ES2329470T3 - Bacterias lacticas texturantes. - Google Patents

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Abstract

Cepa bacteriana láctica que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 y los ácidos nucleicos que comprenden al menos un ORF cuyo producto de traducción posee un porcentaje de restos idénticos superior o igual al 80% con al menos una de las secuencias polipeptídicas procedentes de las ORF identificadas en las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8.

Description

Bacterias lácticas texturantes.
La presente invención se refiere a cepas de bacterias lácticas que comprenden al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, así como a un procedimiento de construcción de estas cepas. Por último la invención se refiere a productos alimenticios que comprenden y/o se elaboran con dichas cepas.
La industria alimentaria utiliza numerosas bacterias, especialmente en forma de fermentos, en particular bacterias lácticas, para mejorar el sabor y la textura de los alimentos pero también para alargar la vida útil de conservación de estos alimentos. En el caso de la industria láctea, las bacterias lácticas se utilizan ampliamente para provocar la acidificación de la leche (por fermentación) pero también para dar textura al producto en el que están incorporadas.
Entre las bacterias lácticas utilizadas en la industria alimentaria, se pueden citar los géneros Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium.
Las bacterias lácticas de la especie Streptococcus thermophilus se utilizan de manera extensiva solas o en combinación con otras bacterias para la fabricación de productos alimenticios, especialmente productos fermentados. Se introducen en particular en la formulación de fermentos utilizados para la fabricación de leches fermentadas, por ejemplo yogures. Entre ellas algunas juegan un papel preponderante en la elaboración de la textura del producto fermentado. Esta particularidad está estrechamente relacionada con la producción de polisacáridos. Entre las cepas de Streptococcus thermophilus pueden distinguirse cepas texturantes y cepas no texturantes.
Se entiende por cepa de Streptococcus thermophilus texturante una cepa que produce leches fermentadas que tienen, en las condiciones descritas en el ejemplo, una viscosidad superior a aproximadamente 35 Pa.s, un área de tixotropía inferior a aproximadamente 2000 Pa/s y un umbral de flujo inferior a aproximadamente 14 Pa. Una cepa de Streptococcus thermophilus puede definirse como muy texturante porque produce leches fermentadas que tienen, en las condiciones descritas en el ejemplo, una viscosidad superior a aproximadamente 50 Pa.s, un área de tixotropía inferior a aproximadamente 1000 Pa/s y una umbral de flujo inferior a aproximadamente 10 Pa.
Para responder a las exigencias industriales, se ha hecho necesario proponer nuevas cepas de bacterias lácticas texturantes, especialmente de Streptococcus thermophilus.
Asimismo la invención propone resolver el problema de proporcionar una cepa de bacteria láctica que tenga buenas propiedades de texturación para los productos alimenticios.
Para ello la invención propone una cepa de bacteria láctica que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8.
La invención propone también una nueva cepa de Streptococcus thermophilus depositada el 26 de febrero del 2003 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el número I-2980.
La invención se refiere también a las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, así como a un ácido nucleico que comprende al menos una de estas secuencias de nucleótidos.
La invención se refiere también a plásmidos, vectores de clonación y/o de expresión que comprenden al menos una de las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, así como un ácido nucleico que comprende al menos una de estas secuencias de nucleótidos.
La invención se amplia también a bacterias hospedadoras transformadas por los plásmidos o los vectores descritos anteriormente.
La invención se refiere también al procedimiento de construcción de las cepas descritas anteriormente caracterizadas porque esas cepas se obtienen por transformación usando un plásmido o un vector que comprende al menos una de las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, o un vector que comprende un ácido nucleico que comprende al menos una de estas secuencias de nucleótidos.
La invención propone también composiciones bacterianas que comprenden al menos una cepa descrita anteriormente o que comprende al menos una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invención.
Finalmente, la invención se refiere a una composición alimenticia o farmacéutica que comprende al menos una cepa de acuerdo con la invención o al menos una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invención o la composición bacteriana de acuerdo con la invención.
La presente invención posee numerosas ventajas en términos de proporcionar textura a los medios en los que se incorpora. Especialmente permite obtener geles, a partir por ejemplo de leches fermentadas, que son espesos, adherentes, consistentes, fibrosos y resistentes a la mezcla y que no son granulosos.
Otras ventajas y características de la invención serán evidentes al leer la descripción y los ejemplos proporcionados a modo puramente ilustrativo y no limitantes que se indican más adelante.
La invención se refiere en primer lugar a una cepa bacteriana láctica que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8.
