ES2329470T3 - Bacterias lacticas texturantes. - Google Patents
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Abstract
Cepa bacteriana láctica que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 y los ácidos nucleicos que comprenden al menos un ORF cuyo producto de traducción posee un porcentaje de restos idénticos superior o igual al 80% con al menos una de las secuencias polipeptídicas procedentes de las ORF identificadas en las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8.
Description
Bacterias lácticas texturantes.
La presente invención se refiere a cepas de
bacterias lácticas que comprenden al menos una secuencia
seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de
nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC
ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, así como a un
procedimiento de construcción de estas cepas. Por último la
invención se refiere a productos alimenticios que comprenden y/o se
elaboran con dichas cepas.
La industria alimentaria utiliza numerosas
bacterias, especialmente en forma de fermentos, en particular
bacterias lácticas, para mejorar el sabor y la textura de los
alimentos pero también para alargar la vida útil de conservación de
estos alimentos. En el caso de la industria láctea, las bacterias
lácticas se utilizan ampliamente para provocar la acidificación de
la leche (por fermentación) pero también para dar textura al
producto en el que están incorporadas.
Entre las bacterias lácticas utilizadas en la
industria alimentaria, se pueden citar los géneros Streptococcus,
Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y
Bifidobacterium.
Las bacterias lácticas de la especie
Streptococcus thermophilus se utilizan de manera extensiva
solas o en combinación con otras bacterias para la fabricación de
productos alimenticios, especialmente productos fermentados. Se
introducen en particular en la formulación de fermentos utilizados
para la fabricación de leches fermentadas, por ejemplo yogures.
Entre ellas algunas juegan un papel preponderante en la elaboración
de la textura del producto fermentado. Esta particularidad está
estrechamente relacionada con la producción de polisacáridos. Entre
las cepas de Streptococcus thermophilus pueden distinguirse
cepas texturantes y cepas no texturantes.
Se entiende por cepa de Streptococcus
thermophilus texturante una cepa que produce leches
fermentadas que tienen, en las condiciones descritas en el ejemplo,
una viscosidad superior a aproximadamente 35 Pa.s, un área
de tixotropía inferior a aproximadamente 2000 Pa/s y un umbral de
flujo inferior a aproximadamente 14 Pa. Una cepa de
Streptococcus thermophilus puede definirse como muy
texturante porque produce leches fermentadas que tienen, en las
condiciones descritas en el ejemplo, una viscosidad superior a
aproximadamente 50 Pa.s, un área de tixotropía inferior a
aproximadamente 1000 Pa/s y una umbral de flujo inferior a
aproximadamente 10 Pa.
Para responder a las exigencias industriales, se
ha hecho necesario proponer nuevas cepas de bacterias lácticas
texturantes, especialmente de Streptococcus thermophilus.
Asimismo la invención propone resolver el
problema de proporcionar una cepa de bacteria láctica que tenga
buenas propiedades de texturación para los productos
alimenticios.
Para ello la invención propone una cepa de
bacteria láctica que comprende al menos una secuencia seleccionada
entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID
Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº
6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8.
La invención propone también una nueva cepa de
Streptococcus thermophilus depositada el 26 de febrero del
2003 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el
número I-2980.
La invención se refiere también a las secuencias
de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4,
SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, así como a un
ácido nucleico que comprende al menos una de estas secuencias de
nucleótidos.
La invención se refiere también a plásmidos,
vectores de clonación y/o de expresión que comprenden al menos una
de las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº
3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8,
así como un ácido nucleico que comprende al menos una de estas
secuencias de nucleótidos.
La invención se amplia también a bacterias
hospedadoras transformadas por los plásmidos o los vectores
descritos anteriormente.
La invención se refiere también al procedimiento
de construcción de las cepas descritas anteriormente
caracterizadas porque esas cepas se obtienen por
transformación usando un plásmido o un vector que comprende al menos
una de las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC
ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID
Nº 8, o un vector que comprende un ácido nucleico que comprende al
menos una de estas secuencias de nucleótidos.
La invención propone también composiciones
bacterianas que comprenden al menos una cepa descrita anteriormente
o que comprende al menos una cepa obtenida de acuerdo con el
procedimiento de la invención.
Finalmente, la invención se refiere a una
composición alimenticia o farmacéutica que comprende al menos una
cepa de acuerdo con la invención o al menos una cepa obtenida de
acuerdo con el procedimiento de la invención o la composición
bacteriana de acuerdo con la invención.
La presente invención posee numerosas ventajas
en términos de proporcionar textura a los medios en los que se
incorpora. Especialmente permite obtener geles, a partir por ejemplo
de leches fermentadas, que son espesos, adherentes, consistentes,
fibrosos y resistentes a la mezcla y que no son granulosos.
Otras ventajas y características de la invención
serán evidentes al leer la descripción y los ejemplos proporcionados
a modo puramente ilustrativo y no limitantes que se indican más
adelante.
