JP5898220B2 - テクスチャを改変する乳酸菌株 - Google Patents
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Description
本発明は、乳酸菌、例えばラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus)及びストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)の突然変異体であって、抗生物質D−シクロセリン及び/又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有し、親株の他の増殖特性を維持しつつ、乳中で増殖させた場合に増加したテクスチャを与えることが発見されている突然変異体に関する。本発明はさらに、培養物、例えばかかる突然変異体を含むスターター培養物、及び前記培養物で発酵させた乳製品に関する。
食品産業は、食品の風味及びテクスチャを改良するためだけでなく、これらの食品の保管寿命を延長するために多数の細菌、特に乳酸菌を使用する。乳業の場合では、乳酸菌は、(発酵による)乳の酸性化をもたらすためだけでなく、これらが組み込まれる製品のテクスチャを改変するために、集中的に用いられる。
本発明の発明者らは、驚くべきことに、D−シクロセリンに対する耐性を有する乳酸菌突然変異体の群が、前記細菌が乳の発酵に用いられる場合、母株よりも高い剪断応力及び/又はゲル剛性を生成することを発見した。
定義
本明細書において、用語「乳酸菌」とは、グラム陽性の微好気性細菌、又は嫌気性細菌を指し、これは、乳酸、主に生成する酸として酢酸、及びプロピオン酸を含む酸の生成と共に糖を発酵させる。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバチルス種、リューコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)種、エンテロコッカス(Enterococcus)種、及びプロピオニバクテリウム(Propionibacterium)種を含む「ラクトバチルス」目内で発見されている。加えて、偏性嫌気性細菌の群に属する乳酸を生産する細菌であるビフィズス菌、すなわちビヒトバクテリウム種は、一般的に乳酸菌の群に含まれる。これらは、単独で、又は他の乳酸菌と組み合わせて、しばしば食品培養物として用いられる。ラクトバチラス種、及びストレプトコッカス・サーモフィラスの細菌を含む乳酸菌は、乳製品、例えば発酵乳製品の製造のために、バルクスターター増殖のための凍結若しくは凍結乾燥された培養物、又は発酵ベッセル若しくはバットへの直接植菌を意図したいわゆる「直接バット投入(Direct Vat Set)」(DVS)培養物のいずれかとして、通常、乳業に供給される。かかる培養物は、一般的に「スターター培養物」又は「スターター」として呼ばれる。
D−シクロセリン(D−4−アミノ−イソオキサゾリドン)は、アラニンラセマーゼ、D−アラニル−D−アラニンリガーゼ、D−アラニルアラニンシンターゼ及びD−アラニンパーミアーゼを阻害する抗生物質であり、細胞溶解を引き起こす。D−アラニンラセマーゼは、細胞壁のペプチドグリカン層の必須部分であるD−アラニンの生産に必須である。D−シクロセリンに耐性を示すマイコバクテリウム属(Mycobacterium)の突然変異体は、D−アラニンラセマーゼ遺伝子の発現を増加させることによりD−アラニンを過剰生産する(Caceres et al. (1997), J. Bacteriol. 179: 5046-5055)。従って、本発明の発明者らは、D−アラニンの高い生産性を天然に有する乳酸菌株の自然突然変異体を単離することができる可能性があることを予測した。かかる突然変異体は単離され、特徴付けられた。
a)乳酸菌母株を提供する工程;
b)D−シクロセリン及び/又はD−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する母株の突然変異体を単離する工程;そして
c)乳中で増殖させた場合に、母株と比較して、より高い剪断応力及び/又はより高いゲル剛性により決定されるより高いテクスチャを生産する場合に突然変異体を選択し、これによりテクスチャを改変する乳酸菌株を得る工程
を含む方法に関する。
a)乳酸菌母株を提供する工程;
b)D−シクロセリン及び/又はD−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する母株の突然変異体を単離する工程;そして
c)乳中で増殖させた場合に、母株と比較して、より高い剪断応力及び/又はより高いゲル剛性により決定されるより高いテクスチャを生産する場合に突然変異体を選択し、これにより乳中で増殖させた場合に、増加した剪断応力及び/又はゲル剛性をもたらす乳酸菌突然変異体を得る工程
を含む方法に関する。
i)本発明の第二、第四、又は第六の態様のストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する株;及び
ii)本発明の第二、第三、又は第五の態様のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種に属する株
を含む。
実施例1:改良されたレオロジー特性を有するラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスにおける突然変異体を単離するためのD−シクロセリンの使用
材料及び方法
株
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスCHCC13995
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスCHCC12944(CHCC13995のD−シクロセリン耐性突然変異体)