Las bacterias lácticas son procariotas, gram positivas que pertenecen al grupo taxonómico Firmicutes. Son heterótrofas y quimiorganotrofas; generalmente anaerobias o aerotolerantes, su metabolismo puede ser homo- o heterofermentario: las bacterias lácticas producen esencialmente ácido láctico por fermentación de un sustrato glucídico. Desprovistas de catalasa, las bacterias lácticas constituyen un grupo heterogéneo de bacterias en forma coco para los géneros Aerococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella, o en forma de bastoncillo para los géneros Lactobacillus y Carnobacterium. La denominación de bacteria láctica a menudo se extiende a otras bacterias relacionadas, tales como Bifidobacterium.
Entre las cepas de bacterias lácticas que son apropiadas para la presente invención se pueden citar los géneros Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium.
La cepa de bacteria láctica preferida de acuerdo con la invención es Streptococcus thermophilus.
Streptococcus thermophilus es una especie presente en la leche de manera natural y ampliamente utilizada en la industria alimentaria, y especialmente láctea ya que permite acidificar y texturizar la leche. Es una bacteria termófila homofermentaria.
La invención se refiere después a la cepa de Streptococcus thermophilus depositada el 26 de febrero del 2003 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el número 1-2980.
La invención también se refiere a las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8.
Las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 2 a SEC ID Nº 8 son parte de un operón de aproximadamente 14350 pares de bases implicado en la síntesis de polisacáridos (PS). Este operón está incluido en la secuencia SEC ID Nº 1. Esto significa que de acuerdo con la invención las secuencias SEC ID Nº 2 a SEC ID Nº 8 están incluidas en la secuencia SEC ID Nº 1.
De acuerdo con la invención, la estructura del operón se ha determinado (ver figura 1). Entre los genes deoD (cadena arriba del operón de PS) y orf14.9 (cadena abajo), se han identificado 17 ORF (fase de lectura abierta en inglés, o marco abierto de lectura) denominados eps13A, eps13B, eps13C, eps13D, eps13E, eps13F, eps13G, eps13H, eps13t, eps13J, eps13K, eps13L, eps13M, eps13N, eps13O, eps13P e IS1193. Los 16 primeros ORF situados sobre la cadena "con sentido" codifican potencialmente polipéptidos implicados en la producción de polisacáridos exocelulares o capsulares; el 17º ORF situado sobre la cadena "antisentido" codifica potencialmente una transposasa funcional que pertenece a la familia IS1193 (secuencia de inserción).
Es posible denominar y posicionar cada ORF. A continuación se indica la denominación de cada ORF, en segundo lugar la supuesta función de dicha proteína y finalmente en tercer lugar la posición de la región que comprende este ORF (con respecto a la secuencia SEC ID Nº 1 como se indica en la lista de secuencias):
- eps13A: Regulador transcripcional (342..1802)
- eps13B: Polimerización (regulación de la longitud de cadenas) y/o exportación de polisacáridos (1803..2534)
- eps13C: Polimerización (regulación de la longitud de cadenas) y/o exportación de polisacáridos (2543..3235)
- eps13D: Polimerización (regulación de la longitud de cadenas) y/o exportación de polisacáridos (3245..3985)
- eps13E: Undecaprenil-fosfato glicosiltransferasa (4042..5409)
- eps13F: Undecaprenil-fosfato glicosiltransferasa (5611..6195)
- eps13G: Undecaprenil-fosfato glicosiltransferasa (6251..6634)
- eps13H: Beta-1,4-galactosiltransferasa (6643..7092)
- eps13I: Beta-1,4-galactosiltransferasa (7092..7607)
- eps13J: Rhamnosiltransferasa (7597..8493)
- eps13K: Glicosiltransferasa (8763..9797)
- eps13L: Polimerasa de unidad repetitiva (9827..10969)
- eps13M: Polimerasa de unidad repetitiva (10984..11793)
- eps13N: Glicosiltransferasa (11844..12578)
- eps130: Glicosiltransferasa (12633..13016)
- eps13P: Transportador transmembrana (13049..14482)
- IS1193: Transposasa (complemento (14614..15870)).
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La invención también se refiere a un ácido nucleico que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8. Por ácido nucleico que comprende al menos una de las secuencias enumeradas anteriormente, se entiende en el sentido de la invención los ácidos nucleicos que comprenden al menos un ORF donde el producto de traducción posee una similitud de secuencia importante (porcentaje de restos idénticos superior o igual al 80%, después del alineamiento de secuencias para una correspondencia máxima entre las posiciones de los restos) con al menos una de las secuencias polipeptídicas deducidas de los ORF identificados en las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8.
Las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 pueden insertarse en un vector por ingeniería genética, especialmente por técnicas de ADN recombinante ampliamente conocidas por los especialistas en la técnica.