La invención se refiere en primer lugar a una
cepa bacteriana láctica que comprende al menos una secuencia
seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de
nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC
ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8.
Las bacterias lácticas son procariotas, gram
positivas que pertenecen al grupo taxonómico Firmicutes. Son
heterótrofas y quimiorganotrofas; generalmente anaerobias o
aerotolerantes, su metabolismo puede ser homo- o heterofermentario:
las bacterias lácticas producen esencialmente ácido láctico por
fermentación de un sustrato glucídico. Desprovistas de catalasa,
las bacterias lácticas constituyen un grupo heterogéneo de bacterias
en forma coco para los géneros Aerococcus, Enterococcus,
Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella, o en forma de
bastoncillo para los géneros Lactobacillus y
Carnobacterium. La denominación de bacteria láctica a menudo
se extiende a otras bacterias relacionadas, tales como
Bifidobacterium.
Entre las cepas de bacterias lácticas que son
apropiadas para la presente invención se pueden citar los géneros
Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus y Bifidobacterium.
La cepa de bacteria láctica preferida de acuerdo
con la invención es Streptococcus thermophilus.
Streptococcus thermophilus es una especie
presente en la leche de manera natural y ampliamente utilizada en
la industria alimentaria, y especialmente láctea ya que permite
acidificar y texturizar la leche. Es una bacteria termófila
homofermentaria.
La invención se refiere después a la cepa de
Streptococcus thermophilus depositada el 26 de febrero del
2003 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el
número 1-2980.
La invención también se refiere a las secuencias
de nucleótidos de las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID
Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8.
Las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 2 a SEC
ID Nº 8 son parte de un operón de aproximadamente 14350 pares de
bases implicado en la síntesis de polisacáridos (PS). Este operón
está incluido en la secuencia SEC ID Nº 1. Esto significa que de
acuerdo con la invención las secuencias SEC ID Nº 2 a SEC ID Nº 8
están incluidas en la secuencia SEC ID Nº 1.
De acuerdo con la invención, la estructura del
operón se ha determinado (ver figura 1). Entre los genes deoD
(cadena arriba del operón de PS) y orf14.9 (cadena abajo),
se han identificado 17 ORF (fase de lectura abierta en inglés, o
marco abierto de lectura) denominados eps13A, eps13B, eps13C,
eps13D, eps13E, eps13F, eps13G, eps13H, eps13t, eps13J, eps13K,
eps13L, eps13M, eps13N, eps13O, eps13P e IS1193. Los 16
primeros ORF situados sobre la cadena "con sentido" codifican
potencialmente polipéptidos implicados en la producción de
polisacáridos exocelulares o capsulares; el 17º ORF situado sobre la
cadena "antisentido" codifica potencialmente una transposasa
funcional que pertenece a la familia IS1193 (secuencia de
inserción).
Es posible denominar y posicionar cada ORF. A
continuación se indica la denominación de cada ORF, en segundo
lugar la supuesta función de dicha proteína y finalmente en tercer
lugar la posición de la región que comprende este ORF (con respecto
a la secuencia SEC ID Nº 1 como se indica en la lista de
secuencias):
- eps13A: Regulador transcripcional
(342..1802)
- eps13B: Polimerización (regulación de
la longitud de cadenas) y/o exportación de polisacáridos
(1803..2534)
- eps13C: Polimerización (regulación de
la longitud de cadenas) y/o exportación de polisacáridos
(2543..3235)
- eps13D: Polimerización (regulación de
la longitud de cadenas) y/o exportación de polisacáridos
(3245..3985)
- eps13E:
Undecaprenil-fosfato glicosiltransferasa
(4042..5409)
- eps13F:
Undecaprenil-fosfato glicosiltransferasa
(5611..6195)
- eps13G:
Undecaprenil-fosfato glicosiltransferasa
(6251..6634)
- eps13H:
Beta-1,4-galactosiltransferasa
(6643..7092)
- eps13I:
Beta-1,4-galactosiltransferasa
(7092..7607)
- eps13J: Rhamnosiltransferasa
(7597..8493)
- eps13K: Glicosiltransferasa
(8763..9797)
- eps13L: Polimerasa de unidad repetitiva
(9827..10969)
- eps13M: Polimerasa de unidad repetitiva
(10984..11793)
- eps13N: Glicosiltransferasa
(11844..12578)
- eps130: Glicosiltransferasa
(12633..13016)
- eps13P: Transportador transmembrana
(13049..14482)
- IS1193: Transposasa (complemento
(14614..15870)).
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La invención también se refiere a un ácido
nucleico que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el
grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC
ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID
Nº 7, SEC ID Nº 8. Por ácido nucleico que comprende al menos una de
las secuencias enumeradas anteriormente, se entiende en el sentido
de la invención los ácidos nucleicos que comprenden al menos un ORF
donde el producto de traducción posee una similitud de secuencia
importante (porcentaje de restos idénticos superior o igual al 80%,
después del alineamiento de secuencias para una correspondencia
máxima entre las posiciones de los restos) con al menos una de las
secuencias polipeptídicas deducidas de los ORF identificados en las
secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8.
