le type d'EPS produit par une souche de bactérie lactique, notamment une souche de S. thermophilus, par détection, chez ladite souche, de la présence de gènes ou de combinaison de gènes impliqués dans la synthèse dudit EPS.
Jusqu'à présent, la détermination de l'EPS produit par une souche de S. thermophilus nécessitait l'isolement puis l'analyse biochimique de l'EPS produit. Cette technique est très consommatrice de temps et de main d' œuvre, et n'est pas applicable en pratique, au typage d'un grand nombre de souches. Grâce à la présente invention, il est désormais possible de déterminer la nature de l'EPS grâce aux gènes intervenant dans sa biosynthèse, et notamment d'établir une relation entre les propriétés d'une souche de S. thermophilus et la présence d'un opéron eps déterminé, ou de certains gènes de cet opéron.
Notamment, il est possible, en procédant à l'alignement des séquences SEQ ID NO :1 à SEQ ID NO :8, ou SEQ ID NO :9 à SEQ ID NO :16, représentant les opérons de types III, IN, N, NI, Nil, IX, X, et XI, entre elles et avec des séquences d'autres opérons (notamment les opérons eps de types I, II et NUI), d'identifier facilement les régions spécifiques de chaque opéron, ainsi que les régions communes à différents opérons, et d'en dériver des oligonucléotides utilisables par exemple comme sondes spécifiques de détection de la présence dudit opéron, et/ou comme amorces permettant l'amplification d'un fragment spécifique dudit opéron.
La présente invention a en conséquence pour objet un procédé de sélection d'au moins un oligonucléotide permettant la détection spécifique d'un gène d'un opéron eps présent dans une souche de S. thermophilus, caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'alignement des ORFs présentes sur les séquences identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID ΝO:l à 8, ou SEQ ID NO :9 à 16, entre elles et, éventuellement avec des ORFs de séquences d'autres opérons eps, notamment des opérons eps de types I, II et VIII ; b) l'identification, dans au moins une desdites ORFs, d'au moins une portion de taille supérieure à 12 pb, et de préférence comprise entre 15 et
50 pb, présentant une homologie inférieure à 80%, et de préférence inférieure à 50% avec les autres séquences.
On peut ensuite facilement préparer un ou plusieurs oligonucléotides de séquence identique ou de séquence complémentaire à celle(s) de la ou des portion(s) de séquence ainsi identifiées.
La présente invention a également pour objet tout oligonucléotide spécifique d'un gène d'un opéron eps, susceptible d'être obtenu par le procédé défini ci- dessus, et notamment tout oligonucléotide spécifique d'un gène d'un opéron eps choisi parmi les opérons de Type I à XI.
On définit ici comme « oligonucléotide spécifique d'un gène d'un opéron eps », tout oligonucléotide pour lequel il est possible de définir des conditions d'hybridation dans lesquelles, en présence des opérons eps des types I à XI, ledit oligonucléotide ne s'hybride qu'avec un seul gène porté par un seul desdits opérons.
Des oligonucléotides conformes à l'invention peuvent notamment être obtenus à partir de la séquence d'au moins un ORF choisi parmi eps3F, eps3G, eps3H, eps3I, eps3J, eps3K, eps4L, eps5F, eps5G, eps5H, eps5I, eps6F, eps6G, eps6H, epsόl, eps6J, eps6K, eps6L, eps6M, eps7F, eps9F, eps9G, eps9H, eps9I, eps9J, eps9K, eps 10F, epslOG, epsl 0H, eps 101, epsl IF, epsl 1 G, epsl 1 H, epsl II, epsl lJ, et avantageusement à partir de la séquence d'au moins un ORF choisi parmi eps3F, eps5F, eps6F, eps6G, eps6I, eps6J, eps9G, eps9J, epslOF, epsl IF, epsl lG.
