CN103270153B - 质构化乳酸细菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对抗生素D‑环丝氨酸和/或功能等效抗生素具有抗性并且在维持亲本菌株的其它生长特性的同时产生增强的质构的乳酸细菌突变株。此外，本发明涉及包含此类突变株的组合物，和涉及用对D‑环丝氨酸和/或功能等效抗生素具有抗性的乳酸细菌发酵的乳制品。

Description

质构化乳酸细菌菌株
技术领域
本发明涉及乳酸细菌突变株，例如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，它们对抗生素D-环丝氨酸和/或功能等效抗生素具有抗性，并且当它们在乳中生长时在保持亲本菌株的其它生长特性的同时还导致质构增强。此外，本发明还涉及包含此类突变株的培养物，例如发酵剂培养物，并且涉及使用所述培养物发酵的乳制品。
背景技术
食品工业使用众多的细菌，特别是乳酸细菌，不但为了改善食品的味道和质构，而且还延长这些食品的货架期。以乳品工业为例，充分使用乳酸细菌不但使乳发生酸化(通过发酵)而且还使乳酸细菌掺入其中的产品质构化。
在食品工业中所使用的乳酸细菌当中，要提到链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。乳酸细菌菌种嗜热链球菌单独或者与其它细菌诸如德氏乳杆菌保加利亚亚种一起广泛用于食物产品，特别是发酵产品的生产中。它们特别用于配制发酵乳例如酸乳酪的生产中所用的酵素。它们当中有一些在所发酵产品的质构增加中起着主导作用。这种特征与多糖产生密切相联。
酸乳酪的当前趋势是追求淡口味和高质构。当今，这通过使用产生淡口味的培养物和添加增稠剂或者蛋白质以产生期望稠度实现。酸乳酪生产者希望能够在不添加增稠剂的情况下制作具有这些特性的酸乳酪。这将帮助他们降低成本并且标签更简洁。一个极其吸引人的实现方式是使用产生高水平质构的发酵剂培养物。
为了满足工业上的需求，提供新颖的质构化乳酸细菌菌株，特别是德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌用于将食物产品质构化变得有必要。尤其需要可以与新颖的质构化嗜热链球菌菌株一起使用的新颖的质构化德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
已经描述了许多不同细菌的对D-环丝氨酸具有抗性的突变株，但是从来没有报道这些突变株可以用于增加乳制品的质构。也没有描述过嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种突变株。
发明内容
本发明的发明人令人惊讶地发现，对D-环丝氨酸具有抗性的一群乳酸细菌突变株在用于乳发酵时产生比亲本菌株更高的剪切应力和/或凝胶刚度。
本发明人已经提供了一种得到此类对抗生素D-环丝氨酸和/或功能等效抗生素具有抗性的质构化乳酸细菌菌株的方法，并且还提供了一组新颖的具有高质构化特性的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的D-环丝氨酸抗性乳酸细菌菌株。
依据上述的惊奇的发现，本发明涉及对D-环丝氨酸和/或功能等效抗生素具有抗性的质构化乳酸细菌菌株，例如德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌菌株，以及一种用于得到此类菌株的方法。此外，本发明涉及包含突变株的培养物，例如发酵剂培养物，并且涉及乳制品，例如用培养物发酵的发酵乳制品。
附图说明
图1显示对于德氏乳杆菌保加利亚亚种亲本菌株CHCC13995和命名为CHCC12944和CHCC12945的两个CHCC13995的D-环丝氨酸突变株，43℃下乳中的酸化特性(pH作为时间的函数)。
图2描述对于亲本菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC13995和命名为CHCC12944和CHCC12945的两个CHCC13995的D-环丝氨酸突变株，43℃下具有2%脱脂乳粉的全脂乳中的剪切应力(300l/s下(Pa))。
图3描述对于亲本菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC13995和命名为CHCC12944和CHCC12945的两个CHCC13995的D-环丝氨酸突变株，43℃下具有2%脱脂乳粉的全脂乳中的凝胶刚度(300l/s下(Pa))。