Las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC
ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID
Nº 7, SEC ID Nº 8 pueden insertarse en un vector por ingeniería
genética, especialmente por técnicas de ADN recombinante
ampliamente conocidas por los especialistas en la técnica.
La invención se refiere igualmente a un vector
de clonación y/o de expresión que comprende al menos una secuencia
seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de
nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC
ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 o un ácido nucleico
como se define a continuación.
El vector preferido de acuerdo con la invención
es un plásmido. Puede tratarse de un plásmido replicativo o
integrativo.
A partir de estos vectores y/o plásmidos es
posible transformar una bacteria para incluir en ella estos vectores
y/o plásmidos. Esta transformación puede realizarse mediante la
técnica de electroporación o por conjugación, y de un manera
convencional para el especialista en la técnica.
La invención también se refiere a bacterias
hospedadoras transformadas por un plásmido o un vector como se ha
defino anteriormente.
Las bacterias transformadas son preferentemente
bacterias lácticas. En particular una bacteria láctica que puede
escogerse entre los géneros Streptococcus, Lactococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc, Pe-diococcus y
Bifidobacterium.
La cepa de bacteria láctica preferida de acuerdo
con la invención es Streptococcus thermophilus.
La invención también se refiere a un
procedimiento de construcción de una cepa o de una bacteria
hospedadora transformada de acuerdo con la invención
caracterizada porque se obtiene por transformación usando un
vector que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el
grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1,
SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC
ID Nº 7, SEC ID Nº 8 o un ácido nucleico que comprende al menos una
secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias
de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4,
SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8.
De acuerdo con el procedimiento de la invención,
el vector preferido es un plásmido.
Ventajosamente de acuerdo con el procedimiento
de la invención la transformación se produce después de una
inserción en el genoma de la cepa o de la bacteria hospedadora
transformada por al menos un evento de recombinación.
La invención también se refiere a una
composición bacteriana que comprende al menos una cepa de acuerdo
con la invención o que comprende al menos una cepa obtenida de
acuerdo con el procedimiento de la invención o que comprende al
menos una bacteria transformada de acuerdo con la invención.
Por composición bacteriana se entiende una
mezcla de diferentes cepas, especialmente un fermento o una
levadura.
Las mezclas de cepas preferidas de acuerdo con
la invención son mezclas de Streptococcus thermophilus con
otras Streptococcus thermophilus, o mezclas de
Streptococcus thermophilus con Lactobacillus
delbrueckii subesp. bulgaricus, o mezclas de
Streptococcus thermophilus con otros Lactobacillus
y/o con Bifidobacterium, o mezclas de Streptococcus
thermophilus con Lactococcus, o mezclas de
Streptococcus thermophilus con otras cepas de bacterias
lácticas y/o levaduras.
La invención también se refiere a la utilización
de una cepa de acuerdo con la invención o una cepa obtenida de
acuerdo con el procedimiento de la invención o de la composición
bacteriana de acuerdo con la invención para elaborar un producto
alimenticio o un ingrediente alimenticio.
Como producto alimenticio o ingrediente
alimenticio preferido de acuerdo con la invención puede citarse un
producto lácteo, un producto cárnico, un producto cerealista, una
bebida, una espuma o un polvo.
Del mismo modo la invención se refiere a una
composición alimenticia o farmacéutica que comprende al menos una
cepa de acuerdo con la invención o al menos una cepa obtenida según
el procedimiento de la invención o la composición bacteriana de
acuerdo con la invención.
La invención también tiene como objeto un
producto lácteo que comprende al menos una cepa de acuerdo con la
invención o al menos una cepa obtenida de acuerdo con el
procedimiento de la invención o la composición bacteriana de
acuerdo con la invención.
En el caso de la elaboración de un producto
lácteo, ésta se realizará de la manera habitual en este campo, y
especialmente por fermentación de un producto lácteo incorporando
una cepa de acuerdo con la invención.
Como producto lácteo de acuerdo con la
invención, puede citarse una leche fermentada, un yogurt, una crema
madura, un queso, queso fresco, una bebida láctea, un producto
lácteo retenido, queso fundido, crema de repostería, requesón o
leche infantil.
De preferencia, de acuerdo con la invención el
producto lácteo comprende leche de origen animal y/o vegetal.
Como leche de origen animal puede citarse la
leche de vaca, de oveja, de cabra o de búfala.
Como leche de origen vegetal puede citarse toda
sustancia fermentable de origen vegetal que puede utilizarse de
acuerdo con la invención que proviene especialmente del grano de
soja, arroz o malta.
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La figura 1 representa la estructura genética
del operón de PS de la cepa de acuerdo con la invención comparado
con el operón de PS de otras cepas de Streptococcus
thermophilus ya conocidas.
