JP2005519597A - 食物醗酵手順を改善する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、乳酸菌を含む食品醗酵手順の分野に関し、特に、酸性度、醗酵後酸性化、芳香、風味、口当たりの柔らかさ、粘稠度、および触感のような乳製品の品質を改善することに関する。具体的には、本発明は、通常の醗酵温度より高い温度で醗酵を行うことを可能にする、低分子熱ショックタンパク質をコードするプラスミドを有する好熱性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび中温性Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを使用して乳製品を製造する方法を提供する。この低分子熱ショックタンパク質を発現する好熱性および中温性乳酸菌種はまた、より低いｐＨおよびより高い塩濃度に対する増大した耐性、ならびに高い醗酵温度でのバクテリオファージの攻撃に対する低下した感受性を示す。
Description
（発明の分野）
本発明は、乳酸細菌に関する食物醗酵手順の分野に関し、そして特に、乳製品の品質（酸性度、醗酵後の酸性度、芳香、風味、まろやかさ、粘り気および口当たりの柔らかさなど）を改善することに関する。具体的には、本発明は、低分子熱ショックタンパク質（これは、醗酵が通常の醗酵温度より高い温度で行われることを可能にする）を発現する好熱性のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび中温性のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを使用して、乳製品を製造するための方法を提供する。上記熱ショックタンパク質を発現する好熱性乳酸菌種および中熱性乳酸菌種はまた、より低いｐＨおよびより高い塩濃度に対する増加した耐性、ならびに上昇した醗酵温度におけるバクテリオファージの攻撃に対する低下した感受性を示す。
本発明は、乳酸細菌に関する食物醗酵手順の分野に関し、そして特に、乳製品の品質（酸性度、醗酵後の酸性度、芳香、風味、まろやかさ、粘り気および口当たりの柔らかさなど）を改善することに関する。具体的には、本発明は、低分子熱ショックタンパク質（これは、醗酵が通常の醗酵温度より高い温度で行われることを可能にする）を発現する好熱性のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび中温性のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを使用して、乳製品を製造するための方法を提供する。上記熱ショックタンパク質を発現する好熱性乳酸菌種および中熱性乳酸菌種はまた、より低いｐＨおよびより高い塩濃度に対する増加した耐性、ならびに上昇した醗酵温度におけるバクテリオファージの攻撃に対する低下した感受性を示す。
（導入）
食物産業において、同種醗酵性の好熱性乳酸菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが、ほとんどの場合に好熱性乳酸菌と組み合わせて、乳製品の醗酵における発端として使用される。商業的に、このような醗酵の最も重要なことは、ヨーグルト製造である。ヨーグルトは、２つの乳酸菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのプロト共生（ｐｒｏｔｏｓｙｍｂｉｏｔｉｃ）増殖の結果として生じる。プロト共生は、生物間での代謝相互関連を特徴付け、これは、この点に関して、両方の乳酸菌が、最適な増殖のために必要とされる栄養分を提供することによって、互いの増殖を促進することを意味する。その結果、酸性化は急激であり、そして３．５程度に低い値の最終ｐＨを生じる。
食物産業において、同種醗酵性の好熱性乳酸菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが、ほとんどの場合に好熱性乳酸菌と組み合わせて、乳製品の醗酵における発端として使用される。商業的に、このような醗酵の最も重要なことは、ヨーグルト製造である。ヨーグルトは、２つの乳酸菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのプロト共生（ｐｒｏｔｏｓｙｍｂｉｏｔｉｃ）増殖の結果として生じる。プロト共生は、生物間での代謝相互関連を特徴付け、これは、この点に関して、両方の乳酸菌が、最適な増殖のために必要とされる栄養分を提供することによって、互いの増殖を促進することを意味する。その結果、酸性化は急激であり、そして３．５程度に低い値の最終ｐＨを生じる。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓは、主として風味の発生を担う、ヨーグルト発端成分であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ株の異なる組み合わせを使用する醗酵実験から得られる結果は、風味の発生に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのかなりの影響を示す（Ｃ．Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｗ．Ｂｏｃｋｅｌｍａｎｎ，およびＫ．Ｊ．Ｈｅｌｌｅｒ，未刊行）。
よりまろやかな芳香を有するヨーグルトを好む消費者の数が、近年の間に増加している。このようなよりまろやかな味は、ｐＨ値が４．０と４．７との間ですでに醗酵が停止する場合に、達成され得る。さらに、醗酵後の酸性化は、ヨーグルトにおける苦味および／または酸味の主要な原因である。ヨーグルトのこの所望でない特性を克服するために、苦味および／または酸味の発生は、醗酵後の酸性化を全くまたはほとんど示さない、発端の組み合わせを使用することによって、阻害され得る。
ヨーグルトに加えて、好熱性スターター培養物はまた、異なる型の硬質チーズ、ならびにセミ硬質チーズ（モツァレラなど）、および酸カードチーズの製造のために使用される。後者のチーズに対して特に、醗酵後に得られる最終ｐＨは、製品の品質に対してかなりの影響を有する。
中熱性の乳酸菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓは、多くのチーズの種類およびバターミルクのための発端成分として使用される。チーズの製造に関して、通常、酸性化は、カードを切断すると同時に醗酵性ラクトースを除去することによって、ｐＨ５．０より十分に高いｐＨで終了するが、バターミルクの醗酵は、４．６のｐＨで終了し、これは、この生物によって達成される最低ｐＨに非常に近い。
温暖な国（例えば、エジプト）においては、生乳の保存期間は、不十分な冷却システムに起因して、非常に短い。急激な品質低下の問題を克服するために、ＮａＣｌが、比較的多量に乳汁に添加される。これは他方で、引き続く乳製品醗酵を妨害する。従って、このような国において、塩耐性のスターター培養物に対する強い要求が存在する。
乳製品の醗酵は、異なる温度要件を有する発端生物によって実施される。異なる温度要件を有する発端生物を含む、１つの温度での醗酵は、これらの生物の１つの最適でない増殖を導く。例として、ヨーグルト製造の場合、最終製品中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの細胞計数は、一般に、最適ではない温度での醗酵に起因して、非常に低い。
従って、通常の醗酵温度および塩濃度より高い温度および塩濃度で乳汁を醗酵させ得る乳酸菌、およびより低いｐＨ値でより長く生存可能なままである種を開発することに対する緊急の必要性が存在する。他方で、より高温での醗酵は、夾雑物の増加を抑制する。この理由により、塩濃度は、ヒトの健康のために、減少され得る。
本発明の局面は、添付の特許請求の範囲ならびに以下の説明および図面に提示される。これらの局面は、別個の節の見出しの下に提示される。しかし、各節の下の教示は、その特定の節の見出しに必ずしも限定されないことが、理解されるべきである。
（発明の要旨）
興味深いことに、本特許出願の発明者らは、低分子熱ショックタンパク質を発現する特定の種の乳酸菌が、通常の乳汁醗酵温度および／または塩濃度より高い温度および／または塩濃度において、乳汁を醗酵させ得ることを示す。本特許出願の発明者らは、熱ショックタンパク質を発現する乳酸菌が、より低いｐＨ条件下でより長く生存可能なままであり、そして高い醗酵温度に起因して、バクテリオファージ攻撃に対してより感受性でなくなることを、さらに示す。
興味深いことに、本特許出願の発明者らは、低分子熱ショックタンパク質を発現する特定の種の乳酸菌が、通常の乳汁醗酵温度および／または塩濃度より高い温度および／または塩濃度において、乳汁を醗酵させ得ることを示す。本特許出願の発明者らは、熱ショックタンパク質を発現する乳酸菌が、より低いｐＨ条件下でより長く生存可能なままであり、そして高い醗酵温度に起因して、バクテリオファージ攻撃に対してより感受性でなくなることを、さらに示す。
重要なことに、本発明者らは、本発明の乳酸菌が、乳汁と共にインキュベートされる場合に、熱ショックタンパク質を発現しない、対応する乳酸菌によって生成される醗酵製品と比較して、よりまろやかな味の特性を有する醗酵製品を生成し得ることを見出した。
