CN1761752A - 组织形成乳酸细菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的乳酸细菌菌株，其包含选自由核苷酸序列SEQID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列，以及涉及生产所述菌株的方法。本发明也涉及SEQ ID Nos.1－8的序列以及包含所述序列的核酸、载体和质粒。本发明还涉及食品，特别是含有所述菌株的奶制品。

Description

组织形成乳酸细菌
技术领域
本发明的主题是包含选自由核苷酸序列 SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列的乳酸细菌菌株，以及构建这些菌株的方法。最后，本发明涉及包含所述菌株和/或由所述菌株生产的食品。
背景技术
食品工业使用很多细菌，尤其是在发酵形式下，尤其是乳酸细菌，为了改善食品味道和质地，和为了延长这些食品的贮存期限。在乳制品工业中，充分使用乳酸细菌，为了致使牛奶酸化(通过发酵)，和为了使掺入它们的产品达到一定稠度。
在食品工业中使用的乳酸细菌当中，可以提及链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、小球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)种的乳酸细菌被广泛地单独或与其它细菌联合使用生产食品，尤其是发酵产品。它们尤其用于用来生产发酵乳的发酵制剂中，例如酸奶。它们中的某些在发酵产品的质地发展中起着主要作用。这个特征与多糖的生产息息相关。在嗜热链球菌菌株当中，有可能区分组织形成和非组织形成菌株。
嗜热链球菌的组织形成菌株意思是在如实施例所述条件下，产生粘度大于大约35Pa.s、触变域小于大约2000Pa/s和屈服点小于大约14Pa的发酵乳的菌株。嗜热链球菌菌株可以定义为强烈组织形成，因为在如实施例所述条件下，它产生粘度大于大约50Pa.s、触变域小于大约1000Pa/s和屈服点小于大约10Pa的发酵乳。
发明内容
为了满足工业需要，提出乳酸细菌，尤其是嗜热链球菌的新的组织形成菌株变得必需。
因此，本发明提出解决的问题是提供具有好的组织形成食品性能的乳酸细菌菌株。
为此目的，本发明提出了包含选自由核苷酸序列 SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列的乳酸细菌菌株。
本发明也提出了2003年2月26日保藏在国立微生物保藏中心，保藏号为I-2980的新的嗜热链球菌菌株。
核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8，以及包含这些核苷酸序列中至少一个的核酸也是本发明的主题。
包含核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8中的至少一个的质粒、克隆和/或表达载体，以及包含这些核苷酸序列中至少一个的核酸也是本发明的另一主题。
本发明也提供由上述质粒或载体转化的宿主细菌。
本发明还涉及构建上述菌株的方法，其特征在于这些菌株是通过使用包含核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8中至少一个的质粒或载体，或包含这些核苷酸序列中至少一个的核酸的载体转化获得的。
本发明还提出了包含上述至少一个菌株或包含根据本发明方法获得的至少一个菌株的细菌组合物。
最后，本发明涉及包含根据本发明的至少一个菌株或根据本发明方法获得的至少一个菌株或细菌组合物的食品或药物组合物。
本发明在将介质组织形成方面具有很多优点。尤其是，它使从例如发酵乳获得凝胶成为可能，该凝胶浓稠、粘稠、有涂布性、有粘性和耐搅拌并且不是粒状的。
阅读下列说明书和纯粹为例证而给出的非限制性实施例后，本发明的其它优点和特征将变得显而易见。
本发明首先涉及包含选自由核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列的乳酸细菌菌株。
该乳酸细菌是革兰氏阳性原核生物，属于厚壁菌门分类群。它们是异养的和亲化学器官的；一般是厌氧的或耐氧的，它们的新陈代谢可以是同型或异型发酵；该乳酸细菌基本上通过glucidic底物发酵产生乳酸。缺少过氧化氢酶，该乳酸细菌组成气球菌属(Aerococcus)、肠球菌(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、小球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)的球菌形式，或乳杆菌属(Lactobacillus)和肉杆菌属(Carnobacterium)的棒状形式的细菌异种群。该名称乳酸细菌常常延至其它相关细菌，如双歧杆菌属(Bifidobacterium)。
在适于本发明的乳酸细菌菌株当中，可以提及链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、小球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。
根据本发明优选的乳酸细菌菌株是嗜热链球菌。
嗜热链球菌是天然存在于牛奶中的种并广泛用于食品中，尤其是乳业，因为它使牛奶变酸和达到一定稠度成为可能。它是同型发酵嗜热菌。
然后，本发明涉及2003年2月26日保藏在国立微生物保藏中心，保藏号为I-2980的嗜热链球菌菌株。
核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8也是本发明的主题。
核苷酸序列SEQ ID No.2至SEQ ID No.8形成参与多糖(PS)合成的大约14,350个碱基对的操纵子的一部分。这个操纵子包括在序列SEQ IDNo.1中。这意思是根据本发明，序列SEQ ID No.2至SEQ ID No.8包括在序列SEQ ID No.1中。
已经确定了根据本发明的操纵子结构(参见图1)。在deoD(操纵子PS的上游)和orf14.9(下游)基因之间，已经鉴定了称作eps13A、eps13B、eps13C、eps13D、eps13E、eps13F、eps13G、eps13H、eps13I、eps13J、eps13K、eps13L、eps13M、eps13N、eps13O、eps13P和IS1193的17个ORFs(开放阅读框)。位于“正义”链上的前16个ORFs可能编码参与生产胞外或荚膜多糖的多肽；位于“反义”链上的第17个ORF可能编码属于IS1193家族的功能转座酶(插入序列)。