La figura 2 representa el plano factorial
1-2 del análisis de componentes principales (ACP)
obtenido a partir de datos sensoriales sobre leches fermentadas
obtenidas con las diferentes cepas el estudio.
La figura 3 representa los promedios de las
puntuaciones obtenidas sobre las descripciones de TEXTURA EN LA
CUCHARA para cada una de las cepas del estudio. Interpretación de
resultados del ensayo de Newman-Keuls: la
diferencia entre las cepas relacionadas por una misma letra no es
significativa.
La figura 4 representa los promedios de las
puntuaciones obtenidas sobre las descripciones de TEXTURA EN LA
BOCA para cada una de las fuentes del estudio. Interpretación de
resultados del ensayo de Newman-Keuls: la
diferencia entre las cepas relacionadas por una misma letra no es
significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describen ejemplos concretos
pero no limitantes de la invención.
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El fragmento de ADN que lleva el operón de PS de
la cepa Streptococcus thermophilus CNCM
I-2980 se ha obtenido por amplificación mediante
PCR (reacción en cadena de la polimerasa, en inglés) a partir del
ADN genómico extraído de dicha cepa. La amplificación se realizó
con el termociclador Mastercycler (Eppendorf) utilizando la ADN
polimerasa LA-Taq (BioWhittaker/Cambrex) y los siguientes
cebadores: 5'-GGGTGAACGTATCTCAGTAATGGG
GACTGG-3' y 5'-CCTGAGTTATGGGACGATTACTTGGCTG-3'. Las condiciones experimentales de esta amplificación son las siguientes: 14 ciclos de desnaturalización alternantes a 98ºC durante 30 segundos e hibridación-elongación a 68ºC durante 15 min., seguido de 16 ciclos de desnaturalización alternantes a 98ºC durante 30 segundos e hibridación-elongación a 68ºC durante 15 minutos con un aumento de 15 s por ciclo, y después un ciclo adicional de elongación a 72ºC durante 10 min. El producto PCR se ha secuenciado de acuerdo con un enfoque de clonación por fragmentos.
GACTGG-3' y 5'-CCTGAGTTATGGGACGATTACTTGGCTG-3'. Las condiciones experimentales de esta amplificación son las siguientes: 14 ciclos de desnaturalización alternantes a 98ºC durante 30 segundos e hibridación-elongación a 68ºC durante 15 min., seguido de 16 ciclos de desnaturalización alternantes a 98ºC durante 30 segundos e hibridación-elongación a 68ºC durante 15 minutos con un aumento de 15 s por ciclo, y después un ciclo adicional de elongación a 72ºC durante 10 min. El producto PCR se ha secuenciado de acuerdo con un enfoque de clonación por fragmentos.
La secuencia del operón de PS de la cepa
Streptococcus thermophilus CNCM 1-2980 se ha
obtenido a partir de un fragmento de ADN de aproximadamente 17100
pares de bases sintetizado por PCR en presencia de una matriz de
ADN genómica purificada de la cepa y utilizando dos cebadores
específicos de genes conservados (deoD que codifica una
purina-nucleótido fosforilasa, y orf14.9 de
función desconocida) que flanquean generalmente al operón de PS en
los Streptococcus thermophilus descritos en la bibliografía.
La secuencia comprendida entre los genes deoD y orf14.9, que
se corresponde con la secuencia SEC ID Nº 1, se proporciona en la
lista de secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 esquematiza la estructura genética
del operón de PS de la cepa CNCM I-2980 establecida
por el análisis de su secuencia nucleotídica, así como la
estructura del operón de PS de otras 7 cepas de Streptococcus
thermophilus. Para las diferentes estructuras, identificadas por
el nombre de la cepa y por el número de acceso GENBANK (entre
paréntesis), las flechas representan la posición, el tamaño y la
orientación de los genes desde el codón de inicio hasta el codón de
fin. El significado de los colores y/o motivos en el interior de
las flechas se indica en la leyenda de la figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis estructural del operón de PS de la
cepa CNCM I-2980 demuestra que posee una
organización global similar a la de los operones de PS ya conocidos
(ver figura 1): un primer ORF potencialmente implicado en la
regulación de la transcripción del operón de PS, seguido de 3 ORF
que probablemente intervienen en la regulación de la polimerización
de las unidades repetidas de PS y/o sus exportados, seguidos de 11
ORF que codifican glicosiltransferasas y una polimerasa que asegura
el ensamblaje de la unidad repetitiva, seguidas estas mismas por 1
ORF potencialmente implicado en el transporte de las unidades
repetitivas a través de la membrana plasmídica.