従って、本発明は、第一の局面において、穏やかな醗酵に基づく乳製品を調製する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：乳汁を、低分子熱ショックタンパク質を発現し得る乳酸菌と混合する工程、ならびにこの乳汁／細菌混合物を、通常の醗酵温度より高い温度、および／または通常の醗酵塩濃度より高い塩濃度で培養する工程であって、ここで、醗酵製品が、低分子熱ショックタンパク質を発現しない対応する乳酸菌によって生成される醗酵製品と比較して、よりまろやかな味特徴を有する、工程。
別の局面において、乳製品の醗酵プロセスにおいて使用される、好熱性および／または中熱性の乳酸菌を提供し、この乳酸菌は、低分子熱ショックタンパク質をコードする遺伝子を保有し、そしてこの乳酸菌は、本発明の低分子熱ショックタンパク質を発現しない、対応する好熱性および／または中熱性の乳酸菌によって生成される醗酵製品と比較して、よりまろやかな味特徴を有する醗酵製品を生成する。
好ましくは、この製品のｐＨは、４．０より高い。
別の局面において、本発明は、乳汁を、第一の乳酸菌および第二の乳酸菌と混合する工程、ならびにこの乳汁／細菌混合物を、特定されるように培養する工程を包含する方法を提供し、ここで、第一の乳酸菌および／または第二の乳酸菌のうちの少なくとも１つの各々は、低分子熱ショックタンパク質を発現し得る。
別の局面において、本発明はまた、第一の乳酸菌および第二の乳酸菌の各々が、中熱性細菌を含む方法を提供する。
別の局面において、本発明はまた、第一の乳酸菌および第二の乳酸菌の各々が、好熱性細菌を含む方法を提供する。
別の局面において、本発明はまた、乳汁が、第一の好熱性乳酸菌を含有するスターター培養物と混合され、その後、第二の好熱性乳酸菌が添加される方法を提供する。
別の局面において、本発明はまた、第一の乳酸菌が、中熱性乳酸菌を含み、そして第二の乳酸菌が、好熱性乳酸菌を含む方法を提供する。
別の局面において、本発明はまた、乳汁が、中熱性乳酸菌を含有するスターター培養物と混合され、その後、好熱性乳酸菌が添加される方法を提供する。
別の局面において、本発明はまた、各中熱性細菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓ、およびＬａｃｔａｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓを含むがこれらに限定されない群から独立して選択される方法を提供する。
別の局面において、本発明はまた、各好熱性細菌が、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（低分子熱ショックタンパク質をコードする遺伝子を保有するプラスミドを含む）を含むがこれらに限定されない群から独立して選択される方法を提供する。
なお別の局面において、増加した酸耐性を有する、中熱性乳酸菌および好熱性乳酸菌が提供される。
さらなる局面において、上昇した醗酵温度の結果として、バクテリオファージの攻撃に対して減少した感受性を有する、中熱性乳酸菌種および好熱性乳酸菌種が提供される。
なおさらなる局面において、本発明は、本発明の方法によって得られる乳汁、およびこのような乳汁を醗酵させることによって得られる、本発明の低分子熱ショックタンパク質を発現しない対応する乳酸菌によって生成される醗酵製品と比較して、よりまろやかな味特徴を有する醗酵製品（例えば、ヨーグルト、および酸カードチーズ、および硬質チーズ、および半硬質チーズ（モツァレラなど）、およびフレッシュチーズ、およびクワルク（ｑｕａｒｋ）、ならびにバターミルク、およびカッテージチーズ）に関する。
なお別の局面において、本発明は、本発明の方法によって得られる乳汁およびこのような乳汁を醗酵させることによって得られる醗酵製品に関し、ここで、この醗酵製品は、酸カードチーズ、硬質チーズ、半硬質チーズ（モツァレラなど）、フレッシュチーズ、クワルク、バターミルク、スイスタイプチーズ、またはカッテージチーズからなる群より選択され得る。
なおさらなる局面において、本発明は、本発明の方法によって得られる乳汁、およびこのような乳汁を醗酵させることによって得られる、本発明の低分子熱ショックタンパク質を発現しない対応する乳酸菌によって生成されるヨーグルトと比較してまろやかな味特性のヨーグルトに関する。
別の局面において、本発明は、乳汁を醗酵させる方法を提供し、ここで、乳酸菌が、組換え乳酸菌を含み、この乳酸菌は、対応する未改変細菌より高いレベルで、低分子熱ショックタンパク質を発現するように操作されている。
別の局面において、本発明は、乳汁を醗酵させる方法を提供し、ここで、乳酸菌が、組換え乳酸菌を含み、この乳酸菌は、対応する未改変細菌と比較して、低分子熱ショックタンパク質を過剰発現するように操作されている。
別の局面において、好熱性乳酸菌および／または中熱性乳酸菌が提供され、これらの乳酸菌は、乳醗酵製品において使用され、これらの乳酸菌は、低分子熱ショックタンパク質についての遺伝子を保有する。
別の局面において、本発明は、通常の醗酵および／または塩濃度より高い温度および／または塩濃度で、乳汁の醗酵を実施し得る、組換え微生物を提供する。
低分子熱ショックタンパク質（ｓＨｓｐ）は、不可逆的な凝集を防止し、そして変性タンパク質のリフォールディングを補助する、分子シャペロンのファミリーの１つを形成することが公知である。これらのタンパク質は、全ての生物において存在し、そして１２〜３０ｋＤａの範囲の低い分子量、オリゴマー構造、および保存されたドメインの存在によって特徴付けられる。このドメインは、脊椎動物のα−クリスタリン（ｃｒｉｓｔａｌｌｉｎ）に非常に類似している。本発明の方法において使用され得る低分子熱ショックタンパク質は、１６〜１８ｋＤａの範囲の分子量を有することが好ましい。
代表的に、用語「低分子熱ショックタンパク質または（ｓＨｓｐ）」とは、変性タンパク質を結合および安定化し得、そしてこれらの不可逆的凝集を防止し得る、ＡＴＰ非依存性のｓＨｓｐをいう。この様式で安定化されるタンパク質は、ＡＴＰ依存性シャペロン系によって、引き続いてリフォールディングされ得る。
完全な細菌ゲノム配列の分析は、大部分の細菌が、少数の低分子熱ショックタンパク質のみを有することを明らかにした。乳酸菌において、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｓｕｓのほんの数個の株が、ｓＨｐｓに対する遺伝子を保有し、これらの遺伝子は、細菌ゲノムとは別個の低分子量プラスミド上に位置する。
本発明は、低分子熱ショックタンパク質に関して記載されるが、他の型の熱ショックタンパク質もまた、本発明の方法において適合され、そして使用され得ることが、当業者によって理解されるべきである。
（発明の詳細な説明）
（改善された乳酸醗酵）
本発明の主要な目的は、醗酵に基づく乳製品の特性を改善する方法を提供することである。これは、ヨーグルトに関して、よりまろやかな芳香、酸性度、醗酵後酸性化、味および口当たりの柔らかさに関する非常に望ましい特性を有し、そしてさらに、減少した乳清産生、芳香のまろやかさおよびより高い密度の生存培養物に反映されるような、延長された貯蔵寿命を有するヨーグルトを調製するための方法を提供することによって、達成される。すなわち、醗酵乳製品が新鮮でなくなることが、本発明の微生物を使用せずに製造された乳製品と比較して、遅延される。
（改善された乳酸醗酵）
本発明の主要な目的は、醗酵に基づく乳製品の特性を改善する方法を提供することである。これは、ヨーグルトに関して、よりまろやかな芳香、酸性度、醗酵後酸性化、味および口当たりの柔らかさに関する非常に望ましい特性を有し、そしてさらに、減少した乳清産生、芳香のまろやかさおよびより高い密度の生存培養物に反映されるような、延長された貯蔵寿命を有するヨーグルトを調製するための方法を提供することによって、達成される。すなわち、醗酵乳製品が新鮮でなくなることが、本発明の微生物を使用せずに製造された乳製品と比較して、遅延される。
本明細書中において使用される場合、用語「よりまろやかな味特性」とは、有意に減少した苦味および／または酸味によって特徴付けられる、醗酵乳製品をいう。さらに、または代替的に、用語「よりまろやかな味特性」はまた、製品のｐＨに関して意図され得る。従って、まろやかな味特性を有する本発明の製品は、４．０より高いｐＨ、好ましくは、４．０〜５．０の範囲、なおより好ましくは、４．０〜４．７のｐＨを有する。従って、よりまろやかな味特性の醗酵乳製品とは、本発明の乳酸菌を、乳汁と共に、本発明の方法に従ってインキュベートすることによって得られる醗酵乳製品をいう。
本明細書中において使用される場合、用語「本発明の低分子熱ショックタンパク質を発現しない、対応する乳酸菌」とは、本発明の低分子熱ショックタンパク質を保有するプラスミドを除かれた（すなわち、失った）乳酸菌をいう（実施例を参照のこと）。細菌をプラスミドから除くことは、当該分野において公知の方法によって達成され得る。あるいは、本発明の熱ショックタンパク質を発現しない乳酸菌は、依然としてこのプラスミドを含み得るが、ｓｈｓｐをコードする遺伝子は、遺伝子組換えおよび／または変異誘発技術を使用して特異的に改変され、この遺伝子の発現を防止され得る。
ヨーグルトの製造のために本発明の方法を使用することが現在好ましいが、本発明の微生物の添加によって品質が改善され得る任意の他の型の醗酵に基づく乳製品（例えば、硬質チーズ、半硬質チーズ（モツァレラなど）、酸カードチーズ、クワルク、バターミルク、フレッシュチーズおよびカッテージチーズ）のための、この方法の使用もまた企図される。
