JP2013503604A - エキソ多糖の過剰発現による、食品をテキスチャリングするための改変されたガラクトキナーゼ発現を伴う乳酸菌 - Google Patents

Abstract

本発明は、特性を改良することを伴う細菌細胞、細胞を含むスターター培養、及びスターター培養で発酵される乳製品に関する。

Description

発明の分野
本発明は、特性を改良することを伴う細菌細胞、細胞を含むスターター培養、及びスターター培養で発酵される乳製品に関する。

発明の背景
食品産業は、食品の風味及び質感を改良するために、しかしまた、これらの食品の保存可能期間を延長するために、多くの細菌、特に乳酸菌を使用する。乳製品の場合では、乳酸菌は、乳の酸性化（発酵による）をもたらすために、しかしまたそれらが組み込まれる製品をテキスチャリングするために、集中的に用いられる。

食品産業に用いられる乳酸菌の中でも、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が言及され得る。ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の乳酸菌は、食品、特に発酵食品の製造に、単独で、又は他の細菌と組み合わせて広く用いられる。それらは、発酵乳の製品に、例えばヨーグルトに用いられる発酵の処方に、特に用いられる。それらの一部は、発酵食品の質感の開発において主要な役割を果たす。この特性は、多糖の産生に密接に関係している。ストレプトコッカス・サーモフィラスの菌株の中でも、テキスチャリング菌株と非テキスチャリング菌株に区別することができる。

産業の要求に適うために、乳酸菌の、特にストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の新規テキスチャリング菌株を提案することは、必要となる。

ＷＯ２００７０９５９５８Ａ１は、テキスチャリング特性を有するストレプトコッカス・サーモフィラス菌株を開示する。図１では、一番のテキスチャリング菌株ＣＨＣＣ８８３３（ＤＳＭ１７８７６）は、約５９Ｐａのせんだん応力値を有することが見られ得る。

Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．９２：４７７−４８２（２００９）は、ＧａｌＫ活性を増加させることにより、遺伝的操作を経た粘着性のストレプトコッカス・サーモフィラス菌株によるＥＰＳの産生を増加させることが可能であることを示す研究を開示する。そのような菌株が、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）と組み合わせてヨーグルト製造に用いられた場合、組み換え菌株のＥＰＳ過剰発現は有意ではないことが結論付けられた。

従って、本発明が解決することを提案する課題は、乳酸菌のテキスチャリング菌株（例えばストレプトコッカス・サーモフィラス）がラクトバチルス種の菌株と一緒に用いられる場合に、食品、特に製品をテキスチャリングするための優れた特性を有する乳酸菌の菌株を提供することである。

発明の概要
本発明者らは、ＧａｌＫ（ガラクトキナーゼ）遺伝子中に変異を有する乳酸菌が、特にラクトバチルス細菌と共に発酵乳に用いられる場合、発酵乳において野生（母）型菌株よりも高い粘性を生じることを、驚くべきことに発見した。

この驚くべき発見に従って、本発明は、新規のスーパーテキスチャリング（ｓｕｐｅｒｔｅｘｔｕｒｉｚｉｎｇ）乳酸菌株、例えばＧａｌＫ遺伝子中に変異を有するストレプトコッカス・サーモフィラス菌株、及びこれらの菌株を製造するための方法に、及びそのような菌株を用いて作られた発酵乳製品に関する。

図１は、ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈレオメーターで測定されたＣＨＣＣ１１３７９のせん断応力を表す。結果は、４３℃で一晩培養後、ＣＨＣＣ１１３７９で凝塊された乳における改良された質感（せん断応力）を示す。質感は、「発酵乳における質感の分析」の下に記述されるように、ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈレオメーターの使用によりパスカル（Ｐａ）で測定されたせん断応力を評価することにより定量化された。

詳細な開示
第一の態様では、本発明は、乳酸菌（例えば、母株と比べて、発酵乳において高い粘性を生じる細菌、又は例えば、発酵乳において約７０Ｐａ超（例えば、３７℃で１２時間培養後、せん断応力として測定された場合、７１超、又は７３Ｐａ超）の粘性を生じる細菌）を製造するための方法であって、以下：
ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；及び
ｂ）菌株のＧａｌＫ遺伝子に変異を導入すること、
を含む方法、に関する。