El entorno genético del operón de PS de la cepa
CNCM I-2980 es también similar al de otros operones
de PS conocidos, cadena arriba el ORF deoD codifica una
purina-nucleótido fosforilasa, y cadena abajo en
sentido opuesto los ORF IS1193 y orf14.9 codifican
respectivamente una transposasa (que pertenece a la familia de
secuencias de inserción IS1193, elementos genéticos móviles)
y una proteína de función desconocida.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, la comparación de secuencia realizada
entre las proteínas potencialmente codificadas por los ORF del
operón de la cepa CNCM I-2980 y las disponibles en
las bases de datos públicas (GENBANK) demuestra que el contenido
genético del operón de PS de la cepa CNCM I-2980 es
nuevo en su parte distal.
- La parte proximal del operón de PS de
Streptococcus thermophilus, y más generalmente la de los
estreptococos hasta ahora conocidos, comprende 4 ORF denominados
epsA (o cpsA, o capA, o wzg), epsB (o
cpsB, o capB, o wzh), epsC (o
cpsC, o cpaC, o wzd) y epsD (o
cpsD, o capD, o wze) en los que los productos
polipeptídicos deducidos, para cada uno de los 4 ORF, presentan
importantes similitudes de secuencia entre las cepas. A este nivel,
los productos polipeptídicos deducidos de los ORF eps13A, eps13B,
eps13C y eps13D del operón de PS de la cepa CNCM
I-2980 no difieren de los deducidos de otros
operones de PS (porcentaje de aminoácidos idénticos superior o
igual al
94%).
94%).
- Inmediatamente después de la ORF epsD,
la ORF epsE (o cpsE, o capE, o wchA)
está presente en la mayoría de los operones de PS conocidos en
Streptococcus thermophilus. En este caso también, las
similitudes de secuencia son importantes entre productos
polipeptídicos homólogos procedentes de diferentes secuencias
conocidas; el producto de traducción del ORF eps13E de la
cepa CNCM I-2980 es muy similar a sus homólogos que
provienen de otras cepas.
- La organización de los 4 ORF siguientes
(eps13F, eps13G, eps13H y eps13I) del operón de PS de
la cepa CNCM I-2980, ya descrito, es menos
frecuente entre las diferentes estructuras conocidas de operones PS
de Streptococcus thermophilus. Esta organización se ha
encontrado, a veces de manera incompleta, en las cepas IP6757
(número de acceso a GENBANK AJ289861), "tipo VII" (número de
acceso a GENBANK AF454498) y "tipo III" (número de acceso a
GENBANK AY057915).
- En la parte distal del operón, los 7 ORF
eps13J, eps13K, eps13L, eps13M, eps13N, eps130 y
eps13P son nuevos y específicos del operón de PS de la cepa
CNCM I-2980. Aunque reducida, su similitud de
secuencia a nivel proteico o en algunos casos la existencia de
motivos proteicos específicos, permite asignar una supuesta función
a los productos de estos ORF: actividad potencial de
glicosiltransferasa o polimerasa para el producto de los ORF
eps13J a eps13O, o actividad de transporte transmembrana de
PS para el producto del ORF eps13P.
Las cepas de Streptococcus thermophilus
utilizadas CNCM I-2423, CNCM I-2429,
CNCM I-2432, CNCM I-2978 y CNCM
1-2979 son cepas de colección de Rhodia Food. La
mayoría de ellas se utilizan para la elaboración industrial de
leches fermentadas o yogures y destacan por sus propiedades
texturantes. Son representativas de cepas descritas en la
bibliografía. Se han estudiado a continuación en comparación con la
cepa CNCM I-2980 y se han considerado como
representativas de cepas texturantes utilizadas actualmente en la
industria agro-alimenticia.
La cepas de Streptococcus thermophilus
RD736 y RD676 son cepas industriales de Rhodia Food reconocidas por
su débil poder texturante. No se conocen los polisacáridos que
pueden producir ni su operón de PS. Se han estudiado a continuación
en comparación con la cepa CNCM I-2980 y se han
considerado como representativas de cepas no texturantes.
La leche fermentada utilizada se obtiene
añadiendo 100 ml de leche UHT semi-descremada (Le
Petit Vendéen®) por 3% (peso/volumen) de polvo de leche descremada.
La esterilidad de la solución se obtiene mediante pasteurización a
90ºC durante 10 minutos, la temperatura se mide en el interior de la
leche. El soporte de fermentación obtenido de esta manera se
inocula con la cepa a ensayar a razón de 10E+6 ufc/ml (unidad
formadora de colonias/ml) después se incuba a 43ºC (al baño maría)
hasta obtener un pH de 4,6. El seguimiento del pH se registra de
manera continua. Las leches fermentadas obtenidas de esta manera se
colocan en una estufa ventilada a 6ºC, hasta su análisis.
