ES2329470T5 - Bacterias lácticas texturizantes - Google Patents
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Description
DESCRIPCION
Bacterias lacticas texturizantes
La presente invencion se refiere a la cepa de Streptococcus thermophiles depositada el 26 de febrero en la CNCM con el numero I-2980, a su utilizacion, asf como a la utilizacion de una cepa de bacteria lactica del genera Streptococcus que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8 para fabricar un producto alimenticio o un ingrediente alimenticio para texturizar un producto alimenticio, as^ como a un procedimiento de construccion de estas cepas.
La industria alimentaria utiliza numerosas bacterias, especialmente en forma de fermentos, en particular bacterias lacticas, para mejorar el sabor y la textura de los alimentos, pero tambien para alargar la vida util de conservacion de estos alimentos. En el marco de la industria lactea, las bacterias lacticas se utilizan ampliamente para provocar la acidificacion de la leche (por fermentacion) pero tambien para dar textura al producto en el que estan incorporadas.
Entre las bacterias lacticas utilizadas en la industria alimentaria, se pueden citar los generos Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium.
Las bacterias lacticas de la especie Streptococcus thermophilus se utilizan de manera extensiva solas o en combinacion con otras bacterias para la fabricacion de productos alimenticios, especialmente productos fermentados. Se introducen en particular en la formulacion de fermentos utilizados para la fabricacion de leches fermentadas, por ejemplo, yogures. Entre ellas algunas juegan un papel preponderante en la elaboracion de la textura del producto fermentado. Esta particularidad esta estrechamente relacionada con la produccion de polisacaridos. Entre las cepas de Streptococcus thermophilus pueden distinguirse cepas texturizantes y cepas no texturizantes.
Se entiende por cepa de Streptococcus thermophilus texturizante una cepa que produce leches fermentadas que tienen, en las condiciones descritas en el ejemplo, una viscosidad superior a aproximadamente 35 Pa.s, un area de tixotropfa inferior a aproximadamente 2000 Pa/s y un umbral de flujo inferior a aproximadamente 14 Pa. Una cepa de Streptococcus thermophilus puede definirse como muy texturizante porque produce leches fermentadas que tienen, en las condiciones descritas en el ejemplo, una viscosidad superior a aproximadamente 50 Pa.s, un area de tixotropfa inferior a aproximadamente 1000 Pa/s y un umbral de flujo inferior a aproximadamente 10 Pa.
Para responder a las exigencias industriales, se ha hecho necesario proponer nuevas cepas de bacterias lacticas texturizantes, especialmente de Streptococcus thermophilus.
Asimismo, la invencion propone resolver el problema de proporcionar una cepa de bacteria lactica que tenga buenas propiedades de texturacion para los productos alimenticios.
Para ello la invencion propone la cepa de Streptococcus thermophilus_depositada el 26 de febrero a la CNCM con el numero I-2980, a su utilizacion, asf como a la utilizacion de una cepa de bacteria lactica del genero Streptococcus para fabricar un producto alimenticio o un ingrediente alimenticio para texturizar un producto alimenticio.
La invencion propone una nueva cepa de Streptococcus thermophilus depositada el 26 de febrero del 2003 en la Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos con el numero I-2980.
La invencion se refiere tambien a las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8, asf como a un acido nucleico que comprende al menos una de estas secuencias de nucleotidos.
La invencion se refiere tambien a plasmidos, vectores de clonacion y/o de expresion que comprenden al menos una de las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8, asf como un acido nucleico que comprende al menos una de estas secuencias de nucleotidos.
La invencion se amplfa tambien a bacterias hospedadoras transformadas por un vector de clonacion o de expresion o un plasmido de clonacion o de expresion que comprende la secuencia de nucleotidos SEC ID N°1.
La invencion se refiere tambien al procedimiento de construccion de las cepas descritas anteriormente caracterizadas porque las cepas se obtienen por transformacion usando un plasmido o un vector que comprende al menos una de las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, s Ec ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8, o un vector que comprende un acido nucleico que comprende al menos una de estas secuencias de nucleotidos.
La invencion propone tambien composiciones bacterianas que comprenden al menos una cepa descrita anteriormente. Unas composiciones alimenticias o farmaceuticas que comprenden al menos una cepa de acuerdo con la invencion o al menos una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invencion o la composicion bacteriana de acuerdo con la invencion se describen tambien.