従って、第一の態様の実施形態は以下である：
−母株と比べて、発酵乳において高い粘性を生じる（例えば３７℃で１２時間培養後、例えばせん断応力として測定される）乳酸菌を製造するための方法であって、以下：
ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；及び
ｂ）菌株のＧａｌＫ遺伝子中に変異を導入すること、
を含む方法。
−発酵乳において約７０Ｐａ超の粘性を生じる（例えば３７℃で１２時間培養後、例えばせん断応力として測定される）乳酸菌を製造するための方法であって、以下：
ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；及び
ｂ）菌株のＧａｌＫ遺伝子に変異を導入すること、
を含む方法。

現在好ましい実施形態では、粘性は、３７℃で１２時間培養後、せん断応力として、及び／又は下記に記述されるアッセイで測定されるように測定される。従って、本発明の第一の態様の現在好ましい実施形態は、３７℃で１２時間培養後、せん断応力として測定された場合、発酵乳において約７０Ｐａ超の粘性を生じる乳酸菌を製造するための方法であって、以下：
ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；及び
ｂ）菌株のＧａｌＫ遺伝子に変異を導入すること、
を含む方法である。

本発明の方法は、以下：
ｃ１）質感を生じる変異株、例えば母株よりもより質感を生じる、又は乳基質の粘性を増加させる菌株をスクリーニングすること、及び
ｃ２）母株と比較して、改良されたガラクトース分解／発酵活性のような、Ｇａｌ＋表現型を有する変異株をスクリーニングすること、
からなる群から選択される１又は複数のさらなるステップ（単数又は複数）を含んでもよい。

変異は、遺伝子のプロモーター領域、例えば、遺伝子の−１０領域（プリブノーボックス）に導入されてもよい。

本発明の方法の興味深い実施形態では、変異は、野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ）におけるＣ及びＧの一つ又は双方の、Ａ及びＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドとの置き換えをもたらす。

変異は、野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ）におけるＣの、Ａ及びＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドとの置き換えをもたらしてもよい。

一つの実施形態では、変異は、野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ）のＣの、Ｔとの置き換えをもたらし、及び／又は変異は、ヌクレオチド配列ＴＡＴＧＡＴ、ＴＡＴＴＡＴ又はＴＡＣＴＡＴを有する−１０領域をもたらす。

変異は、遺伝子操作技術の使用により、及び／又は突然変異生成の使用により、例えば、随意的に、ＧａｌＫ遺伝子における変異を実証するためのＧａｌＫ遺伝子の分析に続く、放射線又は化学物質での処理により、導入されてもよい。

細菌（母株）は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群に属する属から選択されてもよい。興味深い細菌は、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属する。

さらなる態様では、本発明は、本発明の方法により得られる乳酸菌に関する。

また、本発明は、３７℃で１２時間培養後、せん断応力として測定された場合、発酵乳において約７０Ｐａ超の粘性を生じる乳酸菌に；ＧａｌＫ遺伝子の−１０領域に変異を有する（野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ）と比較して）乳酸菌であって、変異がヌクレオチド配列ＴＡＴＧＡＴ、ＴＡＴＴＡＴ又はＴＡＣＴＡＴを有する−１０領域をもたらす乳酸菌に；及びＧａｌＫ遺伝子の−１０領域に変異を有し、その変異が野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ）中のＣの、Ａ及びＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドで置き換えられた乳酸菌に、関する。興味深い実施形態では、変異は、野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ）中のＣの、Ｔとの置き換えもたらす。

興味深い実施形態では、本発明の乳酸菌は、配列番号５、又は−３５領域、及び−１０領域を含む、それらのプロモーター領域を含む。乳酸菌は、好ましくは、ストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する。

さらなる実施形態では、本発明は、以下：ＣＨＣＣ１１３７９（ＤＳＭ２２８８４）、ＣＨＣＣ１１３４２、ＣＨＣＣ１１９７６、及びこれらの任意の変異体（ｍｕｔａｎｔ）及び変異体（ｖａｒｉａｎｔ）からなる群から選択されるストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する細菌株に関連する。加えて、本発明は、本明細書で言及される全く新規な菌株及びそれらの変異体（ｍｕｔａｎｔ）及び変異体（ｖａｒｉａｎｔ）に関する。

さらなる態様では、本発明は、本発明の乳酸菌、例えば、ＣＨＣＣ１１３７９菌株に属する細菌、を含む組成物に関する。そのような組成物は、少なくとも１０ｅｘｐ１０ＣＦＵ（細胞形成単位）の前記細菌を含むことが好ましい。