La invención se refiere igualmente a un vector de clonación y/o de expresión que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 o un ácido nucleico como se define a continuación.
El vector preferido de acuerdo con la invención es un plásmido. Puede tratarse de un plásmido replicativo o integrativo.
A partir de estos vectores y/o plásmidos es posible transformar una bacteria para incluir en ella estos vectores y/o plásmidos. Esta transformación puede realizarse mediante la técnica de electroporación o por conjugación, y de un manera convencional para el especialista en la técnica.
La invención también se refiere a bacterias hospedadoras transformadas por un plásmido o un vector como se ha defino anteriormente.
Las bacterias transformadas son preferentemente bacterias lácticas. En particular una bacteria láctica que puede escogerse entre los géneros Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pe-diococcus y Bifidobacterium.
La cepa de bacteria láctica preferida de acuerdo con la invención es Streptococcus thermophilus.
La invención también se refiere a un procedimiento de construcción de una cepa o de una bacteria hospedadora transformada de acuerdo con la invención caracterizada porque se obtiene por transformación usando un vector que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 o un ácido nucleico que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8.
De acuerdo con el procedimiento de la invención, el vector preferido es un plásmido.
Ventajosamente de acuerdo con el procedimiento de la invención la transformación se produce después de una inserción en el genoma de la cepa o de la bacteria hospedadora transformada por al menos un evento de recombinación.
La invención también se refiere a una composición bacteriana que comprende al menos una cepa de acuerdo con la invención o que comprende al menos una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invención o que comprende al menos una bacteria transformada de acuerdo con la invención.
Por composición bacteriana se entiende una mezcla de diferentes cepas, especialmente un fermento o una levadura.
Las mezclas de cepas preferidas de acuerdo con la invención son mezclas de Streptococcus thermophilus con otras Streptococcus thermophilus, o mezclas de Streptococcus thermophilus con Lactobacillus delbrueckii subesp. bulgaricus, o mezclas de Streptococcus thermophilus con otros Lactobacillus y/o con Bifidobacterium, o mezclas de Streptococcus thermophilus con Lactococcus, o mezclas de Streptococcus thermophilus con otras cepas de bacterias lácticas y/o levaduras.
La invención también se refiere a la utilización de una cepa de acuerdo con la invención o una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invención o de la composición bacteriana de acuerdo con la invención para elaborar un producto alimenticio o un ingrediente alimenticio.
Como producto alimenticio o ingrediente alimenticio preferido de acuerdo con la invención puede citarse un producto lácteo, un producto cárnico, un producto cerealista, una bebida, una espuma o un polvo.
Del mismo modo la invención se refiere a una composición alimenticia o farmacéutica que comprende al menos una cepa de acuerdo con la invención o al menos una cepa obtenida según el procedimiento de la invención o la composición bacteriana de acuerdo con la invención.
La invención también tiene como objeto un producto lácteo que comprende al menos una cepa de acuerdo con la invención o al menos una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invención o la composición bacteriana de acuerdo con la invención.
En el caso de la elaboración de un producto lácteo, ésta se realizará de la manera habitual en este campo, y especialmente por fermentación de un producto lácteo incorporando una cepa de acuerdo con la invención.
Como producto lácteo de acuerdo con la invención, puede citarse una leche fermentada, un yogurt, una crema madura, un queso, queso fresco, una bebida láctea, un producto lácteo retenido, queso fundido, crema de repostería, requesón o leche infantil.
De preferencia, de acuerdo con la invención el producto lácteo comprende leche de origen animal y/o vegetal.
Como leche de origen animal puede citarse la leche de vaca, de oveja, de cabra o de búfala.
Como leche de origen vegetal puede citarse toda sustancia fermentable de origen vegetal que puede utilizarse de acuerdo con la invención que proviene especialmente del grano de soja, arroz o malta.
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La figura 1 representa la estructura genética del operón de PS de la cepa de acuerdo con la invención comparado con el operón de PS de otras cepas de Streptococcus thermophilus ya conocidas.
La figura 2 representa el plano factorial 1-2 del análisis de componentes principales (ACP) obtenido a partir de datos sensoriales sobre leches fermentadas obtenidas con las diferentes cepas el estudio.
La figura 3 representa los promedios de las puntuaciones obtenidas sobre las descripciones de TEXTURA EN LA CUCHARA para cada una de las cepas del estudio. Interpretación de resultados del ensayo de Newman-Keuls: la diferencia entre las cepas relacionadas por una misma letra no es significativa.
La figura 4 representa los promedios de las puntuaciones obtenidas sobre las descripciones de TEXTURA EN LA BOCA para cada una de las fuentes del estudio. Interpretación de resultados del ensayo de Newman-Keuls: la diferencia entre las cepas relacionadas por una misma letra no es significativa.