本発明に関する乳汁は、反芻動物（好ましくは、スイギュウ、ウシ、ヒツジ、ラマ、ヤギまたはラクダからなる群より選択される）から得られ得る。乳汁はまた、脱脂または半脱脂され得る。乳汁はまた、植物（例えば、ダイズまたはイネ）に由来し得るかあるいは合成的に生成された乳汁であり得る。
合成的に生成された乳汁は、当該分野において、乳汁に類似の人工産物を記載するために使用される用語である。合成乳汁の組成は、例えば、消費者が不耐性またはアレルギー性であり得る特定の成分を除くように、特に設計され得る。合成乳汁はまた、強化ミルクであり得る。例として、強化ミルクは、栄養価を有しても有さなくてもよいさらなる化合物（例えば、鉱物、ビタミン、多糖類、オリゴ糖類、増粘剤または水吸収物質）を含有し得る。
一般に、生物の増殖のための温度範囲は、かなりの分類学的値の特徴である。これらの好ましい増殖温度に依存して、細菌は、一般に、そして乳酸菌を含めて、中熱性細菌および好熱性細菌に、広く分割される。中熱性細菌は、２０℃〜４４℃の最適温度を有することが公知である。一方で、好熱性細菌の最適温度は、３５℃〜５５℃の範囲である。
本発明は、乳汁を、中熱性乳酸菌および／または好熱性乳酸菌と組み合わせて醗酵させることによって、異なる乳製品を製造する方法に関する。
本発明によれば、中熱性乳酸菌は、２０℃〜３０℃の範囲の、通常の増殖温度を有する細菌と定義される。しかし、３０℃〜４４℃の通常の増殖温度を示す中熱性乳酸菌もまた、本発明の方法において使用され得る。
本発明によれば、好熱性乳酸菌は、３５℃〜４７℃の間の範囲の通常の増殖温度を有する細菌であると定義される。しかし、５０℃〜５５℃の通常の増殖温度を示す好熱性乳酸菌もまた、本発明の方法において使用され得る。
以下の要約は、多数の異なる中熱性乳酸菌および好熱性乳酸菌を列挙し、これは、説明の目的であり、そして以下の要約に含まれる特定の乳酸菌に、いかなる様式でも限定されない。
スターター培養物の最適増殖温度
ヨーグルトの醗酵温度は、４２℃（または４０℃〜４３℃の間）であり、これは、２種のスターター生物Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの最適（３９℃）とＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの最適（４５℃）との間の妥協である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが、ｓｈｓｐを保有する場合、最適醗酵温度は変更され、そしてその生物の最適温度は上昇する。これは、ヨーグルトを４５℃で醗酵させ得、次いで、ｓｈｓｐを保有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ＢｕｌｇａｒｉｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの両方が、最適温度で増殖することを意味する。
従って、本発明は、本発明に従う小さい熱ショックタンパク質を発現することの結果として、本発明に従う小さい熱ショックタンパク質を発現しない対応する中温性乳酸細菌よりも高い温度で乳汁を醗酵し得る、中温性乳酸細菌を提供する。
本発明はまた、好熱性乳酸細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを提供し、これは、本発明に従う小さい熱ショックタンパク質を発現する場合、４２℃〜５５℃の範囲で乳汁を醗酵し得、この温度は、本発明に従う小さい熱ショックタンパク質を発現しない対応するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓについての最適温度よりも高い。
重要なことに、有効量の小さい熱ショックタンパク質を発現するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌は、有効量のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓと共にインキュベートされる場合、通常温度よりも高い温度で乳汁を醗酵し得、これが、よりまろやかな風味の特徴的な製品の産生を導く。
本明細書中で使用する場合、用語「有効量」は、乳汁中に存在する検出可能な量の糖化合物を醗酵するのに十分な量の、好熱性細菌種および／または中温性細菌種（例えば、それぞれ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を説明する。より具体的には、本発明の微生物の存在は、乳汁中の糖化合物の検出可能な醗酵を生じ得るだけではなく、さらに、乳製品の改善された特性（例えば、有意に改善された酸性度、口当たりの柔らかさ、風味、口当たりの柔らかさおよび芳香のマイルドさ）を生じるレベルで、醗酵最終製品の形成を生じる。これらの特性は、本発明の微生物の添加に起因し得る。
１つの局面において、本発明は、ヨーグルト、酸性カードチーズ、硬質チーズ、半硬質チーズ（例えば、モッツァレラ）またはフレッシュチーズを含むがこれらに限定されない、まろやかな芳香の醗酵乳汁製品の産生のために、上昇した温度で乳汁を醗酵するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを提供する。
別の局面において、本発明は、クワルク、バターミルク、フレッシュチーズまたはカッテージチーズを含むがこれらに限定されない、まろやかな芳香の醗酵乳汁製品の産生のために、上昇した温度で乳汁を醗酵するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを提供する。
本明細書中で使用する場合、用語「上昇した温度」または「より高い温度」は、相互交換可能に使用され、そして中温性乳酸細菌および好熱性乳酸細菌が、通常の醗酵温度よりも高い温度で乳汁を醗酵する能力をいう。
中温性乳酸細菌について、用語「上昇した温度」とは、通常の醗酵温度範囲と比較して、３９℃〜４８℃の間、好ましくは４１℃〜４７℃の間、より好ましくは４３℃〜４６℃の間、なおより好ましくは４３℃〜４６℃の間、そして最も好ましくは４３℃での、乳汁の醗酵をいう（上記要旨を参照のこと）。
好熱性乳酸細菌の場合、用語「上昇した温度」とは、通常の醗酵温度範囲と比較して、４８℃〜５８℃の間、好ましくは５３℃〜５７℃の間、より好ましくは５４℃〜５７℃の間、なおより好ましくは５４℃〜５６℃の間、そして最も好ましくは５５℃での、乳汁の醗酵をいう（上記要旨を参照のこと）。
さらに、３９℃よりも高い温度で増殖する中温性スターター細菌の利用可能性は、新たな醗酵製品の産生のための、中熱性スターター細菌および／または好熱性スターター細菌の新たな組み合わせを可能にする。
なお別の局面において、本発明は、バクテリオファージ攻撃感受性が減少した乳酸細菌を提供する。これは、本発明に従う乳酸細菌が、上昇した温度で乳汁を醗酵する能力の結果としてである。
別の局面において、本発明は、より高い塩濃度（例えば、１％より高い、好ましくは２％より高い、そしてより好ましくは２．５％より高い）に対する耐性が増大した乳酸細菌を提供する。乳汁の通常の塩濃度は、０．７〜０．８％の範囲であることに留意のこと。
本発明の微生物のこの特徴は、品質を低下させる微生物および病原性微生物の増殖を阻害するために乳汁に塩が添加される、南方の国について特に重要である。本発明の小さい熱ショックタンパク質を発現しない対応する乳酸細菌によって産生された乳製品と比較して、このような乳汁を醗酵させることによって得られたよりまろやかな風味を特徴とする乳製品を産生する場合、このような乳汁は、本発明の乳酸細菌によってより容易に醗酵され得る。
別の局面において、本発明は、４℃で保存した場合に製品の保存期間が増大する、本発明の小さい熱ショックタンパク質を発現する乳酸細菌を含む醗酵製品を提供する。
別の局面において、本発明は、最終製品中の生存可能なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の細胞計数がより高い、４２℃より高い温度で好熱性スターター培養物を用いたヨーグルトの製品を提供する。
別の局面において、本発明は、乳汁を醗酵する方法を提供し、ここで、乳酸細菌は、組換え乳酸細菌を含み、この組換え乳酸細菌は、対応する未改変の細菌よりもより高いレベルで小さい熱ショックタンパク質を発現するように操作されており、通常の醗酵および／または塩濃度よりも高い温度および／または塩濃度で乳汁醗酵を実行し得る。
別の局面において、本発明は、乳汁を醗酵する方法を提供し、ここで、乳酸細菌は、組換え乳酸細菌を含み、この組換え乳酸細菌は、対応する未改変の細菌と比較して小さい熱ショックタンパク質を過剰発現するように操作されており、通常の醗酵および／または塩濃度よりも高い温度および／または塩濃度で乳汁醗酵を実行し得る。
１つの局面において、本発明は、ｐＳｔ０４およびｐＥＲ１−１由来のポリペプチドを提供する。
１つの局面において、本発明は、本発明の方法において使用するための、配列番号１および配列番号２として示されるアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供する。