有可能对每一ORF进行命名和定位它。下面给出每一ORF的名称，然后其次是推定的衍生蛋白的功能，和最后，第三是包含这个ORF的区域的位置(与如序列表表示的序列SEQ ID No.1有关)：
-      eps13A：   转录调节子 (342..1802)
-      eps13B：   多糖的聚合(链长调节)和/或输出(1803..2534)
-      eps13C：   多糖的聚合(链长调节)和/或输出(2543..3235)
-      eps13D：   多糖的聚合(链长调节)和/或输出(3245..3985)
-      eps13E：   Undecaprenyl-磷酸盐糖基转移酶(4042..5409)
-      eps13F：   Undecaprenyl-磷酸盐糖基转移酶(5611..6195)
-      eps13G：   Undecaprenyl-磷酸盐糖基转移酶(6251..6634)
-      eps13H：   β-1，4-半乳糖基转移酶(6643..7092)
-      eps13I：   β-1，4-半乳糖基转移酶(7092..7607)
-      eps13J：   鼠李糖基转移酶(7597..8493)
-      eps13K：   糖基转移酶(8763 9797)
-      eps13L：   重复单位聚合酶(9827..10969)
-      eps13M：   重复单位聚合酶(10984..11793)
-      eps13N：   糖基转移酶(11844..12578)
-      eps13O：   糖基转移酶(12633..13016)
-      eps13P：   跨膜转运蛋白(13049..14482)
-      IS1193：   转座酶(互补物(14614..15870))
本发明还涉及包含选自由核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8组成的组的至少一个序列的核酸。在本发明的意思中，包含上面所列序列中至少一个的核酸的意思是包含至少一个ORF的核酸，该ORF的翻译产物与序列SEQ ID No.1至SEQ ID No.8中鉴定的ORFs所得到的至少一个多肽序列具有显著的序列相似性(残基位置之间最大一致序列的比对后，相同残基大于或等于80％的百分比)。
核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8可以通过基因工程插入载体，尤其是通过本领域技术人员普遍认识的重组DNA技术。
本发明还涉及包含选自核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8组成的组的至少一个序列或如上定义的核酸的克隆和/或表达载体。
根据本发明的优选载体是质粒。它可以是复制型或整合型质粒。
从这些载体和/或质粒开始，为了将这些载体和/或质粒包括入细菌中，有可能转化细菌。可以通过电穿孔法或通过结合技术以对本领域技术人员来说的标准方式进行这种转化。
本发明也涉及由上面定义的质粒或载体转化的宿主细菌。
优选，转化的细菌是乳酸细菌。尤其是，它们是选自链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、小球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的乳酸细菌。
根据本发明优选的乳酸细菌菌株是嗜热链球菌。
本发明还涉及构建根据本发明的菌株或转化的宿主细菌的方法，其特征在于它们是通过使用包含选自核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列的载体，或包含选自核苷酸序列SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列的核酸的载体转化获得的。
根据本发明的方法，优选载体是质粒。
有利地，根据本发明的方法，转化之后是通过至少一个重组结果插入到菌株或宿主细菌的基因组。
本发明还涉及包含根据本发明的至少一个菌株或包含根据本发明方法获得的至少一个菌株或包含根据本发明转化的至少一个细菌的细菌组合物。
细菌组合物的意思是不同菌株的混合物，尤其是发酵物，或发酵剂。
根据本发明优选菌株的混合物是嗜热链球菌与其它嗜热链球菌的混合物，或嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种的混合物，或嗜热链球菌与其它乳杆菌和/或与双歧杆菌的混合物，或嗜热链球菌与乳球菌的混合物，或嗜热链球菌与乳酸细菌的其它菌株和/或酵母的混合物。
本发明还涉及根据本发明的菌株或根据本发明方法获得的菌株或根据本发明的细菌组合物为生产食品或食品成分的用途。
作为根据本发明的优选食品或食品成分，可以提及乳制品、肉制品、谷类制品、饮料、起泡剂或粉剂。
本发明还涉及包含根据本发明的至少一个菌株或根据本发明方法获得的至少一个菌株或根据本发明的细菌组合物的食品或药物组合物。
包含根据本发明的至少一个菌株或根据本发明方法获得的至少一个菌株或根据本发明的细菌组合物的乳制品也是本发明的主题。
在生产乳制品的情况下，后者以这个领域通常的方式进行，和尤其是通过掺入根据本发明的菌株进行乳制品的发酵。
作为根据本发明的乳制品可以提及发酵乳、酸奶、成熟奶油、乳酪、清爽干酪、乳制饮料、乳制品截留物、融化干酪、奶油甜点、酪农干酪或婴儿奶。
优选根据本发明的乳制品包含动物和/或植物来源的奶。
作为动物来源的奶，可以提及母牛、母羊、山羊或水牛的奶。
作为植物来源的奶，可以提及根据本发明可以使用的植物来源的任何可发酵物质，尤其是来源于大豆种子、大米或麦芽。
附图说明
图1表示与其它已经知道的嗜热链球菌菌株的PS操纵子相比，根据本发明菌株的PS操纵子的基因结构。
图2表示由本研究的不同菌株得到的发酵乳的感觉数据获得的主要成分分析(PCA)的析因设计1-2。
图3表示对于本研究的每一菌株匙上质地的描述信息获得得分的平均值。Newman-Keuls检验结果的解释：相同字母相关的菌株之间的差异不显著。
图4表示对于本研究的每一菌株口中质地的描述信息获得得分的平均值。Newman-Keuls检验结果的解释：相同字母相关的菌株之间的差异不显著。
具体实施方式
现在将描述具体但是非限制性的实施例。
实施例
1/嗜热链球菌CNCM I-2980的PS操纵子的序列