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A continuación se describen ejemplos concretos pero no limitantes de la invención.
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Ejemplos 1/ Secuenciación del operón de PS de Streptococcus thermophilus CNCM I-2980
El fragmento de ADN que lleva el operón de PS de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980 se ha obtenido por amplificación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa, en inglés) a partir del ADN genómico extraído de dicha cepa. La amplificación se realizó con el termociclador Mastercycler (Eppendorf) utilizando la ADN polimerasa LA-Taq (BioWhittaker/Cambrex) y los siguientes cebadores: 5'-GGGTGAACGTATCTCAGTAATGGG
GACTGG-3' y 5'-CCTGAGTTATGGGACGATTACTTGGCTG-3'. Las condiciones experimentales de esta amplificación son las siguientes: 14 ciclos de desnaturalización alternantes a 98ºC durante 30 segundos e hibridación-elongación a 68ºC durante 15 min., seguido de 16 ciclos de desnaturalización alternantes a 98ºC durante 30 segundos e hibridación-elongación a 68ºC durante 15 minutos con un aumento de 15 s por ciclo, y después un ciclo adicional de elongación a 72ºC durante 10 min. El producto PCR se ha secuenciado de acuerdo con un enfoque de clonación por fragmentos.
2/ Caracterización molecular de la cepa de acuerdo con la invención comparada con cepas de Streptococcus thermophilus ya conocidas \bullet Secuencia del operón de PS
La secuencia del operón de PS de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM 1-2980 se ha obtenido a partir de un fragmento de ADN de aproximadamente 17100 pares de bases sintetizado por PCR en presencia de una matriz de ADN genómica purificada de la cepa y utilizando dos cebadores específicos de genes conservados (deoD que codifica una purina-nucleótido fosforilasa, y orf14.9 de función desconocida) que flanquean generalmente al operón de PS en los Streptococcus thermophilus descritos en la bibliografía. La secuencia comprendida entre los genes deoD y orf14.9, que se corresponde con la secuencia SEC ID Nº 1, se proporciona en la lista de secuencias.
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\bullet Organización genética del operón de PS
La figura 1 esquematiza la estructura genética del operón de PS de la cepa CNCM I-2980 establecida por el análisis de su secuencia nucleotídica, así como la estructura del operón de PS de otras 7 cepas de Streptococcus thermophilus. Para las diferentes estructuras, identificadas por el nombre de la cepa y por el número de acceso GENBANK (entre paréntesis), las flechas representan la posición, el tamaño y la orientación de los genes desde el codón de inicio hasta el codón de fin. El significado de los colores y/o motivos en el interior de las flechas se indica en la leyenda de la figura 1.
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\bullet Comparación con la bibliografía
El análisis estructural del operón de PS de la cepa CNCM I-2980 demuestra que posee una organización global similar a la de los operones de PS ya conocidos (ver figura 1): un primer ORF potencialmente implicado en la regulación de la transcripción del operón de PS, seguido de 3 ORF que probablemente intervienen en la regulación de la polimerización de las unidades repetidas de PS y/o sus exportados, seguidos de 11 ORF que codifican glicosiltransferasas y una polimerasa que asegura el ensamblaje de la unidad repetitiva, seguidas estas mismas por 1 ORF potencialmente implicado en el transporte de las unidades repetitivas a través de la membrana plasmídica.
El entorno genético del operón de PS de la cepa CNCM I-2980 es también similar al de otros operones de PS conocidos, cadena arriba el ORF deoD codifica una purina-nucleótido fosforilasa, y cadena abajo en sentido opuesto los ORF IS1193 y orf14.9 codifican respectivamente una transposasa (que pertenece a la familia de secuencias de inserción IS1193, elementos genéticos móviles) y una proteína de función desconocida.
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Por tanto, la comparación de secuencia realizada entre las proteínas potencialmente codificadas por los ORF del operón de la cepa CNCM I-2980 y las disponibles en las bases de datos públicas (GENBANK) demuestra que el contenido genético del operón de PS de la cepa CNCM I-2980 es nuevo en su parte distal.
- La parte proximal del operón de PS de Streptococcus thermophilus, y más generalmente la de los estreptococos hasta ahora conocidos, comprende 4 ORF denominados epsA (o cpsA, o capA, o wzg), epsB (o cpsB, o capB, o wzh), epsC (o cpsC, o cpaC, o wzd) y epsD (o cpsD, o capD, o wze) en los que los productos polipeptídicos deducidos, para cada uno de los 4 ORF, presentan importantes similitudes de secuencia entre las cepas. A este nivel, los productos polipeptídicos deducidos de los ORF eps13A, eps13B, eps13C y eps13D del operón de PS de la cepa CNCM I-2980 no difieren de los deducidos de otros operones de PS (porcentaje de aminoácidos idénticos superior o igual al
94%).