图4描述对于亲本菌株嗜热链球菌CHCC13994和命名为CHCC13235和CHCC13236的两个CHCC13994的D-环丝氨酸突变株，43℃下具有2%脱脂乳粉的全脂乳中的剪切应力(300l/s下(Pa))。
图5描述对于亲本菌株嗜热链球菌CHCC13994和命名为CHCC13235和CHCC13236的两个CHCC13994的D-环丝氨酸突变株，43℃下具有2%脱脂乳粉的全脂乳中的凝胶刚度(300l/s下(Pa))。
具体实施方式
定义
如本文所使用，术语“乳酸细菌”是指使糖发酵同时产生酸(包括乳酸作为主要产生的酸、乙酸和丙酸)的革兰氏阳性的微需氧或者厌氧细菌。工业上最有用的乳酸细菌存在于“乳杆菌目”内，它包括乳球菌属的某些种(Lactococcus spp.)、链球菌属某些种(Streptococcus spp.)、乳杆菌属某些种(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属某些种(Leuconostoc spp.)、片球菌属某些种(Pediococcus spp.)、短杆菌属某些种(Brevibacterium spp.)、肠球菌属某些种(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属某些种(Propionibacterium spp.)。此外，属于严格厌氧细菌双歧杆菌，即双歧杆菌属某些种(Bifidobacterium spp.)群组的产乳酸细菌通常包括在乳酸细菌群组内。它们单独或者与其它乳酸细菌相结合经常用作食物培养物。乳酸细菌，包括乳杆菌属某种和嗜热链球菌的细菌，正常情况下或者作为用于生产制曲的冰冻或者冷冻干燥培养物或者作为所谓“直投式发酵剂”(DVS)培养物添加到乳品工业中，旨在直接接种到发酵罐或者发酵桶中以生产乳制品，例如发酵乳制品。此类培养物一般称为“发酵剂培养物”或者“发酵剂”。
术语“乳”应当理解为通过对任何哺乳动物例如牛、绵羊、山羊、水牛或者骆驼进行挤奶所得到的乳分泌物。在优选的实施方案中，乳是牛乳。术语乳还包括由植物材料制成的蛋白质/脂肪溶液，例如豆乳。
术语“乳底物”可以是可根据本发明方法进行发酵的任何粗制和/或加工的乳材料。因此，有用的乳底物包括但不限于任何乳或者含蛋白质的乳样产品(例如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复配乳粉、炼乳、干乳、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖结晶的母液、乳清蛋白浓缩物或者乳酪)的溶液/混悬液。显然，乳底物可来源于任何哺乳动物，例如为基本上纯的哺乳动物乳或者复原乳粉。
优选地，乳底物中至少部分蛋白质是乳中天然存在的蛋白质，例如酪蛋白或乳清蛋白。然而，部分蛋白质可以是乳中非天然存在的蛋白质。
在发酵之前，乳底物可以根据本领域中已知的方法均质化和巴氏消毒。
如本文所使用，“均质化”意思是指充分混合以得到可溶性的混悬液或者乳液。如果在发酵之前开展匀质化，则可以将乳脂肪打碎成更小的大小以便其不再与乳分离。这可以通过以高压力迫使乳通过小孔实现。
如本文所使用，“巴氏消毒”意思是指处理乳底物以降低或者消除活生物体例如微生物的存在。优选地，巴氏消毒通过维持特定温度达特定时间阶段实现。特定温度通过加热达到。可以选择温度和持续时间以杀死或者灭活某些细菌，例如有害细菌。之后可以是快速冷却步骤。
本发明方法中的“发酵”意思是指通过微生物作用将碳水化合物转化成醇或者酸。优选地，本发明方法中的发酵包括乳糖向乳酸的转化。
在发酵乳制品生产中使用的发酵工艺是众所周知的并且本领域技术人员会知道如何选择适宜的工艺条件，例如温度、氧、一种或多种微生物的数量和特征以及加工时间。明显地，选择发酵条件以支持本发明的实施，即得到固体或液体形式的乳制品(发酵乳制品)。
在本上下文中，酸乳酪发酵剂培养物是包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌菌株的细菌培养物。依照本文，“酸乳酪”指可以通过以包含德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和嗜热链球菌菌株的组合物接种乳并发酵而得到的发酵乳制品。
在本上下文中，术语“剪切应力”决定粘度。粘度(单位为Pa s)定义为剪切应力(Pa)/剪切速率(l/s)。
