DE60131538T2

DE60131538T2 - Alanine-racemase (alr) aus corynebacterium glutamicum

Info

Publication number: DE60131538T2
Application number: DE60131538T
Authority: DE
Inventors: Andreas Tauch; Michael Binder; Walter Pfefferle; Georg Thierbach; Jörn Kalinowski; Alfred Pühler
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-07-24
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2008-10-23
Anticipated expiration: 2021-07-12
Also published as: US20020106754A1; AU2001272533A1; DE60131538D1; WO2002008406A2; WO2002008406A3; EP1303624A2; EP1303624B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung stellt Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien, die für das alr-Gen kodieren, ein Wirt-Vektor-System für coryneforme Bakterien unter Verwendung des alr-Gens, Verfahren zur Herstellung chemischer Verbindungen unter Verwendung des Wirt-Vektor-Systems und Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, insbesondere D-Alanin oder D-Valin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien oder Enterobacteriaceae, in denen das alr-Gen aus coryneformen Bakterien in verstärkter Form vorliegt, bereit.
Stand der Technik
Chemische Verbindungen, d. h. insbesondere L-Aminosäuren, Vitamine, Nukleoside und Nukleotide und D-Aminosäuren, werden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in Kosmetika, in der Nahrungsmittelindustrie und bei der Tierernährung verwendet.
Viele dieser Verbindungen werden durch Fermentation aus Stämmen von coryneformen Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt. Aufgrund ihrer großen Bedeutung werden ständig Arbeiten unternommen, um die Herstellungsverfahren zu verbessern. Verbesserungen an den Verfahren können Fermentationsmaßnahmen, wie zum Beispiel Rühren und Sauerstoffversorgung, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung in die Produktform, zum Beispiel durch Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Abgabeeigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Verfahren zur Mutagenese, Selektion und Mutantenselektion werden dazu verwendet, die Abgabeeigenschaften dieser Mikroorganismen zu verbessern. Stämme, die gegenüber Antimetaboliten resistent oder für Metaboliten von regulatorischer Bedeutung auxotroph sind und die bestimmten Verbindungen produzieren, werden auf diese Weise erhalten.
Seit einigen Jahren werden auch DNA-Rekombinationstechniken zur Verbesserung des Stammes der Corynebacterium-Stämme durch Vervielfältigen einzelner Biosynthesegene und Untersuchen der Wirkung auf die Produktion eingesetzt.
Aus diesen präparierte natürlich vorkommende Plasmide und Plasmidvektoren sind eine wichtige Vorbedingung zur Verbesserung der Produktionseigenschaften coryneformer Bakterien. Die Konstruktion von Plasmidvektoren für diese Gruppe industriell wichtiger Bakterien basiert im wesentlichen auf kryptischen Plasmiden, die mit geeigneten Antibiotikaresistenzmarkern ausgestattet sind, die in Corynebakterien oder Brevibakterien funktionieren können ( US-A 5,158,891 und US-A 4,500,640 ). Diese Plasmidvektoren können zur Klonierung und Verstärkung von Genen eingesetzt werden, die an der Produktion chemischer Verbindungen, wie zum Beispiel L-Aminosäuren, Vitaminen oder Nukleosiden und Nukleotiden, beteiligt sind. Die Produktion der gewünschten Substanzen kann in positiver Weise durch die Expression der bestimmten Gene beeinflusst werden. So führte zum Beispiel Klonieren eines DNA-Fragments, das ein Protein für einen Lysin-Exporter codiert, zu einer Verbesserung in der fermentativen Produktion von L-Lysin mit dem Corynebacterium-glutamicum-Stamm MH2022B ( DE-A 19548222 ).
Im Gegensatz zu dem bekannten Bakterium von gleichem industriellem Wert, Escherichia coli, ist nur eine begrenzte Anzahl an natürlichen Plasmiden und geeigneten Selektionsmarkern für die Entwicklung von Klonierungs- und Expressionsvektoren für Corynebakterien und Brevibakterien, insbesondere für Corynebacterium glutamicum, bekannt. Selektionssysteme sind bisher nur in Form von zwei Antibiotikaresistenzmarkern verfügbar, die auf dem Streptomycin-/Spectinomycin-Resistenzplasmid pCG4 von Corynebacterium glutamicum ATCC31830 ( US-A 4,489,160 ) und auf dem Tetracyclin- Resistenzplasmid pAG1 von Corynebacterium melassecola 22243 ( US-A 5,158,891 ) identifiziert wurden. Das Plasmid pCG4 trägt außerdem das sulI-Gen, das Sulfamethoxazol-Resistenz verleiht und dessen Sequenz von Nesvera et al. (FEMS Microbiology Letters 169, 391–395 (1998)) bestimmt wurde.
Für eine schnelle Untersuchung und Verbesserung von Stämmen, die die erwähnten Verbindungen produzieren, ist es wichtig, über Plasmidvektoren zu verfügen, die miteinander kompatibel sind und eine ausreichend hohe Stabilität haben, wie z. B. das Plasmid pGA1 aus Corynebacterium glutamicum LP-6 ( US-A 5,175,108 ). Die herkömmlicherweise eingesetzten Plasmidvektoren bestehen aus Komponenten, die aus der Spezies Corynebacterium glutamicum und einer anderen Bakterienspezies, gewöhnlich Escherichia coli, stammen. Fremde DNA wird in die Spezies Corynebacterium glutamicum durch dieses Verfahren eingeführt. Stabile Plasmidvektoren, die funktionsfähig sind und nur Speziescharakteristische DNA mit einer antibiotikafreien Selektionsmöglichkeit enthalten und folglich die Kriterien der Selbst-Klonierung erfüllen, sind Fachleuten nicht bekannt.
Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren mit Corynebacterium glutamicum durch fermentative oder biokatalytische Verfahren sind Fachleuten nicht bekannt.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder hatten die Aufgabe, neue Wirt-Vektor-Systeme für coryneforme Bakterien bereitzustellen.
Die Erfinder hatten ferner die Aufgabe, neue Maßnahmen für einer verbesserte Herstellung von D-Aminosäuren bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien bereit, umfassend eine für das alr-Gen codierende Polynukleotidsequenz, gewählt aus der Gruppe:

a) Polynukleotid, das in einem Ausmaß von mindestens 70% identisch zu einem Polynukleotid ist, das für ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 umfasst,
b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die in einem Ausmaß von mindestens 70% identisch zu der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 ist,
c) Polynukleotid, das komplementär zu den Polynukleotiden von a) oder b) ist, und
d) Polynukleotid, das mindestes 15 aufeinander folgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c) umfasst,

Die Erfindung stellt ein Polynukleotid bereit, bei dem es sich eine vorzugsweise um eine DNA handelt, die zur Replikation fähig ist, umfassend:

(i) die in der SEQ ID Nr. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder
(ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
(iii) mindestens eine Sequenz, die mit der zu der Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
(iv) Sense-Mutationen neutraler Funktion in (i).

Die Erfindung stellt zudem bereit
ein Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt, umfasst,
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt, umfasst,
einen Vektor, der das Polynukleotid gemäß SEQ ID Nr. 1 oder Teile davon enthält, insbesondere einen Shuttle-Vektor oder Plasmidvektor,
Bakterien, die den oben genannten Vektor enthalten,
coryneforme Bakterien, in denen das chromosomale alr-Gen in abgeschwächter, vorzugsweise beseitigter, Form vorhanden ist,
und Bakterien, insbesondere coryneforme Bakterien und Enterobacteriaceae, in denen das alr-Gen von coryneformen Bakterien in verstärkter Form, gegebenenfalls in Kombination mit der Abschwächung oder Beseitigung des chromosomalen alr-Gens, vorhanden ist.
Die Erfindung stellt auch Polynukleotide bereit, die im wesentlichen eine Polynukleotidsequenz umfassen, die durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbibliothek, die das vollständige Gen mit der Polynukleotidsequenz umfasst, die SEQ ID Nr. 1 entspricht, mit einer Sonde, die die Sequenz des erwähnten Polynukleotids gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein Fragment davon umfasst, und Isolation der erwähnten DNA-Sequenz erhältlich sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Polynukleotide, welche die erfindungsgemäßen Sequenzen umfassen, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um in voller Länge Polynukleotide oder Gene isolieren, die für Alaninracemase codieren, und solche Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit derjenigen des Alaninracemase-Gens haben. Sie eignen sich auch zum Einbringen in so genannte "Arrays", "Mikroarrays" oder "DNA-Chips", um die entsprechenden Polynukleotide nachzuweisen und zu bestimmen.
Polynukleotide, die erfindungsgemäße Sequenzen umfassen, eignen sich ferner als Primer zur Herstellung der DNA von Genen, die für D-Alaninracemase codieren, mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR).
Solche Oligonukleotide, die als Sonden oder Primer dienen, umfassen mindestens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, vorzugsweise mindestens 20, 21, 22, 23 oder 24, ganz besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinander folgende Nukleotide. Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 oder mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden sind ebenfalls geeignet. Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden sind gegebenenfalls auch geeignet.
"Isoliert" bedeutet aus seiner natürlichen Umgebung abgetrennt.
"Polynukleotid" betrifft im Allgemeinen Polyribonukleotide und Polydesoxyribonukleotide, wobei diese nicht-modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein können.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen ein Polynukleotid gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein davon hergestelltes Fragment und ferner solche, die mindestens 70% bis 80%, vorzugsweise mindestens 81% bis 85%, besonders bevorzugt mindestens 86% bis 90% und ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einem davon hergestellten Fragment sind.
Unter "Polypeptiden" werden Peptide oder Proteine verstanden, die zwei oder mehrere Aminosäuren umfassen, die über Peptidbindungen verbunden sind.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen ein Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Alaninracemase, und ferner solche, die mindestens 70% bis 80%, vorzugsweise mindestens 81% bis 85%, besonders bevorzugt mindestens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2 sind und die erwähnte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Wirt-Vektor-System, umfassend 1) ein coryneformes Bakterium als Wirt, in dem das chromosomale alr-Gen in abgeschwächter, vorzugsweise beseitigter, Form vorliegt, und 2) ein Plasmid, das sich in diesem Wirt repliziert und mindestens das alr-Gen trägt. Die Kopienzahl des Plasmids beträgt mindestens 1, aber nicht mehr als 1000, vorzugsweise mindestens 1 bis 300, besonders bevorzugt mindestens 1 bis 100 und ganz besonders bevorzugt mindestens 1 bis 50. Das erfindungsgemäße Wirt-Vektor-System hat den Vorteil, dass es als Stabilisierungssystem wirkt und daher die Zugabe stabilisierender oder selektiv wirkender Substanzen, zum Beispiel Antibiotika, verringert werden und gegebenenfalls weggelassen werden kann.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Beseitigung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, zum Beispiel unter Verwendung eines schwachen Promotors oder eines Gens oder Allels, das für ein entsprechendes Enzym mit niedriger Aktivität codiert oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert, und gegebenenfalls durch Kombination dieser Maßnahmen.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur fermentativen Herstellung von chemischen Verbindungen, insbesondere L-Aminosäuren, Vitaminen, Nukleosiden und Nukleotiden, unter Verwendung des erwähnten Wirt-Vektor-Systems.
Die folgenden Schritte werden hier durchgeführt:

a) Fermentation eines coryneformen Mikroorganismus, der eine oder mehrere gewünschte chemische Verbindungen produziert und das alr-Wirt-Vektor-System enthält, gegebenenfalls in Abwesenheit von Antibiotika auf mindestens einer Fermentationsstufe,
b) Anreicherung dieser chemischen Verbindung(en) oder des bzw. der entsprechenden Salzes bzw. Salze im Medium oder in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen des coryneformen Mikroorganismus, sowie gegebenenfalls
c) Isolierung dieser chemischen Verbindung(en) und/oder des bzw. der entsprechenden Salzes bzw. Salze, gegebenenfalls zusammen mit einem Teil der oder der gesamten Biomasse und den gelösten Bestandteilen der Fermentationsbrühe.