組成物は、混合物として、又はパーツからなるキットとして、以下、
−ラクトバチルス種に属する菌株、例えば、ラクトバチルス・ブルガリクス、又はラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株；及び
−本発明の乳酸菌の株、例えばストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する株、
を含んでもよい。

ラクトバチルス種に属する菌株は、多糖（例えば、ヘテロ多糖、ホモ多糖）及び／又はフルクトシルトランスフェラーゼ酵素を産生するラクトバチルス種に属する菌株であることが現在好ましい。

組成物は、少なくとも１０ｅｘｐ１０ＣＦＵ（細胞形成単位）のラクトバチルス種に属する菌株；及び少なくとも１０ｅｘｐ１０ＣＦＵのストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する菌株を含んでもよい。

組成物は、好ましくはスターター培養として使用可能であり、凍結、凍結乾燥、又は液体形態である。

他の態様では、本発明は、本発明の乳酸菌、菌株、又は組成物で乳基質（例えば牛乳）を発酵させることを含む、発酵乳製品（ｍｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｔ）／乳製品（ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）を生産するための方法に関する。

本方法は、さらにラクトバチルス種に属する菌株、例えば、ラクトバチルス・ブルガリクス、又はラクトバチルス・ファーメンタム、例えばＬＢ１８、ＣＨＣＣ１００１９（ＤＳＭ１９２５２）、ＤＳＭ２２５８４、又はＣＨＣＣ３９８４（ＤＳＭ１９２５１）からなる群から選択される菌株、及びこれらの菌株の任意の変異体（ｍｕｔａｎｔ）及び変異体（ｖａｒｉａｎｔ）で乳基質を発酵させることを含んでもよい。

乳基質は、ラクトバチルス種に属する菌株での発酵の前、最中、後に、前記の菌株又は細菌、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する菌株で発酵させてもよい。

本方法は、発酵の前、最中、及び／又は後に、乳基質に、例えば、以下：タンパク質を架橋することができる酵素、トランスグルタミナーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、キモシン、及びレンネットからなる群から選択される酵素を添加することを含んでもよい。

他の態様では、本発明は、本発明の方法により得ることのできる乳製品、例えば発酵乳製品（例えばヨーグルト又はバターミルク）、又はチーズ（例えばフレッシュチーズ又はパスタ・フィターラ）に関する。発酵乳製品は、例えば、撹拌型製品、又はセット型製品でもよい。

乳製品は、以下：果実濃縮物、シロップ、プロバイオティック細菌培養、着色剤、増粘剤、香料、及び保存剤からなる群から選択される成分を任意で含んでもよく；及び／又はそれは任意で撹拌型製品、セット型製品、又は飲料製品の形態である。

また本発明は、本発明の乳酸菌（例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する菌株、例えばＤＳＭ２２８８４）、及びラクトバチルス・ブルガリクス、及びラクトバチルス・ファーメンタム（例えば、ＣＨＣＣ１００１９（ＤＳＭ１９２５２）、ＣＨＣＣ３９８４（ＤＳＭ１９２５１）、及びＣＨＣＣ２００８（ＤＳＭ２２５８４））から選択される乳酸菌種で、乳基質（例えば牛乳）を発酵させることにより作られる乳製品に関する。

本発明の興味深い乳製品では、例えば、３７℃で１２時間培養後、せん断応力として測定された場合、１００Ｐａ超（例えば、１０２超、又は１０４Ｐａ超）の粘性を有する。現在好ましい実施形態では、１００Ｐａ超の粘性は、細菌細胞の増殖単独により得られるが、しかし高い粘性値は、化合物、例えばゼラチン、カラギーナンなどの添加により得ることができる。

定義
本明細書で用いられるように、用語「乳酸菌」とは、グラム陽性、微好気性又は嫌気性細菌を指し、それは、主に産生される酸として乳酸、酢酸、プロピオン酸を含む酸の産生と共に糖を発酵させる。工業的に最も有用な乳酸菌は、「ラクトバチルス」目内で発見されており、それは、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバチルス種、ロイコノストック種、シュードロイコノストック（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種を含む。加えて、偏性嫌気性細菌、ビフィズス菌、すなわちビヒトバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の群に属する、乳酸を産生する細菌は、一般的に乳酸菌の群に含まれる。これらは、単独で、又は他の乳酸菌と組み合わせて、しばしば食品培養物として用いられる。ラクトバチラス種、及びストレプトコッカス・サーモフィラスの細菌を含む乳酸菌は、通常、バルクスターター増殖のための凍結又は凍結乾燥された培養物として、又は乳製品、例えば発酵乳製品の製造のための発酵ベッセル又はバットへの直接植菌を意図した、いわゆる「直接バット投入（Ｄｉｒｅｃｔ Ｖａｔ Ｓｅｔ）」（ＤＶＳ）培養物として、乳業に供給される。そのような培養は、一般的に「スターター培養」又は「スターター」として呼ばれる。