剪切应力数值在本文报导为剪切速率=300l/s下的标准。感觉试验已经表明(数据未显示)，当使用在剪切速率300l/s下测量的粘度时发现在流变学测量值与感觉粘度/口感稠度之间存在最佳相关。
在本上下文中，术语“功能等效抗生素”应当理解为与D-环丝氨酸具有相同作用模式或者相同靶标的抗生素，例如D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶的其它抑制剂，例如万古霉素(Tytgat等，(2009)，Curr.Med.Chem.16(20)：2566-2580)和D-丙氨酸消旋酶的其它抑制剂，例如O-氨基甲酰基-D-丝氨酸、阿拉磷(alaphosphin)和卤代丙氨酸(haloalanines)(Holtje(2004)，The Desk Encyclopedia of Microbiology：239-258)。
术语“对D-环丝氨酸和/或功能等效抗生素具有抗性”在本文中意思是指，在培养基中存在所述抗生素的情况下，与衍生特定的突变菌株的相应非突变菌株相比，特定的突变细菌菌株不被杀死，或者明显更慢地被杀死。取决于培养基中抗生素化合物的浓度，抗性还可以通过突变与非突变菌株的改变的生长特性反映出来。例如，培养基中抗生素的浓度低会阻止或者明显降低非突变菌株的生长，而突变菌株的生长不受影响。在抗性评价中可以用作敏感参照菌株的非突变菌株优选包括菌株CHCC13995和CHCC13994。
本申请的实施例1和2分别例证了对D-环丝氨酸具有抗性的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌突变株菌株的分离。基于实施例1和2中提到的方法，技术人员能够针对每一非突变亲本菌株容易地选择D-环丝氨酸的量或者功能等效抗生素的量，所述的量有效地杀死大多数的亲本菌株细胞而不杀死或者明显更慢地杀死对D-环丝氨酸和/或功能等效抗生素具有抗性的突变株菌株。
在本上下文中，术语“突变株”应当理解为衍生的菌株，或者可以通过例如遗传工程、辐射和/或化学处理从本发明的菌株(或者亲本菌株)衍生的菌株。突变株还可以是自发产生的突变株。优选地，突变株是功能等效突变株，例如具有与亲本菌株基本相同或者改善的特性(例如关于粘度、凝胶刚度、口腔覆盖、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体鲁棒性)的突变株。此种突变株是本发明的一部分。特别地，术语“突变株”指通过使本发明的菌株经受任何常规使用的诱变处理，包括用化学诱变剂诸如甲基磺酸乙酯(EMS)或者N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)、UV线处理得到的菌株，或者指自发产生的突变株。突变株可经历数次诱变处理(单次处理应当理解为一个诱变步骤，接着进行一个筛选/选择步骤)，但是目前优选的是开展不超过20次、不超过10次、或者不超过5次处理(或者筛选/选择步骤)。在目前优选的突变株中，与亲本菌株相比，细菌基因组中少于1%、少于0.1%、少于0.01%、少于0.001%或者甚至少于0.0001%的核苷酸已经被另一核苷酸替代或者缺失。
在本上下文中，术语“变异株”应当理解为与本发明菌株功能等效的菌株，例如具有基本相同或者改善的特性，例如关于粘度、凝胶刚度、口腔覆盖、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体鲁棒性。可以使用适当筛选技术鉴定的此类变异株是本发明的一部分。
术语“一”和“所述”和相似指代物在描述本发明的上下文中(特别是后附权利要求书的上下文中)的使用应解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指出或者上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放性的术语(即意思是“包括但不限于”)，除非另外指出。本文中对数值范围的引用仅仅是充当对各自提及的处于范围之内的每一单独数值的速记法，除非本文另外指出，并且每个单独的数值并入说明书中，就像它们在本文单独引用一样。本文所述的所有方法可以以任何适宜顺序开展，除非本文另外指出或者上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实施例或者示例性语言(例如“诸如”)的使用旨在是仅仅更佳地阐述本发明并且没有对本发明的范围构成限制，除非另外声明。说明书中的任何语言均不应当解释为标明任何非要求保护的要素作为实施本发明的必需要素。