Die gewünschten chemischen Verbindungen beinhalten vorzugsweise L-Aminosäuren, insbesondere die proteino genen L-Aminosäuren, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin und Salzen davon.
Vitamine bedeutet insbesondere Vitamin B1 (Thiamin), Vitamin B2 (Riboflavin), Vitamin B5 (Pantothensäure), Vitamin 36 (Pyridoxin), Vitamin B12 (Cyanocobalamin), Nicotinsäure/Nicotinsäureamid, Vitamin M (Folsäure) und Vitamin E (Tocopherol) und Salze davon, wobei Pantothensäure bevorzugt ist.
Nukleoside und Nukleotide bedeutet unter anderem S-Adenosylmethionin, Inosin-5'-monophosphorsäure und Guanosin5'-monophosphorsäure und Salze davon.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, insbesondere D-Alanin und D-Lysin, unter Verwendung geeigneter Bakterien, insbesondere coryneformer Bakterien und Enterobacteriaceae, in denen die Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien, die für das alr-Gen codieren, verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Die folgenden Schritte werden hier im Allgemeinen durchgeführt:

a) Kultivierung eines Bakteriums, in dem das alr-Gens eines coryneformen Bakteriums in verstärkter Form vorliegt,
b) gegebenenfalls Isolierung der gesamten oder eines Teils der Biomasse,
c) gegebenenfalls Präparation eines Zellextraktes oder eines vollständig oder teilweise gereinigten Enzyms aus der Biomasse,
d) Zugabe der L-Aminosäure zur Fermentationsbrühe oder zur isolierten Biomasse oder zum Zellextrakt oder zu einem teilweise oder vollständig gereinigten Enzym, gegebenenfalls in einem geeigneten Puffer, und
e) Isolierung der produzierten D-Aminosäure.