- Inmediatamente después de la ORF epsD, la ORF epsE (o cpsE, o capE, o wchA) está presente en la mayoría de los operones de PS conocidos en Streptococcus thermophilus. En este caso también, las similitudes de secuencia son importantes entre productos polipeptídicos homólogos procedentes de diferentes secuencias conocidas; el producto de traducción del ORF eps13E de la cepa CNCM I-2980 es muy similar a sus homólogos que provienen de otras cepas.
- La organización de los 4 ORF siguientes (eps13F, eps13G, eps13H y eps13I) del operón de PS de la cepa CNCM I-2980, ya descrito, es menos frecuente entre las diferentes estructuras conocidas de operones PS de Streptococcus thermophilus. Esta organización se ha encontrado, a veces de manera incompleta, en las cepas IP6757 (número de acceso a GENBANK AJ289861), "tipo VII" (número de acceso a GENBANK AF454498) y "tipo III" (número de acceso a GENBANK AY057915).
- En la parte distal del operón, los 7 ORF eps13J, eps13K, eps13L, eps13M, eps13N, eps130 y eps13P son nuevos y específicos del operón de PS de la cepa CNCM I-2980. Aunque reducida, su similitud de secuencia a nivel proteico o en algunos casos la existencia de motivos proteicos específicos, permite asignar una supuesta función a los productos de estos ORF: actividad potencial de glicosiltransferasa o polimerasa para el producto de los ORF eps13J a eps13O, o actividad de transporte transmembrana de PS para el producto del ORF eps13P.
3/ Ensayo de reología comparado de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980
Las cepas de Streptococcus thermophilus utilizadas CNCM I-2423, CNCM I-2429, CNCM I-2432, CNCM I-2978 y CNCM 1-2979 son cepas de colección de Rhodia Food. La mayoría de ellas se utilizan para la elaboración industrial de leches fermentadas o yogures y destacan por sus propiedades texturantes. Son representativas de cepas descritas en la bibliografía. Se han estudiado a continuación en comparación con la cepa CNCM I-2980 y se han considerado como representativas de cepas texturantes utilizadas actualmente en la industria agro-alimenticia.
La cepas de Streptococcus thermophilus RD736 y RD676 son cepas industriales de Rhodia Food reconocidas por su débil poder texturante. No se conocen los polisacáridos que pueden producir ni su operón de PS. Se han estudiado a continuación en comparación con la cepa CNCM I-2980 y se han considerado como representativas de cepas no texturantes.
La leche fermentada utilizada se obtiene añadiendo 100 ml de leche UHT semi-descremada (Le Petit Vendéen®) por 3% (peso/volumen) de polvo de leche descremada. La esterilidad de la solución se obtiene mediante pasteurización a 90ºC durante 10 minutos, la temperatura se mide en el interior de la leche. El soporte de fermentación obtenido de esta manera se inocula con la cepa a ensayar a razón de 10E+6 ufc/ml (unidad formadora de colonias/ml) después se incuba a 43ºC (al baño maría) hasta obtener un pH de 4,6. El seguimiento del pH se registra de manera continua. Las leches fermentadas obtenidas de esta manera se colocan en una estufa ventilada a 6ºC, hasta su análisis.
Se efectuaron dos tipos de mediciones reológicas: viscosidad y flujo. Las mediciones de viscosidad se realizaron a 8ºC sobre leches fermentadas, después de 1, 7, 14 y 28 días de almacenaje a 6ºC. El instrumental utilizado es un viscosímetro Brookfield® de tipo RVF (Brookfield Engineering Laboratories, Inc.) montado sobre un pie Helipath (Brookfield Engineering Laboratories, Inc.). El viscosímetro está equipado con una aguja de tipo C y la velocidad de oscilación aplicada a la aguja es 10 vueltas/minuto. Las mediciones de flujo se efectuaron a 8ºC sobre leches fermentadas, después de 14 días de almacenaje a 6ºC y que previamente se habían mezclado. El instrumental utilizado es un reómetro AR1000-N (TA Instrument) equipado con cilindros co-axiales (Radio 1 = 15 mm, Radio 2 = 13,83 mm, Altura = 32 mm, Entrehierro = 2 mm). Para el segmento ascendente, la tensión de barrido continuo aplicada varía de 0 a 60 Pa durante un tiempo de 1 minuto de acuerdo con un modo lineal. Para el segmento descendente, la tensión de barrido continuo aplicada varía de 60 a 0 Pa durante un tiempo de 1 minuto de acuerdo con un modo lineal. Los valores tomados en cuenta son el área de isotropía y el umbral de flujo; este último se calcula de acuerdo con el modelo de Casson.