本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸配列」とは、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列、あるいはその改変体、ホモログ、フラグメントまたは誘導体をいう。
用語「誘導体」は、本明細書中で使用する場合、本発明の方法において使用され得るポリペプチドの化学的改変を含む。このような改変の例は、アルキル基、アシル基またはアミノ基による水素の置換である。
好ましくは、本発明の方法において使用され得るポリペプチドは、天然のポリペプチドがその天然の環境にある場合、そして天然のポリペプチドが、これもまたその天然の環境にあるその天然のヌクレオチドコード配列によって発現される場合、そしてそのヌクレオチド配列が、これもまたその天然の環境にあるその天然のプロモーターの制御下にある場合、天然のポリペプチドをカバーしない。
より好ましくは、本発明の方法において使用され得るポリペプチドは、天然のポリペプチドがその天然の環境にある場合、そして天然のポリペプチドが、これもまたその天然の環境にあるその天然のヌクレオチドコード配列によって発現される場合、そしてそのヌクレオチド配列が、これもまたその天然の環境にあるその天然のプロモーターの制御下にある場合、天然のポリペプチドをカバーする。
本発明の１つの局面において、これらのポリペプチドは、本発明のポリペプチドを発現しない対応する乳酸細菌によって産生されるヨーグルトと比較して、よりまろやかな風味特徴のヨーグルトの産生における、乳酸細菌による改善された乳汁醗酵方法を提供する。
本発明はまた、本発明の方法において使用され得るポリペプチドをコードする、配列番号３および配列番号４として本質的に示されるヌクレオチド配列もまたカバーする。
本発明の文脈において、本発明の方法において使用され得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在する形態と同じであり得るか、またはその改変体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体である。好ましくは、本発明の方法において使用され得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、乳酸細菌内に含まれる。
用語「ヌクレオチド配列」とは、本明細書中で使用する場合、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、ならびにその改変体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体（例えば、その部分）をいう。
このヌクレオチド配列は、センス鎖でもアンチセンス鎖でも、二本鎖または一本鎖であり得る、ゲノム起源または合成起源または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。このヌクレオチド配列は、完全に天然に存在するＤＮＡ配列である必要はない。従って、このＤＮＡ配列は、例えば、合成ＤＮＡ配列、組換えＤＮＡ配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製された）、ｃＤＮＡ配列または部分的ゲノムＤＮＡ配列（これらの組み合わせを含む）であり得る。このＤＮＡ配列は、コード領域である必要はない。このＤＮＡ配列は、コード領域である場合、コード領域全体である必要はない。さらに、このＤＮＡ配列は、センス方向またはアンチセンス方向であり得る。好ましくは、このＤＮＡ配列は、センス方向である。しかし、アンチセンスＤＮＡ配列が転写され、そしてタンパク質合成のテンプレートとして使用されるいくつかの場合には、アンチセンス配列が好ましい。好ましくは、このＤＮＡはｃＤＮＡを含むか、またはｃＤＮＡである。
従って、好ましくは、用語「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡを意味する。より好ましくは、用語「ヌクレオチド配列」は、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製されたＤＮＡ（すなわち、組換えＤＮＡ）を意味する。従って、好ましくは、本発明は、本発明の方法において使用され得るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（好ましくは、ｃＤＮＡ配列）に関する。
１つの好ましい局面において、本発明は、本発明のコード配列の方法において使用され得るポリペプチドから本質的になるヌクレオチド配列を提供する。
別の局面において、本発明は、配列番号３および配列番号４で示される本発明の方法において使用され得るポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を提供する。
さらなる局面において、本発明は、配列番号３または配列番号４で示される本発明の方法において使用され得るポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、またはその改変体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体を提供する。
本発明の方法において使用され得るポリペプチド／小さい熱ショックタンパク質をコードする変更されたポリヌクレオチド配列は、本発明に従って使用され得、そして本発明のポリペプチドと同じかまたは機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生じる異なるヌクレオチド残基を含み得、このポリペプチドは、その中に欠失、挿入または置換を有し得る。
本明細書中で使用する場合、「欠失」は、それぞれ、１つ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が存在しない、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかにおける変化として定義される。
本明細書中で使用する場合、「挿入」または「付加」は、それぞれ、本発明の天然に存在するポリペプチドまたはコードヌクレオチド配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基の付加を生じている、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかにおける変化である。
本明細書中で使用する場合、「置換」は、それぞれ、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置き換えから生じる。
本発明によれば、記載されるような方法において使用され得るポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、融合タンパク質またはその機能的等価物をコードするヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞におけるその発現を指向する組換えＤＮＡ分子を生成するために使用され得る。本発明の１つの実施形態において、本発明の方法において使用され得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞において、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るプロモーター配列に、作動可能に連結される。宿主細胞に導入される場合、形質転換した宿主／組換え微生物は、十分なレベルの本発明のポリペプチドが達成されるまで、適切な条件下で培養され得、その後、これらの細胞は、本発明の方法の下で、乳汁の醗酵のために使用され得る。
（ペプチド配列）
本発明の方法において使用され得るポリペプチド配列に関して、用語「改変体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」は、得られたヌクレオチド配列の発現産物が、通常の温度および／または塩濃度よりも高い温度および／または塩濃度で乳酸細菌が乳汁を醗酵することを可能にし、好ましくは、通常の温度および／または塩濃度よりも高い温度および／または塩濃度で乳酸細菌が乳汁を醗酵することを可能にする、配列番号１および配列番号２によってカバーされる配列の発現産物と少なくとも同じ能力を有する場合、配列からの、またはそのような配列への、１つ（またはそれ以上の）核酸の、任意の置換、バリエーション、改変、置き換え、欠失または付加を含む。
本発明の方法において使用され得るポリペプチド配列に関して、用語「改変体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」は、得られたヌクレオチド配列の発現産物が、通常の温度および／または塩濃度よりも高い温度および／または塩濃度で乳酸細菌が乳汁を醗酵することを可能にし、好ましくは、通常の温度および／または塩濃度よりも高い温度および／または塩濃度で乳酸細菌が乳汁を醗酵することを可能にする、配列番号１および配列番号２によってカバーされる配列の発現産物と少なくとも同じ能力を有する場合、配列からの、またはそのような配列への、１つ（またはそれ以上の）核酸の、任意の置換、バリエーション、改変、置き換え、欠失または付加を含む。