Se efectuaron dos tipos de mediciones
reológicas: viscosidad y flujo. Las mediciones de viscosidad se
realizaron a 8ºC sobre leches fermentadas, después de 1, 7, 14 y 28
días de almacenaje a 6ºC. El instrumental utilizado es un
viscosímetro Brookfield® de tipo RVF (Brookfield Engineering
Laboratories, Inc.) montado sobre un pie Helipath (Brookfield
Engineering Laboratories, Inc.). El viscosímetro está equipado con
una aguja de tipo C y la velocidad de oscilación aplicada a la
aguja es 10 vueltas/minuto. Las mediciones de flujo se efectuaron a
8ºC sobre leches fermentadas, después de 14 días de almacenaje a 6ºC
y que previamente se habían mezclado. El instrumental utilizado es
un reómetro AR1000-N (TA Instrument) equipado con
cilindros co-axiales (Radio 1 = 15 mm, Radio 2 =
13,83 mm, Altura = 32 mm, Entrehierro = 2 mm). Para el segmento
ascendente, la tensión de barrido continuo aplicada varía de 0 a 60
Pa durante un tiempo de 1 minuto de acuerdo con un modo lineal.
Para el segmento descendente, la tensión de barrido continuo
aplicada varía de 60 a 0 Pa durante un tiempo de 1 minuto de
acuerdo con un modo lineal. Los valores tomados en cuenta son el
área de isotropía y el umbral de flujo; este último se calcula de
acuerdo con el modelo de Casson.
La viscosidad de la leche fermentada obtenida
con la cepa Streptococcus thermophilus CNCM
I-2980 se midió después de 1, 7, 14 y 28 días de
almacenaje a 6ºC (tabla 1). El valor de viscosidad medido después de
un día de almacenaje es de 53,3 Pa.s. Este valor varía poco en el
tiempo mostrando la estabilidad de la leche fermentada obtenida con
la cepa Streptococcus thermophilus CNCM
I-2980. Comparativamente (tabla 1), las viscosidades
medidas para las leches fermentadas elaboradas con las cepas RD736
y RD676, consideradas como de débil poder texturante, están
comprendidas entre el 26 y 30 Pa.s. Las otras cepas ensayadas
generan leches fermentadas que presentan viscosidades más débiles
que las obtenidas con la cepa CNCM I-2980. Se puede
distinguir un grupo de cepas que generan viscosidades del orden de
40 Pa.s (CNCM I-2979, CNCM I-2423 y
CNCM I-2432) y un segundo, al que pertenecen CNCM
I-2980, que generan viscosidades del orden de 50
Pa.s.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las mediciones de flujo han permitido definir
dos descriptores reológicos significativos (umbral de flujo y área
de tixotropía) para la descripción reológica de las leches
fermentadas (tabla 2). Para la leche fermentada obtenida con la
cepa CNCM I-2980, los valores promedio son de 5,89
Pa y de 488 Pa/s para, respectivamente, el umbral de flujo y el
área de tixotropía. Estos valores son significativamente diferentes
de los obtenidos para las leches fermentadas obtenidas con las
cepas consideradas como no texturantes (RD676 y RD736). Por ejemplo
para la leche fermentada obtenida con la cepa RD676, estos valores
promedio son respectivamente de 17,01 Pa y de 17083 Pa/s. En el
caso de cepas consideradas como texturantes, los valores de umbral
de flujo y área de tixotropía están mucho más próximos a los
obtenidos con la cepa CNCM I-2980, pero
significativamente superiores, mostrando una capacidad texturante
superior a la de la cepa CNCM I-2980.
Las leches fermentadas se evaluaron mediante un
análisis sensorial después de 14 días de almacenaje a 6ºC. El
análisis descriptivo cuantitativo de las leches fermentadas,
conservadas a una temperatura óptima de degustación de 12ºC, lo
realizó un jurado de 9 expertos sobre una escala lineal no
estructurada de 0 a 6 puntos. Este análisis de perfil sensorial se
duplicó con algunos días de diferencia. Los jueces, previamente
seleccionados y entrenados, efectuaron su evaluación sobre 4
descriptores de textura en la cuchara: quebradiza, resistencia a la
mezcla, fibroso, granulosidad, y sobre 4 descriptores de textura en
la boca: se funde, adherencia, espesor, consistencia. Las
diferencias sensoriales se evaluaron mediante un análisis de
varianza (denominado ANOVA) de dos factores, de modelo fijo,
seguido de un ensayo de comparación de promedio de
Newman-Keuls con un umbral alfa del 5% sobre cada
uno de los descriptores. Se puso en práctica un Análisis de
Componentes Principales (ACP) con los descriptores sensoriales como
variables y las cepas como individuos para visualizar el espacio
producido. Una Clasificación Ascendente Jerárquica (CAH) permitió
distribuir los grupos de cepas sobre el ACP. Los programas
informáticos utilizados para estos análisis estadísticos son Fizz®
(Biosystèmes), Statgraphics® y Uniwin plus®.
Los datos de la leche fermentada obtenidos con
la cepa Streptococcus thermophilus CNCM
I-2980 se compararon con los de las leches
fermentadas obtenidas con las otras fuentes de referencia. Los
valores promedio obtenidos con las diferentes cepas para los
descriptores de textura aceptados se indican en la tabla 3 y las
diferencias significativas que se obtienen de ANOVA y del ensayo de
comparación de promedios se muestran en la tabla 4 y en las figuras
3 y 4.