携带嗜热链球菌菌株CNCM I-2980的PS操纵子的DNA片段通过PCR(聚合酶链式反应)扩增所述菌株提取的基因组DNA获得。用Mastercycler热循环仪(Eppendorf)，使用LA-Tag DNA聚合酶(BioWhittaker/Cambrex)和下列引物：5’-GGGTGAACGTATCTCAGTAATGGGGACTGG-3’和5’-CCTGAGTTATGCGACGATTACTTGGCTG-3’进行扩增。这个扩增的实验条件是下列：14个循环交替的98℃变性30秒和68℃杂交延伸15分钟，然后16个循环交替的98℃变性30秒和68℃杂交延伸15分钟，每个循环增加15秒，然后72℃另外延伸循环10分钟。根据片段克隆方法对PCR产物测序。
2/与已经知道的嗜热链球菌菌株相比，根据本发明菌株的表征
·PS操纵子的序列
嗜热链球菌菌株CNCM I-2980的PS操纵子的序列是在该菌株的纯化基因组DNA模板存在下，使用文献中描述的通常构架嗜热链球菌中PS操纵子的保守基因(编码嘌呤核苷酸磷酸化酶的deoD和功能未知的orf14.9)的两个特异性引物，通过PCR合成大约17,100个碱基对的DNA片段获得的。用序列表给出了包含基因deoD和orf14.9之间相当于序列SEQ ID No.1的序列。
·PS操纵子的基因结构
图1图解显示了通过菌株CNCM I-2980的PS操纵子的核苷酸序列分析确定的它的基因结构，以及嗜热链球菌其他7个菌株的PS操纵子结构。对于不同的结构，用菌株名称和GENBANK登录号(在括号中)鉴别，箭头表示位置，基因的大小和方向是从起始密码子至终止密码子。图1的图例说明给出了箭头内颜色和/或部件的意义。
·文献比较
菌株CNCM I-2980的PS操纵子的结构分析表明它具有类似于已经知道的PS操纵子的总体结构(参见图1)；可能参与PS操纵子转录调节的第一个ORF，后面是可能参与PS重复单位聚合和/或它们的输出调节的3个ORFs，后面是编码糖基转移酶和确保重复单位装配的聚合酶的11个ORFs，它们自己后面是可能参与重复单位通过质粒膜运输的1个ORF。
菌株CNCM I-2980的PS操纵子的基因环境也类似于其它已知的PS操纵子的基因环境：上游的ORF deoD编码嘌呤核苷酸磷酸化酶，和下游的相反方向上ORFs IS1193和orf14.9分别编码转座酶(属于IS1193家族插入序列，可动基因元件)和功能未知的蛋白。
然而，菌株CNCM I-2980的操纵子的ORFs可能编码的蛋白和公共数据库(GENBANK)中可获得的蛋白之间进行的序列比较表明菌株CNCMI-2980的PS操纵子的基因内容在其远端部分是新的。
-嗜热链球菌，和目前已知的链球菌属更常见菌株的PS操纵子的近端部分，包含称作epsA(或cpsA，或capA，或wzg)、epsB(或cpsB，或capB，或wzh)、epsC(或cpsC，或cpaC，或wzd)和epsD(或cpsD，或capD，或wze)的4个ORFs。对于这4个ORFs的每一个，菌株之间其得到的多肽产物具有显著的序列相似性。在这个水平，由菌株I-2980的PS操纵子的ORFs eps13A、eps13B、eps13C和eps13D得到的多肽产物不能与其它PS操纵子得到的产物有显著不同(相同氨基酸的百分比大约或等于94％)。
-就在ORF epsD之后，在嗜热链球菌的大多数已知PS操纵子中存在ORF epsE(或cpsE，或capE，或wchA)。在这种情况下，同样，来源于不同已知序列的同种多肽产物之间的序列相似性是显著的；菌株CNCMI-2980的ORF eps13E的翻译产物与来源于其它菌株的它的同系物强烈类似。
尽管已经描述过，但是在嗜热链球菌的PS操纵子的不同已知结构当中，菌株CNCM I-2980的PS操纵子的下列4个ORFs(eps13F、eps13G、eps13H和eps13I)的结构较少见。有时不完全地在菌株IP6757(GENBANK登录号AJ289861)、“VIl型”(GENBANK登录号AF454498)和“III型”(GENBANK登录号AY057915)中发现这个结构。
-在该操纵子的远端部分，7个ORFs eps13J、eps13K、eps13L、eps13M、eps13N、eps130和eps13P对菌株CNCM I-2980的PS操纵子是新的和特异性的。尽管细微，但是在蛋白水平它们的序列相似性，或在特异蛋白单位存在的某些情况下，使得赋予这些ORFs的产物的推定功能成为可能：ORFseps13J至eps130的产物具有潜在的糖基转移酶或聚合酶活性，ORF eps13P的产物具有PS的跨膜转运活性。
3/嗜热链球菌菌株CNCM I-2980的对比流变学试验
使用的嗜热链球菌菌株CNCM I-2423、CNCM I-2429、CNCM I-2432、CNCM I-2978和CNCM I-2979是来自Rhodia Food保藏的菌株。它们用于大部分发酵乳或酸奶的工业生产并且公认它们的组织形成性能。它们是文献中描述菌株的代表。此后它们同菌株CNCM I-2980比较起来研究并认为是当前用于农食品工业的组织形成菌株代表。
嗜热链球菌菌株RD736和RD676是Rhodia Food工业菌株，具有低组织形成能力的声誉。它们可以生产的多糖和它们的PS操纵子未知。此后它们同菌株CNCM I-2980比较起来研究并认为是非组织形成菌株的代表。
使用的发酵乳是通过给100ml UHT脱脂乳(Le Petit Vendeen)补充3％(体重/体积)的脱脂奶粉获得的。在90℃巴氏灭菌10分钟达到溶液的灭菌，在奶的中心测量该温度。以10E+6cfu/ml(菌落形成单位/ml)的比率给由此获得的发酵载体接种待检测的菌株，然后在43℃(在水浴中)培养直至pH达到4.6。连续记录pH的监测。由此获得的发酵乳置于6℃通风烘箱中，直至分析。
进行两种类型的流变性测量：粘度和流量。在6℃贮存1、7、14和28天后，在8℃对发酵乳进行粘度测量。使用的仪器是固定在Helipath支架(Brookfield Engineering Laboratories，Inc.)上的RVF-typeBrookfield粘度计(Brookfield Engineering Laboratories，Inc.)。该粘度计安装有C型针和施加于该针的振动速度是10转/分。在6℃贮存14天并且预先已经搅拌过后，在8℃对发酵乳进行流量测量。使用的仪器是装备着同轴圆筒(半径1＝15mm、半径2＝13.83mm、高度＝32mm、气隙＝2mm)的AR1000-N血流速度计(TA Instruments)。对于上升段，连续扫描中应用的应力从0至60Pa变化，根据线性模型，持续时间1分钟。对于下降段，连续扫描中应用的应力从60至0Pa变化，根据线性模型，持续时间1分钟。考虑的值是触变域和屈服点；后者根据卡森模式计算。