本发明的实施和方面
D-环丝氨酸(D-4-氨基-异恶唑酮)是一种抑制丙氨酸消旋酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶、D-丙氨酰丙氨酸合酶和引起细胞裂解的D-丙氨酸通透酶的抗生素。D-丙氨酸消旋酶是D-丙氨酸产生所必需的，D-丙氨酸是细胞壁肽聚糖层的组成部分。对D-环丝氨酸具有抗性的分枝杆菌属突变株通过增加D-丙氨酸消旋酶基因的表达而过量产生D-丙氨酸(Caceres等，(1997)，J.Bacteriol.179：5046-5055)。因此，本发明的发明人考虑到这将有可能分离天然具有更高D-丙氨酸产量的乳酸细菌菌株的自发突变株。此类突变株被分离并表征。
本领域技术人员将认识到，与D-环丝氨酸具有相同作用模式或者相同靶标的其它抗生素可以单独使用或者与D-环丝氨酸组合一起使用来分离此处所述类型的突变株。因此，本发明还包括其它的此类功能等效抗生素，例如D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶或者D-丙氨酸消旋酶的其它抑制剂的使用。
如本文所使用，术语“D-环丝氨酸的功能等效抗生素”包括干扰D-丙氨酸合成、D-丙氨酸向细胞内转运、从D-丙氨酸形成D-丙氨酰-D-丙氨酸或者D-丙氨酰-D-丙氨酸包含于肽聚糖聚合物结构单元内的任何化合物。此类抗生素包括但不限于抑制D-丙氨酸-消旋酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶、D-丙氨酰丙氨酸合酶和D-丙氨酸通透酶的抗生素。此类D-环丝氨酸的功能等效抗生素包括但不限于万古霉素、O-氨基甲酰基-D-丝氨酸、阿拉磷和卤代丙氨酸。
发现对D-环丝氨酸具有抗性的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的一些突变株在乳中生长时与亲本菌株相比产生增强的质构，同时保持了亲本菌株的其它生长特性。
根据上述的令人惊奇的发现，在第一方面中，本发明涉及一种得到质构化乳酸细菌菌株的方法，所述方法包括：
a)提供乳酸细菌亲本菌株；
b)分离对D-环丝氨酸和/或D-环丝氨酸的功能等效抗生素具有抗性的亲本菌株的突变株；和
c)如果突变株产生更强的质构，如通过在乳中生长时比亲本菌株具有更大的剪切应力和/或更大的凝胶刚度所确定，则选择所述突变株，由此得到质构化乳酸细菌菌株。
因此，第一方面涉及一种得到乳酸细菌突变株的方法，所述乳酸细菌突变株当在乳中生长时产生增强的剪切应力和/或凝胶刚度，所述方法包括：
a)提供乳酸细菌亲本菌株；
b)分离对D-环丝氨酸和/或D-环丝氨酸的功能等效抗生素具有抗性的亲本菌株的突变株；和
c)如果突变株产生更强的质构，如通过在乳中生长时比亲本菌株具有更大的剪切应力和/或更大的凝胶刚度所确定，则选择所述突变株，因此得到当在乳中生长时产生增强的剪切应力和/或凝胶刚度的乳酸细菌突变株。
如通过更大的剪切应力和/或更大的凝胶刚度所确定，与亲本菌株相比所选择突变株产生更强的质构在全脂乳和低脂乳中均发生。
在优选的实施方案中，乳是牛乳。优选地，乳是全脂牛乳。
在优选的实施方案中，乳酸细菌亲本菌株是选自由德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组成的群组的乳酸细菌。然而，其它乳酸细菌，例如乳球菌属某些种、链球菌属某些种、乳杆菌属某些种、明串珠菌属某些种、片球菌属某些种、短杆菌属某些种、肠球菌属某些种、丙酸杆菌属某些种和双歧杆菌属某些种的细菌的使用也是本发明的部分。
在一个优选实施方案中，通过如下步骤得到突变株，即在包含D-环丝氨酸和/或D-环丝氨酸的功能等效抗生素的生长培养基中/上培养乳酸细菌亲本菌株，并且分离不被D-环丝氨酸和/或D-环丝氨酸的功能等效抗生素杀死或者比大多数所测试非突变细胞明显更缓慢地被杀死的亲本菌株的突变株。然而，本发明包括技术人员已知的分离对D-环丝氨酸和/或D-环丝氨酸的功能等效抗生素具有抗性的突变株的其它方式。因此，在本发明第一方面的方法中使用的亲本菌株是对D-环丝氨酸和/或D-环丝氨酸的功能等效抗生素没有抗性(或者抗性较小)的菌株。
在一个实施方案中，突变株可以是对D-环丝氨酸和/或D-环丝氨酸的功能等效抗生素具有抗性的自发突变株。
在另一个实施方案中，本发明的方法可以包括在例如步骤b之前或者步骤b过程中的对亲本菌株的诱变步骤(例如通过化学处理或者辐射处理，或者借助于遗传工程技术)。