このタンパク質はまた、サイレントな変化を生じ、そして機能的に等価なポリペプチドを生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。意図的なアミノ酸置換は、本発明のポリペプチドの生物学的活性が維持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似に基づいて、なされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の疎水性値を有する非荷電の極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。
保存的置換は、例えば、以下の表に従ってなされ得る。二番目の欄の同じブロックにあり、そして好ましくは三番目の欄の同じ行にあるアミノ酸は、互いに置換され得る：
置き換えはまた、以下の非天然のアミノ酸によってなされ得る；α＊アミノ酸およびα二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハライド誘導体（例えば、トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊）、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＊、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体（例えば、４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊）、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＊、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊。記号＊は、（相同な置換または非相同な置換に関して）上記考察の目的のために利用されて、誘導体の疎水性性質を示し、一方、＃は、誘導体の親水性性質を示すために利用され、＃＊は、脂肪族特徴を示す。
改変体アミノ酸配列は、配列の任意の２つのアミノ酸の間に挿入され得る適切なスペーサー基（グリシン残基またはβ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基またはプロピル基）を含む）を含み得る。
改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋（ｃｒｏｓｓ−ｉｎｋ）の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化が挙げられる。
本発明の方法において使用され得るポリペプチドはまた、タンパク質の精製を容易にするために付加された１つ以上のさらなるポリペプチドドメインを有する組換えタンパク質として発現され得る。このような精製を促進するドメインとしては、固定化金属での精製を可能にする金属キレートペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）（Ｐｏｒａｔｈ Ｊ（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ３−２６３２８ １）、固定化免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）において利用されるドメインが挙げられるが、これらに限定されない。精製ドメインと本発明の方法において使用され得るポリペプチドとの間の切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））の内包は、精製を促進するために有用である。
（ヌクレオチド配列）
本発明の方法において使用され得るヌクレオチド配列に関して、用語「改変体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」は、得られたヌクレオチド配列の発現産物が、通常よりも高い温度および／または塩濃度で乳酸細菌が乳汁を醗酵することを可能にし、好ましくは、より高い温度および／または塩濃度で乳酸細菌が乳汁を醗酵することを可能にする、配列番号３および／または配列番号４によってカバーされる配列の発現産物と少なくとも同じ能力を有する場合、配列からの、またはそのような配列への、１つ（またはそれ以上の）核酸の、任意の置換、バリエーション、改変、置き換え、欠失または付加を含む。
本発明の方法において使用され得るヌクレオチド配列に関して、用語「改変体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」は、得られたヌクレオチド配列の発現産物が、通常よりも高い温度および／または塩濃度で乳酸細菌が乳汁を醗酵することを可能にし、好ましくは、より高い温度および／または塩濃度で乳酸細菌が乳汁を醗酵することを可能にする、配列番号３および／または配列番号４によってカバーされる配列の発現産物と少なくとも同じ能力を有する場合、配列からの、またはそのような配列への、１つ（またはそれ以上の）核酸の、任意の置換、バリエーション、改変、置き換え、欠失または付加を含む。
特に、用語「ホモログ」は、得られるヌクレオチド配列の発現産物を提供し、通常よりも高い温度および塩濃度で、乳酸菌が乳汁を発酵するのを可能にする能力を有する、構造および／または機能に関して、同一性を網羅する。配列同一性（すなわち、類似性）に関して、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性が存在する。より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性が存在する。この用語はまた、配列の対立遺伝子バリエーションを包含する。
配列番号３および／または配列番号４に関する配列同一性は、任意の１つ以上の配列と別の配列との簡単な「眼球」比較（すなわち、厳密な比較）によって、他の配列が、例えば、この配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか否かを観察することによって決定され得る。
相対配列同一性はまた、例えば、デフォルトパラメーターを使用して、同一性を決定するための任意の適切なアルゴリズムを使用して、２つ以上の配列間の％同一性を計算し得る市販のコンピュータープログラムによって、決定され得る。このようなコンピュータープログラムの代表的な例は、ＣＬＵＳＴＡＬである。有利には、パラメーターをデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが用いられる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ（本明細書中に参考として援用される）で詳細に記載される。検索パラメーターは、以下のようにして規定され、有利には、規定されたデフォルトパラメーターに設定され得る。
有利には、ＢＬＡＳＴにより評価する場合、「実質的に同一」は、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０以上のＥＸＰＥＣＴ値と一致する配列と同等である。ＢＬＡＳＴ検索におけるＥＸＰＥＣＴのデフォルト閾値は、通常、１０である。
ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘにより用いられる発見的検索アルゴリズムであり；これらのプログラムは、わずかに改良したＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌを参照のこと）の統計的方法を使用たその検索結果に対する有意性に基づく。ＢＬＡＳＴプログラムは、配列類似性検索に適合され、例えば、問い合わせ配列に対するホモログを同定する。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１１９−１２９を参照のこと。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能な５つのＢＬＡＳＴプログラムは、以下のタスクを実行する：
ｂｌａｓｔｐ−アミノ酸問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較する。
ｂｌａｓｔｐ−アミノ酸問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較する。
ｂｌａｓｔｎ−ヌクレオチド問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する。
ｂｌａｓｔｘ−ヌクレオチド問い合わせ配列の６通りのフレーム概念翻訳産物（鎖の両側）を、タンパク質配列データベースと比較する。
ｔｂｌａｓｔｎ−タンパク質問い合わせ配列を、６通り全てのリーディングフレーム（鎖の両側）において動的に翻訳されるヌクレオチド配列データベースと比較する。
ｔｂｌａｓｔｘ−ヌクレオチド問い合わせ配列の６通りのフレーム翻訳を、ヌクレオチド配列データベースの６通りのフレーム翻訳と比較する。
ＢＬＡＳＴは、以下の検索パラメーターを使用する：
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ−各検索についてのスコアのヒストグラムを表示する；デフォルトは、ｙｅｓである（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメーターＨを参照のこと）。