用語「乳」とは、任意の哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、又はラクダを搾乳することにより得られる乳状分泌物として理解される。好ましい実施形態では、乳は牛乳である。乳なる用語はまた、植物原料から作られるタンパク質／脂肪溶液、例えば、豆乳をまた含む。

用語「乳基質」とは、本発明の方法に従って発酵に供されることができる任意の未加工及び／又は加工された乳原料でもよい。従って、有用な乳基質は、任意の乳又はタンパク質を含む乳様製品の溶液／懸濁液、例えば、全又は低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、再構成乳粉末、コンデンスミルク、粉ミルク、ホエー、ホエー透過物、乳糖、乳糖の結晶化由来の母液、ホエータンパク質濃縮物、又はクリームを含むがこれに限定されない。言うまでもなく、乳基質は、例えば、実質的に純粋な哺乳動物乳、又は還元乳粉末である任意の哺乳動物由来でもよい。

発酵の前に、乳基質は、当該技術分野で知られている方法に従って、均質化及び殺菌されてもよい。

「均質化すること」とは、本明細書で用いられるように、可溶性懸濁液又はエマルジョンを得るために激しく混合することを意味する。均質化が発酵の前に行われる場合、それは、乳脂肪が乳から分離しないように、小さいサイズに分散するように行われる。これは、乳を高圧で小孔に強制的に通すことにより達成され得る。

「殺菌すること」とは、本明細書で用いられるように、生きている有機体、例えば微生物の存在を減少させる、又は取り除くための、乳基質の処理を意味する。好ましくは、殺菌は、特定の時間、特定の温度を維持することにより達成される。特定の温度は、通常加熱により達成されてもよい。温度及び持続時間は、特定の細菌、例えば有害な細菌を殺す又は不活性にするために選択されてもよい。急速に冷却するステップが続いてもよい。

本発明の方法における「発酵」とは、微生物の作用を介して、アルコール又は酸への糖類の変換を意味する。好ましくは、本発明の方法における発酵は、乳糖の乳酸への変換を含む。

発酵乳製品の製造に用いられる発酵プロセスはよく知られており、当業者は、好適なプロセス条件、例えば温度、酸素、微生物（単数又は複数）の量及び／又は特性、及び処理時間をどのように選択するかを知っている。言うまでもないが、発酵条件は、本発明の達成を支持するために、すなわち、固体又は液体形態における乳製品（発酵乳製品）を得るために選択される。

用語「撹拌型製品」とは、発酵ステージ下で形成される凝塊の分解及び液状化をもたらす、機械的処理を発酵後に持続する、発酵乳製品を特に意味する。機械的処理は、典型的には、ゲルを撹拌すること、ポンピングすること、濾過すること、又は均質化することにより、又は他の成分と共にそれを混合することにより得られるがこれに限らない。撹拌型製品は、典型的には９〜１５％の無脂肪含量の乳固体を有するがこれに限らない。

用語「セット型製品」とは、スターター培養、例えばスターター培養で植菌され、植菌ステップの次にパッケージ化され、その後パッケージ中で発酵する乳に基づく製品を含む。

本文脈において、用語「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」とは、例えば、遺伝子操作、放射線及び／又は化学処理により、本発明の菌株由来の菌株として理解されるべきである。変異体は、機能的に同等な変異体、例えば、母株のように、実質的に同等又は改良された特性（例えば、質感、せん断応力、粘性、ゲル剛性、マウスコーティング（ｍｏｕｔｈ ｃｏａｔｉｎｇ）、風味、後酸性化（ｐｏｓｔ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、酸性化速度、及び／又はファージ頑健性（ｐｈａｇｅ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）に関して）を有する変異体であることが好ましい。そのような変異体は、本発明の一部である。