La viscosidad de la leche fermentada obtenida con la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980 se midió después de 1, 7, 14 y 28 días de almacenaje a 6ºC (tabla 1). El valor de viscosidad medido después de un día de almacenaje es de 53,3 Pa.s. Este valor varía poco en el tiempo mostrando la estabilidad de la leche fermentada obtenida con la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980. Comparativamente (tabla 1), las viscosidades medidas para las leches fermentadas elaboradas con las cepas RD736 y RD676, consideradas como de débil poder texturante, están comprendidas entre el 26 y 30 Pa.s. Las otras cepas ensayadas generan leches fermentadas que presentan viscosidades más débiles que las obtenidas con la cepa CNCM I-2980. Se puede distinguir un grupo de cepas que generan viscosidades del orden de 40 Pa.s (CNCM I-2979, CNCM I-2423 y CNCM I-2432) y un segundo, al que pertenecen CNCM I-2980, que generan viscosidades del orden de 50 Pa.s.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Viscosidad y pH de las leches fermentadas obtenidas con las diferentes cepas ensayadas, después de diferentes tiempos de almacenaje a 6ºC
1
Las mediciones de flujo han permitido definir dos descriptores reológicos significativos (umbral de flujo y área de tixotropía) para la descripción reológica de las leches fermentadas (tabla 2). Para la leche fermentada obtenida con la cepa CNCM I-2980, los valores promedio son de 5,89 Pa y de 488 Pa/s para, respectivamente, el umbral de flujo y el área de tixotropía. Estos valores son significativamente diferentes de los obtenidos para las leches fermentadas obtenidas con las cepas consideradas como no texturantes (RD676 y RD736). Por ejemplo para la leche fermentada obtenida con la cepa RD676, estos valores promedio son respectivamente de 17,01 Pa y de 17083 Pa/s. En el caso de cepas consideradas como texturantes, los valores de umbral de flujo y área de tixotropía están mucho más próximos a los obtenidos con la cepa CNCM I-2980, pero significativamente superiores, mostrando una capacidad texturante superior a la de la cepa CNCM I-2980.
TABLA 2 Valores del umbral de flujo y del área de tixotropía (promedio de tres repeticiones) medidos usando el equipo AR1000-N de leches fermentadas obtenidas con las diferentes cepas ensayadas después de 14 días de almacenaje a 6ºC
2
4/ Caracterización sensorial de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980, comparación con las cepas de referencia
Las leches fermentadas se evaluaron mediante un análisis sensorial después de 14 días de almacenaje a 6ºC. El análisis descriptivo cuantitativo de las leches fermentadas, conservadas a una temperatura óptima de degustación de 12ºC, lo realizó un jurado de 9 expertos sobre una escala lineal no estructurada de 0 a 6 puntos. Este análisis de perfil sensorial se duplicó con algunos días de diferencia. Los jueces, previamente seleccionados y entrenados, efectuaron su evaluación sobre 4 descriptores de textura en la cuchara: quebradiza, resistencia a la mezcla, fibroso, granulosidad, y sobre 4 descriptores de textura en la boca: se funde, adherencia, espesor, consistencia. Las diferencias sensoriales se evaluaron mediante un análisis de varianza (denominado ANOVA) de dos factores, de modelo fijo, seguido de un ensayo de comparación de promedio de Newman-Keuls con un umbral alfa del 5% sobre cada uno de los descriptores. Se puso en práctica un Análisis de Componentes Principales (ACP) con los descriptores sensoriales como variables y las cepas como individuos para visualizar el espacio producido. Una Clasificación Ascendente Jerárquica (CAH) permitió distribuir los grupos de cepas sobre el ACP. Los programas informáticos utilizados para estos análisis estadísticos son Fizz® (Biosystèmes), Statgraphics® y Uniwin plus®.
Los datos de la leche fermentada obtenidos con la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980 se compararon con los de las leches fermentadas obtenidas con las otras fuentes de referencia. Los valores promedio obtenidos con las diferentes cepas para los descriptores de textura aceptados se indican en la tabla 3 y las diferencias significativas que se obtienen de ANOVA y del ensayo de comparación de promedios se muestran en la tabla 4 y en las figuras 3 y 4.
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TABLA 3 Promedio de las puntuaciones atribuidas por el jurado de análisis sensorial para las leches fermentadas obtenidas con las diferentes cepas del estudio sobre los descriptores de textura 
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3
TABLA 4 Comparación de promedios sobre cada descriptor de textura en la cuchara y de textura en la boca mediante el ensayo Newman-Keuls al 5%. Interpretación de los resultados: la diferencia entre las cepas relacionadas con una misma letra no es significativa
4
Las figuras 3 y 4 muestran una representación mediante histograma de los resultados obtenidos en la tabla 4.