在6℃贮存1、7、14和28天后测量由嗜热链球菌菌株CNCM I-2980得到的发酵乳的粘度(表1)。贮存一天后测量的粘度值是53.3Pa-s。这个值随表明由嗜热链球菌菌株CNCM I-2980得到的发酵乳的稳定性的时间变化很小。相比之下(表1)，测量用具有弱组织形成能力声誉的菌株RD736和RD676生产的发酵乳的粘度包括在26和30Pa-s之间。试验的其它菌株产生比由菌株CNCM I-2980得到的粘度较低的发酵乳。有可能区分产生40Pa.s级别(CNCM I-2979、CNCM I-2423和CNCM I-2432)粘度的一组菌株，和产生50Pa.s级别粘度的第二组—CNCM I-2980所属的组。
表1：由试验的不同菌株得到的发酵乳在6℃不同贮存时间后的粘度和pH
  菌株                               以Pa-s/pH表示的粘度
  贮存1天   贮存7天   贮存14天   贮存28天
  CNCM I-2980   53.3/4.50   53.0/4.44   53.0/4.42   53.5/4.40
  CNCM I-2429   51.2/4.55   51.9/4.45   51.0/4.44   51.2/4.44
  CNCM I-2978   50.4/4.56   51.8/4.52   49.6/4.49   51.0/4.45
  CNCM I-2432   42.4/4.60   42.2/4.56   43.0/4.55   43.0/4.45
  CNCM I-2423   42.0/4.60   41.9/4.40   42.0/4.37   43.0/4.30
  CNCM I-2979   37.8/4.54   40.7/4.45   42.2/4.42   42.2/4.33
  RD676   29.6/4.60   30.0/4.57   30.0/4.57   30.0/4.52
  RD736   26.0/4.45   26.0/4.34   28.0/4.34   27.0/4.26
流量测量使定义对于发酵乳流变性描述的两个重要流变性描述信息(屈服点和触变域)成为可能(表2)。对于由菌株CNCM I-2980得到的发酵乳，屈服点和触变域的平均值分别是5.89Pa和488Pa/s。这些值显著不同于由认为是非组织形成菌株得到的发酵乳获得的值。(RD676和RD736)例如对于由菌株RD676得到的发酵乳，这些平均值分别是17.01Pa和17083Pa/s。在认为是组织形成菌株的情况下，屈服点和触变域值非常接近于由菌株CNCM I-2980得到的值，但是然而明显更大，表明比菌株CNCMI-2980更大的组织形成能力。
表2：由试验的不同菌株得到的发酵乳在6℃贮存14天后，使用AR1000-N装置测量的屈服点和触变域值(3次重复的平均值)
  菌株   屈服点(Pa)   触变域(Pa/s)
  CNCM I-2980   5.89   488
  CNCM I-2429   13.32   1215(2个值)
  CNCM I-2978   10.51   728
  CNCM I-2432   12.27   1245
  CNCM I-2423   8.86   1344
  CNCM I-2979   13.56   1786
  RD676   17.01   17083
  RD736   15.91   33100
4/与参照菌株比较，嗜热链球菌菌株CNCM I-2980的感觉特征
在6℃贮存14天后通过感觉分析评估发酵乳。维持在12℃的最佳味道温度，9位专家的陪审团以0至6点的非构造的线性刻度进行发酵乳的定量描述性分析。以几天的间隔重复这个感觉课题分析。所选择的和预先训练的鉴定人以匙上质地的4个描述信息：脆性、耐搅拌性、粘性、粒度，和以口中质地的4个描述信息：熔化性、粘稠性、浓稠度、涂布性进行它们的评估。通过固定模式—双因素方差分析(称作ANOVA)，随后是对每一描述信息的5％α阈的Newman-Keuls均数比较检验法评估感觉差异。为了直观化所产生的空间，进行各个菌株的感觉描述信息作为变量的主要成分分析(PCA)。上升等级分类(AHC)使根据PCA分离菌株组成为可能。这些统计分析使用的软件是Fizz(Biosystèmes)、Statgraphics和Uniwinplus。
由嗜热链球菌菌株CNCM I-2980得到的发酵乳数据与进行由其它参照菌株得到的发酵乳的数据比较。表3示出了由采用的不同菌株质地描述信息得到的平均值和表4和图3和4列出了由ANOVA和平均比较检验法出现的显著性差异
表3：通过陪审团对于由本研究的不同菌株得到的发酵乳的质地描述信息的感觉分析分配的分数的平均值
   菌株                  匙上描述信息                      口中描述信息
  脆性   耐搅拌性   粒度   粘性   熔化性   粘稠性   浓稠度   涂布性
  CNCM I-2980   0.89   4.97   0.04   5.09   1.32   4.27   5.06   4.41
  CNCM I-2429   4.12   3.49   1.53   1.24   3.36   1.46   3.54   2.94
  CNCM I-2978   3.39   4.35   0.42   2.83   2.96   1.97   3.86   3.41
  CNCM I-2432   3.28   3.14   1.60   1.32   3.11   1.43   3.01   2.91
  CNCM I-2423   1.64   4.02   0.16   3.44   2.25   2.48   3.61   3.30
  CNCM-I 2979   3.98   2.79   2.36   0.74   3.71   0.72   2.39   2.22
  RD676   4.98   1.46   5.14   0.17   4.98   0.04   0.91   1.03
  RD736   4.35   1.45   3.43   0.04   5.18   0.31   0.77   0.67
表4：Newman-Keuls检验以5％进行的匙上质地和口中质地的每一描述信息的平均值比较。结果解释：相同字母相关的菌株之间的差异不显著。