因此，在一个实施方案中，突变株可以借助于例如化学处理或者辐射处理对亲本菌株诱变得到，或者是借助于遗传工程技术得到的突变株。
“质构”或者“口感”意思是指产品在口内的物理和化学相互作用。
用于确定乳质构的方法包括测量发酵乳的剪切应力(粘度)或者凝胶刚度，所述方法容易得到并且是本领域已知的，且在本文中例证。
如果以与亲本菌株相同的量(例如每ml至少104个细胞的量)接种时，与亲本菌株相比，突变株在发酵乳中产生更强的质构，如通过更大的剪切应力和/或更大的凝胶刚度所确定，则在步骤c)中选择突变株。
在优选的实施方案中，突变株在乳中产生的以300l/s下的剪切应力(Pa)测量的粘度比亲本菌株产生的粘度高至少大约5%、至少大约10%、至少大约15%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约50%。
在另一个优选实施方案中，突变株在乳中产生的凝胶刚度比亲本菌株产生的凝胶刚度高至少大约5%、至少大约10%、至少大约15%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约50%。
优选地，在德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的情况下，当以每ml乳至少104个细胞的量接种时，于37℃在乳中生长12小时后突变株在添加有2%脱脂乳粉的全脂牛乳中产生的粘度，以300l/s下的剪切应力(Pa)所测量，大于大约105Pa，并且在嗜热链球菌菌株的情况下，当以每ml乳至少104个细胞的量接种时，于37℃在乳中生长12小时后突变株产生的粘度，以300l/s下的剪切应力(Pa)所测量，大于大约75Pa。
在优选的实施方案中，在德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的情况下，当以每ml乳至少104个细胞的量接种时，于37℃在乳中生长12小时后突变株在添加有2%脱脂乳粉的全脂牛乳中产生的凝胶刚度大于大约80Pa，并且在嗜热链球菌菌株的情况下，当以每ml乳至少104个细胞的量接种时，于37℃在乳中生长12小时后突变株产生的凝胶刚度大于大约140Pa。
在第二方面中，本发明涉及一种通过根据本发明第一方面的方法可得到的乳酸细菌菌株。
在优选的实施方案中，乳酸细菌菌株是选自由德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组成的群组的菌株。
在另一个优选实施方案中，在德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的情况下，当以每ml乳104个细胞的量接种时，于37℃在乳中生长12小时后乳酸细菌菌株在添加有2%脱脂乳粉的全脂牛乳中产生的粘度，以300l/s下的剪切应力(Pa)所测量，大于大约105Pa，并且在嗜热链球菌菌株的情况下，当以每ml乳至少104个细胞的量接种时，于37℃在乳中生长12小时后产生的粘度，以300l/s下的剪切应力(Pa)所测量，大于大约75Pa。
优选地，在德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的情况下，当以每ml乳至少104个细胞的量接种时，于37℃在乳中生长12小时后乳酸细菌菌株在添加有2%脱脂乳粉的全脂牛乳中产生的凝胶刚度大于大约80Pa，并且在嗜热链球菌菌株的情况下，当以每ml乳至少104个细胞的量接种时，于37℃在乳中生长12小时后产生的凝胶刚度大于大约140Pa。
在第三方面中，本发明涉及一种属于德氏乳杆菌保加利亚亚种物种的乳酸细菌菌株，选自由以下菌株组成的群组：以保藏号DSM24019保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC12944，以保藏号DSM24020保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC12945，和这些菌株中的任何菌株的突变株和变异株。突变株和变异株显示出衍生它们的保藏菌株的特征性剪切应力和/或凝胶刚度。
在第四方面中，本发明涉及一种属于嗜热链球菌物种的乳酸细菌菌株，选自由以下菌株组成的群组：以保藏号DSM24010保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC13235，以保藏号DSM24011保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC13236，和这些菌株中的任何菌株的突变株和变异株。突变株和变异株显示出衍生它们的保藏菌株的特征性剪切应力和/或凝胶刚度。