La presente invencion posee numerosas ventajas en terminos de proporcionar textura a los medios en los que se incorpora. Especialmente permite obtener geles, a partir por ejemplo de leches fermentadas, que son espesos, adherentes, consistentes, fibrosos y resistentes a la mezcla y que no son granulosos.
Otras ventajas y caractensticas de la invencion seran evidentes al leer la descripcion y los ejemplos proporcionados a modo puramente ilustrativo y no limitante que se indican mas adelante.
Las bacterias lacticas son procariotas, gram positivas que pertenecen al grupo taxonomico Firmicutes. Son heterotrofas y quimiorganotrofas; generalmente anaerobias o aerotolerantes, su metabolismo puede ser homo- o heterofermentario: las bacterias lacticas producen esencialmente acido lactico por fermentacion de un sustrato gluddico. Desprovistas de catalasa, las bacterias lacticas constituyen un grupo heterogeneo de bacterias en forma coco para los generos Aerococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella, o en forma de bastoncillo para los generos Lactobacillus y Carnobacterium. La denominacion de bacteria lactica a menudo se extiende a otras bacterias relacionadas, tales como Bifidobacterium.
Entre las cepas de bacterias lacticas que son apropiadas para la presente invencion se pueden citar los generos Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium.
La cepa de bacteria preferida de acuerdo con la invencion es Streptococcus thermophilus.
Streptococcus thermophilus es una especie presente en la leche de manera natural y ampliamente utilizada en la industria alimentaria, y especialmente lactea ya que permite acidificar y texturizar la leche. Es una bacteria termofila homofermentaria.
La invencion se refiere en primer lugar a la cepa de Streptococcus thermophilus depositada el 26 de febrero del 2003 en la Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos con el numero I-2980.
La invencion tambien se refiere a las secuencias de nucleotidos de las SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8.
Las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 2 a SEC ID N° 8 son parte de un operon de aproximadamente 14350 pares de bases implicado en la smtesis de polisacaridos (PS). Este operon esta incluido en la secuencia SEC ID N° 1. Esto significa que de acuerdo con la invencion las secuencias SEC ID N° 2 a SEC ID N° 8 estan incluidas en la secuencia SEC ID N° 1.
De acuerdo con la invencion, la estructura del operon se ha determinado (ver figura 1). Entre los genes deoD (cadena arriba del operon de PS) y orf 14.9 (cadena abajo), se han identificado 17 ORF (fase de lectura abierta en ingles, o marco abierto de lectura) denominados eps13A, eps13B, eps13C, eps13D, eps13E, eps13F, eps13G, eps13H, eps13I, eps13J, eps13K, eps13L, eps13M, eps13N, eps13O, eps13P e IS1193. Los 16 primeros ORF situados sobre la cadena "con sentido" codifican potencialmente polipeptidos implicados en la produccion de polisacaridos exocelulares o capsulares; el 17° ORF situado sobre la cadena "antisentido" codifica potencialmente una transposasa funcional que pertenece a la familia IS1193 (secuencia de insercion).
Es posible denominar y posicionar cada ORF. A continuacion, se indica la denominacion de cada ORF, en segundo lugar, la supuesta funcion de dicha protema y finalmente en tercer lugar la posicion de la region que comprende este ORF (con respecto a la secuencia SEC ID N° 1 como se indica en la lista de secuencias):
- eps13A: Regulador transcripcional (342..1802)
- eps13B: Polimerizacion (regulacion de la longitud de cadenas) y/o exportacion de polisacaridos (1803..2534) - eps13C: Polimerizacion (regulacion de la longitud de cadenas) y/o exportacion de polisacaridos (2543..3235) - eps13D: Polimerizacion (regulacion de la longitud de cadenas) y/o exportacion de polisacaridos (3245..3985) - eps13E: Undecaprenil-fosfato glicosiltransferasa (4042. 5409)
- eps13F: Undecaprenil-fosfato glicosiltransferasa (5611.6195)
- eps13G: Undecaprenil-fosfato glicosiltransferasa (6251..6634)
- eps13H: Beta-1,4-galactosiltransferasa (6643..7092)
- eps13l: Beta-1,4-galactosiltransferasa (7092..7607)
- eps13J: Rhamnosiltransferasa (7597..8493)
- eps13K: Glicosiltransferasa (8763..9797)
- eps13L: Polimerasa de unidad repetitiva (9827..10969)
- eps13M: Polimerasa de unidad repetitiva (10984..11793)
- eps13N: Glicosiltransferasa (11844..12578)
- eps13O: Glicosiltransferasa (12633..13016)
- eps13P: Transportador transmembrana (13049..14482)
- S1193: Transposasa (complemento (14614..15870)).