   菌株             匙上描述信息              口中描述信息
  脆性   耐搅拌性   粒度   粘性   熔化性   粘稠性   浓稠度   涂布性
  CNCM I-2980   E   A   E   A   D   A   A   A
  CNCM I-2429   B   C   D   D   B   C   B   BC
  CNCM I-2978   C   B   E   C   B   BC   B   B
  CNCM I-2432   C   CD   D   D   B   C   C   BC
  CNCM I-2423   D   B   E   B   C   B   B   B
  CNCM I-2979   B   D   C   E   B   D   D   C
  RD676   A   E   A   F   A   D   E   D
  RD736   B   E   B   F   A   D   E   D
图3和4显示了表4中获得结果的直方图表示。
对于所有描述信息，认为是非组织形成的菌株RD676和RD736与其它菌株有显著区别。在组织形成菌株当中，菌株CNCM I-2980除了粒度的所有描述信息具有清晰和显著区别，粒度的情况不能与菌株I-2978和CNCMI-2423区别。
PCA使菌株位置作为它们的涉及感觉描述信息的距离的函数成为可能。
图2中PCA的设计1-2表示97.3％的产生空间。成分1与两组感觉变量相对照。变量：耐搅拌性、在口中的浓稠度、在口中的涂布性、在匙上的粘性和在口中的粘稠性组成的第一组说明右边的成分1。由变量：在口中熔化性、在匙上脆性和在匙上成粒度组成的第二组说明左边的成分1。第一组变量与第二组反向相关。这些变量使分析菌株在这个平面图上的位置成为可能。此外，AHC分析使对析因设计1-2上以点圆形式表示的不同组的菌株进行分类成为可能。
析因设计对照了提供不同质地性能的几组菌株。从这些分析显露出菌株RD736和RD676给予发酵乳匙上脆性和粒状质地和口中熔化质地。同样地，与另一组菌株比较，它们在口中不产生浓稠、粘稠或涂布质地，在匙上既无抗性也无粘性。因此它们产生非组织形成发酵乳。相反，菌株CNCMI-2429、CNCM I-2432和CNCM I-2979产生平均稠度的发酵乳；菌株CNCMI-2423和CNCM I-2978产生稠度的发酵乳，和菌株CNCM I-2980产生高稠度的发酵乳。这些分析表明与所有参照菌株相比，菌株CNCM I-2980在发酵乳中产生非常特殊的质地特征。
5/嗜热链球菌菌株CNCM I-2980对噬菌体的抗性的对比试验
溶解血小板法确定菌株对噬菌体的敏感性。用100μl待试验菌株的培养物和100μl含有待研究噬菌体的适当稀释度的血清接种在补充10mMCaCl2的5ml M17葡糖琼脂培养基中不至于溢出(琼脂0.6％重量/体积)。全部倒在补充10mM CaCl2的固化M17葡糖琼脂培养基(琼脂1.5％重量/体积)表面上。在42℃培养16小时后，在溶解血小板存在下评估菌株对噬菌体的敏感性。溶解血小板的缺乏象征这个菌株对试验的噬菌体有抗性。菌株对噬菌体(也称作噬菌体型)的敏感性谱由所有对所研究噬菌体的敏感性和抗性组成。
下表5定义了本研究使用的噬菌体和它们的菌株的来源/繁殖。这些是来源于Rhodia Food保藏的菌株和噬菌体。根据对参照组织形成菌株vis-à-vis的传染性选择噬菌体。
表5：噬菌体
  噬菌体名称   菌株来源
  2972   CNCM I-2423
  4082   RD729
  4074   CNCM I-2429
  4154   CNCM I-2429
  1272   CNCM I-2978
  4128   RD852
  1255   CNCM I-2432
  1765   RD728
  4121   RD862
为了评估菌株CNCM I-2980关于与噬菌体相关问题的工业益处，评估菌株CNCM I-2980的噬菌体型并与参照组织形成菌株的噬菌体型相比。表6显示了用溶解血小板法确定的菌株对这些不同噬菌体(噬菌体型)的敏感性。看来本研究的六个菌株具有不同的噬菌体型。尤其是，菌株CNCM I-2980具有与试验的其它组织形成菌株不同的噬菌体型。事实上，菌株CNCMI-2980不能被试验的噬菌体感染。
表6：试验的菌株的噬菌体型
  噬菌体                                       菌株
  CNCMI-2980   CNCM I-2423   CNCM I-2978   CNCM I-2432   CNCM I-2429   CNCM I-2979
  2972   -   +   -   -   -   -
  4082   -   +   -   -   -   -
  1272   -   -   +   -   -   -
  4128   -   -   +   -   -   -
  1255   -   -   -   +   -   -
  1765   -   -   -   +   -   -
  4074   -   -   -   -   +   -
  4154   -   -   -   -   +   -
  4121   -   -   -   -   -   +
+：对试验的噬菌体敏感；-：对试验的噬菌体有抗性
                                序列表
                           SEQUENCE LISTING
<110>罗迪亚化学
<120>组织形成乳酸细菌
<130>P 02244
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>16032
<212>DNA
<213>Streptococcus thermophilus
<400>1
tttgtaaaag gacgccattt ggtcgtcctt ttgtgttgta gctaatatct gttcgaagtg      60
ataataagtt aaaatttttc aaactactag aaaaaataaa aatatttgga agaagaagac     120
ttttaataaa taggtaaata tctgacaatt taaagtttaa ctactaaaaa tgtgaaagat     180