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ−各検索についてのスコアのヒストグラムを表示する；デフォルトは、ｙｅｓである（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメーターＨを参照のこと）。
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ−レポートされるマッチング配列の短い記述の数を、特定された数に制限する；デフォルト限度は、１００の記述である（マニュアルページのパラメーターＶを参照のこと）。
ＥＸＰＥＣＴ−データベース配列に対するマッチングをレポートするための統計的有意性閾値；デフォルト値は、１０である（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率的モデルによると、１０のマッチングが、単に偶然に見出されると予想される）。マッチングに起因する統計的有意性が、ＥＸＰＥＣＴ閾値よりも大きい場合、このマッチングはレポートされない。より低いＥＸＰＥＣＴ閾値は、よりストリンジェントが高く、これによりレポートされるマッチングの確率がより低くなる。少数の値が、入力可能である（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメーターＥを参照のこと）。
ＣＵＴＯＦＦ−ハイスコアセグメント対をレポートするためのカットオフスコア。デフォルト値は、ＥＸＰＥＣＴ値（上記を参照のこと）から算出される。ＨＳＰに基づく統計的有意性が、少なくとも、ＣＵＴＯＦＦ値と等しいスコアを有する単独のＨＳＰに基づく場合と同じ程度に高い場合にのみ、ＨＳＰがデータベース配列について報告される。より高いＣＵＴＯＦＦ値は、ストリンジェントが高く、これによりレポートされるマッチングの確率がより低くなる（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメーターＳを参照のこと）。代表的には、有意性閾値は、ＥＸＰＥＣＴを使用してより直感的に管理され得る。
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ−データベース配列を、ハイスコアセグメント対（ＨＳＰ）が報告される特定の数に制限する；デフォルト限界は、５０である。これより多くのデータベース配列が、レポートのための統計的有意性閾値を偶然満たす場合（以下のＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦを参照のこと）、最も高い統計的有意性に起因するマッチングのみが、レポートされる（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメーターＢを参照のこと）。
ＭＡＴＲＩＸ−ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸについての代替のスコア付けマトリクスを特定する。デフォルトマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９（２２），１０９１５−９）。有効な代替の選択肢としては、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０およびＩＤＥＮＴＩＴＹが挙げられる。ＢＬＡＳＴＮについて、利用可能な代替のスコア付けマトリクスは存在せず；ＢＬＡＳＴＮにおけるＭＡＴＲＩＸディレクティブの特定は、リターンおよびエラー応答を要求する。
ＳＴＲＡＮＤ−ＴＢＬＡＳＴＮ検索を、データベース配列の上の鎖または下の鎖のみに制限する；またはＢＬＡＳＴＮ検索、ＢＬＡＳＴＸ検索またはＴＢＬＡＳＴＸ検索を、問い合わせ配列の上の鎖または下の鎖におけるリーディングフレームのみに制限する。
ＦＩＬＴＥＲ−Ｗｏｏｔｔｏｎ ＆ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ １９９３ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９−１６３のＳＥＧプログラムによって決定されるような、低い組成複雑性を有する問い合わせ配列のセグメント、またはＣｌａｖｅｒｉｅ ＆ Ｓｔａｔｅｓ １９９３ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１９１−２０１のＸＮＵプログラム、またはＢＬＡＳＴＮについては、ＴａｔｕｓｏｖおよびＬｉｐｍａｎのＤＵＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）によって決定されるような、短周期内部反復から構成されるセグメントをマスクする。フィルタリングは、ｂｌａｓｔ出力から、統計的に有意であるが生物学的に目的と違うレポート（例えば、一般的な酸性領域、塩基性領域またはプロリンリッチ領域にヒットする）を除去し、データベース配列に対する特異的なマッチングのために利用可能な問い合わせ配列の、生物学的により目的に適す領域を残す。
フィルタープログラムによって見出された複雑性の低い配列は、ヌクレオチド配列中において、文字「Ｎ」を使用して置き換えられ（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）、そしてタンパク質配列において、文字「Ｘ」で置き換えられる（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）。
フィルタリングは、問い合わせ配列（またはその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮについて、ＤＵＳＴであり、他のプログラムについて、ＳＥＧである。
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおける配列に適用される場合、ＳＥＧ、ＸＮＵまたはその両方によってマスクされるものが全くないことは珍しいことではなく、そのため、フィルタリングは、常に効果をもたらすことを期待するべきではない。さらに、いくつかの場合において、配列は、その全体においてマスクされ、このことは、フィルタリングされていない問い合わせ配列に対してレポートされた任意のマッチングの統計的有意性が疑わしいはずであることを示す。
ＮＣＢＩ−ｇｉ − ＮＣＢＩ ｇｉ識別子を、出力において、登録名および／または遺伝子座名に加えて示させる。
最も好ましくは、配列比較は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで提供される簡単なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用して実施される。
配列同一性を決定する場合にギャップペナルティーが使用される場合、好ましくは、以下のパラメーターが使用される：
本発明はまた、本発明の方法で使用され得る配列に相補的な配列、あるいは本発明の配列である配列番号３および配列番号４またはこれらの相補的な配列のいずれかにハイブリダイズし得る配列を包含する。
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書中で使用される場合、「核酸の鎖が、塩基対形成によって相補鎖に結合するプロセス」、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において実行されるような増幅プロセスを含む。
本発明はまた、本明細書中に記載される配列に対して相補的な配列、または任意の誘導体、それらのフラグメントもしくは誘導体にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の使用を包含する。
用語「改変体」はまた、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
好ましくは、用語「改変体」は、ストリンジェントな条件下（例えば、５０℃、０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ３（ｐＨ７．０）｝）で、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
より好ましくは、用語「改変体」は、高ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ３（ｐＨ７．０）｝）で、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
本発明はまた、本発明の方法で使用され得るヌクレオチド配列（本明細書に記載される配列の相補配列を含む）にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列に関する。
本発明はまた、本発明の方法で使用され得るヌクレオチド配列（本明細書に記載される配列の相補配列を含む）にハイブリダイズし得る配列に相補的なヌクレオチド配列に関する。
中程度〜最高のストリンジェンシーの条件下で、本明細書に記載されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列もまた、本発明の範囲内である。