In diesem Zusammenhang beschreibt der Begriff "Verstärkung" den Anstieg in der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen in einem Mikroorganismus, die von der entsprechenden DNA codiert werden, zum Beispiel durch Erhöhung der Kopienzahl des Gens oder der Gene unter Verwendung eines starken Promotors oder unter Verwendung eines Gens oder Allels, das für ein entsprechendes Enzym mit hoher Aktivität codiert, und gegebenenfalls durch Kombination dieser Maßnahmen.
Die Mikroorganismen, welche die vorliegende Erfindung bereitstellt, enthalten das erwähnte Wirt-Vektor-System und sind Vertreter der coryneformen Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium. Aus der Gattung Corynebacterium kann insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum genannt werden, die unter Fachleuten für ihre Fähigkeit, L-Aminosäuren zu produzieren, bekannt ist.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum, sind insbesondere die bekannten Wildtyp-Stämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERN BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
sowie daraus hergestellte Mutanten oder Stämme, die chemische Verbindungen produzieren.
Die Erfindung stellt außerdem Bakterien, insbesondere coryneforme Bakterien und Enterobacteriaceae, bereit, in denen das alr-Gen von coryneformen Bakterien, in verstärkter, insbesondere überexprimierter, Form vorliegt.
Das neue alr-Gen von C. glutamicum, das für das Enzym Alaninracemase (EC-Nr. 5.1.1.1) codiert, ist isoliert worden.
Die Nukleotidsequenzen des alr-Gens und die Aminosäuresequenzen der Alaninracemase verschiedener Bakterien, wie zum Beispiel Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis, Streptomyces coelicolor oder Escherichia coli, sind bekannt und in öffentlich zugänglichen Datenbanken erhältlich, wie zum Beispiel derjenigen der Europäischen Molekularbiologie-Laboratorien (EMBL, Heidelberg, Deutschland) oder derjenigen des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) oder derjenigen des Schweizer Instituts für Bioinformatik (Swissprot, Genf, Schweiz) oder derjenigen der Protein Information Resource-Datenbank (PIR, Washington, DC, USA).
Durch Vergleichen der Aminosäuresequenzen der Enzymproteine verschiedener Bakterien können Regionen hoch-identischer Art, d. h. so genannte konservierte Proteinregionen, identifiziert werden. Unter Berücksichtigung der Codonnutzung von Corynebacterium glutamicum (Malumbres et al., Gene 134, 15–24 (1993)) kann auf die Nukleotidsequenz der entsprechenden DNA-Region zurückgeschlossen werden. Dementsprechend können wiederum synthetische Oligonukleotide synthetisiert und als Primer zur Amplifikation der entsprechenden chromosomalen DNA-Segmente mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt werden. Anleitungen dafür können vom Fachmann u. a. zum Beispiel in dem Handbuch von Gait: Oligonuceotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, GB, 1984) und in Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) gefunden werden. Das in dieser Weise erhaltene DNA-Fragment des alr-Gens wird dann durch bekannte Verfahren kloniert und kann als Sonde bei der Suche nach dem vollständigen Gen, einschließlich seiner 5'- und 3'-Flanken, in Genbibliotheken mithilfe von Hybridisierung eingesetzt werden.
Anleitungen zur Identifikation von DNA-Sequenzen mithilfe von Hybridisierung können vom Fachmann u. a. in dem Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und in Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255–260) gefunden werden. Die Hybridisierung findet vorzugsweise unter stringenten Bedingungen statt, d. h. nur Hybride, in denen die Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten DNA-Fragmente oder Gene, mindestens zu 70% identisch sind, werden gebildet. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung, einschließlich der Waschschritte, durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst oder bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise unter einer relativ niedrigen Stringenz verglichen mit den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, GB, 1996).
Ein 5×-SSC Puffer bei einer Temperatur von etwa 50°C–68°C kann zum Beispiel für die Hybridisierungsreaktion eingesetzt werden. Sonden können hier auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die zu weniger als 70% identisch mit der Sequenz der Sonde sind. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann zum Beispiel durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und gegebenenfalls anschließend auf 0,5 × SSC erzielt werden ("The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation", Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995), wobei eine Temperatur von etwa 50°C–68°C aufrechterhalten wird. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration auf 0,1 × SSC zu senken. Polynukleotidfragmente, die zum Beispiel zu mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% oder mindestens 96% bis 99% identisch mit der Sequenz der eingesetzten Sonde sind, können durch stufenweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur von 50°C bis 68°C in Schritten von ca. 1°C–2°C isoliert werden. Es ist ebenfalls möglich, Polynukleotidfragmente zu isolieren, die mit der Sequenz der eingesetzten Sonde vollständig identisch sind. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind auf dem Markt in Form so genannter Kits erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalog Nr. 1603558).
Die Herstellung von Genbibliotheken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern beschrieben. Als Beispiel können das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) erwähnt werden. Eine bekannte Genbibliothek ist diejenige des E.-coli-K-12-Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in λ-Vektoren hergestellt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics 252: 255–265, 1996) beschreiben eine Genbibliothek von C. glutamicum ATCC13032, die mithilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160–2164) in dem E.-coli-K-12-Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) hergestellt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317–326 (1992)) beschreiben wiederum eine Genbibliothek von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291–298 (1980)).
Zur Herstellung einer Genbibliothek von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide, wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences 25, 807–818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene 19: 259–268), verwendet werden. Geeignete Wirte sind insbesondere E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefizient sind, wie zum Beispiel der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87 (1990) 4645–4649) beschrieben wurde. Die langen DNA-Fragmente, die mithilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren kloniert werden, können dann wiederum in die üblichen Vektoren, die sich zur DNA-Sequenzierung eignen, subkloniert und anschließend sequenziert werden, wie z. B. von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74: 5463–5467, 1977) oder Frangeul et al. (Microbiology 145, 2625–2643 (1999)) beschrieben.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen oder Sequenzanalyseprogrammen untersucht werden, wie z. B. demjenigen von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)) untersucht werden.
Die Erfindung stellt die Herstellung eines Wirt-Vektor-Systems, das auf dem alr-Gen basiert, für Corynebacterium glutamicum bereit. Das Wirt-Vektor-System umfasst 1) einen geeigneten Wirtsstamm von Corynebacterium glutamicum, in dem das chromosomale alr-Gen in abgeschwächter Form vorliegt, und 2) ein Plasmid, das sich in diesem Wirt repliziert und mindestens das alr-Gen trägt. Die Anzahl der Kopien des Plasmids beträgt mindestens 1, aber nicht mehr als 1000, vorzugsweise mindestens 1 bis 300, besonders bevorzugt mindestens 1 bis 100 und ganz besonders bevorzugt mindestens 1 bis 50.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des alr-Gens oder die katalytischen/regulatorischen Eigenschaften des Enzymproteins verringert oder beseitigt werden. Die beiden Maßnahmen können gegebenenfalls kombiniert werden.
Die Verringerung der Genexpression kann durch genetische Modifikation (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind zum Beispiel Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Start-Codon und Terminatoren. Der Fachmann kann Informationen darüber z. B. in der WO 96/15246 , in Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), in Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)), in Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), in Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) finden.
Mutationen, die zu einer Veränderung oder Verringerung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; Beispiele, die erwähnt werden können, sind die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760–1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte aus dem Forschungszentrum Jülich, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994). Zusammenfassende Beschreibungen lassen sich bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie entnehmen, wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Mögliche Mutationen sind Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen. Je nach der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität spricht man von "Missense-Mutationen" oder "Nonsense-Mutationen". Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu Leserahmenverschiebungsmutationen, als deren Konsequenz falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig unterbrochen wird. Wird infolge der Mutation ein Stopp-Codon in der codierenden Region gebildet, führt dieses ebenfalls zur vorzeitigen Beendigung der Translation. Deletionen mehrerer Codons führen in der Regel zu einem völligen Verlust der Enzymaktivität. Anleitungen für die Herstellung solcher Mutationen sind Stand der Technik und können in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie gefunden werden, wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Ein Beispiel für ein mutiertes alr-Gen ist das in SEQ ID Nr. 12 dargestellte Δalr91-Allel (deltaalr91). Es enthält die 5'- und die 3'-Region des alr-Gens. Ein 75 bp langer Abschnitt der codierenden Region fehlt (Deletion).
Die Mutation im alr-Gen kann durch Gen- oder Allelaustausch in geeignete Stämme eingebracht werden.
Ein übliches Verfahren zur Mutation von Genen von C. glutamicum oder zum Einbringen von Mutationen in Stämme ist das Gen- oder Allelaustauschverfahren ("Genaustausch", "Allelersatz", das von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)) oder von Schäfer et al. (Gene 145, 69–73 (1994)) beschrieben wird.
Beim "Genaustausch" verfahren wird eine Mutation, wie z. B. eine Deletion, eine Insertion oder ein Basenaustausch, in dem Gen von Interesse in vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird seinerseits in einen Vektor kloniert, der für C. glutamicum nicht replikationsfähig ist, und dies wird dann durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum übertragen. Nach homologer Rekombination mithilfe eines ersten "Cross-over"-Ereignisses, welches die Integration bewirkt, und eines geeigneten zweiten "Cross-over"-Ereignisses, welches das Ausschneiden in dem Zielgen oder in der Zielsequenz bewirkt, wird der Einbau der Mutation oder des Allels erreicht. Dieses Verfahren wurde zum Beispiel von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)) zur Eliminierung des pyc-Gens von C. glutamicum durch eine Deletion verwendet. Schäfer et al. (Gene 145: 69–73 (1994)) nutzten zum Beispiel dieses Verfahren zum Einbringen einer Deletion in die homthrB-Genregion. Auf die gleiche Weise brachten Kronemeyer et al. (Journal of Bacteriology 177: 1152–1158 (1995) eine Deletion in die gluABCD-Region von C. glutamicum ein.
Eine Deletion, eine Insertion oder ein Hasenaustausch können auf diese Weise in das alr-Gen eingebracht werden. Stämme mit einem abgeschwächten alr-Gen sind für die Aminosäure D-Alanin auxotroph. Ein Beispiel für einen Wirt mit einem abgeschwächten alr-Gen ist der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 (ATCC13032deltaalr91), der die in SEQ ID Nr. 12 gezeigte Mutation trägt.
In einem weiteren Schritt wird ein funktionsfähiges alr-Gen durch im Stand der Technik bekannte Klonierungsverfahren in ein Plasmid eingebracht. Geeignete Plasmide sind diejenigen, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93–98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)), basieren auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1 und können verwendet werden. Andere Plasmidvektoren, wie z. B. diejenigen auf Basis von pCG4 ( US-A 4,489,160 ) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119–124 (1990)) oder pAG1 ( US-A-5,158,891 ), können auf die gleiche Weise verwendet werden. Ein Beispiel für ein solches Plasmid ist der Plasmidvektor pSELF2000, der in 5 dargestellt ist.
Das Plasmid, das mindestens das alr-Gen trägt, wird dann mithilfe von im Stand der Technik bekannten Transformationsverfahren in einen coryneformen Wirt eingebracht, der ein abgeschwächtes alr-Gen in seinem Chromosom trägt. Der hier gebildete Transformant benötigt kein D-Alanin. Ein Beispiel für ein solches Wirt-Vektor-System ist der Stamm ATCC13032Δalr91[pSELF2000].
Ein Produktionsgen, zum Beispiel das panD-Gen (Dusch et al., Applied and Environmental Microbiology 65, 1530–1539 (1999)), das für die Produktion einer chemischen Verbindung, zum Beispiel des Vitamins Pantothensäure, von Interesse ist, wird wiederum in das Plasmid eingebracht, welches das alr-Gen enthält, wobei das erhaltene Plasmid gegebenenfalls kein Gen trägt, das eine Resistenz gegen Antibiotika verleiht.
Das erhaltene Plasmid, das eines oder mehrere Produktionsgen(e) enthält, wird dann durch Transformation oder Konjugation in den Wirt eingebracht, der die bestimmte chemische Verbindung produziert, wobei das chromosomale alr-Gen des Wirtes abgeschwächt, insbesondere beseitigt, ist.
Die Erfindung stellt auch die hergestellten coryneformen Mikroorganismen bereit, die das erfindungsgemäße Wirt-Vektor-System enthalten, das von dem alr-Gen abhängt, und die kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder im Fed-Batch-(Beschickungsverfahren) oder wiederholten Fed-Batch-Verfahren (wiederholten Beschickungsverfahren) zum Zweck der Produktion chemischer Verbindungen gezüchtet werden können. Eine Zusammenfassung bekannter Anzuchtverfahren ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss den Anforderungen der jeweiligen Stämme auf geeignete Weise entsprechen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Zucker und Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melassen, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosnussfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol, und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure, können als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, können als Stickstoffquelle verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze können als Phosphorquellen verwendet werden.
Das Kulturmedium muss ferner Metallsalze enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum erforderlich sind. Schließlich können essenzielle Wachstumssubstanzen, wie Aminosäuren und Vitamine, zusätzlich zu den vorstehend genannten Substanzen eingesetzt werden. Geeignete Vorstufen können ebenfalls zum Kulturmedium gegeben werden. Die genannten Ausgangssubstanzen können zu der Kultur in Form einer einzigen Charge zugefügt oder während der Kultur auf geeignete Weise eingespeist werden.
Basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniakwasser, oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, können auf geeignete Weise zur Regulation des pH-Wertes der Kultur eingesetzt werden. Antischäummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglycolester, können zur Regulation der Entwicklung von Schaum eingesetzt werden.
Zur Aufrechterhaltung aerober Bedingungen werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie zum Beispiel Luft, in die Kultur eingebracht. Die Temperatur der Kultur beträgt gewöhnlich 20°C bis 45°C und vorzugsweise 25°C bis 40°C. Die Kultur wird fortgesetzt, bis sich ein Maximum der gewünschten chemischen Verbindung gebildet hat. Dieses Ziel wird gewöhnlich innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Es wurde gefunden, dass die Zugabe von selektiv wirkenden Substanzen, insbesondere Antibiotika, zum Medium mit dieser Erfindung verringert werden und gegebenenfalls entfallen kann. D. h. in industriellen Verfahren, die im Allgemeinen über mehrere Stufen erfolgen und die zum Beispiel Schüttelkolbenkulturen, einen oder mehrere Vorfermenter und den Produktionsfermenter umfassen, kann die Zugabe von Antibiotika insbesondere im Produktionsfermenter unterbleiben.
Bei der Kultur der Stämme, die das erfindungsgemäße Wirt-Vektor-System enthalten, werden mindestens 3, vorzugsweise mindestens 6, besonders bevorzugt mindestens 9 und ganz besonders bevorzugt mindestens 12 Generationen in einem Nährmedium durchlaufen, das kein Antibiotikum umfasst.
Bei der vorliegenden Erfindung wurde außerdem gefunden, dass die Alaninracemase, für die das alr-Gen von Corynebacterium glutamicum codiert, zur Herstellung von D-Alanin und D-Valin eingesetzt werden kann. Bakterien, vorzugsweise coryneforme Bakterien und Enterobacteriaceae, insbesondere Corynebacterium glutamicum und Escherichia coli, in denen das alr-Gen von Corynebacterium glutamicum in verstärkter, insbesondere überexprimierter, Form vorliegt, werden dafür verwendet.
Um eine Überexpression zu erreichen, kann die Anzahl der Kopien der entsprechenden Gene erhöht werden, oder der Promotor und die regulatorische Region oder die Ribosomenbindungsstelle stromaufwärts des Strukturgens können mutiert werden. Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebracht werden, wirken in der gleichen Weise. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlauf der Kultur zu erhöhen. Die Expression wird ebenso durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA verbessert. Ferner wird die Enzymaktivität auch erhöht, indem man den Abbau des Enzymproteins verhindert. Die Gene oder Genkonstrukte können sich entweder in Plasmiden mit variabler Kopienzahl befinden oder in das Chromosom integriert und dort amplifiziert werden. Alternativ kann eine Überexpression der in Frage kommenden Gene auch durch Verändern der Zusammensetzung der Medien und des Anzuchtverfahrens erreicht werden.
Die hergestellten Mikroorganismen, in denen die Alaninracemase, für die das alr-Gen von coryneformen Bakterien codiert, in verstärkter, insbesondere überexprimierter, Form vorliegt, können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder im Fed-Batch-(Beschickungsverfahren) oder wiederholten Fed-Batch-Verfahren (wiederholten Beschickungsverfahren) zum Zweck der Gewinnung von Biomasse gezüchtet werden können. Eine Zusammenfassung bekannter Anzuchtverfahren ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss den Anforderungen der bestimmten Stämme in geeigneter Weise entsprechen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Die in dieser Weise gezüchteten Mikroorganismen können aus der Kulturbrühe durch geeignete Abtrennungsverfahren, wie Filtration, Zentrifugation, Ausflockung, Fällung oder Kombinationen davon abgetrennt werden. Beschreibungen solcher Verfahren können im Lehrbuch "Mikrofiltration mit Membranen Grundlagen, Verfahren, Anwendungen" (Ripperger S., VCH Verlagsgesellschaft, Weilheim, Deutschland (1991)) oder im Handbuch "Bioseparations, Downstream Processing for Biotechnology" (Belter P. A., Cussler E. L., Hu Wei-Shou, John Wiley & Sons; New York (1988)) gefunden werden. Die konzentrierte und isolierte Biomasse kann in wässrigen Puffersystemen oder organischen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel Aceton, Methanol und Acetonitril, oder Gemischen eines wässrigen Puffers mit einem organischen Lösungsmittel resuspendiert und dann zur Herstellung der D-Aminosäure aus der entsprechenden L-Aminosäure eingesetzt werden.
Es ist ebenfalls möglich, die Konzentration und Isolierung der Biomasse wegzulassen und die L-Aminosäure direkt in die Fermentationsbrühe einzubringen und die produzierte D-Aminosäure aus der Fermentationsbrühe zu isolieren.
Wenn gewünscht, kann die Biomasse, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt und erhalten wird, zur Herstellung eines Rohextraktes oder Zellextraktes oder zur Herstellung einer vollständig oder teilweise gereinigten Enzymzubereitung eingesetzt werden.
Durch Zellaufschlussverfahren, zum Beispiel mithilfe von Ultraschall, Kugelmühlen oder Hochdruckhomogenisatoren, kann ein Zellextrakt hergestellt werden, der dann direkt für die Umwandlung der L-Aminosäure in die D-Aminosäure eingesetzt werden kann.
Zum Zweck der weiteren Reinigung kann der erhaltene Zellextrakt durch geeignete chromatographische oder elektrophoretische Verfahren mit dem Ziel der Reinigung und Isolation der Alaninracemase weiter aufbereitet werden. Verfahren dafür werden im Detail im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 2. Angewandte Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) und im Lehrbuch "Industrielle Enzyme" (Heinz Ruttloff, Behrs Verlag GmbH & Co., Hamburg (1994)) beschrieben.
Weitere Anleitungen und Beschreibungen für solche Verfahren, die auch als Biokatalyse bezeichnet werden, können im Lehrbuch "Stereoselective Biocatalysis" (Ramesh N. Patel, Verlag Marcel Dekker, Inc., New York, Basel (2000)) nachgeschlagen werden.
Nachdem die Biomasse oder der Zellextrakt oder das gereinigte Enzym abgetrennt worden ist, können die D-Aminosäure der verwendeten racemischen chemischen Verbindung oder Salze davon durch geeignete Aufarbeitungsverfahren, wie zum Beispiel Filtration, Abtrennung, reaktive Extraktion, Kristallisation oder Trocknen, erhalten werden.
Es ist auch möglich, dass die vollständig oder teilweise gereinigte Alaninracemase an geeignete Trägermaterialien gebunden oder in eine geeignete Matrix eingebettet wird (Immobilisierung). Mögliche Träger sind zum Beispiel Polysaccharide, Polyhydroxy-Verbindungen, Silikate, Silicagele, Gläser, Polyamide und Polyamine. Agar, Cellulose, Alginat, Gelatine und Polyacryle können zum Beispiel als Matrix verwendet werden. Es ist weiterhin möglich, das Enzym in Membranen einzuschließen oder einzukapseln. Anleitungen in diesem Zusammenhang können ebenfalls im Lehrbuch "Industrielle Enzyme [Industrial Enzymes]" (Heinz Ruttloff, Behrs Verlag GmbH & Co., Hamburg (1994)) gefunden werden.
Reine Kulturen des folgenden Mikroorganismus wurden am 2. Mai 2001 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Deutschland) kraft dem Budapester Vertrag hintergelegt:

• Escherichia coli DH5αMCR[pSAC-ALR81] als DSM 14277
• Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 als DSM 14280
• Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91[pSELF2000] als DSM 14279

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden mithilfe von Beispielen ausführlicher erläutert.
Die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet:
Corynebacterium glutamicum LP-6 wurde im Zusammenhang mit EP-B 0 472 869 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Deutschland) als DSM5816 hintergelegt. Der Aufbewahrungszeitraum von DSM5816 wurde kraft der Richtlinie 9.1 des Budapester Vertrags verlängert. DSM5816 hat die folgenden taxonomischen Merkmale:

– Zellform: V-förmig verzweigend
– Peptidoglycan: meso-Diaminopimelinsäure
– Mycolsäuren: Corynebakterien-Mycolsäuren mit großer Ähnlichkeit zu DSM20300
– Fettsäuremuster: typisches Fettsäuremuster von Corynebakterien mit unverzweigten, gesättigten und ungesättigtenen Fettsäuren mit großer Ähnlichkeit zu denjenigen von DSM20300.
– Guanin- + Cytosin-(G + C-)Gehalt: 55,1%
– 16S-rDNA-Sequenz: 98,6% identisch mit DSM20300
– DNA-DNA-Homologie: 81,6% mit DSM20300 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erhalten.