agttcacaat ataatggaaa atgatataaa ttaaatgatt gatatcataa tgaaaacgtt     240
tttttgtttt tttttgaaaa aaatgacaat tgaaatgaaa ttgtattaat gttacaataa     300
taatggggaa tacttaattt taatttttag gagcaattta tatgagttcg cgtacgaatc     360
gtaagcaaaa acgtacgggt aatagatcat gggggatggt caacgttgga ttgaccattc     420
tgtatgctat tttagcattg gtcttattat tcaccatgtt caattataat ttcctatcct     480
ttaggttttt gaacatcatt atcactattg gtttgttggt agttcttgct attagcatct     540
tccttcagaa gactaagaaa tcaccactag tgacaacggt tgtattggtt atcttctcgc     600
tagtttctct ggttggtatt tttggtttta aacaaatgat tgacatcact aaccgtatga     660
atcagacggc agcattttct gaagtagaaa tgagcatcgt ggttcctaag gaaagtgaca     720
tcaaagatgt gagccagctt actagcgtac aggcacctac taaggttgat aagaacaata     780
tcgagatctt gatgtcagct ctcaaaaaag ataaaaaagt tgatgttaaa gttgatgatg     840
ttgcctcata tcaagaagct tatgataatc ttaagtctgg caaatctaaa gctatggtct     900
tgagtgggtc ttatgctagc ctactagagt ctgtcgatag taattatgct tcaaatctaa     960
aaacaattta tacttataaa attaaaaaga agaatagcaa ctctgcaaac caagtagatt    1020
caaaagtctt caatatttat attagtggta ttgataccta cggttcgatt tcaacagtgt    1080
cacgttcaga tgtcaatatt attatgacag taaacatgaa tacacataag attctcttga    1140
cgactactcc acgtgatgca tacgttaaga ttcctggtgg tggagcagac cagtatgata    1200
aattaaccca cgcaggtatt tatggcgttg aaacatctga acaaactctg gaagatctat    1260
atggtactaa gattgattac tatgcccgaa ttaacttcac atctttcctt aagttgattg    1320
accaacttgg tggtgtgaca gtccataatg atcaagcttt cacaagtctt catgggaagt    1380
ttgatttccc agttggagat atccaaatga attcagagca agcacttgga tttgttcgtg    1440
aacgctatag tttagatggc ggagataatg atcgtggtaa aaaccaggaa aaagtcattt    1500
ctgcgattgt aaacaagttg gcttctctaa agtctgtatc aaactttact tcaatcgtta    1560
ataatctcca agactctgtt cagacaaata tttctttgga taccattaat gctttggcta    1620
atacacaact tgattcaggt tctaaattta cggtgacttc tcaagcagta actggtacag    1680
gttcaaccgg acaattgacc tcttatgcga tgccaaattc tagtctttac atgatgaaac    1740
tagataattc gagtgtggca agtgcctctc aagctatcaa aaatctaatg gaggaaaaat    1800
aagtgattga cgttcactca catattgttt ttgatgttga tgatggtcct aaaactttag    1860
aagaaagttt agatctcatt ggtgaaagtt acgcccaggg ggtacgtaag attgtttcaa    1920
catcccatcg tcgtaagggg atgtttgaga ctccagagga taaaattttt gccaactttt    1980
ctaaggtaaa agcagaagca gaagcacttt atccagactt aactatttat tatggaggtg    2040
aactttatta caccttagac attgtggaga aacttgaaaa gaatctcatt ccgcgcatgc    2100
acaacactca atttgctttg attgagttta gtgctcgcac atcttggaaa gaaattcata    2160
gtgggcttag taatgttttg agagcggggg taacgcctat tgttgctcat attgagcgct    2220
atgatgccct cgaagaaaat gctgaccgtg ttcgagaaat catcaacatg gggtgctata    2280
ctcaagttaa tagctctcat gttctaaaac caaagctctt tggagataaa gataaagtaa    2340
gaaaaaaacg tgttcgttat tttttggaga aaaatttggt tcatatggtt gctagcgaca    2400
tgcataatct tgggccgaga ccaccattta tgaaagatgc ttatgaaatt gttaaaaaga    2460