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Las figuras 3 y 4 muestran una representación
mediante histograma de los resultados obtenidos en la tabla 4.
Para las cepas RD676 y RD736, consideradas no
texturantes, todos los descriptores se diferencian
significativamente de otras cepas. Entre las cepas texturantes, la
cepa CNCM I-2980 se diferencia netamente y
significativamente en todos los descriptores, excepto en la
granulosidad donde no se diferencia de las cepas CNCM
I-2978 y CNCM I-2423.
El ACP permite situar las cepas en función de su
distancia en relación a los descriptores sensoriales.
El plano 1-2 del ACP en la
figura 2 representa el 97,3% del espacio producido. La componente 1
divide dos grupos de variables sensoriales. El primer grupo
constituido por las variables: resistencia a la mezcla, espesor en
la boca, consistencia en la boca, fibroso en la cuchara y adherencia
en la boca, explica la componente 1 a la derecha. El segundo grupo,
constituido por las variables: se funde en la boca, quebradizo en la
cuchara y granulosidad en la cuchara, explica la componente 1 a la
izquierda. El primer grupo de variables es
anti-correlativo con respecto al segundo grupo.
Estas variables permiten analizar las situaciones de las cepas sobre
el plano. Por otro lado, el análisis en CAH permite clasificar las
cepas en diferentes grupos que se representan en forma de círculos
indicados sobre el plano factorial 1-2.
El plano factorial divide varios grupos de cepas
que aportan propiedades de textura diferentes. A partir de estos
análisis se obtiene que las cepas RD736 y RD676 proporcionan a la
leche fermentada una textura quebradiza y granulosa en la cuchara y
que se funde en la boca. Del mismo modo, no proporcionan una textura
espesa, adherente o consistente en la boca, ni son resistentes o
fibrosas en la cuchara en comparación con otros grupos de cepas.
Proporcionan por tanto una leche fermentada no texturizada. Por el
contrario, las cepas CNCM I-2429, CNCM
I-2432 y CNCM I-2979 proporcionan
leches fermentadas medianamente texturizadas; las cepas CNCM
I-2423 y CNCM I-2978 proporcionan
leches fermentadas texturizadas, y la cepa CNCM
I-2980 proporciona una leche fermentada muy
texturizada. Este análisis demuestra que la cepa CNCM
I-2980 aporta características de textura muy
particulares en la leche fermentada en comparación con el resto de
las cepas de referencia.
La sensibilidad de una cepa a un bacteriófago se
establece por el método de placas de lisis. Se utilizaron cien
\mul de un cultivo de la cepa a ensayar y 100 \mul de una
dilución apropiada de un suero que contenía el bacteriófago a
estudiar para sembrar 5 ml de medio agar sobreenfriado (agar al 0,6%
peso/volumen) M17 suplementado con glucosa 10 mM en CaCl_{2.} La
mezcla se vierte sobre la superficie de medio agar solidificado
(agar al 1,5% peso/volumen) M17 suplementado con glucosa a 10 mM en
CaCl_{2}. Después de incubar a 42ºC durante 16 horas, la
sensibilidad de la cepa al bacteriófago se evalúa por la presencia
de placas lisis. La ausencia de placas de lisis significa que esta
cepa es resistente a los bacteriófagos ensayados. El espectro de
sensibilidad de una cepa a los bacteriófagos (denominado también
lisotipo) está constituido por el conjunto de sensibilidades y
resistencias a los bacteriófagos estudiados.
La tabla 5 mostrada a continuación define los
bacteriófagos utilizados para este estudio y su cepa de
origen/propa-
gación. Son cepas y fagos procedentes de la colección de Rhodia Food. Los bacteriófagos se seleccionaron por su poder infeccioso en las cepas texturantes de referencia.
gación. Son cepas y fagos procedentes de la colección de Rhodia Food. Los bacteriófagos se seleccionaron por su poder infeccioso en las cepas texturantes de referencia.
Para evaluar el interés industrial de la cepa
CNCM I-2980 con respecto a los problemas asociados
con los bacteriófagos, se evaluó y se comparó el lisotipo de la
cepa CNCM I-2980 con el de las cepas texturantes de
referencia. La tabla 6 muestra las sensibilidades de las cepas a
estos diferentes fagos (lisotipo) establecidas por el método de
placas de lisis. Se observa que las seis cepas del estudio tienen
lisotipos diferentes. En particular, la cepa CNCM
I-2980 presenta un lisotipo distinto al de las otras
cepas texturantes ensayadas. En efecto los fagos ensayos no han
podido infectar a la cepa CNCM I-2980.