在第五方面中，本发明涉及一种属于德氏乳杆菌保加利亚亚种物种的对D-环丝氨酸和/或功能等效抗生素具有抗性的乳酸细菌菌株，其具有与以保藏号DSM24019保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC12944或者以保藏号DSM24020保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC12945相同或者改善的凝胶刚度和/或剪切应力特征。
在第六方面中，本发明涉及一种属于嗜热链球菌物种的对D-环丝氨酸和/或功能等效抗生素具有抗性的乳酸细菌菌株，其具有与以保藏号DSM24010保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC13235或者以保藏号DSM24011保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC13236相同或者改善的凝胶刚度和/或剪切应力特征。
在第七方面中，本发明涉及一种包含根据本发明第二至第六方面的乳酸细菌菌株的组合物。
在一个本发明的实施方案中，组合物包含作为混合物或者作为多部分试剂盒的以下菌株：
i)属于根据本发明第二、第四或第六方面的嗜热链球菌物种的菌株；和
ii)属于根据本发明第二、第三或第五方面的德氏乳杆菌保加利亚亚种物种的菌株。
一个实施方案中的组合物优选地包含至少109CFU(菌落形成单位)的属于德氏乳杆菌保加利亚亚种物种的菌株；和至少1010CFU的属于嗜热链球菌物种的菌株。另一个实施方案中的组合物包含至少1011CFU(菌落形成单位)的属于德氏乳杆菌保加利亚亚种物种的菌株；和至少1012CFU的属于嗜热链球菌物种的菌株。
一个优选实施方案中的组合物可以有利地用作发酵剂培养物，并且是冰冻形式、冷冻干燥形式或者液体形式。
在第八方面中，本发明涉及一种生产乳制品，例如发酵乳制品的方法，其包括用根据本发明第二至第六方面中任一个的乳酸细菌菌株或者根据本发明第七方面的组合物将乳底物发酵，由此得到乳制品。
因此，通过所述方法产生的乳制品分别包含根据本发明第二至第六方面任一个的乳酸细菌菌株或者根据本发明第七方面的组合物的乳酸细菌菌株。
在所述方法中，乳底物可以在用本发明的菌株例如属于乳杆菌属物种的菌株发酵之前、过程中或者之后，用本发明的菌株例如属于嗜热链球菌物种的菌株发酵。
此外，所述方法可包括在发酵之前、过程中和/或之后向乳底物中添加酶，例如选自由下列酶组成的群组的酶：能够交联蛋白质的酶、转谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、凝乳酶和粗制凝乳酶。
在第九方面中，本发明涉及一种通过根据本发明第八方面的方法可得到的乳制品，例如发酵乳制品(例如酸乳酪或者酪乳)或者乳酪(例如新鲜的帕斯塔费拉塔乳酪)。
乳制品包含乳酸细菌。
乳制品可任选包含选自由下列物质组成的群组的成分：水果浓缩物、糖浆剂、益生菌细菌培养物、着色剂、增稠剂、调味剂和防腐剂；和/或任选是搅拌类型产品、凝固类型产品或者可饮用产品的形式。
在第十方面中，本发明涉及一种包含根据本发明第二至第六方面任一个的乳酸细菌菌株的乳制品。
在第十一方面中，本发明涉及根据第二至第六方面任一个的乳酸细菌菌株用于制造发酵乳制品的用途。
本发明还通过下列非限定性实施例进一步说明。
实施例
实施例1：使用D-环丝氨酸分离具有改善的流变学特性的德氏乳杆菌保加利亚亚 种突变株
材料与方法
菌株
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC13995
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC12944(CHCC13995的D-环丝氨酸抗性突变株)
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC12945(CHCC13995的D-环丝氨酸抗性突变株)
突变株分离