Die in den folgenden Beispielen erwähnten allgemeinen genetischen Arbeitstechniken und die verwendeten Nährmedien, wie zum Beispiel LB-Agar, sind in der Fachliteratur von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborytory Manual, Cold Spring Harbor Laborytory Press (1989)) beschrieben. Der Elektrotransfer von Plasmid-DNA wurde durch das Verfahren von Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 65, 299–304 (1989)) durchgeführt. Chromosomale DNA von Corynebacterium glutamicum wurde durch das Verfahren von Tauch et al. (Plasmid 34, 119–131 (1995)) isoliert.
Das Sequenzieren der in den folgenden Beispielen beschriebenen DNA-Fragmente wurde durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463–5467 (1977)) durchgeführt. Die erhaltenen rohen Sequenzdaten wurden unter Verwendung des "STAREN-Softwarepakets" (Staden, Molecular Biotechnology 5, 233–241 (1996)) verarbeitet. Die computergestützten Analysen codierender Regionen wurden mit dem "XNIP"-Programm (Staden, Molecular Biotechnology 5, 233–241 (1996)) durchgeführt. Weitere Sequenzanalysen wurden mit den "BLAST-Programmen" (Altschul et al., Nucleic Acids Research 25, 3389–3402 (1997)) durchgeführt.
Beispiel 1
Isolation und Charakterisierung des Plasmids pTET3
Zur Charakterisierung des Plasmids pTET3 wurde der Bakterienstamm Corynebacterium glutamicum LP-6 in LB-Medium gezüchtet, und Plasmid-DNA wurde gemäß den Anleitungen des "NucleoBond-Nukleinsäurereinigungskits- und -kartuschen-Benutzerhandbuchs (PT3167-1) (Clonetech Laboratories GmbH, Heidelberg, Deutschland, 1997) isoliert. Die Plasmid-DNA wurde in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt, und die Plasmidbande, die dem Plasmid pTET3 entsprach, wurde aus dem Agarosegel reisoliert. Die Arbeitsanleitungen für das Experiment entsprachen dem "QIAEX II-Handbuch zur DNA-Extraktion aus Agarosegelen)" (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997). Die reisolierte pTET3-Plasmid-DNA wurde dann, jeweils einzeln und in Kombination, mit den Restriktionsenzymen AvrII, MunI (New England Biolabs GmbH (Schwalbach, Deutschland)), HpaI, ScaI, XbaI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) und SpeI (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anleitungen der Hersteller gespalten. Die Restriktionsansätze wurden dann in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Die in 1 gezeigte Restriktionskarte des Plasmids pTET3 von Corynebacterium glutamicum LP-6 wurde durch Vergleich der erhaltenen DNA-Fragmente mit DNA-Fragmenten bekannter Länge (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), bestimmt.
Beispiel 2
Isolation und Sequenzierung der Antibiotikaresistenzregion des Plasmids pTET3
Zur Identifikation von Antibiotikaresistenzregionen auf dem Plasmid pTET3 wurden der resistente Teststamm Corynebacterium glutamicum LP-6 und der sensitive Kontrollstamm Corynebacterium glutamicum ATCC13032 zuerst in Anwesenheit und Abwesenheit verschiedener Antibiotika und Antibiotikakonzentrationen gemäß den Anleitungen für Experimente des "National Committee of Clinical Laboratory Standards", Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; Approved Standard, M7-A4 (1997)) gezüchtet. Die für diesen Test benötigten Antibiotika, u. a. das Antibiotikum Tetracyclin, wurden vom Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, Deutschland) erhalten und in den Konzentrationen eingesetzt, die in den "Approved Standards M7-A4" angegeben sind. Das für diesen Test benötigte Nährmedium, "MÜLLER-HINTON-Bouillon", wurde von Merck KgaA (Darmstadt, Deutschland) erhalten und gemäß den Anleitungen des Herstellers eingesetzt. Gemäß den Anleitungen der "Approved Standards M7-A4" konnte eine inhibitorische Konzentration für Tetracyclin bestimmt (1) und eine Resistenz des Bakterienstammes Corynebacterium glutamicum LP-6 gegen das Antibiotikum Tetracyclin identifiziert werden. Die Plasmid-DNA, die aus Corynebacterium glutamicum LP-6 mithilfe eines alkalischen Lyseverfahrens isoliert wurde ("NukleoBond-Nukleinsäurereinigungskits- und -kartuschen-Benutzerhandbuch (PT3167-1)", Clonetech Laboratories GmbH, Heidelberg, Deutschland, 1997), wurde dann mittels Elektrotransfer in Corynebacterium glutamicum ATCC13032 eingebracht.
Bei der primären Selektion auf LB-Agar mit 5 μg/ml Tetracyclin erfolgte eine Selektion direkt auf die Anwesenheit der identifizierten Tetracyclinresistenz. Die Anwesenheit eines Plasmids im dem transformierten Bakterienstamm Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde dann durch ein alkalisches Lyseverfahren demonstriert ("NukleoBond-Nukleinsäurereinigungskits- und -kartuschen-Benutzerhandbuch (PT3167-1)", Clonetech Laboratories GmbH, Heidelberg, Deutschland, 1997).
Restriktionsanalysen der isolierten Plasmid-DNA und Vergleich der erhaltenen Fragmentlängen mit DNA-Fragmenten bekannter Länge (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) und mit DNA-Fragmenten des Plasmids pTET3 zeigten, dass das transformierte Plasmid, das Tetracyclinresistenz verleiht, das Plasmid pTET3 ist. Der transformierte Stamm wurde als Corynebacterium glutamicum ATCC13032[pTET3] bezeichnet.
Ein erneuter Resistenztest mit dem isolierten resistenten Teststamm, Corynebacterium glutamicum ATCC13032[pTET3], und dem sensitiven Kontrollstamm Corynebacterium glutamicum ATCC13032 in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Antibiotikums Tetracyclin gemäß den Anleitungen für Experimente des "National Committee of Clinical Laboratory Standards" zeigte, dass der Teststamm Corynebacterium glutamicum ATCC13032[pTET3] eine Resistenz gegen dieses Antibiotikum hat (Tabelle 1). Tabelle 1 Minimale inhibitorische Konzentration (μg Tetracyclin pro ml) verschiedener Corynebacterium glutamicum-Stämme

Antibiotikum ATCC13032 LP-6 ATCC13032[pTET3]

Tetracyclin ≤ 0,75 ≤ 12 ≤ 12

≤ = Die minimale inhibitorische Konzentration ist kleiner als oder gleich dem angegebenen Wert.