La invencion tambien se refiere a un acido nucleico que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8.
Las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8 pueden insertarse en un vector por ingeniena genetica, especialmente por tecnicas de ADN recombinante ampliamente conocidas por los especialistas en la tecnica.
La invencion se refiere igualmente a un vector de clonacion y/o de expresion que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8 o un acido nucleico como se define a continuacion.
El vector preferido de acuerdo con la invencion es un plasmido. Puede tratarse de un plasmido replicativo o integrativo.
A partir de estos vectores y/o plasmidos es posible transformar una bacteria para incluir en ella estos vectores y/o plasmidos. Esta transformacion puede realizarse mediante la tecnica de electroporacion o por conjugacion, y de una
manera convencional para el especialista en la tecnica.
La invencion tambien se refiere a bacterias hospedadoras transformadas por un plasmido de clonacion o de expresion o un plasmido de clonacion o de expresion que comprende la secuencia de nucleotidos SEC ID N° 1.
Las bacterias transformadas son preferentemente bacterias lacticas. En particular una bacteria lactica que puede escogerse entre los generos Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pe-diococcus y Bifidobacterium.
La cepa de bacteria lactica preferida de acuerdo con la invencion es Streptococcus thermophilus.
La invencion tambien se refiere a un procedimiento de construccion de una cepa o de una bacteria hospedadora transformada de acuerdo con la invencion caracterizada porque se obtiene por transformacion usando un vector que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8 o un acido nucleico que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8.
De acuerdo con el procedimiento de la invencion, el vector preferido es un plasmido.
Ventajosamente de acuerdo con el procedimiento de la invencion la transformacion se produce despues de una insercion en el genoma de la cepa o de la bacteria hospedadora transformada por al menos un evento de recombinacion.
La invencion tambien se refiere a una composicion bacteriana que comprende al menos una cepa de acuerdo con la invencion o que comprende al menos una bacteria transformada de acuerdo con la invencion.
Por composicion bacteriana se entiende una mezcla de diferentes cepas, especialmente un fermento o una levadura.
Las mezclas de cepas preferidas de acuerdo con la invencion son mezclas de Streptococcus thermophilus con otras Streptococcus thermophilus, o mezclas de Streptococcus thermophilus con Lactobacillus delbrueckil subesp. bulgaricus, o mezclas de Streptococcus thermophilus con otros Lactobacillus y/o con Bifidobacterium, o mezclas de Streptococcus thermophilus con otros Lactococcus, o mezclas de Streptococcus thermophilus con otras cepas de bacterias lacticas y/o de levaduras.
La invencion tambien se refiere a utilizacion de una cepa de bacteria lactica del genero Streptococcus que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8 o de una cepa de acuerdo con la reivindicacion 1 o de una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de las reivindicaciones 16 a 18 donde la cepa se selecciona entre el genero Streptococcus para elaborar un producto alimenticio o un ingrediente alimenticio para texturizar un producto alimenticio.
Como producto alimenticio o ingrediente alimenticio preferido de acuerdo con la invencion puede citarse un producto lacteo, un producto carnico, un producto cerealista, una bebida, una espuma o un polvo.
Unas composiciones alimenticias o farmaceuticas que comprenden al menos una cepa de acuerdo con la invencion o al menos una cepa obtenida segun el procedimiento de la invencion o la composicion bacteriana de acuerdo con la invencion se describen tambien.
Un producto lacteo que comprende al menos una cepa de acuerdo con la invencion o al menos una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invencion o la composicion bacteriana de acuerdo con la invencion se describe tambien.
En el caso de la elaboracion de un producto lacteo, esta se realizara de la manera habitual en este campo, y especialmente por fermentacion de un producto lacteo incorporando una cepa de acuerdo con la invencion.
Como producto lacteo de acuerdo con la invencion, puede citarse una leche fermentada, un yogurt, una crema madura, un queso, queso fresco, una bebida lactea, un producto lacteo retenido, queso fundido, crema de repostena, requeson o leche infantil.
De preferencia, de acuerdo con la invencion el producto lacteo comprende una leche de origen animal y/o vegetal.
Como leche de origen animal puede citarse la leche de vaca, de oveja, de cabra o de bufala.
Como leche de origen vegetal puede citarse toda sustancia fermentable de origen vegetal que puede utilizarse de acuerdo con la invencion que proviene especialmente del grano de soja, arroz o malta.