用語「選択的にハイブリダイズ可能な」とは、ヌクレオチド配列が、プローブとして使用される場合、本発明の方法で使用され得る標的ヌクレオチド配列が、バックグラウンドより有意に上のレベルでこのプローブにハイブリダイズすることが見出されている条件下で使用されることを意味する。バックグランドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされているｃＤＮＡライブラリまたは細菌ゲノムＤＮＡライブラリ中の他のヌクレオチド配列の存在に起因して生じ得る。この場合、バックグランドは、プローブと、ライブラリの非特異的ＤＮＡメンバー（標的ＤＮＡで観察される特異的相互作用の１０倍未満、好ましくは１００倍未満の強度である）との間の相互作用によって生じるレベルを示す。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば、３２Ｐで放射性標識することによって、測定され得る。
ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）で教示されるような、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づき、そして以下で説明されるように、規定された「ストリンジェンシー」を与える。
最高のストリンジェンシーは、代表的に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）で生じ；高ストリンジェンシーは、Ｔｍの約５℃〜１０℃下で生じ；中程度のストリンジェンシーは、Ｔｍの約１０℃〜２０℃下で生じ；そして低ストリンジェンシーは、Ｔｍの約２０℃〜２５℃下で生じる。当業者により理解されるように、最高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得、一方、中程度（または低い）ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、類似または関連のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得る。
好ましい局面において、本発明は、ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ３（ｐＨ７．０）｝）で、本発明の方法で使用され得るヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を網羅する。本発明の方法で使用され得るヌクレオチド配列が、二本鎖である場合、二重鎖の両方の鎖は、個々にまたは組み合わせてのいずれかで、本発明によって包含される。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合、このヌクレオチド配列の相補配列もまた、本発明の範囲に含まれることが理解されるべきである。
本発明の方法で使用され得る配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲に含まれるヌクレオチド配列は、多数の方法で得られ得る。本明細書に記載される配列の他の改変体は、例えば、ある範囲の供給源から作製されるＤＮＡライブラリをプローブすることによって、得られ得る。さらに、他のウイルス性／細菌性ホモログ、または細胞性ホモログ、特に、哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類の細胞）において見出される細胞ホモログが得られ得、そしてこのようなホモログおよびそのフラグメントは、一般に、本明細書中の配列表に示される配列に選択的にハイブリダイズし得る。このような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ、または他の動物種由来のゲノムＤＮＡライブラリをプローブし、そしてこのようなライブラリを、本発明の配列表の配列番号３または配列番号４に示されるヌクレオチド配列の全てまたは一部を含むプローブで、中程度〜高いストリンジェンシーの条件下でプローブすることによって、得られ得る。
改変体および株／種ホモログはまた、縮重ＰＣＲを使用して得られ得、この縮重ＰＣＲは、本発明の方法で使用され得る配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする改変体およびホモログ内の配列を標的化するように設計されたプライマーを使用する。保存された配列は、例えば、いくつかの改変体／ホモログ由来のアミノ酸配列を整列することによって、予測され得る。配列アラインメントは、当該分野で公知のコンピューターソフトウェアを使用して実施され得る。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが、広く使用される。縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、そして既知の配列に対して１つの配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される条件よりも低いストリンジェンシー条件で使用される。
あるいは、このようなヌクレオチド配列は、特徴付けされた配列（例えば、本発明の配列表の配列番号３または配列番号４に示されるヌクレオチド配列）の部位特異的変位誘発によって得られ得る。例えば、ヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞についてコドンの優先度を最適化するためにサイレントなコドン変化が配列に必要とされる場合、これは有用であり得る。
本発明の方法で使用され得るヌクレオチド配列は、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー、代替的増幅反応のためのプライマー）、プローブ（例えば、放射性標識もしくは非放射性標識を使用する従来の手段による、明示標識によって標識されたプローブ）、またはベクターにクローニングされ得るヌクレオチド配列を生成するために使用され得る。このようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長（例えば、少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチド長）であり、そしてまた、本明細書中で使用される場合、本発明の方法で使用され得る用語「ヌクレオチド配列」により包含される。
本発明に従うＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブの様なヌクレオチド配列は、組換え的にか、合成的にか、または当業者に利用可能な任意の手段によって生成され得る。これらはまた、標準的な技術によってクローニングされ得る。
一般に、プライマーは、一度に所望の核酸配列の１ヌクレオチドの段階的製造を含む合成手段によって、生成される。自動化技術を使用してこれを達成するための技術は、当該分野で容易に利用可能である。
より長いヌクレオチド配列は、一般に、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して、組換え手段を使用して生成される。これは、クローニングすることが所望される標的配列の領域に隣接する一対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製すること、このプライマーを、細菌細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施すること、増幅されたフラグメントを（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）単離すること、および増幅されたＤＮＡを回収すること、を包含する。これらのプライマーは、適切な制限酵素認識部位を含むように設計され得、その結果、増幅されたＤＮＡは、適切なクローニングベクターにクローニングされ得る。
遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし発現するために使用され得る。当業者により理解されるように、特定の発現系について、天然に存在しないコドンを有するヌクレオチド配列をコードする、本発明の方法で使用され得るポリヌクレオチドを生成することが有利であり得る。特定の原核生物細胞に好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅら、１９８９，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４７７−５０８）が、選択されて、例えば、チャネル発現の速度が増大され得るか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物より、長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物が生成され得る。
一実施形態において、本発明の方法で使用され得るポリペプチドは、組換えポリペプチドである。
好ましくは、本発明の方法で使用され得る組換えポリペプチドは、遺伝ベクターを使用して調製される。
（構築物）