La présente invention a également pour objet toute paire d'amorces oligonucléotidiques permettant l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique d'un gène d'un opéron eps, et notamment toute paire d'amorces oligonucléotidiques spécifique d'un gène d'un opéron eps choisi parmi les opérons de Type I à XL Ceci englobe en particulier :
- tout couple d'oligonucléotides comprenant au moins un oligonucléotide spécifique d'un gène d'un opéron eps, tel que défini ci-dessus ;
- tout couple d'oligonucléotides pour lequel il est possible de définir des conditions d'amplification dans lesquelles, en présence des opérons eps des types I à XI, ils ne s'hybrident conjointement qu'avec un seul gène de l'un desdits opérons, permettant donc uniquement l'amplification de séquences dudit gène ; - tout couple d'oligonucléotides qui, bien que pouvant s'hybrider conjointement avec un ou plusieurs gènes d'un ou plusieurs opérons eps des types I à XI, génèrent pour chacun de ces gènes, un produit d'amplification de taille différente.
De même, il est possible d'identifier des oligonucléotides utilisables comme amorces pour l'amplification d'une séquence d'acide nucléique spécifique d'un opéron eps, notamment d'un opéron eps choisi parmi les opérons de Type I à XL
On définit par : « séquence d'acide nucléique spécifique d'un opéron eps » tout gène, portion de gène, ou combinaison de gènes, présents uniquement sur cet opéron.
La présente invention a également pour objet toute paire d'amorces oligonucléotidiques permettant l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique d'un opéron eps, et notamment toute paire d'amorces oligonucléotidiques permettant l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique d'un opéron eps choisi parmi les opérons de Type I à XL Ceci englobe en particulier :
- tout couple d'oligonucléotides comprenant au moins un oligonucléotide spécifique d'un gène d'un opéron eps, tel que défini ci-dessus ;
- tout couple d'oligonucléotides pour lequel il est possible de définir des conditions d'amplification dans lesquelles, en présence des opérons eps des types I à XI, ils ne s'hybrident conjointement qu'avec un seul desdits opérons, permettant donc uniquement l'amplification de séquences dudit opéron ;
- tout couple d'oligonucléotides qui, bien que pouvant s'hybrider conjointement avec plusieurs opérons eps, génèrent pour chacun de ces opérons, un produit d' amplification de taille différente.
De telles amorces nucléotidiques sont susceptibles d'être obtenues par un procédé comprenant : a) l'alignement des séquences identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:l à 8, ou SEQ ID NO:9 à 16, entre elles et, éventuellement avec des séquences d'autres opérons eps ; b) l'identification, dans la séquence représentant le type d'opéron eps que l'on souhaite détecter d'au moins une région spécifique, par sa taille et/ou sa séquence, dudit opéron ; c) l'identification d'amorces permettant d'obtenir l'amplification spécifique de ladite région.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un oligonucléotide ou d'au moins un couple d'amorces tels que définis ci-dessus pour la détermination du type d'EPS produit par une souche de S. thermophilus.
La présente invention a aussi pour objet un kit permettant la détermination du type d'EPS produit par une souche de S. thermophilus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un oligonucléotide spécifique d'un gène d'un opéron eps, et/ou au moins une paire d'amorces oligonucléotidiques permettant l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique d'un opéron eps, conformes à l'invention.
Les oligonucléotides conformes à l'invention permettent de cribler rapidement une collection de souches de S. thermophilus pour connaître le type d'EPS produit par ces souches. Ils permettent de déterminer, sans qu'il soit nécessaire de purifier et d'analyser l'EPS concerné, la relation entre la présence d'un type d'EPS et les caractéristiques d'un produit, par exemple les qualités organoleptiques, la texture, les effets probiotiques éventuels, etc. Ils permettent également de sélectionner les ferments en fonction de leur capacité à produire un EPS déterminé.
La présente invention englobe également les souches de Streptococcus thermophilus comprenant au moins un opéron eps conforme à l'invention, et notamment des souches de Streptococcus thermophilus comprenant : - un opéron eps de type III, représentées par la souche CNCM 1-2425 ;
- un opéron eps de type IV, représentées par la souche CNCM 1-2432 ;
- un opéron eps de type V, représentées par la souche CNCM 1-2431 ;
- un opéron eps de type NI, représentées par la souche CΝCM 1-2130 ; - un opéron eps de type IX, représentées par la souche CΝCM 1-2427 ;
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'utilisation de séquences d'acide nucléique conformes à l'invention pour la détermination du type d'opéron eps contenu dans différentes souches de S. thermophilus. EXEMPLE 1 : KITS DE TYPAGE GENETIQUE
2 kits de typage permettant d'amplifier spécifiquement les opérons de type I, II, III, IV, VI NUI et X (kit 1) ou de type N, IX et XI (kit 2) sont décrits ci-après à titre d'exemple..