特に、用語「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」とは、化学的突然変異原、例えばエタンメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、又はＮ‐メチル‐Ｎ’‐ニトロ‐Ｎ‐ニトログアニジン（ＮＴＧ）、ＵＶ光での処理を含む任意の従来から用いられている変異誘発処理に、本発明の菌株を、供することにより得られる菌株、又は自発的に生じる変異体（ｍｕｔａｎｔ）を意味する。変異体（ｍｕｔａｎｔ）は、いくつかの変異誘発処理（１回の処理は、スクリーニング／選択ステップが後に続く、１回の変異誘導ステップであると理解されるべきである）に供されるが、しかし２０回以下、又は１０回以下、又は５回以下の処理（又はスクリーニング／選択ステップ）が行われることが目下好ましい。目下好ましい変異体では、細菌のゲノムにおいて、５％未満、又は１％未満、又は０．１％未満のヌクレオチドが、母株と比較して、別のヌクレオチドに変化している、又は欠損している。本文脈において、用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、例えば、実質的に同等又は改良された特性（例えば、質感、せん断応力、粘性、ゲル剛性、マウスコーティング（ｍｏｕｔｈ ｃｏａｔｉｎｇ）、風味、後酸性化（ｐｏｓｔ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、酸性化速度、及び／又はファージ頑健性（ｐｈａｇｅ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）に関して）を有する本発明の菌株と機能的に同等である菌株として理解されるべきである。適切なスクリーニング技術を用いて同定され得るそのような変異体（ｖａｒｉａｎｔ）は、本発明の一部である。

本文脈において、「質感」は、３７℃で１２時間培養後、せん断応力として測定される。質感の分析のために用いられるアッセイ：
インキュベーションの翌日、発酵乳は１３℃に移され、サンプルが均質になるまで、穴の開いたディスクが取り付けられた棒により、穏やかに撹拌された。サンプルのレオロジー学的性質は、Ｃ２５同軸ケーブル測定系を備えたレオメーター（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ，Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で評価された。粘性試験は、２１ステップで０．２７から３００ １／ｓまで変化するせん断率で行われた。せん断率は、上昇させ、その後減少させ、せん断応力の上昇及び下降曲線、並びに見かけの粘性は記録された。遅延及び積分時間はそれぞれ５秒及び１０秒であった。

本発明を記載する文脈において（特に添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」、及び「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本明細書で他に指示されない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の双方を網羅すると解釈される。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含むこと（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に記載のない限り、制約のない用語（すなわち、「含むがこれに限定されないこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する）として解釈される。本明細書での値の範囲の記述は、本明細書で他に指示のない限り、範囲内にあるそれぞれの別個の値を個別に示す簡単な方法として役割を果たすことが意図されるにすぎず、あたかもそれが本明細書で個別に詳述されたように、それぞれの別個の値は、明細書中に組み込まれる。本明細書で記述される全ての方法は、本明細書で他に指示のない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われ得る。本明細書で提供されるありとあらゆる実施例、又は例示的な言語（例えば、「例えば」）の使用は、発明をより理解することを意図するにすぎず、他に請求のない限り、本発明の範囲について制限を課すものではない。本明細書におけるいかなる言語も、本発明の実施に必須である任意の請求されない要素を指すものとして解釈されるべきである。

実施例１ ストレプトコッカス株のガラクトース陽性変異体の調製
ガラクトース発酵菌株の単離
変異体は、ストレプトコッカス・サーモフィラス菌株ＣＨＣＣ６００８（＝ＳＴ６００８、ＤＳＭ１８１１１）のガラクトース発酵変異体として単離された。ＣＨＣＣ６００８細胞は、変異体単離ステップの前に、任意の変異原性化合物によっても、又はＵＶ光によっても変異誘発されなかった。従って単離された菌株は、ＣＨＣＣ６００８の自然発生的なガラクトース陽性変異体に似ている。

変異体単離の前に、ＣＨＣＣ６００８は、２％ガラクトースを含むＭ１７アガープレート（Ｍ１７‐ｇａｌプレート）上に縞状に播かれた。ＣＨＣＣ６００８は唯一の炭水化物源としてガラクトース上で増殖しなかった。

ＣＨＣＣ６００８の一晩の培養は、その後Ｍ１７‐ｇａｌプレート上にプレートされ、いくつかのコロニーは、３７℃で２日の培養後、単離されることができた。いくつかの変異体は、Ｍ１７‐ｇａｌプレート上で精製され、唯一の炭水化物として２％ガラクトースを含むＭ１７培地で再試験された。