为了分离德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC13995的突变株，将来源于单一集落生长的细胞接种到包含50-100μg/ml范围D-环丝氨酸的MRS肉汤内并且生长至饱和。将细胞稀释并铺于MRS平板上并且在微量滴定板中筛选在50-100μg/ml范围D-环丝氨酸存在下能够生长的菌落。典型地，经鉴定所得到菌落的25%是D-环丝氨酸存在下的快速生长菌落。选择它们用于进一步研究。将选择的D-环丝氨酸抗性突变株进一步纯化并且测试它们在乳内生长的能力。在该工作过程中，观察到在这些条件下一些突变株产生比亲本菌株相当更强的质构。
流变学
在添加有2%脱脂乳粉的全脂牛乳中生长之后，在来自瑞典ReoLogicaInstruments AB的StressTech流变仪上开展流变学分析。
结果
命名为CHCC12944和CHCC12945的CHCC13995的两个突变株衍生物产生比亲本菌株明显更强的质构，其具有增加的剪切应力(粘度)以及凝胶刚度。这极其明显，仅仅通过用吸管搅拌发酵乳便可明显看出。此外，观察到在不同突变株之间乳清的量不同并且这变成了用于选择突变株的参数之一用于进一步研究(见下表1)。所选择的突变株是显示低水平脱水收缩的那些：下面实施例中的突变株1和突变株11(表1)分别对应于突变株CHCC12944和CHCC12945。
表1：由于产生低体积的乳清，所以在20个突变株中选择突变株1和突变株11。空栏是没有使乳凝固的突变株。2个突变株分别命名为CHCC12945和CHCC12944。
ml：于43℃下在100ml B-乳中生长24小时后的乳清
实际的流变学测试支持稠度增加的观察(表2和图2和3)。突变株CHCC12945和CHCC12944的凝胶刚度的增加在52%和59%之间。剪切应力也是更高的，但没有凝胶刚度那样高许多(表2和图2和3)。
表2
样品 300l/s下的剪切应力(Pa) 1HZ下的凝胶刚度(Pa)
CHCC13995 99 58.55
CHCC12945 108.5 93.20
CHCC12944 108 89.05
一个特征是改善的流变学，但是如果其它重要特性例如酸化受影响，则突变株的吸引力较小。当于43℃下在具有额外2%脱脂乳粉的全脂牛乳中生长时，所选择突变株的酸化特性与相关亲本菌株的酸化特性相同(图1)。
结论
本文所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种的D-环丝氨酸突变株可以掺入培养物中，例如发酵剂培养物中，产生所希望的高水平质构。
实施例2：使用D-环丝氨酸分离具有改善的流变学特性的嗜热链球菌突变株
材料与方法
菌株
嗜热链球菌CHCC13994
嗜热链球菌CHCC13236(CHCC13994的D-环丝氨酸抗性突变株)
嗜热链球菌CHCC13235(CHCC13994的D-环丝氨酸抗性突变株)
突变株分离：
为了分离嗜热链球菌CHCC13994的突变株，将来源于单一集落生长的细胞接种到包含50-70μg/ml范围D-环丝氨酸的M17+2%乳糖肉汤内并且生长至饱和。将细胞稀释并铺于M17+2%乳糖平板上，挑取并且在微量滴定板中筛选在50-70μg/ml范围D-环丝氨酸存在下能够生长的菌落。典型地，经鉴定所得到菌落的25%是D-环丝氨酸存在下的快速生长菌落。选择它们用于进一步研究。将选择的D-环丝氨酸抗性突变株进一步纯化并且测试它们在乳内生长的能力。在该工作过程中，观察到在这些条件下一些突变株产生比亲本菌株相当更强的质构。还测量乳清的量作为高或低凝胶刚度的指示。
流变学
在添加有2%脱脂乳粉的全脂牛乳中生长之后，在来自瑞典ReoLogicaInstruments AB的StressTech流变仪上开展流变学分析。
结果
命名为CHCC13235和CHCC13236的CHCC13994的两个突变株衍生物产生比亲本菌株明显更强的质构。这极其明显，仅仅通过用吸管搅拌发酵乳便可明显看出。此外，观察到在不同突变株之间乳清的量不同并且这变成了用于选择突变株的参数之一用于进一步研究(见下表3)。所选择的突变株(表3中的第9号和第13号)是显示低水平脱水收缩的两个突变株。两个突变株分别命名为CHCC13236和CHCC13235。
表3：在20个突变株中选择出第9号和第13号这2个突变株。
ml：于37℃下在50ml B-乳中生长24小时后的乳清
实际的流变学测试支持稠度增加的观察(图4和图5)。突变株CHCC13236剪切应力增加15%，凝胶刚度增加19%，而突变株CHCC13235仅显示凝胶刚度增加(23%)(表4)。
表4
样品 300l/s下的剪切应力(Pa) 1HZ下的凝胶刚度(Pa)
CHCC13994 69.6 136.6