La figura 1 representa la estructura genetica del operon de PS de la cepa de acuerdo con la invencion comparado con el operon de PS de otras cepas de Streptococcus thermophilus ya conocidas.
La figura 2 representa el plano factorial 1-2 del analisis de componentes principales (ACP) obtenido a partir de datos sensoriales sobre leches fermentadas obtenidas con las diferentes cepas el estudio.
La figura 3 representa los promedios de las puntuaciones obtenidas sobre las descripciones de TEXTURA EN LA CUCHARA para cada una de las cepas del estudio. Interpretacion de resultados del ensayo de Newman-Keuls: la diferencia entre las cepas relacionadas por una misma letra no es significativa.
La figura 4 representa los promedios de las puntuaciones obtenidas sobre las descripciones de TEXTURA EN LA
BOCA para cada una de las fuentes del estudio. Interpretacion de resultados del ensayo de Newman-Keuls: la diferencia entre las cepas relacionadas por una misma letra no es significativa.
A continuacion, se describen ejemplos concretos, pero no limitantes de la invencion.
Ejemplos
1/ Secuenciacion del operon de PS de Streptococcus thermophilus CNCM I-2980
El fragmento de ADN que lleva el operon de PS de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980 se ha obtenido por amplificacion mediante PCR (reaccion en cadena de la polimerasa, en ingles) a partir del ADN genomico extrafdo de dicha cepa. La amplificacion se realizo con el termociclador Mastercycler (Eppendorf) utilizando la ADN polimerasa LA-Taq (BioWhittaker/Cambrex) y los siguientes cebadores: 5'-GGGTGAACGTATCTCAGTAATGGGGACTGG-3' y 5'-CCTGAGTTATGGGACGATTACTTGGCTG-3'. Las condiciones experimentales de esta amplificacion son las siguientes: 14 ciclos de desnaturalizacion alternantes a 98°C durante 30 segundos e hibridacion-elongacion a 68°C durante 15 min., seguido de 16 ciclos de desnaturalizacion alternantes a 98°C durante 30 segundos e hibridacion-elongacion a 68°C durante 15 minutos con un aumento de 15 s por ciclo, y despues un ciclo adicional de elongacion a 72°C durante 10 min. El producto PCR se ha secuenciado de acuerdo con un enfoque de clonacion por fragmentos.
2/ Caracterizacion molecular de la cepa de acuerdo con la invencion comparada con cepas de Streptococcus thermophilus ya conocidas
• Secuencia del operon de PS
La secuencia del operon de PS de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980 se ha obtenido a partir de un fragmento de ADN de aproximadamente 17100 pares de bases sintetizado por PCR en presencia de una matriz de ADN genomica purificada de la cepa y utilizando dos cebadores espedficos de genes conservados (deoD que codifica una purina-nucleotido fosforilasa, y orf14.9 de funcion desconocida) que flanquean generalmente al operon de PS en los Streptococcus thermophilus descritos en la bibliograffa. La secuencia comprendida entre los genes deoD y orf14.9, que se corresponde con la secuencia SEC ID N° 1, se proporciona en la lista de secuencias.
• Organizacion genetica del operon de PS
La figura 1 esquematiza la estructura genetica del operon de PS de la cepa CNCM I-2980 establecida por el analisis de su secuencia nucleotfdica, asf como la estructura del operon de PS de otras 7 cepas de Streptococcus thermophilus. Para las diferentes estructuras, identificadas por el nombre de la cepa y por el numero de acceso GENBANK (entre parentesis), las flechas representan la posicion, el tamano y la orientacion de los genes desde el codon de inicio hasta el codon de fin. El significado de los colores y/o motivos en el interior de las flechas se indica en la leyenda de la figura 1.
• Comparacion con la bibliograffa
El analisis estructural del operon de PS de la cepa CNCM I-2980 demuestra que posee una organizacion global similar a la de los operones de PS ya conocidos (ver figura 1): un primer o Rf potencialmente implicado en la regulacion de la transcripcion del operon de PS, seguido de 3 o Rf que probablemente intervienen en la regulacion de la polimerizacion de las unidades repetidas de PS y/o sus exportados, seguidos de 11 ORF que codifican glicosiltransferasas y una polimerasa que asegura el ensamblaje de la unidad repetitiva, seguidas estas mismas por 1 ORF potencialmente implicado en el transporte de las unidades repetitivas a traves de la membrana plasmfdica.