<110> RHODIA CHIMIE
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<120> Bacterias lácticas texturantes
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<130> P 02244
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 16032
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<212> ADN
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<213> Streptococcus
thermophilus
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 906
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<212> ADN
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<213> Streptococcus
thermophilus
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1032
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<212> ADN
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<213> Streptococcus
thermophilus
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 1140
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<212> ADN
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<213> Streptococcus
thermophilus
\newpage
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 810
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<212>ADN
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<213> Streptococcus
thermophilus
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 750
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<212> ADN
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<213> Streptococcus
thermophilus
\newpage
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 435
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<212> ADN
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<213> Streptococcus
thermophilus
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 1452
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Streptococcus
thermophilus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (28)
1. Cepa bacteriana láctica que comprende al
menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las
secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC
ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 y los
ácidos nucleicos que comprenden al menos un ORF cuyo producto de
traducción posee un porcentaje de restos idénticos superior o igual
al 80% con al menos una de las secuencias polipeptídicas
procedentes de las ORF identificadas en las secuencias SEC ID Nº 1 a
SEC ID Nº 8.
2. Cepa bacteriana láctica de acuerdo con la
reivindicación 1 caracterizada porque se escoge entre los
géneros Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus y Bifidobacterium.
3. Cepa bacteriana láctica de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 caracterizada porque pertenece a la
especie Streptococcus thermophilus.
4. Cepa de Streptococcus thermophilus
depositada el 26 de febrero del 2003 en la Colección Nacional de
Cultivos de Microorganismos con el número
I-2980.
5. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº1.
6. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº2.
7. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº3.
8. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº4.
9. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº5.
10. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº6.
11. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº7.
12. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº8.
13. Ácido nucleico que comprende al menos una
secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias
de nucleótidos SEC ID Nº1, SEC ID Nº2, SEC ID Nº3, SEC ID Nº4, SEC
ID Nº5, SEC ID Nº6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº8, o un ácido nucleico
que comprende al menos un ORF en el que el producto de traducción
posee un porcentaje de restos idénticos superior o igual al 80% con
al menos una de las secuencias polipeptídicas procedentes de los
ORF identificados en las secuencias SEC ID Nº1 a SEC ID Nº8.
14. Vector de clonación y/o de expresión que
comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo
constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº1, SEC ID
Nº2, SEC ID Nº3, SEC ID Nº4, SEC ID Nº5, SEC ID Nº6, SEC ID Nº 7,
SEC ID Nº8 o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación
13.
15. Vector de acuerdo con la reivindicación 14
caracterizado porque es un plásmido.
16. Bacteria hospedadora transformada por un
vector o un plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó
15.
17. Bacteria de acuerdo con la reivindicación 16
caracterizada porque es una bacteria láctica.
18. Bacteria de acuerdo con la reivindicación 16
o 17, caracterizada porque es una bacteria láctica escogida
entre los géneros Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium.
19. Procedimiento de construcción de una cepa de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 o de una bacteria de acuerdo
con las reivindicaciones 16 a 18 caracterizado porque la cepa
o la bacteria se obtiene por transformación usando un vector que
comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo
constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº1, SEC ID
Nº2, SEC ID Nº3, SEC ID Nº4, SEC ID Nº5, SEC ID Nº6, SEC ID Nº 7,
SEC ID Nº8 o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación
13.
20. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19 caracterizado porque la transformación se
realiza después de una inserción en el genoma de la cepa o de la
bacteria por al menos un evento recombinante
21. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19 ó 20 caracterizado porque el vector es un
plásmido.
22. Composición bacteriana que comprende al
menos una cepa de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 4 o al menos
una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de las
reivindicaciones 19 a 21 o al menos una bacteria
transformada de acuerdo con las reivindicaciones 16 a 18.
23. Uso de una cepa de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 4 o de una cepa obtenida de acuerdo con el
procedimiento de las reivindicaciones 19 a 21 o de la composición
bacteriana de acuerdo con la reivindicación 22 para elaborar un
producto alimenticio o un ingrediente alimenticio.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23
caracterizado porque el producto alimenticio o ingrediente
alimentario es un producto lácteo, un producto cárnico, un producto
cereal, una bebida, una espuma o un polvo.
25. Composición alimenticia o farmacéutica que
comprende al menos la cepa de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
4 o al menos una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de
las reivindicaciones 19 a 21 o la composición bacteriana de acuerdo
con la reivindicación 22.
26. Producto lácteo que comprende al menos la
cepa de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 o al menos la cepa
obtenida de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 19 a 21 o la composición bacteriana de acuerdo con
la reivindicación 22.
27. Producto lácteo de acuerdo con la
reivindicación 26 caracterizado porque es leche fermentada,
yogur, crema madurada, queso, queso fresco, bebida láctea, producto
lácteo retenido, queso fundido, crema de repostería, requesón o
leche infantil.
28. Producto lácteo de acuerdo con las
reivindicaciones 26 o 27 caracterizado porque comprende leche
de origen animal y/o vegetal.
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