Para las cepas RD676 y RD736, consideradas no texturantes, todos los descriptores se diferencian significativamente de otras cepas. Entre las cepas texturantes, la cepa CNCM I-2980 se diferencia netamente y significativamente en todos los descriptores, excepto en la granulosidad donde no se diferencia de las cepas CNCM I-2978 y CNCM I-2423.
El ACP permite situar las cepas en función de su distancia en relación a los descriptores sensoriales.
El plano 1-2 del ACP en la figura 2 representa el 97,3% del espacio producido. La componente 1 divide dos grupos de variables sensoriales. El primer grupo constituido por las variables: resistencia a la mezcla, espesor en la boca, consistencia en la boca, fibroso en la cuchara y adherencia en la boca, explica la componente 1 a la derecha. El segundo grupo, constituido por las variables: se funde en la boca, quebradizo en la cuchara y granulosidad en la cuchara, explica la componente 1 a la izquierda. El primer grupo de variables es anti-correlativo con respecto al segundo grupo. Estas variables permiten analizar las situaciones de las cepas sobre el plano. Por otro lado, el análisis en CAH permite clasificar las cepas en diferentes grupos que se representan en forma de círculos indicados sobre el plano factorial 1-2.
El plano factorial divide varios grupos de cepas que aportan propiedades de textura diferentes. A partir de estos análisis se obtiene que las cepas RD736 y RD676 proporcionan a la leche fermentada una textura quebradiza y granulosa en la cuchara y que se funde en la boca. Del mismo modo, no proporcionan una textura espesa, adherente o consistente en la boca, ni son resistentes o fibrosas en la cuchara en comparación con otros grupos de cepas. Proporcionan por tanto una leche fermentada no texturizada. Por el contrario, las cepas CNCM I-2429, CNCM I-2432 y CNCM I-2979 proporcionan leches fermentadas medianamente texturizadas; las cepas CNCM I-2423 y CNCM I-2978 proporcionan leches fermentadas texturizadas, y la cepa CNCM I-2980 proporciona una leche fermentada muy texturizada. Este análisis demuestra que la cepa CNCM I-2980 aporta características de textura muy particulares en la leche fermentada en comparación con el resto de las cepas de referencia.
5/ Ensayo comparativo de resistencia a fagos de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980
La sensibilidad de una cepa a un bacteriófago se establece por el método de placas de lisis. Se utilizaron cien \mul de un cultivo de la cepa a ensayar y 100 \mul de una dilución apropiada de un suero que contenía el bacteriófago a estudiar para sembrar 5 ml de medio agar sobreenfriado (agar al 0,6% peso/volumen) M17 suplementado con glucosa 10 mM en CaCl_{2.} La mezcla se vierte sobre la superficie de medio agar solidificado (agar al 1,5% peso/volumen) M17 suplementado con glucosa a 10 mM en CaCl_{2}. Después de incubar a 42ºC durante 16 horas, la sensibilidad de la cepa al bacteriófago se evalúa por la presencia de placas lisis. La ausencia de placas de lisis significa que esta cepa es resistente a los bacteriófagos ensayados. El espectro de sensibilidad de una cepa a los bacteriófagos (denominado también lisotipo) está constituido por el conjunto de sensibilidades y resistencias a los bacteriófagos estudiados.
La tabla 5 mostrada a continuación define los bacteriófagos utilizados para este estudio y su cepa de origen/propa-
gación. Son cepas y fagos procedentes de la colección de Rhodia Food. Los bacteriófagos se seleccionaron por su poder infeccioso en las cepas texturantes de referencia.
TABLA 5 Fagos
6
Para evaluar el interés industrial de la cepa CNCM I-2980 con respecto a los problemas asociados con los bacteriófagos, se evaluó y se comparó el lisotipo de la cepa CNCM I-2980 con el de las cepas texturantes de referencia. La tabla 6 muestra las sensibilidades de las cepas a estos diferentes fagos (lisotipo) establecidas por el método de placas de lisis. Se observa que las seis cepas del estudio tienen lisotipos diferentes. En particular, la cepa CNCM I-2980 presenta un lisotipo distinto al de las otras cepas texturantes ensayadas. En efecto los fagos ensayos no han podido infectar a la cepa CNCM I-2980.