El entorno genetico del operon de PS de la cepa CNCM I-2980 es tambien similar al de otros operones de PS conocidos, cadena arriba el ORF deoD codifica una purina-nucleotido fosforilasa, y cadena abajo en sentido opuesto los ORF IS1193 y orf14.9 codifican respectivamente una transposasa (que pertenece a la familia de secuencias de insercion IS1193, elementos geneticos moviles) y una protema de funcion desconocida.
Por tanto, la comparacion de secuencia realizada entre las protemas potencialmente codificadas por los ORF del operon de la cepa CNCM I-2980 y las disponibles en las bases de datos publicas (GENBANK) demuestra que el contenido genetico del operon de PS de la cepa CNCM I-2980 es nuevo en su parte distal.
- La parte proximal del operon de PS de Streptococcus thermophilus, y mas generalmente la de los estreptococos hasta ahora conocidos, comprende 4 ORF denominados epsA (o cpsA, o capA, o wzg), epsB (o cpsB, o capB, o wzh), epsC (o cpsC, o cpaC, o wzd) y epsD (o cpsD, o capD, o wze) en los que los productos polipeptfdicos deducidos, para cada uno de los 4 ORF, presentan importantes similitudes de secuencia entre las cepas. A este nivel, los productos polipeptfdicos deducidos de los ORF eps13A, eps13B, eps13C y eps13D del operon de PS de la cepa CNCM I-2980 no difieren de los deducidos de otros operones de PS (porcentaje de aminoacidos identicos superior o igual al 94%).
- Inmediatamente despues de la ORF epsD, la ORF epsE (o cpsE, o capE, o wchA) esta presente en la mayona de los operones de PS conocidos en Streptococcus thermophilus. En este caso tambien, las similitudes de secuencia son importantes entre productos polipeptfdicos homologos procedentes de diferentes secuencias conocidas; el producto de traduccion del ORF eps13E de la cepa CNCM I-2980 es muy similar a sus homologos que provienen de otras cepas.
- La organizacion de los 4 ORF siguientes (eps13F, eps13G, eps13H y eps13I) del operon de PS de la cepa CNCM I-2980, ya descrito, es menos frecuente entre las diferentes estructuras conocidas de operones PS de Streptococcus thermophilus. Esta organizacion se ha encontrado, a veces de manera incompleta, en las cepas IP6757 (numero de acceso a GENBANK AJ289861), "tipo VII" (numero de acceso a GENBANK AF454498) y "tipo III" (numero de acceso a GENBANK AY057915).
- En la parte distal del operon, los 7 ORF eps13J, eps13K, eps13L, eps13M, eps13N, eps13O y eps13P son
nuevos y espedficos del operon de PS de la cepa CNCM I-2980. Aunque reducida, su similitud de secuencia a nivel proteico o en algunos casos la existencia de motivos proteicos espedficos, permite asignar una supuesta funcion a los productos de estos ORF: actividad potencial de glicosiltransferasa o polimerasa para el producto de los ORF eps13J a eps13O, o actividad de transporte transmembrana de PS para el producto del ORF eps13P.
3/ Ensayo de reologia comparado de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980
Las cepas de Streptococcus thermophilus utilizadas CNCM I-2423, CNCM I-2429, CNCM I-2432, CNCM I-2978 y CNCM 1-2979 son cepas de coleccion de Rhodia Food. La mayona de ellas se utilizan para la elaboracion industrial de leches fermentadas o yogures y destacan por sus propiedades texturizantes. Son representativas de cepas descritas en la bibliograffa. Se han estudiado a continuacion en comparacion con la cepa CNCM I-2980 y se han considerado como representativas de cepas texturizantes utilizadas actualmente en la industria agro-alimenticia.
Las cepas de Streptococcus thermophilus RD736 y RD676 son cepas industriales de Rhodia Food reconocidas por su debil poder texturizante. No se conocen los polisacaridos que pueden producir ni su operon de PS. Se han estudiado a continuacion en comparacion con la cepa CNCM I-2980 y se han considerado como representativas de cepas no texturizantes.
La leche fermentada utilizada se obtiene anadiendo 100 ml de leche UHT semi-descremada (Le Petit Vendeen®) por 3% (peso/volumen) de polvo de leche descremada. La esterilidad de la solucion se obtiene mediante pasteurizacion a 90°C durante 10 minutos, la temperatura se mide en el interior de la leche. El soporte de fermentacion obtenido de esta manera se inocula con la cepa a ensayar a razon de 10E+6 ufc/ml (unidad formadora de colonias/ml) despues se incuba a 43°C (al bano mana) hasta obtener un pH de 4,6. El seguimiento del pH se registra de manera continua. Las leches fermentadas obtenidas de esta manera se colocan en una estufa ventilada a 6°C, hasta su analisis.