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスCHCC12945(CHCC13995のD−シクロセリン耐性突然変異体)
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株CHCC13995の突然変異体を単離するために、単一コロニーの増殖に由来する細胞を、50〜100μg/mlの範囲でD−シクロセリン含むMRS培地に植菌し、飽和するまで増殖させた。細胞を希釈し、MRSプレートにプレートし、50〜100μg/mlの範囲のD−シクロセリン存在下において増殖する能力について、コロニーをマイクロタイタープレートでスクリーニングした。典型的には、得られたコロニーの25%を、D−シクロセリンの存在下で早く増殖するものとして同定した。これらをさらなる研究のために選択した。選択されたD−シクロセリン耐性突然変異体を更に純化し、乳中で増殖するこれらの能力について試験した。この研究の間、いくつかの突然変異体が、これらの条件下で親株よりも著しく高いテクスチャを生産したことが観察された。
レオロジー解析は、脱脂粉乳が2%添加された全脂肪牛乳中での増殖後、ReoLogica Instruments AB, Sweden製のStressTechレオメーターで行なった。
CHCC12944及びCHCC12945と称されるCHCC13995の二つ派生体は、母株よりも増加した剪断応力(粘度)及びゲル剛性を有する有意に高いテクスチャを生産した。これは、発酵乳中をピペットでかき混ぜることにより明らかであった。さらに、乳清の量が様々な突然変異体間で異なることが観察され、これは、さらなる研究のための突然変異体を選択するために用いられるパラメーターの一つとなった(下記の表1を参照のこと)。選択された突然変異体は、低いレベルのシネレシスを示したものであった:下記の実施例(表1)中の突然変異体1及び突然変異体11は、それぞれ突然変異体CHCC12944とCHCC12945に対応する。
本明細書に記載されるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス D−シクロセリン突然変異体は、培養物、例えばスターター培養物に組み込まれてもよく、これは所望の高レベルのテクスチャを生産する。
材料及び方法
株
ストレプトコッカス・サーモフィルス CHCC13994
ストレプトコッカス・サーモフィルス CHCC13236(CHCC13994のD−シクロセリン耐性突然変異体)
ストレプトコッカス・サーモフィルス CHCC13235(CHCC13994のD−シクロセリン耐性突然変異体)
ストレプトコッカス・サーモフィルスCHCC13994の突然変異体を単離するために、単一コロニーの増殖に由来する細胞を50〜70μg/mlの範囲でD−シクロセリン含むM17+2%乳糖培地に植菌し、飽和するまで増殖させた。細胞を希釈し、M17+2%乳糖プレートにプレートし、50〜70μg/mlの範囲のD−シクロセリン存在下において増殖する能力について、コロニーをマイクロタイタープレートで選択し、スクリーニングした。典型的に、得られたコロニーの25%を、D−シクロセリンの存在下で早く増殖するものとして同定した。これらをさらなる研究のために選択した。選択されたD−シクロセリン耐性突然変異体を更に純化し、乳中で増殖するこれらの能力について試験した。この研究の間、いくつかの突然変異体が、これらの条件下で親株よりもより有意により高いテクスチャを生産したことが観察された。乳清の量はまた、高い又は低いゲル剛性の指標として測定された。
レオロジー解析は、脱脂粉乳が2%添加された全脂肪牛乳中での増殖後、ReoLogica Instruments AB, Sweden製のStressTechレオメーターで行なった。
CHCC13235及びCHCC13236と称されるCHCC13994の二つの突然変異体派生物は、母株と比較してより高いテクスチャを生産した。これは、発酵乳中をピペットでかき混ぜることにより明らかであった。さらに、乳清の量が様々な突然変異体間で異なることが観察され、これは、さらなる研究のための突然変異体を選択するために用いられるパラメーターの一つとなった(下記の表3を参照のこと)。選択された突然変異体である表3中のno.9及びno.13は、低いレベルのシネレシスを示した二つであった。二つの突然変異体は、それぞれ指定されたCHCC13236及びCHCC13235と称された。
本明細書に記載されるストレプトコッカス・サーモフィルス D−シクロセリン突然変異体は、培養物、例えばスターター培養物に組み込まれてもよく、これは所望の高レベルのテクスチャを生産する。
ヨーグルトは、9:1の比で混合されたS.サーモフィルス及びLb.デルブルッキー亜種ブルガリクスの組み合わせで作り、脱脂粉乳が2%添加された全脂肪牛乳を植菌した。一つの混合物は、親株CHCC13994とCHCC13995を含み;第二の混合物は、S.サーモフィルス D−シクロセリン突然変異体CHCC13236とLb.デルブルッキー亜種ブルガリクス D−シクロセリン突然変異体CHCC12945を含み;そして第三の混合物は、S.サーモフィルス D−シクロセリン突然変異体CHCC13235とLb.デルブルッキー亜種ブルガリクス D−シクロセリン突然変異体CHCC12945を含む。3つの組み合わせ間の酸性化プロファイルの比較は、二つの突然変異体を含む混合物は、親株との組み合わせよりも、僅かに高い最終pHを有したことを示した(データは示さない)。スプーンでの撹拌は、D−シクロセリン突然変異体で作られた製品が、親株を用いて生産された製品と比較して、撹拌に対する著しく増加した抵抗を有することを示した。加えて、得られたヨーグルトは、3人のヒトにより評価された場合、よりクリーミーなテクスチャ、及び新鮮な風味を有すると考えられた。