ＣＨＣＣ６００８が、Ｍ１７‐ｇａｌ培地においてｐＨを有意に下げなかった一方で、精製された変異体の一つであるＣＨＣＣ１１３７９は、３７℃で１０時間後に５．３のｐＨに達し、従って、ＣＨＣＣ６００８由来のガラクトースを発酵する変異体と考えられた。

ＣＨＣＣ１１３４２及びＣＨＣＣ１１９７６は、同様の方法で単離された。

遺伝子操作による変異体の単離
ガラクトース陽性変異体はまた、部位特異的変異導入により作られ得る。ｇａｌＫ‐１０プロモーターボックス内の変異導入されたヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにより特異的ＤＮＡフラグメントを増幅するために用いられた。所望の変異を有するＰＣＲフラグメントは、ベクタープラスミドにクローン化され、ストレプトコッカス・サーモフィラス標的菌株に形質転換され、変異は染色体に統合され、組み換えにより野生型ｇａｌＫプロモーター領域を交換する。菌株の単離は上記のように行われる。

発酵乳における質感の分析
インキュベーションの翌日、発酵乳は１３℃に移され、サンプルが均質になるまで、穴の開いたディスクが取り付けられた棒により、穏やかに撹拌された。サンプルのレオロジー学的性質は、Ｃ２５同軸ケーブル測定系を備えたレオメーター（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ，Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）により評価された。粘性試験は、２１ステップで０．２７から３００ １／ｓまで変化するせん断率で行われた。せん断率は、上昇させ、その後減少させ、せん断応力の上昇及び下降曲線、並びに見かけの粘性は記録された。遅延及び積分時間はそれぞれ５秒及び１０秒であった。さらなる分析のために、３００ １／ｓでのせん断応力が選択された。レオメーターの結果は、ＣＨＣＣ１１３７９が、ＣＨＣＣ６００８と比較して、１０％まで上昇したせん断応力を有することが示された（母株ＣＨＣＣ６００８についての６７．５Ｐａ（パスカル）と比較して、ＣＨＣＣ１１３７９についてのせん断応力値７４．０Ｐａ、図１を参照のこと）。

乳における質感の分析
別の実験では、ＣＨＣＣ１１３７９は、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来の菌株が、種ラクトバチルスデルブリュッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の亜種であるブルガリクス由来の菌株と一緒に、４３℃のスキムミルク中で共培養される、ヨーグルト培養の一部として用いられた。ヨーグルトの製造においての唯一の違いが、野生型ＣＨＣＣ６００８の変わりのＣＨＣＣ１１３７９の使用であった場合、せん断応力はまた、１０％まで増加した。（ＣＨＣＣ６００８を含むヨーグルト培養についての９４．７Ｐａと比較して、ＣＨＣＣ１１３７９を含むヨーグルト培養について１０５．０Ｐａ）。

ＣＨＣＣ１１３７９由来のｇａｌＫプロモーター領域の配列決定
ｇａｌ陽性変異体ＣＨＣＣ１１３７９についての変異の種類を明らかにするために、ｇａｌＫ遺伝子（ストレプトコッカス・サーモフィラス由来のガラクトキナーゼについてコードする）の先頭は、配列決定された。ＣＨＣＣ１１３７９について、ｇａｌＫプロモーターの領域における変異は、同定された（下記を参照のこと）。それぞれの変異は、母株６００８と比較して強力なプロモーター活性を導く可能性が高く、観察されるガラクトース陽性表現型を説明する。これは、−１０プロモーターボックスの共通配列が「ＴＡＴＡＡＴ」であり、ＣＨＣＣ６００８の‐１０ボックス（領域）のヌクレオチド３における変異（「ＴＡＣＧＡＴ」）が、ＣＨＣＣ１１３７９中の共通配列と高い相同性を有する‐１０ボックス（「ＴＡＴＣＡＴ」）を導くという事実に基づく。

ＣＨＣＣ１１３７９由来のｇａｌＫ遺伝子のプロモーター領域。ＣＨＣＣ１１３７９ｇａｌＫプロモーター内の点変異は、灰色の記号で示される。ストレプトコッカス・サーモフィラスＳＴ１１１由来の公知のｇａｌＫ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＹ７０４３６８）は、比較として示される。−３５：−３５‐プロモーター領域；−１０：−１０‐プロモーター領域；ＲＢＳ：リボソーム結合部位。