actacggccc caaacgtgct aagaatcttt ttattgaaaa tcccaaaaca ttactagaaa    2520
atcaatattt ataggagata ttatgaatca agataacact aaaagtgatg aaatcgacgt    2580
actagcattg ctacataaac tttggacgaa gaagcttttg attcttttca cagcttttta    2640
tttcgctgct ttcagtttct taggtactta tttctttatc caaccaacat atacatcaac    2700
aacgcgtatc tatgttgtta atcaggcaac agataataat aatctttctg ctcaagattt    2760
gcaagctggt acctatttgg caaatgacta taaagagttt attacatcaa atgatgtatt    2820
atcagaagtt attaaagatg aaaaattgaa tttgagtgag gcagaactgt ctaaaatggt    2880
ttcagttaat attcctactg atactcgtct tatttcaatt tctgttaatg ctaaaactgg    2940
tcaagatgcg caaacacttg ctaataaggt tcgtgaagtt gcttcaaaaa aaatcaagaa    3000
ggtgacaaaa gttgaagatg tcacaacgct cgaagaagct aaattgccag agtcaccatc    3060
ttcaccaaat atcaaacgta atgtgcttct tggggcagtg cttggaggat tccttgcagt    3120
ggttggtgta ttggtacgtg aaatcctaga tgatcgtgtt cgccgtccag aagatgtgga    3180
agatgccctt ggaatgacac ttcttggaat tgtccctgat acagataaga tttaaggaga    3240
agaaatgcct ttattaaagt tagttaaatc aaaagtagac tttgctaaaa agacggaaga    3300
gtattataac gctattcgca caaatattca attttctggt gctcagatta aagtgattgc    3360
gattagctct gttgaaactg gtgaaggaaa atcaacgaca tctgttaact tggcgatttc    3420
atttgctagt gttgggctcc gaacacttct gattgatgcg gatacgcgta attctgtttt    3480
gtcgggtaca tttaaatcaa atgagcctta taaaggtctt tcaaatttcc tttcaggaaa    3540
tgccgatcta aatgaaacga tttgccaaac tgatatttct ggtttagatg ttattgcatc    3600
tggtcctgta ccacctaatc caacaagtct tttgcaaaat gacaatttta gacatttgat    3660
ggaagttgct cgtagtcgtt atgattatgt tatcatttat acaccaccaa ttggtctggt    3720
cattgatgct ggtattattg cccatcaggc tgatgctagt cttttggtta cagcagctgg    3780
aaaaattaaa cgtcgtttcg taactaaggc ggtcgaacaa ttgaaacaaa gtggttctca    3840
gttcttaggt gtcgtcctta ataaagttga catgacagtt gataaatatg gatcatatgg    3900
ttcttacgga tcatatggtg agtacgggaa aaaaacagac caaaaagaag gtcattcaag    3960
agcacatcgt cgtagaaaag gatagcatta atggggatga tgcggctcct tataccttaa    4020
cagattaaaa aggggtttag agtgaaagaa aaacaagaaa ttcgtcgcat tgaaattggt    4080
attatacagt tggttgtggt tgttttcgca gccatggtag ctagtaaaat accatataca    4140
gagattaccc aaggaagtat tgtcctttta ggtgtcgtac atgtagtgtc ttactatatc    4200
agtagttatt atgaaaatct taagtataga ggctacttgg atgaactcat tgcaactgtc    4260
aaatattgtt tcatatttgc tctaattgca acatttctct cgttttttgc agatggaagt    4320
ttttcaatct cacgtcgcgg acttctttac gtcaccatga tttcaggtgt tctcttatac    4380
gttacaaata ctgttcttaa gtatttccgc tcatctattt atacacgtcg taaaagtaac    4440
aagaatattc tcttgatttc tgatcaggca cgtcttgata atgttttatc tcgtatgaag    4500
gacaatatgg atggtaggat ttcagcagtt tgtgtcttgg ataatcctta tttcactgat    4560
ccatttatca agagtgttaa acctgaaaat ttgattgaat atgcgacaca ctcagtagta    4620
gaccaagttt tgattaatct gccaagtgag cagtacaaga tttgggatta tgcgtcacca    4680
tttgaactta tgggaatccc agtatccatt aatttgaatg cccttgaatt tatgagtcag    4740