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株CHCC12944、CHCC12945、及びCHCC13995は、2010年9月22日にそれぞれDSM 24019、DSM 24020、及びDSM 24021の受託番号でDSMZ (ドイツ微生物細胞培養コレクション(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)、Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)に寄託された。
Tytgat et al. (2009), Curr. Med. Chem. 16(20) : 2566-2580.
Caceres et al. (1997), J. Bacteriol. 179: 5046-5055.
Holtje (2004), The Desk Encyclopedia of Microbiology: 239-258.
Claims (15)
- テクスチャを改変する乳酸菌株を得るための方法であって、前記方法が
a)乳酸菌母株を提供する工程;
b)D−シクロセリン及び/又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する前記母株の突然変異体を単離する工程であって、ここで前記機能的に同等な抗生物質は、D−アラニンラセマーゼの阻害剤である、工程;及び
c)乳中で増殖させた場合に、母株と比較して、より高い剪断応力及び/又はより高いゲル剛性により決定される、より高いテクスチャを生産する場合に前記突然変異体を選択する工程
を含む、方法。 - 前記突然変異体が、母株により生産される剪断応力よりも少なくとも5%高い剪断応力を生産する場合に、c)において選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記突然変異体が、母株により生産されるゲル剛性よりも少なくとも5%高いゲル剛性を生産する場合に、c)において選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程b)が、D−シクロセリン及び/又は前記の機能的に同等な抗生物質を含有する成長培地中/上で前記乳酸菌母株をインキュベートし、そしてD−シクロセリン及び/又は機能的に同等な抗生物質により死滅しない前記母株の突然変異体を単離することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記突然変異体が、自然突然変異体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)の前又は間に、前記母株を変異誘発させることをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記乳酸菌母株が、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus)及びストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)からなる群から選択される株である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- DSM 24019の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクション(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)に寄託されたCHCC12944株、及び、DSM 24020の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されたCHCC12945株からなる群から選択される、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種に属する乳酸菌株。
- DSM 24010の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクション(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)に寄託されたCHCC13235株、及び、DSM 24011の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されたCHCC13236株からなる群から選択される、ストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する乳酸菌株。
- 請求項8又は9に記載の乳酸菌株を含む組成物。
- 混合物又はキットの部分のいずれかとして、
i)請求項9に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する株、及び
ii)請求項8に記載のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種に属する株
を含む、請求項10に記載の組成物。 - スターター培養物として用いることができ、凍結形態、凍結乾燥形態、又は液体形態である、請求項10又は11に記載の組成物。
- 請求項8又は9に記載の乳酸菌株、あるいは請求項10〜12のいずれか一項に記載の組成物を用いて乳基質を発酵させることを含む、乳製品を生産する方法。
- 請求項8又は9に記載の乳酸菌株を含む乳製品。
- 乳製品の製造のための、請求項8又は9に記載の乳酸菌株の使用。
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