Zur weiteren Charakterisierung der Tetracyclinresistenz von pTET3 wurde die Plasmid-DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032[pTET3] mithilfe eines alkalischen Lyseverfahrens ("NucleoBond-Nukleinsäurereinigungskits- und -kartuschen-Benutzerhandbuch (PT3167-1)" (Clonetech Laboratories GmbH, Heidelberg, Deutschland, 1997) reisoliert. Die Plasmid- DNA wurde dann mit dem Restriktionsenzym HindIII (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gespalten und in den Escherichia-coli-Klonierungsvektor pK18mob2 (Tauch et al., Plasmid 40, 126–139 (1998)) ligiert.
Die DNA-Restriktion und die DNA-Ligation wurden mit der Enzym T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Der Ligationsansatz wurde dann durch Elektroporation in den Bakterienstamm Escherichia coli DH5αMCR (Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123, 343–348 (1994)) überführt. Nach Selektion auf LB-Agar, der mit 5 μg/ml Tetracyclin angereichert war, wurden Transformanten mit Plasmidvektoren erhalten, die DNA-Abschnitte des Plasmids pTET3 enthielten. Die Anwesenheit der Plasmide wurde durch ein alkalisches Lyseverfahren gezeigt ("QIAprep Miniprep-Handbuch zur Reinigung von Piasmid-DNA^TM, Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997).
Restriktionsanalysen der isolierten Plasmid-DNA und Vergleich der erhaltenen Fragmentlängen mit DNA-Fragmenten bekannter Länge zeigten, dass das als pTET3-H9 bezeichnete, isolierte Plasmid aus dem Plasmidvektor pK18mob2 und einem DNA-Fragment von pTET3 mit einer Größe von etwa 4000 bp bestand. Der Plasmidvektor pTET3-H9, der aus der Klonierung mit dem Restriktionsenzym HindIII stammt, verleiht Resistenz gegen Tetracyclin (5 μg/ml) in Escherichia coli DH5αMCR.
Für die Sequenzierung von doppelsträngiger DNA des DNA-Fragments von pTET3 mit einer Größe von ca. 400 bp, das Resistenz gegen Tetracyclin verleiht, wurde DNA des Plasmids pTET3-H9 gemäß den Anleitungen des QIAprep Miniprep-Handbuchs zur Reinigung von Plasmid-DNA" (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) isoliert. Nach Sequenzieren und Analyse der Sequenz war es möglich, zwei offene Lesenrahmen (ORFs) auf dem sequenzierten DNA-Fragment festzustellen. 2 zeigt eine Restriktionskarte der sequenzierten DNA-Regionen von pTET3 und die Position der identifizierten offenen Lesenrahmen (ORFs). Die Analysen zeigten, dass ORF1 ein tetR-Gen darstellt, das für ein Tetracyclinresistenz-Repressorprotein (TetR) codiert, und ORF2 ein tetA-Gen darstellt, das für ein Tetracyclinresistenzprotein (TetA) codiert. Die DNA-Sequenz der Resistenzregion von pTET3 ist in SEQ ID Nr. 1 wiedergegeben. Die von den Sequenzdaten abgeleitete Aminosäuresequenz des Tetracyclinresistenzproteins (TetA) ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. Die codierende Region des tetR-Gens, das für das Tetracyclinresistenz-Repressorprotein (TetR) codiert, ist außerdem in SEQ ID Nr. 3 und die abgeleitete Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 4 gezeigt.
Beispiel 3
Konstruktion des Plasmidvektors pSELF1-1
Der Plasmidvektor pSELF1-1 wurde aus dem bekannten Plasmid pGA1 ( US-A 5,175,108 ) unter Verwendung des Tetracyclinresistenzgens von pTET3 (siehe Beispiel 1 und 2) hergestellt.
Dazu wurde Gesamt-Plasmid-DNA von Corynebacterium glutamicum LP-6 durch alkalische Behandlung der Bakterienzellen isoliert ("NucleoBond-Nukleinsäurereinigungskits- und -kartuschen-Benutzerhandbuch (PT3167-1)" (Clonetech Laboratories GmbH, Heidelberg, Deutschland, 1997)). Die erhaltene DNA-Präparation wurde in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Plasmidbanden, die dem Plasmid pGA1 und dem Plasmid pTET3 entsprachen, wurden aus dem Agarosegel isoliert ("QIAEX II-Handbuch zur DNA-Extraktion aus Agarosegelen", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland). Danach wurde die isolierte Plasmid-DNA von pGA1 mit dem Restriktionsenzym SalI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers gespalten. Die isolierte Plasmid-DNA von pTET3 wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gespalten.
Der Restriktionsansatz von pTET3 wurde in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 2500 bp, auf dem sich die Tetracyclinresistenzregion gemäß den DNA-Sequenzdaten (Beispiel 2) befindet, wurden reisoliert. Das von pGA1 erzeugte DNA-Fragment und das reisolierte DNA-Fragment von pTET3 wurden dann mithilfe von T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers miteinander ligiert. Das Ligationsgemisch wurde durch Elektroporation in Corynebacterium glutamicum ATCC13032 eingebracht. Die Selektion wurde auf LB-Agar mit 5 μg/ml Tetracyclin durchgeführt. Nach Inkubation für 48 Stunden bei 30°C wurden Kolonien isoliert, die den neuen Plasmidvektor enthielten. Die Anwesenheit des Plasmidvektors in den transformierten Bakterienzellen wurde durch ein alkalisches Lyseverfahren gezeigt ("QIAGEN-Plasmid-Mini-Handbuch für Plasmid-Mini-Kit", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997). Das isolierte Plasmid wurde als pSELF1-1 bezeichnet. Restriktionsanalysen von pSELF1-1 und ein Vergleich der Fragmentlängen, die mit DNA-Fragmenten bekannter Länge erhalten wurden, ergaben die Restriktionskarte, die als 3 angefügt ist.
Durch diesen Konstruktionsweg umfasst das Plasmid pSELF1-1 ausschließlich DNA-Fragmente, die von Corynebacterium glutamicum stammen.
Beispiel 4
Identifikation des alr-Gens von Corynebacterium glutamicum
Das alr-Gen von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde mithilfe eines PCR-Verfahrens und chromosomaler Matrizen-DNA identifiziert.
Zuerst wurden konservierte Proteinregionen aus einem Mehrfach-Vergleich mit Aminosäuresequenzen bekannter Alr-Proteine von Escherichia coli (GenBank-Zugangsnummer AE000478), Mycobacterium smegmatis (GenBank-Zugangsnummer U70872), Mycobacterium leprae (GenBank-Zugangsnummer U00020), Bacillus subtilis (GenBank-Zugangsnummer AB001488) und Streptomyces coelicolor (GenBank-Zugangsnummer AL031317) unter Verwendung des ALIGN-Computerprogramms (Myers und Miller, Computer Application in Bioscience 4, 11–17 (1988)) identifiziert. Die konservierten Proteinregionen wurden dann auf DNA-Ebene in den Nukleotidsequenzen von Mycobacterium smegmatis (GenBank-Zugangsnummer U70872), Mycobacterium leprae (GenBank-Zugangsnummer U00020) und Escherichia coli (GenBank-Zugangsnummer AE000478) identifiziert und ebenfalls mit dem ALIGN-Computerprogramm miteinander verglichen.
Unter Berücksichtigung der Codonnutzung von Corynebacterium glutamicum (Malumbres et al., Gene 134, 15–24 (1993)), wurden die folgenden Oligonukleotidprimer für die konservierten DNA-Regionen hergestellt und verwendet (siehe auch SEQ ID Nr. 5 und 6):
Eine PCR-Reaktion wurde mit den Primern ALR1-1 und ALR4-1 (ARK Scientific GmbH, Darmstadt, Deutschland) und einer chromosomalen Matrizen-DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 in einem PCT-100-Thermocycler (MJ Research Inc., Watertown, USA) durchgeführt. Die Amplifikation wurde mit Taq-DNA-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt hergestellt: 2 Minuten Anfangslauf bei 94°C, 90 Sekunden Denaturieren bei 94°C, 45 Sekunden Primer-Hybridisierung bei 61°C und 90 Sekunden Verlängerung bei 72°C. Die Amplifikationsschritte wurden 35 Mal wiederholt und mit einem Verlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72°C beendet. Von der PCR-Reaktion wurden 3 μl in einem 0,8%igen Agarosegel mit einem DNA-Längenstandard (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgetrennt, und die Amplifikation eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 830 bp wurde demonstriert.
Das erhaltene PCR Produkt wurde dann in den Vektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen BV, Groningen, Niederlande) kloniert. Die Klonierung erfolgte gemäß den Anleitungen des Herstellers ("TOPO TA-Klonierungsanleitungshandbuch, Version H", Invitrogen BV, Groningen, Nieder lande, 1999). Die Selektion der Klone erfolgte auf Antibiotikum-Medium Nr. 3 (Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland), das mit 25 μg/ml Kanamycin und 20 μg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactopyranosid; Biosolve BV, Valkenswaard, Niederlande) angereichert war. Plasmid-DNA wurde aus rekombinanten Klonen gemäß den Anleitungen des "QIAprep Miniprep-Handbuches zur Reinigung von Plasmid-DNA" (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland,) gespalten. Die Auftrennung des Spaltungsansatzes in einem 0,8%igen Agarosegel zeigte, dass das PCR-Produkt mit einer Größe von etwa 830 bp kloniert worden war. Das erhaltene Plasmid wurde als pALR14-12 bezeichnet.
Die isolierte Plasmid-DNA von pALR14-12 wurde außerdem zur DNA-Sequenzierung mit dem universellen Reversprimersystem (Invitrogen, Groningen, Niederlande) und dem Kettenabbruchverfahren von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463–5467 (1977)) eingesetzt. Die erhaltene DNA-Sequenz ist in SEQ ID Nr. 7 gezeigt. Die DNA-Sequenz wurde mit den BLAST-Programmen gegen die Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, USA) abgeglichen. Die mit den Primern ALR1-1 und ALR4-1 amplifizierte DNA zeigte auf der Ebene des abgeleiteten Proteins u. a. eine Homologie mit dem Alr-Protein von Mycobacterium tuberculosis (GenBank-Zugangsnummer AL123456).
Beispiel 5
Sequenzanalyse des alr-Gens von Corynebacterium glutamicum
Das Plasmid pALR14-12 wurde gemäß den Anleitungen des "QIAprep Miniprep-Handbuches zur Reinigung von Plasmid-DNA" (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gespalten. Der Spaltungsansatz wurde in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Das EcoRI-Fragment von pALR14-12 mit einer Größe von etwa 830 bp wurde aus dem Agarose-Gel isoliert ("QIAEX II-Handbuch zur DNA Extraktion aus Agarosegelen", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) und mit dem DNA-Markierungs- und Nachweiskit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers markiert. Diese markierte DNA-Sonde wurde an die Cosmid-Bibliothek von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 hybridisiert, die von Bathe et al. (Molecular and General Genetics 252, 255–265 (1996)) beschrieben wurde. Die Hybridisierung wurde ebenfalls gemäß der Anleitung des Herstellers mit dem DNA-Markierungs- und Nachweiskit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Ein hybridisierendes Cosmid wurde durch dieses Verfahren in der Cosmid-Bibliothek identifiziert. Dieses Cosmid wurde gemäß den Anleitungen des "QIAprep Miniprep-Handbuches zur Reinigung von Plasmid-DNA" (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) isoliert und für die DNA-Sequenzierung eingesetzt.
Ausgehend von der Sequenz des identifizierten, im Plasmid pALR14-12 enthaltenen Amplifikationsproduktes des alr-DNA-Fragments (Beispiel 4) wurde eine DNA-Sequenzierung des gesamten alr-Gens durch das Primer-Walking-Verfahren durchgeführt (Frangeul et al., Microbiology 145, 2625–2634 (1999)). Eine kontinuierliche DNA-Sequenz mit einer Größe von etwa 1,8 kb, die einem ScaI-BglII Fragment aus dem Chromosom von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 entspricht, wurde in dieser Weise erhalten. Eine Restriktionskarte der sequenzierten DNA-Region ist in 4 gezeigt. Die bestimmte DNA Sequenz ist in SEQ ID Nr. 8 gezeigt. Eine Analyse der Codierungswahrscheinlichkeit der sequenzierten DNA-Region zeigte eine codierende Region, die in vollständiger Form vorhanden ist, deren Proteinsequenz (siehe SEQ ID Nr. 9) eine hohe Homologie zu bekannten Alr-Proteinen in der NCBI-Datenbank (Bethesda, USA) hat. Diese codierende Region wurde als das alr-Gen bezeichnet (4).
Beispiel 6
Konstruktion und phänotypische Charakterisierung einer alr-Mutante von Corynebacterium glutamicum
Die alr-Genregion wurde mit folgenden Primern
(ARK Scientific GmbH, Darmstadt, Deutschland), die von der DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 8) abgeleitet waren, und mit chromosomaler Matrizen-DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 amplifiziert. Die PCR-Reaktion wurde in einem PCT-100-Thermocycler (MJ Research Inc., Watertown, USA) durchgeführt. Die Amplifikation wurde mit Taq-DNA-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt hergestellt: 2 Minuten Anfangslauf bei 94°C, 90 Sekunden Denaturieren bei 94°C, 45 Sekunden Primer-Hybridisierung bei 57°C und 90 Sekunden Verlängerung bei 72°C. Die Amplifikation wurde 35 Mal wiederholt und mit einem Verlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72°C beendet. Von der PCR-Reaktion wurden 3 μl in einem 0,8%igen Agarosegel mit einem DNA-Längenstandard (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgetrennt, und die Amplifikation eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 1,3 kb wurde auf diese Art demonstriert.
Das erhaltene PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen BV, Groningen, Niederlande) kloniert. Die Klonierung erfolgte gemäß den Anleitungen des Herstellers ("TOPO TA-Klonierungsanleitungshandbuch, Version H", Invitrogen BV, Groningen, Niederlande, 1999). Die Selektion der Klone wurde auf Antibiotikum-Medium Nr. 3 (Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland) durchgeführt, das mit 25 μg/ml Kanamycin und 20 μg/ml X-Gal (Biosolve BV, Valkenswaard, Niederlande) angereichert war. Plasmid-DNA wurde aus rekombinanten Klonen gemäß den Anleitungen des "QIAprep Miniprep-Handbuches zur Reinigung von Plasmid-DNA" (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland,) gespalten. Die Auftrennung des Spaltungsansatzes in einem 0,8%igen Agarosegel zeigte, dass das PCR-Produkt mit einer Größe von etwa 1,3 kb kloniert worden war. Das erhaltene Plasmid wurde als pALR5 bezeichnet.
Das DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 1,3 kb wurde aus dem Plasmid pALR5 mit dem Restriktionsenzym EcoRI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) ausgeschnitten und in den Vektor pK18mobsacB (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)) kloniert. Die DNA-Restriktion und die DNA-Ligation wurden mit dem Enzym T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Der Ligationsansatz wurde dann durch Elektroporation in den Bakterienstamm Escherichia coli DH5αMCR (Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123, 343–348 (1994)) überführt, und die Selektion erfolgte auf Antibiotikum-Medium Nr. 3 (Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland) mit 25 μg/ml Kanamycin und 20 μg/ml X-Gal (Biosolve BV, Valkenswaard, Niederlande).
Das Vorliegen von Plasmiden in den transformierten Bakterienzellen wurde durch ein alkalisches Lyseverfahren ("QIAprep Miniprep-Handbuch zur Reinigung von Plasmid-DNA", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) demonstriert. Restriktionsanalysen der isolierten Plasmid-DNA und ein Vergleich der Fragmentlängen mit DNA-Fragmenten bekannter Länge zeigten, dass das isolierte Plasmid den Plasmidvektor pK18mobsacB und das DNA-Fragment von pALR5 mit einer Größe von etwa 1,3 kb umfasste. Dann wurde auf die gleiche Weise in das erhaltene Plasmid mit den Enzymen EcoRV und SspI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) eine Deletion eingeführt. Das erhaltene Plasmid wurde als pSAC-ALR81 bezeichnet und ist in 5 gezeigt. Die Sequenz des in diesem Plasmid enthaltenen und als Δalr91 bezeichneten alr-Allels ist in SEQ ID Nr. 12 gezeigt.
Das Deletionskonstrukt pSAC-ALR81 wurde durch Elektroporation in Corynebacterium glutamicum ATCC13032 eingebracht. Die Selektion auf Plasmidintegration erfolgte auf LB-Agar, der mit 25 μg/ml Kanamycin angereichert war. Die weitere Konstruktion der alr-Deletionsmutante wurde gemäß den Testanleitungen von Schäfer et al. (Gene 145, 69–73 (1994)) durchgeführt. Eine einzelne Kolonie des Integrantenstammes wurde 15 Stunden lang in 10 ml Lb-Medium gezüchtet, das mit 0,4 g/l D-Alanin angereichert war, und dann auf LB-Agar ausplattiert, der mit 0,4 g/l D-Alanin und 100 g/l Saccharose angereichert war. Nach Inkubation der Agarplatten für 15 Stunden bei 30°C wurden einzelne Kolonien parallel auf die drei Testnährmedien LB-Agar + 0,4 g/l D-Alanin, LB-Agar + 0,4 g/l D-Alanin + 25 μg/ml Kanamycin und LB-Agar überführt. Nach einer weiteren Inkubation von 20 Stunden bei 30°C wurden rekombinante Klone identifiziert, die nur auf LB-Agar mit Zugabe von 0,4 g/l D-Alanin wachsen. Diese Klone tragen die als Δalr91 bezeichnete Deletion im alr-Gen.
Um die Δalr91-Deletion im Chromosom von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 zu demonstrieren, wurde chromosomale DNA von einem Klon isoliert und als Matrizen-DNA in einer PCR-Reaktion zusammen mit einer Kontrolle mit chromosomaler DNA von Wildtyp-Corynebacterium glutamicum ATCC13032 eingesetzt. Die PCR-Primer wurden von der DNA-Sequenz abgeleitet, die für das alr-Gen bestimmt wurde und in SEQ ID Nr. 8 gezeigt ist:
(ARK Scientific GmbH, Darmstadt Deutschland). Die PCR-Reaktion wurde in einem PCT-100-Thermocycler (MJ Research Inc., Watertown, USA) durchgeführt. Die Amplifikation wurde mit Taq-DNA-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt hergestellt: 2 Minuten Anfangslauf bei 94°C, 90 Sekunden Denaturieren bei 94°C, 45 Sekunden Primer- Hybridisierung bei 55°C und 90 Sekunden Verlängerung bei 72°C. Die Amplifikationsschritte wurden 35 Mal wiederholt und mit einem Verlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72°C beendet. Von der PCR-Reaktion wurden 3 μl in einem 0,8%igen Agarosegel mit einem DNA-Längenstandard (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgetrennt, und die Amplifikation eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 620 bp wurde auf diese Weise demonstriert.
Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde dann mit den Enzymen EcoRV und SspI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gespalten. Die Restriktionsansätze wurden in einem 0,8%igen Agarosegel mit einem DNA-Längenstandard (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgetrennt, und das Fehlen der Restriktionsspaltstellen für die Enzyme EcoRV und SspI wurde in dieser Weise demonstriert. Dieses Ergebnis bestätigt den Einbau der Δalr91-Deletion in das alr-Gen. Der auf diese Weise erhaltene und getestete Stamm wurde als Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 bezeichnet.
Beispiel 7
Konstruktion eines Plasmidvektors zur Antibiotikum-freien Selektion in Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91
Damit das alr-Gen für die Entwicklung von Klonierenvektoren für Corynebacterium glutamicum verwendet werden konnte, wurde das vollständige alr-Gen von dem Chromosom von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 mithilfe der PCR-Technik isoliert. Die eingesetzte Primerkombination waren die Oligonukleotide
(ARK Scientific GmbH, Darmstadt Deutschland). Die PCR-Reaktion wurde in einem PCT-100-Thermocycler (NJ Research Inc., Watertown, USA) durchgeführt. Die Amplifikation wurde mit Taq-DNA-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt hergestellt: 2 Minuten Anfangslauf bei 94°C, 90 Sekunden Denaturieren bei 94°C, 45 Sekunden Primer-Hybridisierung bei 57°C und 90 Sekunden Verlängerung bei 72°C. Die Amplifikation wurde 35 Mal wiederholt und mit einem Verlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72°C beendet. Von der PCR-Reaktion wurden 3 μl in einem 0,8%igen Agarosegel mit einem DNA-Längenstandard (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgetrennt, und die Amplifikation eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 1,6 kb wurde auf diese Weise demonstriert.
Die amplifizierte DNA wurde anschließend mit den Enzymen EcoRI und ScaI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gespalten und in den Vektor pSELF1-1 (Beispiel 3) kloniert, der ebenfalls mit den Enzymen EcoRI und ScaI gespalten worden war. Der Ligationsansatz wurde durch das Verfahren von Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 65, 299–304 (1989)) in den Empfängerstamm Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 (Beispiel 6) überführt. Die Selektion wurde auf LB-Medium mit 5 μg/ml Tetracyclin durchgeführt. Die erfolgte Plasmidtransformation wurde durch ein alkalisches Lyseverfahren ("QIAGEN-Plasmid-Mini-Handbuch für Plasmid-Mini-Kit", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) und anschließende Agarosegel-Elektrophorese gezeigt. Der konstruierte Vektor besteht aus dem EcoRI-ScaI-Fragment von pSELF1-1 und dem PCR-Amplifikationsprodukt des alr-Gens von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 und wurde als pSELF2000 bezeichnet. Eine Restriktionskarte des Plasmids pSELF2000 ist in 6 angefügt.
Um die Eigenschaften des Plasmids PSELF2000 zu testen, wurde 1 μg der isolierten Plasmid-DNA durch Elektroporation in Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 (Beispiel 6) eingebracht. Die Selektion wurde parallel auf LB-Agar, der mit 5 μg/ml Tetracyclin und 0,4 g/l D-Alanin angereichert war, und auf LB-Agar durchgeführt. Die Selektionsagarplatten wurden 20 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die erhaltene Anzahl an Klonen wurde dann gezählt. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt. Um die Transformation zu demonstrieren, wurde die Plasmid-DNA in jedem Fall aus 10 Kolonien durch alkalische Lyse ("QIAGEN Plasmid-Mini-Handbuch für Plasmid-Mini-Kit", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) isoliert und in einem 0,8%igen Agarosegel nachgewiesen.
Das Plasmid pSELF2000 gestattet eine Selektion ohne Verwendung von Antibiotika. Die Anzahl der Klone nach Elektrotransfer des Plasmids und anschließender Selektion auf Antibiotikum-freiem LB-Agar ist höher als im Fall iner Selektion mithilfe von Tetracyclin.
Das Plasmid pSELF2000 wurde außerdem mit dem Restriktionsenzym XhoI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gespalten, um die Antibiotikaresistenzregion vollständig entfernen. Der Ligationsansatz wurde in Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 transformiert, und die Selektion wurde auf LB-Agar durchgeführt. Der erhaltene Plasmidvektor wurde als pSELF2000X bezeichnet. Eine Karte von pSELF2000X ist in 7 gezeigt. Zum Testen der Eigenschaften des Plasmids pSELF2000X wurde 1 μg der isolierten Plasmid-DNA durch Elektroporation in Corynebacterium glutamicum Δalr91 (Beispiel 6) eingebracht. Die Selektion erfolgte auf LB-Medium. Die Selektionsagarplatten wurden 20 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die erhaltene Anzahl an Kolonien wurde dann gezählt. Bei der Vermehrung einer transformierten Zelle zu einer Kolonie werden ungefähr 15 Generationen durchlaufen. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt. Um die erfolgte Transformation zu demonstrieren, wurde die Plasmid-DNA von 10 Kolonien durch alkalische Lyse ("QIAGEN Plasmid-Mini-Handbuch für Plasmid-Mini-Kit", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) isoliert und in einem 0,8%igen Agarosegel nachgewiesen.
Das Plasmid pSELF2000X umfasst ausschließlich DNA-Fragmente vom Corynebacterium glutamicum und trägt kein Antibiotikaresistenzgen, ist aber zur Selektion in Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 geeignet. Tabelle 2 Transformation von Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 (Transformanten pro μg Plasmid-DNA)