ggtgaaaaac gtatccaaca attgggtcct ttcaaagttg ttacgttttc tacgcatttt    4800
tatagctatg gagatatctt ggcgaaacgc ttcctcgata tctgtggagc tctagttggt    4860
ttggtgctct gtgggattgt tggaatcttc ctttatccac ttattcgtaa ggatggtggg    4920
ccagccattt ttgctcaaga ccgtgtggga gaaaatggac gtatcttcaa gttttataaa    4980
ttccgttcta tgcgtgttga tgctgaggaa attaaaaagc aattgatgga taaaaatcaa    5040
atgtctggtg gtatgtttaa gatagacaat gatccacgta ttaccaaaat tggacatttc    5100
attcgtaaaa caagtcttga tgaacttcca caattttgga atgttctaaa aggtgatatg    5160
agcttggtag gaacacgtcc accaacattg gatgagtacg aatcttatac accggaacaa    5220
aaacgtcgtt taagttttaa acctggtatc acaggtcttt ggcaagtaag tggacgaagt    5280
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<211>1032
<212>DNA
<213>Streptococcus thermophilus
<400>3
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<210>4
<211>1140
<212>DNA
<213>Streptococcus  thermophilus
<400>4
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<210>5
<211>810
<212>DNA
<213>Streptococcus thermophilus
<400>5
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<212>DNA
<213>Streptococcus thermophilus
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ggaagtgaat ta                                                        1452

Claims (28)

1.包含选自由核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列的乳酸细菌菌株。
2.根据权利要求1的乳酸细菌菌株，其特征在于它选自链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、小球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。
3.根据权利要求1或2的乳酸细菌菌株，其特征在于它属于嗜热链球菌种。
4.2003年2月26日保藏在国立微生物保藏中心，保藏号为I-2980的嗜热链球菌菌株。
5.SEQ ID No.1的核苷酸序列。
6.SEQ ID No.2的核苷酸序列。
7.SEQ ID No.3的核苷酸序列。
8.SEQ ID No.4的核苷酸序列。
9.SEQ ID No.5的核苷酸序列。
10.SEQ ID No.6的核苷酸序列。
11.SEQ ID No.7的核苷酸序列。
12.SEQ ID No.8的核苷酸序列。
13.包含选自由核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列的核酸。
14.包含选自核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列或根据权利要求13的核酸的克隆和/或表达载体。
15根据权利要求14的载体，其特征在于它是质粒。
16.由根据权利要求14或15的载体或质粒转化的宿主细菌。
17.根据权利要求16的细菌，其特征在于它是乳酸细菌。
18.根据权利要求16或17的细菌，其特征在于它是选自链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、小球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的乳酸细菌。
19.构建根据权利要求1至4的菌株或根据权利要求16至18的细菌的方法，其特征在于该菌株或细菌是通过使用包含选自由核苷酸序列SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8组成的组的至少一个序列或根据权利要求13的核酸的载体转化获得的。
20.根据权利要求19的方法，其特征在于转化之后是通过至少一个重组结果插入到菌株或宿主细菌的基因组。
21.根据权利要求19或20的方法，其特征在于该载体是质粒。
22.包含根据权利要求1或4的至少一个菌株或根据权利要求19至21的方法获得的至少一个菌株或根据权利要求16至18的至少一个转化细菌的细菌组合物。
23.根据权利要求1至4的菌株或根据权利要求19至21的方法获得的菌株或根据权利要求22的细菌组合物为生产食品或食品成分的用途。
24.根据权利要求23的用途，其特征在于食品或食品成分是乳制品、肉制品、谷类制品、饮料、起泡剂或粉剂。
25.包含根据权利要求1至4的至少一个菌株或根据权利要求19至21的方法获得的至少一个菌株或根据权利要求22的细菌组合物的食品或药物组合物。
26.包含根据权利要求1至4的至少一个菌株或根据权利要求19至21的方法获得的至少一个菌株或根据权利要求22的细菌组合物的乳制品。
27.根据权利要求26的乳制品，其特征在于它是发酵乳、酸奶、成熟奶油、乳酪、清爽干酪、乳制饮料、乳制品截留物、融化干酪、奶油甜点、酪农干酪或婴儿奶。
28.根据权利要求26或27的乳制品，其特征在于它包含动物和/或植物来源的奶。
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Open date: 20060419