この発明の好ましい実施形態は、本明細書で記述され、発明を実施するための、発明者らが知っているベストモードを含む。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、先の記述を読んだ場合、当業者に明らかになり得る。発明者らは、当業者らが必要に応じてそのようなバリエーションを用いることを予測し、本発明者らは、発明が本明細書で特に記述されるようでなく実施されることを意図する。従って、この発明は、適用法により認められるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に詳述される主題の全ての変更物及び同等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書で他に指示のない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明により網羅される。

寄託及び専門的解決方法
菌株ストレプトコッカス・サーモフィラスＣＨＣＣ１１３７９は、２００９年８月２６日に、受託番号ＤＳＭ２２８８４の下にＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された。
ストレプトコッカス・サーモフィラス（ＳＴ）菌株ＳＴ６００８（ＣＨＣＣ６００８とも称される）のサンプルは、受託日２００６年３月２９日に、受託番号ＤＳＭ１８１１１でＤＳＭＺに寄託された。ＣＨＣＣ１１３４２（ＤＳＭ２２９３２）及びＣＨＣＣ１１９７６（ＤＳＭ２２９３４）は、２００９年９月８日にＤＳＭＺに寄託された。

ＤＳＭＺにおけるさらなる寄託：
ＣＨＣＣ１００１９（ＤＳＭ１９２５２）、ＣＨＣＣ３９８４（ＤＳＭ１９２５１）：寄託日２００７年４月３日、
ＣＨＣＣ２００８（ＤＳＭ２２５８４）：寄託日２００９年５月１９日。

寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条件下で行われた。

出願人は、寄託された微生物のサンプルは、出願人により承認された専門家にのみ入手されるべきであると要求する。

参考文献
Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１，７，ｐ．３６５９−６７（２００５）
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１３（２００７）１９５−２００
ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ．２００２，ｐ．７８４−７９０
Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ ９２：４７７−４８２（２００９）
ＷＯ２００８／０４０７３４Ａ１，ＷＯ２００７／０２５０９７Ａ２，ＵＳ７２４１６１０Ｂ２，ＷＯ２００７／１４４７７０Ａ２，
ＷＯ２００４／０８５６０７Ａ，ＷＯ２００８／１４８５６１Ａ

この特許書類で引用された全ての参考文献は、それらの全体が参照によりここで本明細書に援用される。

Claims (34)