Le kit 1 comprend : - une amorce 364 (GGGCACATTTGCCATTAGTG) spécifique de l'orfl4.9, présente dans tous les types d'opéron connus, mis à part le Type XI ;
- une amorce 525 (GGAGATGAACCATACTACCC) spécifique du Type I et NI ;
- une amorce 526 (GGTGATTCAGATTAAGTGGCG) spécifique du Type II :
- une amorce 532 (GCACTACTATTAATGATTCCG) spécifique du Type III ; - une amorce 366 (GCTACGTAGGCTATAGAAGC) spécifique du Type IN et
NUI ;
- une amorce 442 (CTCACGGATAAACTCTGG) spécifique du Type X ;
- les amorces 523 (GACGACTACTCCACGTGATCC), et 524 (GAGAGGCACTTTCCACACTCG) spécifiques du gène epsA présent dans tous les types d'opérons eps de
S. thermophilus connus.
Le kit 2 comprend les amorces 364, 523, et 524, ainsi que :
- une amorce 304 (GCAGCCTGCTGGGAGAC) spécifique du Type N ;
- une amorce 543 (CGTCACCTCGTGGAGAGTTGG) spécifique des Types N et XI ;
- les amorces 517 (GAACGCATCTTCCGGTGGC) et 519 (GTACCATCATCTTCGCCAGC) spécifiques du Type XI.
Ces amorces sont utilisées dans la technique de multiplex PCR [SOROKIΝ et al. , Génome Res., 6, 448-453, (1996)] selon le protocole suivant :
La PCR est effectuée sur de l'ADΝ total de Streptococcus thermophilus en présence de l'ensemble des amorces du kit 1 ou de l'ensemble des amorces du kit 2, dans les conditions suivantes : 94°C 5 min, suivi de 30 cycles d'amplification (94°C 30 sec, 50°C 30 sec, 72°C 3 min) puis d'une conservation à 4°C jusqu'au dépôt sur gel d'agarose à 1%.
Les amorces 523 et 524 servent de témoin d'amplification et permettent d'obtenir une bande de 600 bp (fragment interne à eps A) quelque soit le type de l'opéron.
Dans le cas du kit 1, on observe une bande supplémentaire à 1.5 kb, 0.5 kb, 2.8 kb, 2.5kb, 1.4 kb, 2.1 kb ou 0.3kb si la souche de S. thermophilus contient un opéron eps de type I, II, III, IN, NI, NUI ou X.
Dans le cas du kit 2, on observe deux bandes à 2,1 kb et 1,9 kb pour un opéron de Type N, une seule bande à 1,9 kb dans le cas du Type X et une bande à 2,5 kb dans le cas du Type XL
EXEMPLE 2 : CORRELATION ENTRE LA PRESENCE D'UN TYPE D'OPERON EPS ET LA TEXTURE D'UN PRODUIT FERMENTE.
Des laits fermentes par des souches de S. thermophilus possédant différents opérons eps de type I à XI ont été préparés comme suit:
Un litre de lait demi-écrémé a été enrichi avec 3% de poudre de lait écrémé (extrait sec 14%). Après pasteurisation (10 min à 90°C) le lait est refroidi à 43°C et inoculé avec 20g de concentré bactérien congelé pour 100 litres de lait. Le lait est incubé à 43°C jusqu'à pH 4,75. La fermentation est arrêtée par refroidissement à +4°C.
Le produit est caractérisé après stockage de 24h à +6°C.
Temps de fermentation : Pour évaluer le temps de fermentation, le pH est mesuré en continu (CINAC)
Rhéologie : La viscosité est appréciée par Viscosimètre BROOKFIELD, Vitesse 10, aiguille C, à la température de +8°C .Les résultats sont illustrés dans le Tableau X ci-après.
Tableau X
Figure imgf000033_0001
Ces résultats montrent qu'il existe une corrélation entre le type d'opéron eps présent dans une souche de Streptococcus thermophilus, et les propriétés des EPS produits, reflétées ici par la viscosité du produit fermenté obtenu.