TABLA 6 Lisotipo de cepas ensayadas
8
<110> RHODIA CHIMIE
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<120> Bacterias lácticas texturantes
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<130> P 02244
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<160> 8
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 16032
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<212> ADN
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<213> Streptococcus thermophilus 
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<400> 1
9
10
11
12
13 
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<210> 2
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<211> 906
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<212> ADN
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<213> Streptococcus thermophilus 
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<400> 2
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14 
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<210> 3
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<211> 1032
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<212> ADN
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<213> Streptococcus thermophilus 
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<400> 3
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15 
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<210> 4
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<211> 1140
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<212> ADN
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<213> Streptococcus thermophilus 
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<400> 4
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16 
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<210> 5
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<211> 810
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<212>ADN
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<213> Streptococcus thermophilus 
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<400> 5
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17 
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<210> 6
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<211> 750
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<212> ADN
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<213> Streptococcus thermophilus 
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<400> 6
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18 
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<210> 7
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<211> 435
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<212> ADN
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<213> Streptococcus thermophilus 
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<400> 7
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19 
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<210> 8
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<211> 1452
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<212> ADN
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<213> Streptococcus thermophilus 
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<400> 8
20

Claims (28)

1. Cepa bacteriana láctica que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 y los ácidos nucleicos que comprenden al menos un ORF cuyo producto de traducción posee un porcentaje de restos idénticos superior o igual al 80% con al menos una de las secuencias polipeptídicas procedentes de las ORF identificadas en las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8.
2. Cepa bacteriana láctica de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque se escoge entre los géneros Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium.
3. Cepa bacteriana láctica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 caracterizada porque pertenece a la especie Streptococcus thermophilus.
4. Cepa de Streptococcus thermophilus depositada el 26 de febrero del 2003 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el número I-2980.
5. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº1.
6. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº2.
7. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº3.
8. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº4.
9. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº5.
10. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº6.
11. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº7.
12. Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº8.
13. Ácido nucleico que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº1, SEC ID Nº2, SEC ID Nº3, SEC ID Nº4, SEC ID Nº5, SEC ID Nº6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº8, o un ácido nucleico que comprende al menos un ORF en el que el producto de traducción posee un porcentaje de restos idénticos superior o igual al 80% con al menos una de las secuencias polipeptídicas procedentes de los ORF identificados en las secuencias SEC ID Nº1 a SEC ID Nº8.
14. Vector de clonación y/o de expresión que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº1, SEC ID Nº2, SEC ID Nº3, SEC ID Nº4, SEC ID Nº5, SEC ID Nº6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº8 o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13.
15. Vector de acuerdo con la reivindicación 14 caracterizado porque es un plásmido.
16. Bacteria hospedadora transformada por un vector o un plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 15.
17. Bacteria de acuerdo con la reivindicación 16 caracterizada porque es una bacteria láctica.
18. Bacteria de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque es una bacteria láctica escogida entre los géneros Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium.
19. Procedimiento de construcción de una cepa de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 o de una bacteria de acuerdo con las reivindicaciones 16 a 18 caracterizado porque la cepa o la bacteria se obtiene por transformación usando un vector que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº1, SEC ID Nº2, SEC ID Nº3, SEC ID Nº4, SEC ID Nº5, SEC ID Nº6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº8 o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13.
20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 caracterizado porque la transformación se realiza después de una inserción en el genoma de la cepa o de la bacteria por al menos un evento recombinante
21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20 caracterizado porque el vector es un plásmido.
22. Composición bacteriana que comprende al menos una cepa de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 4 o al menos una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de las reivindicaciones 19 a 21 o al menos una bacteria transformada de acuerdo con las reivindicaciones 16 a 18.
23. Uso de una cepa de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 o de una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de las reivindicaciones 19 a 21 o de la composición bacteriana de acuerdo con la reivindicación 22 para elaborar un producto alimenticio o un ingrediente alimenticio.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23 caracterizado porque el producto alimenticio o ingrediente alimentario es un producto lácteo, un producto cárnico, un producto cereal, una bebida, una espuma o un polvo.
25. Composición alimenticia o farmacéutica que comprende al menos la cepa de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 o al menos una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de las reivindicaciones 19 a 21 o la composición bacteriana de acuerdo con la reivindicación 22.
26. Producto lácteo que comprende al menos la cepa de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 o al menos la cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 19 a 21 o la composición bacteriana de acuerdo con la reivindicación 22.
27. Producto lácteo de acuerdo con la reivindicación 26 caracterizado porque es leche fermentada, yogur, crema madurada, queso, queso fresco, bebida láctea, producto lácteo retenido, queso fundido, crema de repostería, requesón o leche infantil.
28. Producto lácteo de acuerdo con las reivindicaciones 26 o 27 caracterizado porque comprende leche de origen animal y/o vegetal.
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