Plasmid Selektionsmedium Transformanten pro μg Plasmid-DNA

pSELF2000 LB-Agar + 5 μg/ml Tetracyclin 6,8 × 10⁶

pSELF2000 LB 1,5 × 10⁷

pSELF2000X LB 2,9 × 10⁷
Beispiel 8
Klonierung des panD-Gens vom Corynebacterium glutamicum ATC013032
Das vollständige panD-Gen von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde durch PCR mit chromosomaler Matrizen-DNA mithilfe der bekannten DNA-Sequenz amplifiziert (Dusch et al., Applied and Environmental Microbiology 65, 1530–1539 (1999)). Die eingesetzte Primerkombination waren die Oligonukleotide
(ARK Scientific GmbH, Darmstadt, Deutschland). Der Primer PAMOD war in Bezug auf die chromosomale DNA-Sequenz von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 durch Insertion einer Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym SalI modifiziert. Die anschließende PCR-Reaktion wurde in einem PCT-100-Thermocycler (MJ Research Inc., Watertown, USA) durchgeführt. Die Amplifikation wurde mit Taq-DNA-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt hergestellt: 2 Minuten Anfangslauf bei 94°C, 90 Sekunden Denaturieren bei 94°C, 45 Sekunden Primer-Hybridisierung bei 55°C und 90 Sekunden Verlängerung bei 72°C. Die Amplifikation wurde 35 Mal wiederholt und mit einem Verlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72°C beendet. Von der PCR-Reaktion wurden 8 μl in einem 0,8%igen Agarosegel mit einem DNA-Längenstandard (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgetrennt, und die Amplifikation eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 1,1 kb wurde auf diese Weise demonstriert.
Zur Klonierung des Amplifikationsproduktes wurde das DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 1,1 kb aus dem Agarosegel mit dem "QIAEX II-Gelextraktionskit" gemäß den Anleitungen des Herstellers ("QIAEX II-Handbuch zur DNA-Extraktion aus Agarosegelen", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) reisoliert und mit den zwei Restriktionsenzymen SalI und NaeI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gespalten. Der Vektor pSELF2000 (Beispiel 7) wurde zudem mit den Restriktionsenzymen SalI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) und Ecl136II (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Deutschland) gespalten. Die Spaltungsansätze wurden mit DNA-T4-Ligase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers miteinander ligiert. Der Ligationsansatz wurde durch das Verfahren von Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 65, 299–304 (1989)) in den Empfängerstamm Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 (Beispiel 6) eingebracht. Die Selektion wurde auf LB-Agar durchgeführt. Die erfolgte Plasmidtransformation wurde durch ein alkalisches Lyseverfahren ("QIAGEN-Plasmid-Mini-Handbuch für Plasmid-Mini-Kit", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) und anschließende Agarosegel-Elektrophorese gezeigt. Der konstruierte Vektor besteht aus dem SalI-Ecl136II-Fragment von pSELF2000 und dem PCR-Amplifikationsprodukt des panD-Gens von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 und wurde als PSELF2000P1 bezeichnet. Eine Restriktionskarte des Plasmids ist in 8 gezeigt.
Beispiel 9
Verwendung des Antibiotikum-freien Vektorsystems zur Produktion von Pantothensäure mit Corynebacterium glutamicum
9.1 Herstellung des Wirtes
Um einen Corynebacterium-glutamicum-Stamm herzustellen, der für die Pantothenat-Produktion geeignet ist, wurde zuerst das ilvA-Gen im Chromosom von Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 (Beispiel 6) deletiert. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pBM20 (Möckel et al., Molecular Microbiology 13, 833–842 (1994)) mit dem Restriktionsenzym BglII (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gespalten und dann mit dem Enzym T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) religiert. Der Ligationsansatz wurde dann durch Elektroporation in Escherichia coli DH5αMCR überführt, und die Selektion erfolgte auf Antibiotikum-Medium Nr. 3 (Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland), das mit 100 μg/ml Amplicillin angereichert war. Das Vorliegen von Plasmiden in den transformierten Bakterienzellen wurde durch ein alkalisches Lyseverfahren ("QIAprep Miniprep-Handbuch zur Reinigung von Plasmid-DNA", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) demonstriert. Restriktionsanalysen der isolierten Plasmid-DNA und Vergleich der erhaltenen Fragmentlängen mit DNA-Fragmenten bekannter Länge zeigten, dass eine Deletion mit einer Größe von etwa 250 bp in das ilvA-Gen auf pBM20 eingebracht worden war. Das Plasmid wurde als pBM20ΔBglII bezeichnet.
Ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 1,5 kb wurde aus dem Plasmid pBM20ΔBglII mit dem Enzym EcoRI (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) ausgeschnitten und in den Vektor pK18mobsacB (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)) kloniert. Die DNA-Restriktion und die DNA-Ligation wurden mit dem Enzym T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Der Ligationsansatz wurde dann durch Elektroporation in den Bakterienstamm Escherichia coli DH5αMCR überführt, und die Selektion erfolgte auf Antibiotikum-Medium Nr. 3 (Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland), das mit 25 μg/ml Kanamycin und 20 μg/ml X-Gal (Biosolve BV, Valkenswaard, Niederlande) angereichert war. Das Vorliegen von Plasmiden in den transformierten Bakterienzellen wurde durch ein alkalisches Lyseverfahren ("QIAprep Miniprep-Handbuch zur Reinigung von Plasmid-DNA", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) demonstriert. Restriktionsanalysen der isolierten Plasmid-DNA und Vergleich der erhaltenen Fragmentlängen mit DNA-Fragmenten bekannter Länge zeigten, dass das isolierte und als pΔilvA bezeichnete Plasmid DNA des Plasmidvektors pK18mobsacB und das DNA-Fragment aus dem Plasmid pBM20ΔBglII mit einer Größe von etwa 1,5 kb umfasst.
Das Deletionskonstrukt pΔilvA wurde durch Elektroporation in Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 eingebracht. Die Plasmidintegration wurde einer Selektion auf LB-Agar unterzogen, der mit 0,4 g/l D-Alanin und 25 μg/ml Kanamycin angereichert war. Die weitere Konstruktion einer ilvA-Deletionsmutante wurde gemäß den Testanleitungen von Schäfer et al. (Gene 145, 69–73 (1994)) durchgeführt. Eine einzelne Kolonie des Integrantenstammes wurde über Nacht in 10 ml LB-Medium gezüchtet, das mit 0,4 g/l D-Alanin angereichert war, und dann auf LB-Agar ausplattiert, der mit 0,4 g/l D-Alanin und 100 g/l Saccharose angereichert war. Nach Inkubation der Agarplatten über Nacht bei 30°C wurden einzelne Kolonien parallel auf die vier Testnährmedien LB-Agar + 0,4 g/l D-Alanin, LB-Agar + 0,4 g/l D-Alanin + 25 μg/ml Kanamycin, MM1-Minimalagar + 0,4 g/l D-Alanin und MM1-Minimalagar + 0,4 g/l D-Alanin + 2 mM L-Isoleucin überführt. MM1-Minimalmedium besteht aus folgenden Komponenten:

(NH₄)SO₄ 10 g/l

Harnstoff 3 g/l

K₂HPO₄ 1 g/l

MgSO₄·7H₂O 0,4 g/l

FeSO₄·7H₂O 2 mg/l

MnSO₄·H₂O 2 mg/l

NaCl 50 mg/l

Biotin 50 g/l

Thiamin·HCl 500 μg/l

Glucosemonohydrat 20g/l
Nach einer weiteren Inkubation der Testnährmedien von 48 Stunden bei 30°C wurden rekombinante Klone identifiziert, die nur auf LB-Agar + 0,4 g/l D-Alanin und auf Minimalagar + 0,4 g/l D-Alanin + 2 mM L-Isoleucin wachsen. Diese Klone tragen eine Deletion im ilvA-Gen.
Um die als ΔilvA46 bezeichnete Deletion im Chromosom von Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91 zu demonstrieren, wurde chromosomale DNA von einem Klon isoliert und als Matrizen-DNA in einer PCR-Reaktion eingesetzt. Chromosomale DNA, die aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 isoliert worden war, wurde als Kontrolle eingesetzt. Die PCR-Primer wurden von der DNA-Sequenz des ilvA-Gens (Möckel et al., Journal of Bacteriology 174, 8065–8072 (1992)) abgeleitet:
(ARK Scientific GmbH, Darmstadt, Deutschland). Die PCR-Reaktion wurde in einem PCT-100-Thermocycler (NJ Research Inc., Watertown, USA) durchgeführt. Die Amplifikation wurde mit Taq-DNA-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anleitungen des Herstellers in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt hergestellt: 2 Minuten Anfangslauf bei 94°C, 90 Sekunden Denaturieren bei 94°C, 45 Sekunden Primer-Hybridisierung bei 57°C und 90 Sekunden Verlängerung bei 72°C. Die Amplifikationsschritte wurden 35 Mal wiederholt und mit einem Verlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72°C beendet. Von der PCR-Reaktion wurden 3 μl in einem 0,8%igen Agarosegel mit einem DNA-Längenstandard (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgetrennt, und die Amplifikation eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 1,6 kb wurde auf diese Weise demonstriert.
Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde dann mit den Enzymen BglII und mit einer Kombination von SpeI und EcoRV (Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg, Deutschland) gespalten. Die Restriktionsansätze wurden in einem 0,8%igen Agarosegel mit einem DNA-Längenstandard (DNA-Molekulargewichtsmarker X, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgetrennt, und das Fehlen einer BglII-Restriktionsspaltstelle und die Herstellung der Deletion im ilvA-Gen wurden in dieser Weise demonstriert. Der erhaltene Stamm wurde als Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91ΔilvA46 bezeichnet.
9.2 Herstellung des Pantothensäure-Produzenten
Zur Herstellung des Pantothensäure-Produzenten wurde in jedem Fall 1 μg der Plasmid-DNA, die aus dem Plasmid pSELF2000P1 (Beispiel 8) sowie den Kontrollplasmiden pSELF2000 und pSELF2000X (Beispiel 7) isoliert worden war, durch Elektroporation in Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91Δilv46 eingebracht. Die Selektion wurde auf LB-Agar durchgeführt. Die Selektionsagarplatten wurden 20 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die erfolgte Plasmidtransformation wurde durch ein alkalisches Lyseverfahren ("QIAGEN Plasmid-Mini-Handbuch für Plasmid-Mini-Kit", Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland, 1997) und anschließende Agarosegel-Elektrophorese demonstriert. Die auf diese Weise konstruierten Stämme, ATCC13032Δalr91Δilv46[pSELF2000], ATCC13032Δalr91Δilv46 [pSELF2000X] und ATCC13032Δalr91Δilv46[pSELF2000P1] wurden für die Produktion von Pantothenat eingesetzt.
9.3 Herstellung von Pantothensäure
Die Bakterienstämme wurden zuerst 24 Stunden lang bei 30°C in 50 ml LB-Medium gezüchtet, wobei ungefähr 15 bis 20 Generationen durchlaufen wurden. Dann wurde 1 ml der Bakterienkultur zweimal mit CGXII-Medium (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175, 5595–5603, (1993)), zu dem 2 mM Isoleucin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland) hinzugefügt worden war, gewaschen, in 50 ml CGXII-Medium überführt, das mit 2 mM L-Isoleucin angereichert war, und 24 Stunden lang bei 30°C gezüchtet. Die Anzahl der Generationen in dieser Kultur betrug ungefähr 6. 50 ml CGXII-Medium, das 2 mM L-Isoleucin umfasste, wurden wiederum mit 3 ml dieser Kultur beimpft. Nach weiterer Inkubation des Ansatzes für 24 lang bei 30°C, was einer Anzahl an Generationen von ungefähr 4 bis 5 entspricht, wurden 20 ml der Bakterienkultur durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 1250 × g sedimentiert. Der Kulturüberstand wurde dann einer Sterilfiltration mit einer Millex-GS-Filtereinheit (0,22 μm, Millipore S. A., Molsheim, Frankreich) unterworfen. Die Pantothensäurekonzentration in den filtrierten Kulturüberständen wurde gemäß den Anleitungen im Difco-Handbuch, 10.
Auflage (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) bestimmt. Die nach 24-stündiger Kultivierung erhaltenen Pantothensäurekonzentrationen sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3 Pantothensäurekonzentration in den Kulturüberständen verschiedener Stämme von Corynebacterium glutamicum

Stamm Konzentration (ng/ml)

ATCC13032Δalr91Δilv46[pSELF2000] 6,4

ATCC13032Δalr91Δilv46[pSELF2000X] 6,6

ATCC13032Δalr91Δilv46[pSELF2000P1] 411
Beispiel 10
Herstellung von D-Alanin
Um das Enzym Alaninracemase zu erhalten, wurden Zellen des Stammes C. glutamicum ATCC13032Δalr91/pSELF2000 (siehe Beispiel 8) in einem Schüttelkolben gezüchtet. Dazu wurde der Stamm in einem zur Kultivierung geeigneten Nährmedium gezüchtet, die Zellen wurden geerntet, und die Enzymaktivität der Alaninracemase im zellfreien Rohextrakt wurde dann bestimmt.

Dazu wurde der Stamm zuerst auf einer Agarplatte gezüchtet, die das Medium BMCG4 (Tabelle 4) enthielt. BMCG4-Medium ist eine Weiterentwicklung eines Mediums, das zur Kultivierung von Corynebacterium glutamicum geeignet ist, wie es von Liebl et al. (Applied Microbiology and Biotechnology, 32: 205–210 (1989)) beschrieben wurde. Tabelle 4 Zusammensetzung von BMCG4-Medium

Substanz	Konzentration
(NH₄)₂SO₄	7 g/l
Na₂HPO₄	6 g/l
KH₂PO₄	3 g/l
NH₄Cl	1 g/l
MgSO₄·7H₂O	0,4 g/l
FeSO₄·7H₂O	0,02 g/l
MnSO₄·H₂O	2,0 mg/l
Na₂B₄O₇·10H₂O	176 μg/l
(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O	80 μg/l
ZnSO₂·7H₂O	20 μg/l
CuSO₄·5H₂O	540 μg/l
MnCl₂·4H₂O	14 μg/l
FeCl₃·6H₂O	1,74 mg/l
CaCl₂·2H₂O	7,5 mg/l
D(+)-Biotin	50 μg/l
Thiaminchlorid·HCl	200 μg/l
Protocatechinsäure	30 mg/l
Glucosemonohydrat	10 g/l