Claims

REVENDICATIONS
1) Fragment d'acide nucléique constituant un opéron eps fonctionnel chez S. thermophilus, et caractérisé en ce qu'il comprend au moins : a) un gène eps A constitué par l'ORF epsl 1 A de la séquence SEQ ID NO: 8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 86% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF ; b) un gène epsB constitué par l'ORF epsl lB de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 94% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF ; c) un gène epsC constitué par l'ORF epsl lC de la séquence SEQ ID
NO: 8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 83% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF ; d) un gène epsD constitué par l'ORF epsl lD de la séquence SEQ ID NO: 8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF ; e) au moins un gène codant une undécaprényl glycosyl- 1 -phosphate transférase, constitué par l'ORF epsl lE de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 96% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF. g) au moins un gène codant une glycosyltransférase choisi parmi :
- l'ORF epsl IF de la séquence SEQ ID NO: 8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 62% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl 1K de la séquence SEQ ID NO.T6 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl lM de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF - l'ORF epsl 1Q de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité, de préférence au moins 70% d'identité, avantageusement au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% à 99% d'identité, avec le produit de traduction dudit ORF.
2) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit opéron eps comprend en outre au moins un gène choisi parmi :
- l'ORF epsl 1 G de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF ; - l'ORF epsl 1H de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins d'identité avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl II de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 50% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF ;
- l'ORF epsl 1J de la séquence SEQ ID NO:8 ou de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 25% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF. - l'ORF epsl IL de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 35% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl IN de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 45% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl 1O de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 25% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl 1P de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl 1Q de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 50% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF. - l'ORF epsl 1R de la séquence SEQ ID NO: 16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 30% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl 1S de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 95% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF.
- l'ORF epsl lT de la séquence SEQ ID NO:16 ou tout fragment d'acide nucléique codant une protéine présentant au moins 70% d'identité avec le produit de traduction dudit ORF.
3) Fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 ou 2, représenté par la séquence SEQ ID NO: 16.
4) Fragment d'acide nucléique comprenant au moins une ORF telle que définie dans une quelconque des revendications 1 ou 2. 5) Utilisation d'au moins un fragment d'acide nucléique selon la revendication 4, pour l'obtention d'un opéron eps chimérique fonctionnel
6) Vecteur recombinant, comprenant au moins un fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications ] à 5. 7) Cellule transformée par au moins un fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 7.
8) Utilisation d'au moins un fragment d'acide nucléique selon une quel ouque des revendications I à 4 pour la production d'un EPS.
9) Procédé de sélection d'au moins un oligonucléotide permettant la détection spécifique d'un gène d'un opέron eps présent dans une souche de S. th rmophil , caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'alignement des ORFs présentes sur la séquence SEQ ID NO.'lό avec les ORFs présentes sur les séquences SRQ lD NO. à 15. entre elles et, éventuellement avec des ORFs des opérons eps de types I, ïï et VIII ; b) ridentifteatuw., dans au ins une des ORF» alignées, d'au moins une portion de taille supérieure à 12 pb, et de préférence comprise entre 15 et 50 pb, présentant une homologie inférieure à 80%, et de préférence inférieure à 50% avec les autres séquences.
10) Oligonucléotide spécifique d'un gène d'un opéron eps, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 9.
1 1) Procédé de sélection d'un couple d'amorces oligonucléotidiques permettant la détection spécifique du type d'opéron eps présent dans une souche de S. thermophilus caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'alignement des séquences identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:l à 8 ou SiîQ ID NO:9 à 16, entre elles et, éventuel] ement avec des séquences d'autres opérons eps , b) l'identification, dans la. séquence représentant le type d'opéron eps que l'on souhaite détecter d'au moins une région spécifique, par sa taille et/ou sa séquence, dudit opéron ; c) l'identification d'amorces permettant d'obtenir l'amplification spécifique de ladite région.
12) Couple d'amorces nucléotidiques permettant la détection du type d'opύ un eps présent dans une souche de S. thermυμhilus, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon la revendication 11. 13) Utilisation d'au moins un oligonucléotide selon la revendication 10, ou d'on couple d'amorces selon la revendication 12, pour la détermination du type d'EPS produit pur une souche de S, thermophilus.
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