CHCC13236 79.7 162.5
CHCC13235 64.9 167.3
关于酸化，所选择突变株的酸化特性与相关亲本菌株的酸化特性相同(数据未显示)。
结论
本文所述的嗜热链球菌的D-环丝氨酸突变株可以掺入培养物中，例如发酵剂培养物中，产生所希望的高水平质构。
实施例3：嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种D-环丝氨酸突变株用于制备发 酵乳制品的用途
使用9:1比例混合的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的组合制备酸乳酪并将其接种到添加有2%脱脂乳粉的全脂牛乳中。一个混合物包含亲本菌株CHCC13994和CHCC13995；第二个混合物包含嗜热链球菌D-环丝氨酸突变株CHCC13236和德氏乳杆菌保加利亚亚种D-环丝氨酸突变株CHCC12945，并且第三个混合物包含嗜热链球菌D-环丝氨酸突变株CHCC13235和德氏乳杆菌保加利亚亚种D-环丝氨酸突变株CHCC12945。对这三个组合之间的酸化特性的比较表明，具有两种突变株的混合物与具有亲本菌株的组合相比，具有稍微更高的最终pH(数据未显示)。用匙搅拌显示，与用亲本菌株制成的产品相比，用D-环丝氨酸突变株制成的产品对搅拌具有显著增加的阻力。另外，通过3个人评估认为所得到的酸乳酪具有含奶油更高的质构和更新鲜的味道。
保藏与专家方案
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC12944、CHCC12945和CHCC13995菌株于2010年9月22日分别以保藏号DSM24019、DSM24020和DSM24021保藏于DSMZ(德国微生物菌种保藏中心GmbH，Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig，德国)中。
嗜热链球菌CHCC13235、CHCC13236和CHCC13994菌株于2010年9月22日分别以保藏号DSM24010、DSM24011和DSM24012保藏于DSMZ(德国微生物菌种保藏中心GmbH，Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig，德国)中。
保藏已经按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行。
申请人要求保藏的微生物样品应当仅对由申请人批准的专家可用。
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在本申请文件中引用的所有参考文献整体性地通过引用并入本文中。

Claims (8)

1.一种属于德氏乳杆菌保加利亚亚种物种的乳酸细菌菌株，其选自由以下菌株组成的群组：以保藏号DSM 24019保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC12944，以保藏号DSM24020保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC12945。
2.一种属于嗜热链球菌物种的乳酸细菌菌株，其选自由以下菌株组成的群组：以保藏号DSM 24010保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC13235，以保藏号DSM 24011保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株CHCC13236。
3.一种包含根据权利要求1或2所述的乳酸细菌菌株的组合物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其包含作为混合物或者作为多部分试剂盒的以下菌株：
i)属于根据权利要求2所述的乳酸细菌菌株；和
ii)属于根据权利要求1所述的乳酸细菌菌株。
5.根据权利要求3或4所述的组合物，其可用作发酵剂培养物，并且是冰冻形式、冷冻干燥形式或者液体形式。
6.一种生产乳制品的方法，其包括用根据权利要求1或2的乳酸细菌菌株或者权利要求3至5任一项的组合物将乳底物发酵。
7.一种包含根据权利要求1或2所述的乳酸细菌菌株的乳制品。
8.根据权利要求1或2所述的乳酸细菌菌株用于制造乳制品的用途。
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