1. 乳酸菌を製造するための方法であって、以下：
   ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；及び
   ｂ）該菌株のＧａｌＫ遺伝子に変異を導入すること、
   を含む、方法。
2. 母株と比較して発酵乳において高い粘性（例えば、３７℃で１２時間培養後、せん断応力として測定される）を生じる乳酸菌を製造するための方法であって、以下：
   ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；及び
   ｂ）該菌株のＧａｌＫ遺伝子に変異を導入すること、
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 発酵乳において約７０Ｐａ超の粘性（例えば、３７℃で１２時間培養後、せん断応力として測定される）を生じる乳酸菌を製造するための方法であって、以下：
   ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；及び
   ｂ）該菌株のＧａｌＫ遺伝子に変異を導入すること、
   を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 以下：
   ｃ１）質感を生じる変異株、例えば母株と比較してより質感を生じる、又は乳基質の粘性を増加させる菌株をスクリーニングすること；及び
   ｃ２）Ｇａｌ＋表現型、例えば母株と比較して改良されたガラクトース分解／発酵活性を有する変異株をスクリーニングすること、
   からなる群から選択される、一又は複数のさらなるステップ（単数又は複数）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 変異が、遺伝子のプロモーター領域中に導入される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 変異が遺伝子の−１０領域（プリブノーボックス）中に導入される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 変異が、野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ、配列番号１）におけるＣ及びＧの一つ又は双方と、Ａ及びＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドとの置き換えをもたらす、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 変異が、野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ、配列番号１）のＣと、Ａ及びＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドとの置き換えをもたらす、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 変異が、野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ、配列番号１）のＣと、Ｔとの置き換えをもたらす、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 変異が、ヌクレオチド配列ＴＡＴＧＡＴ（配列番号２）、ＴＡＴＴＡＴ（配列番号３）、又はＴＡＣＴＡＴ（配列番号４）を有する−１０領域をもたらす、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 変異が遺伝子操作技術の使用により導入される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 変異が、突然変異生成により、例えば放射線又は化学物質で処理により導入され、ＧａｌＫ遺伝子中の変異を検証するために、続いて任意でＧａｌＫ遺伝子の分析を行う、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 細菌が、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種に属する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により得られる乳酸菌。
15. 例えば、３７℃で１２時間培養後、せん断応力として測定された場合、発酵乳において約７０Ｐａ超（例えば７３Ｐａ超）の粘性を生じる乳酸菌。
16. ＧａｌＫ遺伝子の−１０領域中に（野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ、配列番号１）と比較して）変異を有する乳酸菌であって、変異が、ヌクレオチド配列ＴＡＴＧＡＴ（配列番号２）、ＴＡＴＴＡＴ（配列番号３）、又はＴＡＣＴＡＴ（配列番号４）を有する−１０領域をもたらす乳酸菌。
17. 変異が、野生型の−１０領域（ＴＡＣＧＡＴ、配列番号１）中のＣと、Ａ及びＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドとの置き換えをもたらす、ＧａｌＫ遺伝子の−１０領域中に変異を有する乳酸菌。
18. 前記変異がＣのＴとの置換をもたらす、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の乳酸菌。
19. 配列番号５、又は−３５領域及び−１０領域を含むそのプロモーター領域を含む、乳酸菌。
20. ストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の乳酸菌。
21. ＣＨＣＣ１１３７９（ＤＳＭ２２８８４）、ＣＨＣＣ１１３４２（ＤＳＭ２２９３２）、ＣＨＣＣ１１９７６（ＤＳＭ２２９３４）、及びこれらの任意の変異体（ｍｕｔａｎｔ）及び変異体（ｖａｒｉａｎｔ）からなる群から選択される、ストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する細菌株。
22. 例えば、菌株ＣＨＣＣ１１３７９に属する細菌を含む組成物である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の乳酸菌を含む組成物。
23. 混合物として、又はパーツからなるキットとして、以下：
    ‐ラクトバチルス種に属する菌株；及び
    ‐請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の乳酸菌の菌株、
    を含む、組成物。
24. ラクトバチルス種に属する菌株が、多糖（例えば、ヘテロ多糖、ホモ多糖）及び／又はフルクトシルトランスフェラーゼ酵素を産生するラクトバチルス種である、請求項２２又は２３に記載の組成物。
25. 少なくとも１０ｅｘｐ１０ＣＦＵ（細胞形成単位）のラクトバチルス種に属する菌株；及び少なくとも１０ｅｘｐ１０ＣＦＵのストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する菌株を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. スターター培養として使用可能であり、凍結、凍結乾燥、又は液体形態である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
27. 請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の乳酸菌、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の菌株、又は請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物で、乳基質を発酵させることを含む、発酵乳製品（ｍｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｔ）／乳製品（ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）を製造するための方法。
28. ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種に属する菌株、例えばラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、又はラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の菌株、例えば、ＬＢ１８、ＣＨＣＣ１００１９（ＤＳＭ１９２５２）、ＣＨＣＣ２００８（ＤＳＭ２２５８４）、又はＣＨＣＣ３９８４（ＤＳＭ１９２５１）、及びこれらの菌株の任意の変異体（ｍｕｔａｎｔ）及び変異体（ｖａｒｉａｎｔ）からなる群から選択される菌株で、乳基質を発酵させることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 乳基質が、ラクトバチルス種に属する菌株で発酵させる前、最中、後に、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の菌株又は細菌、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する菌株で発酵される、請求項２７又は２８に記載の方法。
30. 発酵の前、最中、及び／又は後に、乳基質に酵素、例えば、以下：タンパク質を架橋することのできる酵素、トランスグルタミナーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、キモシン、及びレンネットからなる群から選択される酵素を添加することを含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法により得られる、例えば発酵乳製品（例えばヨーグルト又はバターミルク）、又はチーズ（例えばフレッシュチーズ又はパスタ・フィターラ）などの乳製品。
32. 果実濃縮物、シロップ、プロバイオティック細菌培養物、着色剤、増粘剤、香料、及び保存剤からなる群から選択される成分を任意で含み；及び／又は任意で撹拌型製品、セット型製品、又は飲料製品の形態である、請求項３１に記載の乳製品。
33. 乳基質（例えば牛乳）を、本発明の乳酸菌（例えばストレプトコッカス・サーモフィラス種に属する菌株、例えばＤＳＭ２２８８４）、及びラクトバチルス・ブルガリクス及び／又はラクトバチラス・ファーメンタムから選択される乳酸菌で発酵させることにより作られる、請求項３１又は３２に記載の乳製品。
34. せん断応力として測定された場合、１００Ｐａ超の粘性を有する、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の乳製品。

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