Se efectuaron dos tipos de mediciones reologicas: viscosidad y flujo. Las mediciones de viscosidad se realizaron a 8°C sobre leches fermentadas, despues de 1, 7, 14 y 28 dfas de almacenaje a 6°C. El instrumental utilizado es un viscosfmetro Brookfield® de tipo RVF (Brookfield Engineering Laboratories, Inc.) montado sobre un pie Helipath (Brookfield Engineering Laboratories, Inc.). El viscosfmetro esta equipado con una aguja de tipo C y la velocidad de oscilacion aplicada a la aguja es 10 vueltas/minuto. Las mediciones de flujo se efectuaron a 8°C sobre leches fermentadas, despues de 14 dfas de almacenaje a 6°C y que previamente se habfan mezclado. El instrumental utilizado es un reometro AR1000-N (TA Instrument) equipado con cilindros co-axiales (Radio 1 = 15 mm, Radio 2 = 13,83 mm, Altura = 32 mm, Entrehierro = 2 mm). Para el segmento ascendente, la tension de barrido continuo aplicada vana de 0 a 60 Pa durante un tiempo de 1 minuto de acuerdo con un modo lineal. Para el segmento descendente, la tension de barrido continuo aplicada vana de 60 a 0 Pa durante un tiempo de 1 minuto de acuerdo con un modo lineal. Los valores tomados en cuenta son el area de isotropfa y el umbral de flujo; este ultimo se calcula de acuerdo con el modelo de Casson.
La viscosidad de la leche fermentada obtenida con la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980 se midio despues de 1, 7, 14 y 28 dfas de almacenaje a 6°C (tabla 1). El valor de viscosidad medido despues de un dfa de almacenaje es de 53,3 Pa.s. Este valor vana poco en el tiempo mostrando la estabilidad de la leche fermentada obtenida con la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980. Comparativamente (tabla 1), las viscosidades medidas para las leches fermentadas elaboradas con las cepas RD736 y RD676, consideradas como de debil poder texturizante, estan comprendidas entre el 26 y 30 Pa.s. Las otras cepas ensayadas generan leches fermentadas que presentan viscosidades mas debiles que las obtenidas con la cepa CNCM I-2980. Se puede distinguir un grupo de cepas que generan viscosidades del orden de 40 Pa.s (CNCM I-2979, CNCM I-2423 y CNCM I-2432) y un segundo, al que pertenecen CNCM I-2980, que generan viscosidades del orden de 50 Pa.s.
Tabla 1: Viscosidad y pH de las leches fermentadas obtenidas con las diferentes cepas ensayadas, despues de diferentes tiempos de almacenaje a 6°C
Las mediciones de flujo han permitido definir dos descriptores reologicos significativos (umbral de flujo y area de tixotrc^a) para la descripcion reologica de las leches fermentadas (tabla 2). Para la leche fermentada obtenida con la cepa CNCM I-2980, los valores promedio son de 5,89 Pa y de 488 Pa/s para, respectivamente, el umbral de flujo y el area de tixotropfa. Estos valores son significativamente diferentes de los obtenidos para las leches fermentadas obtenidas con las cepas consideradas como no texturizantes (RD676 y RD736). Por ejemplo, para la leche fermentada obtenida con la cepa RD676, estos valores promedio son respectivamente de 17,0l Pa y de 17083 Pa/s. En el caso de cepas consideradas como texturizantes, los valores de umbral de flujo y area de tixotropfa estan mucho mas proximos a los obtenidos con la cepa CNCM I-2980, pero significativamente superiores, mostrando una capacidad texturizante superior a la de la cepa CNCM I-2980.
Tabla 2: Valores del umbral de flujo y del area de tixotropfa (promedio de tres repeticiones) medidos usando el equipo AR1000-N de leches fermentadas obtenidas con las diferentes cepas ensayadas despues de 14 dfas de almacenaje a 6°C.