Zur Herstellung fester Nährmedien wurde Agar-Agar zu BMCG4-Medium in einer Endkonzentration von 12 g/l hinzugefügt.
Um Biomasse oder Zellen des Stammes C. glutamicum ATCC13032Δalr91/pSELF2000 zu erhalten, wurde eine BMCG4-Flüssigkultur (10 ml Füllvolumen in einem 100-ml-Schüttelkolben) ausgehend von einer BMCG4-Agarplattenkultur angeimpft. Die Inkubation der Vorkultur wurde bei 33°C und 200 U/min (Umdrehungen pro Minute) 48 Stunden lang durchgeführt. Diese Vorkultur wurde dann in einem Verhältnis von 1% (v/v, Volumenverhältnis) zum Beimpfen der Hauptkultur eingesetzt, die 50 ml BMCG4-Medium in einem 500-ml-Schüttelkolben umfasste. Diese Hauptkultur wurde bei 33°C und 200 U/min 48 Stunden lang inkubiert. Die trockene Biomasse am Ende der Kultur betrug etwa 1,15 Gew.-%.
Die in dieser Weise produzierten Zellen wurden dann aus der Kulturbrühe durch Zentrifugation mit einer Laborzentrifuge des Biofuge-Stratos-Typs von Heraeus (Düsseldorf, Deutschland) bei 4000 U/min für 20 Minuten unter Kühlen aufgetrennt. Der Kulturüberstand wurde verworfen, und der Zellrückstand wurde in 20 ml eines Natrium-/Kaliumphosphat-Puffers (50 mM, pH 7,3) resuspendiert. Eine trockene Biomasse von 2,88 Gew.-% wurde in einer Probe dieser Zellsuspension mithilfe einer HR73-Halogen-Trockenwaage von Mettler Toledo (Greifenase, Schweiz) gemessen. Die Zellen waren dann mithilfe von Glasperlen (Durchmesser 0,5 Millimeter) in einem IMAC-Desintegrator für 30 Minuten unter Kühlen mit Eiswasser aufgebrochen.
Die Zellfragmente des in dieser Weise erhaltenen Rohextraktes wurden dann durch Zentrifugation in einer Laborzentrifuge des Biofuge-Stratos-Typs von Heraeus (Düsseldorf, Deutschland) bei 4000 U/min für 20 Minuten unter Kühlen abgetrennt. Eine Proteinkonzentration von 1,1 mg/l konnte dann im geklärten zellfreien Überstand des Rohextraktes mithilfe des Bradford-Verfahrens gemessen werden. Albuminstandards von Merck (Darmstadt, Deutschland) in den Konzentrationen 0,05 g/l, 0,1 g/l und 0,5 g/l wurden als Vergleichsstandard zum Zeichnen der Kalibrierungsgeraden verwendet. Die Extinktion der Proteinproben wurde in einem UVIKON933-UV/VIS-Photo meter von KROTON Instruments (Neufahrn, Deutschland) bestimmt.
Zur Ermittlung der Enzymaktivität der Alaninracemase wurden 0,5 ml einer L-Alanin-Lösung (10,0 g/l, gelöst in einem 50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,3) in einem Reaktionsbad zu 0,5 ml des zellfreien Proteinrohextraktes des Stammes C. glutamicum ATCC13032Δalr91/pSELF2000 hinzugefügt, der durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt wurde. Die Inkubation erfolgte bei 33°C über insgesamt 120 Minuten. Während dieser Zeit wurden Proben nach 15, 30, 60 und 120 Minuten genommen, und die Konzentration an gebildetem D-Alanin wurde bestimmt. Die Ermittlung der Konzentration an D-Alanin erfolgte mithilfe von isokratischer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC; Pumpe von Dr. Knauer GmbH, Berlin, Deutschland; ERC-Detektor 7515A, ERC Deutschland). Die chirale Auftrennung der einzelnen Enantiomere wurde durch eine Nucleosil-Chiral-1-Säule (250 × 4 mm) von Machery & Nagel (Düren, Deutschland) ermöglicht. Eine 0,5 mM Kupfersulfat-Lösung wurde als mobile Phase bei einer Flussrate von 1,0 ml pro Minute und einem Vordruck von 80 bar bei einer Säulentemperatur von 60°C verwendet.
Unter den oben beschriebenen Bedingungen wurden nach 15 Minuten 0,15 g/l, nach 30 Minuten 0,29 g/l, nach 60 Minuten 0,49 g/l und nach 120 Minuten 0,93 g/l D-Alanin gemessen.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Restriktionskarte des Plasmids pTET3.
2: Karte der Tetracyclinresistenzregion des Plasmids pTET3.
3: Karte des Plasmidvektors pSELF1-1.
4: Karte der alr-Genregion
5: Karte des Plasmids pSAC-alr81
6: Karte des Plasmidvektors pSELF2000
7: Karte des Plasmidvektors pSELF2000X
8: Karte des Plasmidvektors pSELF2000P1
Die angegebenen Basenpaarzahlen sind ungefähre Werte, die im Kontext der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten wurden.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung:

AvrII:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym AvrII
Ecl136II:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym Ecl136II
EcoRI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym EcoRI
HpaI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym HpaI
MunI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym MunI
PstI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym PstI
SacI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym SacI
SacII:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym SacII
SalI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym SalI
ScaI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym ScaI
SpeI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym SpeI
SphI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym SphI
XbaI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym XbaI
XhoI:: Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym XhoI
alr:: Gen für Alaninracemase
alr':: 5'-Fragment des alr-Gens
'alr:: 3'-Fragment des alr-Gens
bp:: Basenpaare
KanR:: Kanamycin-Resistenzgen
lacZ(a)':: 5'-Teil des lacZα-Genfragments
'lacZ(a):: 3'-Teil des lacZα-Genfragments
oriV:: Replikationsursprung
panD:: Gen für das Pantothenat-Biosyntheseprotein PanD
pACYC184:: DNA-Segment aus dem Plasmid pACYC184
RP4mob:: Mobilisierungsstelle aus dem Plasmid RP4
sacB:: sacB-Gen
repA:: Gen für das Replikationsprotein RepA
tetA:: Gen für das Tetracyclinresistenzprotein
tetR:: Gen für das Tetracyclinrepressorprotein

Die folgenden Sequenzen sind im Sequenzprotokoll enthalten:

SEQ ID Nr.:	Beschreibung:
1	Nukleotidsequenz des tetA-Gens in pTET3
2	Aminosäuresequenz des TetA-Resistenzproteins
3	Nukleotidsequenz des tetR-Gens in pTET3
4	Aminosäuresequenz des TetR-Proteins
5	Nukleotidsequenz des Primers ALR1-1
6	Nukleotidsequenz des Primers ALR4-1
7	Nukleotidsequenz der mittels PCR isolierten
	alr-DNA
8	Nukleotidsequenz der 1,8 kbp langen DNA-
	Sequenz, die das alr-Gen enthält
9	Aminosäuresequenz des Alr-Proteins
10	Nukleotidsequenz des Primers RACA
11	Nukleotidsequenz des Primers RACB
12	Nukleotidsequenz des alr91-Allels
13	Nukleotidsequenz des Primers ALRD1
14	Nukleotidsequenz des Primers ALRD2
15	Nukleotidsequenz des Primers RACF
16	Nukleotidsequenz des Primers RACH
17	Nukleotidsequenz des Primers PAA1
18	Nukleotidsequenz des Primers PAMOD
19	Nukleotidsequenz des Primers ILVA1
20	Nukleotidsequenz des Primers ILVA2

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, umfassend eine für das alr-Gen codierende Polynukleotidsequenz, gewählt aus der Gruppe: a) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, welches eine mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 9 zu mindestens 95% identische Aminosäuresequenz aufweist; b) Polynukleotid, das zu den Polynukleotiden aus a) komplementär ist, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Alaninracemase aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Polynukleotid um eine rekombinante DNA handelt, die zur Replikation in coryneformen Bakterien in der Lage ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Polynukleotid um eine RNA handelt.
Polynukleotid nach Anspruch 2, umfassend die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 8.
Polynukleotid nach Anspruch 1, gewählt aus der Gruppe: a) die in der SEQ ID Nr. 8 dargestellte Polynukleotidsequenz oder b) der Sequenz SEQ ID Nr. 8 im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entsprechende Sequenz oder c) Sense-Mutationen neutraler Funktion in SEQ ID Nr. 8.
Polynukleotidsequenz nach Anspruch 1, die für ein Polypeptid codiert, das die in der SEQ ID Nr. 9 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt.
Isoliertes coryneformes Bakterium, wobei die Expression eines für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens zu 95% mit der in SEQ ID Nr. 9 angegebenen Aminosäuresequenz identisch ist, codierenden Polynukleotids rekombinant verstärkt wird, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Alaninracemase aufweist.
Coryneformes Bakterium nach Anspruch 7, wobei das Polynukleotid aus der folgenden Gruppe gewählt wird: a) Polynukleotid mit der wie in SEQ ID Nr. 8 angegebenen Sequenz; oder b) Polynukleotide mit der Sequenz SEQ ID Nr. 8 im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entsprechenden Sequenzen; oder c) Polynukleotide mit Nukleotidsequenzen mit neutralen Sense-Mutationen in SEQ ID Nr. 8.
Coryneformes Bakterium aus Anspruch 7, wobei das Polypeptid die in SEQ ID Nr. 9 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.
Vektor, der zur Replikation in coryneformen Bakterien fähig ist und ein Polynukleotid nach Anspruch 1 bis 6 enthält.
Vektor nach Anspruch 10, wobei der Vektor keine Resistenz gegen Antibiotika trägt.
Isoliertes coryneformes Bakterium, in dem die Expression eines für ein Polypeptid, das eine mit der in SEQ ID Nr. 9 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 95% identische Aminosäuresequenz aufweist, codierenden Polynukleotids abgeschwächt oder ausgeschaltet ist, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Alaninracemase aufweist und das Polynukleotid im Chromosom lokalisiert und das Bakterium für D-Alanin auxotroph ist.
Coryneformes Bakterium, das die folgenden Merkmale umfaßt: 1) das chromosomale alr-Gen ist abgeschwächt oder ausgeschaltet, und 2) ein in dem Bakterium replizierendes und ein alr-Gen umfassendes Plasmid, wobei es sich bei dem alr-Gen um ein Polynukleotid nach den Ansprüchen 1 bis 6 handelt.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91, hinterlegt als DSM14280 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ).
Coryneformes Bakterium nach Anspruch 13, das in der Fermentation eingesetzt wird und L-Aminosäuren oder Vitamine produziert.
Escherichia coli DH5αMCR[pSAC-ALR81], hinterlegt als DSM14277 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ).
Mikroorganismus der Familie Enterobacteriaceae, in dem die Expression des alr-Gens nach den Ansprüchen 1 bis 6 verstärkt ist.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δalr91[pSELF2000], hinterlegt als DSM14279 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ).
Vektor pSELF2000, enthalten in DSM14279.
Δalr91-Allel (deltaalr91), dargestellt in SEQ ID Nr. 12, enthaltend den 5'- und den 3'-Bereich des alr-Gens, wobei ein 75 bp langer Abschnitt des codierenden Bereichs fehlt.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren oder Vitaminen unter Verwendung des Bakteriums nach Anspruch 13 oder 15.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: a) Fermentation des Bakteriums, b) Anreicherung der chemischen Verbindung(en) oder des bzw. der entsprechenden Salzes bzw. Salze im Medium oder in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen des coryneformen Mikroorganismus, sowie gegebenenfalls c) Isolierung dieser chemischen Verbindung(en) und/oder des bzw. der entsprechenden Salzes bzw. Salze, gegebenenfalls zusammen mit einem Teil der oder der gesamten Biomasse und/oder den gelösten Bestandteilen der Fermentationsbrühe.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Fermentation in Abwesenheit von Antibiotika durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, insbesondere D-Alanin und D-Valin, unter Verwendung von Bakterien nach den Ansprüchen 7 bis 9.
Verfahren nach Anspruch 24, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: a) Kultivierung eines Bakteriums, in dem die Expression des alr-Gens mit der Polynukleotidsequenz nach den Ansprüchen 1 bis 6 verstärkt ist; b) gegebenenfalls Isolierung der Biomasse; c) Präparation eines Zellextraktes oder eines teilweise oder vollständig gereinigten Enzyms Alaninracemase aus der Biomasse; d) Zugabe der entsprechenden L-Aminosäure zur Fermentationsbrühe oder zur isolierten Biomasse oder zum Zellextrakt bzw. einem teilweise oder vollständig gereinigten Enzym, gegebenenfalls in einem geeigneten Puffer; und e) Isolierung der produzierten D-Aminosäure, gegebenenfalls zusammen mit einem Teil der oder der gesamten Biomasse und/oder den gelösten Bestandteilen der Fermentationsbrühe.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei wenigstens eine Fermentationsstufe in Abwesenheit von Antibiotika durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, insbesondere D-Alanin oder D-Valin, unter Verwendung des alr-Gens nach Anspruch 1.
Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die für Alaninracemase codieren, wobei man in dem Verfahren das die Polynukleotidsequenzen nach den Ansprüchen 1 bis 6 umfassende Polynukleotid als Hybridisierungssonden einsetzt.
Verfahren wie in Anspruch 28 beansprucht, wobei Arrays, Mikroarrays oder DNA-Chips eingesetzt werden.
Bakterium mit einem Vektor nach Anspruch 11.