4/ Caracterizacion sensorial de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980, comparacion con las cepas de referencia
Las leches fermentadas se evaluaron mediante un analisis sensorial despues de 14 dfas de almacenaje a 6°C. El analisis descriptivo cuantitativo de las leches fermentadas, conservadas a una temperatura optima de degustacion de 12°C, lo realizo un jurado de 9 expertos sobre una escala lineal no estructurada de 0 a 6 puntos. Este analisis de perfil sensorial se duplico con algunos dfas de diferencia. Los jueces, previamente seleccionados y entrenados, efectuaron su evaluacion sobre 4 descriptores de textura en la cuchara: quebradiza, resistencia a la mezcla, fibroso, granulosidad, y sobre 4 descriptores de textura en la boca: se funde, adherencia, espesor, consistencia. Las diferencias sensoriales se evaluaron mediante un analisis de varianza (denominado ANOVA) de dos factores, de modelo fijo, seguido de un ensayo de comparacion de promedio de Newman-Keuls con un umbral alfa del 5% sobre cada uno de los descriptores. Se puso en practica un Analisis de Componentes Principales (ACP) con los descriptores sensoriales como variables y las cepas como individuos para visualizar el espacio producido. Una Clasificacion Ascendente Jerarquica (CAH) permitio distribuir los grupos de cepas sobre el ACP. Los programas informaticos utilizados para estos analisis estadfsticos son Fizz® (Biosystemes), Statgraphics® y Uniwin plus®.
Los datos de la leche fermentada obtenidos con la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980 se compararon con los de las leches fermentadas obtenidas con las otras fuentes de referencia. Los valores promedio obtenidos con las diferentes cepas para los descriptores de textura aceptados se indican en la tabla 3 y las diferencias significativas que se obtienen de ANOVA y del ensayo de comparacion de promedios se muestran en la tabla 4 y en las figuras 3 y 4.
Las figuras 3 y 4 muestran una representacion mediante histograma de los resultados obtenidos en la tabla 4.
Para las cepas RD676 y RD736, consideradas no texturizantes, todos los descriptores se diferencian significativamente de otras cepas. Entre las cepas texturizantes, la cepa CNCM I-2980 se diferencia netamente y significativamente en todos los descriptores, excepto en la granulosidad donde no se diferencia de las cepas CNCM I-2978 y CNCM I-2423.
El ACP permite situar las cepas en funcion de su distancia en relacion a los descriptores sensoriales.
El plano 1-2 del ACP en la figura 2 representa el 97,3% del espacio producido. La componente 1 divide dos grupos de variables sensoriales. El primer grupo que consiste en las variables: resistencia a la mezcla, espesor en la boca, consistencia en la boca, fibroso en la cuchara y adherencia en la boca, explica la componente 1 a la derecha. El segundo grupo, que consiste en las variables: se funde en la boca, quebradizo en la cuchara y granulosidad en la cuchara, explica la componente 1 a la izquierda. El primer grupo de variables es anti-correlativo con respecto al segundo grupo. Estas variables permiten analizar las situaciones de las cepas sobre el plano. Por otro lado, el analisis en CAH permite clasificar las cepas en diferentes grupos que se representan en forma de drculos indicados sobre el plano factorial 1-2.
El plano factorial divide varios grupos de cepas que aportan propiedades de textura diferentes. A partir de estos analisis se obtiene que las cepas RD736 y RD676 proporcionan a la leche fermentada una textura quebradiza y granulosa en la cuchara y que se funde en la boca. Del mismo modo, no proporcionan una textura espesa, adherente o consistente en la boca, ni son resistentes o fibrosas en la cuchara en comparacion con otros grupos de cepas. Proporcionan por tanto una leche fermentada no texturizada. Por el contrario, las cepas CNCM I-2429, CNCM I-2432 y CNCM I-2979 proporcionan leches fermentadas medianamente texturizadas; las cepas CNCM I-2423 y CNCM I-2978 proporcionan leches fermentadas texturizadas, y la cepa CNCM I-2980 proporciona una leche fermentada muy texturizada. Este analisis demuestra que la cepa CNCM I-2980 aporta caractensticas de textura muy particulares en la leche fermentada en comparacion con el resto de las cepas de referencia.
5/ Ensayo comparativo de resistencia a fagos de la cepa Streptococcus thermophilus CNCM I-2980
La sensibilidad de una cepa a un bacteriofago se establece por el metodo de placas de lisis. Se utilizaron cien |il de un cultivo de la cepa a ensayar y 100 |il de una dilucion apropiada de un suero que contema el bacteriofago a estudiar para sembrar 5 ml de medio agar sobreenfriado (agar al 0,6% peso/volumen) M17 suplementado con glucosa 10 mM en CaCh. La mezcla se vierte sobre la superficie de medio agar solidificado (agar al 1,5% peso/volumen) M17 suplementado con glucosa a 10mM en CaCh. Despues de incubar a 42°C durante 16 horas, la sensibilidad de la cepa al bacteriofago se evalua por la presencia de placas lisis. La ausencia de placas de lisis significa que esta cepa es resistente a los bacteriofagos ensayados. El espectro de sensibilidad de una cepa a los bacteriofagos (denominado tambien lisotipo) esta constituido por el conjunto de sensibilidades y resistencias a los bacteriofagos estudiados.
La tabla 5 mostrada a continuacion define los bacteriofagos utilizados para este estudio y su cepa de origen/propagacion. Son cepas y fagos procedentes de la coleccion de Rhodia Food. Los bacteriofagos se seleccionaron por su poder infeccioso en las cepas texturizantes de referencia.
Tabla 5: Fagos
Para evaluar el interes industrial de la cepa CNCM I-2980 con respecto a los problemas asociados con los bacteriofagos, se evaluo y se comparo el lisotipo de la cepa CNCM I-2980 con el de las cepas texturizantes de referencia. La tabla 6 muestra las sensibilidades de las cepas a estos diferentes fagos (lisotipo) establecidas por el metodo de placas de lisis. Se observa que las seis cepas del estudio tienen lisotipos diferentes. En particular, la cepa CNCM I-2980 presenta un lisotipo distinto al de las otras cepas texturizantes ensayadas. En efecto los fagos ensayos no han podido infectar a la cepa CNCM I-2980.
Claims (24)
1. Cepa de Streptococcus thermophilus depositada el 26 de febrero de 2003 en la Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos con el numero I-2980.
2. Secuencia de nucleotidos SEC ID N° 1.
3. Secuencia de nucleotidos SEC ID N° 2.
4. Secuencia de nucleotidos SEC ID N° 3.
5. Secuencia de nucleotidos SEC ID N° 4.
6. Secuencia de nucleotidos SEC ID N° 5.
7. Secuencia de nucleotidos SEC ID N° 6.
8. Secuencia de nucleotidos SEC ID N° 7.
9. Secuencia de nucleotidos SEC ID N° 8.
10. Acido nucleico que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8.
11. Vector de clonacion y/o de expresion que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8 o un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 10.
12. Vector de acuerdo con la reivindicacion 11 caracterizado porque es un plasmido.
13. Bacteria hospedadora transformada por un vector de clonacion o de expresion o un plasmido de clonacion o de expresion que comprende la secuencia de nucleotidos SEC ID N° 1.
14. Bacteria de acuerdo con la reivindicacion 13 caracterizada porque es una bacteria lactica.
15. Bacteria de acuerdo con la reivindicacion 13 o 14, caracterizada porque es una bacteria lactica seleccionada entre los generos Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium.
16. Procedimiento de construccion de una cepa de acuerdo con la reivindicacion 1 o de una bacteria de acuerdo con las reivindicaciones 13 a 15 caracterizado porque la cepa o la bacteria se obtienen por transformacion usando un vector que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8 o un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 10.
17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 16 caracterizado porque la transformacion se realiza despues de una insercion en el genoma de la cepa o de la bacteria por al menos un evento recombinante.
18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 16 o 17 caracterizado porque el vector es un plasmido.
19. Composicion bacteriana que comprende al menos una cepa de acuerdo con la reivindicacion 1 o al menos una bacteria transformada de acuerdo con las reivindicaciones 13 a 15.
20. Uso de una cepa de bacteria lactica del genero Streptococcus que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleotidos SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 7, SEC ID N° 8 o de una cepa de acuerdo con la reivindicacion 1 o de una cepa obtenida de acuerdo con el procedimiento de las reivindicaciones 16 a 18 en el que la cepa se selecciona entre el genero Streptococcus para elaborar un producto alimenticio o un ingrediente alimenticio para texturizar un producto alimenticio.
21. Uso de acuerdo con la reivindicacion 20 caracterizado porque el producto alimenticio o ingrediente alimenticio es un producto lacteo, un producto carnico, un producto cereal, una bebida, una espuma o un polvo.
22. Uso de acuerdo con la reivindicacion 21 en el que el producto lacteo es una leche fermentada, yogur, crema madurada, queso, queso fresco, bebida lactea, producto lacteo retenido, queso fundido, crema de repostena, requeson o leche infantil.
23. Uso de acuerdo con la reivindicacion 21 en el que el producto lacteo comprende leche de origen animal y/o vegetal.
24. Uso de acuerdo con la reivindicacion 20 o 24 caracterizado porque la cepa pertenece a la especie Streptococcus thermophilus.
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