用語「構築物」は、プロモーターに直接結合された、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む。同じことが、直接結合を含む本発明に関して、用語「融合された」についても当てはまる。各場合において、これらの用語は、野生型遺伝子プロモーターと通常会合しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列の本来の組合せ、およびこれらの両方がその天然の環境にある場合を網羅しない。
用語「構築物」は、プロモーターに直接結合された、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む。同じことが、直接結合を含む本発明に関して、用語「融合された」についても当てはまる。各場合において、これらの用語は、野生型遺伝子プロモーターと通常会合しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列の本来の組合せ、およびこれらの両方がその天然の環境にある場合を網羅しない。
この構築物は、例えば、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、Ｓｔｒｅｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌における遺伝構築物の選択を可能にするマーカーをさらに含み得るか、または発現し得る。抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、ゲンタマイシンおよびアンピシリン、ペニシリンに対する耐性）を提供するマーカーのような、使用され得る種々のマーカーが存在する。
好ましくは、本発明の構築物は、少なくとも、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の方法で使用され得るヌクレオチド配列を含む。
（ベクター）
用語「ベクター」は、発現ベクター、形質転換ベクターおよびエピソームを含む。
用語「ベクター」は、発現ベクター、形質転換ベクターおよびエピソームを含む。
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロで発現し得る構築物を意味する。
好ましくは、本発明のベクターは、プラスミドである。
本発明のベクターは、本発明の方法で使用され得るポリペプチドの発現に適切な環境を提供するように制御された条件下で、以下に記載されるような適切な宿主細胞内に形質転換され得る。従って、さらなる局面において、本発明は、本発明に従うポリペプチドを発現するためのプロセスを提供し、このプロセスは、上記のような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、本発明の方法で使用され得るポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現を提供するための条件下で培養する工程を包含する。
本発明の方法において用いられ得るタンパク質をコードする配列に作動可能に連結した制御配列は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節配列を含む。これらの制御配列は、発現ベクターが用いられるように設計される宿主細胞と適合性であるよう選択され得る。用語プロモーターは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位として当該分野で周知であり、そして大きさおよび複雑さにおいて、最小のプロモーターから上流調節配列およびエンハンサーを含むプロモーターにわたる核酸領域を含む。
用語「プロモーター」は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位のような、当該分野の普通の意味において用いられる。このプロモーターは、必要に応じてエンハンサーエレメントを含み得る。
用語「エンハンサー」は、転写開始複合体の他のタンパク質成分と結合し、こうしてその会合したプロモーターによって指図される転写の開始を容易にするＤＮＡ配列を含む。
このプロモーターは、適切な宿主における発現レベルを確実にするかまたは増加させる特徴を含み得る。例えば、これらの特徴は、Ｐｒｉｂｎｏｗボックス、Ｋｏｚａｋ配列またはＴＡＴＡボックスのような保存された領域であり得る。このプロモーターは、ヌクレオチド配列の発現のレベルに影響する（例えば、維持する、増強する、減少させる）、他の配列を含みさえし得る。例えば、適切な他の配列としては、以下：転写調節タンパク質についての標的配列、消費された−１０モチーフ（ｅｘｐｅｎｄｅｄ −１０ ｍｏｔｉｆ）、ＲＮＡリーダー配列、ＵＰエレメントなどが挙げられる。他の配列としては、温度誘導性エレメント、化学物質誘導性エレメント、光誘導性エレメントまたはストレス誘導性エレメントのような誘導性エレメントが挙げられる。また、転写または翻訳を増強強するのに適切なエレメントが、存在し得る。
別の実施形態において、構成的プロモーターが、本発明の方法において用いられ得る、所望されるポリペプチドの発現を指図するよう選択され得る。このような発現構築物は、誘導基質を含む培地上で発現宿主を培養する必要性を回避するので、さらなる利点を提供し得る。
このプロモーターは、代表的に、原核生物プロモーターおよび真核生物プロモーターと呼ばれる、細菌細胞または真菌細胞において機能的であるプロモーターから選択される。
より好ましくは、このプロモーターは、乳酸細菌において活性であるプロモーターから選択される。
誘導可能であることは、プロモーターにとってまた、利点のあることであり得、その結果、異種遺伝子の発現のレベルは、細胞の寿命の間、調節され得る。誘導可能（誘導性）とは、プロモーターを用いて得られた発現のレベルが調節され得ることを意味する。
さらに、任意のこれらのプロモーターが、さらなる調節配列、例えば、エンハンサー配列の付加により、改変され得る。上記の２つ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターもまた、用いられる。
本発明のベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子またはペニシリン耐性遺伝子）を含み得る。
産業上の微生物についての好ましい選択系は、宿主生物における変異を必要としない選択マーカーの群により形成される系である。真菌選択マーカーの例は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、ＡＴＰシンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−ホスフェート−デカルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、フレオマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）およびベノミル耐性（ｂｅｎＡ）についての遺伝子である。非真菌選択マーカーの例は、細菌性Ｇ４１８耐性遺伝子（これはまた酵母において用いられ得るが、糸状菌では用いられない）、アンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびβ−グルコロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子である。
ベクターは、例えばＲＮＡの産生のためにインビトロで用いられ得るか、または宿主細胞をトランスフェクトするために用いられ得る。
本発明のベクターはまた、エピソームを含む。
本明細書中で用いられる場合、用語「エピソーム」は、宿主細胞中で、染色体外の単位として、独立した存在を時々有し、そして他の時には、細胞の染色体に組み込まれ、染色体と一緒にそれ自身を複製する、プロモーターを必要に応じて含む一連の遺伝子から構成される遺伝物質の単位を意味する。エピソームは、細菌において研究されている。エピソームの一群は、事実上、細菌に感染するウイルスである。性因子と呼ばれるエピソームは、染色体物質が、１つの細菌から別の細菌に転移されるか否かを決定する。他のエピソームは、細菌を抗生物質の阻害作用に対して耐性にする遺伝子を保有する。さらに、エピソームは、細菌が通常より高い温度、酸性度、塩などを切り抜けて生き残ることを可能にする遺伝子を保有する。
従って、本発明の方法において用いられ得るポリヌクレオチドは、組換えベクター（代表的には複製可能ベクター）、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターに組み込まれ得る。このベクターを用いて、適合性の宿主細胞中で核酸を複製し得る。従ってさらなる実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドを複製可能なベクター中に導入し、このベクターを適合性の宿主細胞に導入し、そしてベクターの複製をもたらす条件下でこの宿主細胞を増殖させることにより、本発明の方法において用いられ得るポリヌクレオチドを作る方法を提供する。このベクターは、宿主細胞から回収され得る。適切な宿主細胞が、発現ベクターと関連して以下に記載される。
（細胞）
本発明は、その範囲内において、本発明の核酸分子、構築物またはベクターを含む細胞を包含する。これらは、例えば、本明細書中に記載されるように、発現のために用いられ得る。
本発明は、その範囲内において、本発明の核酸分子、構築物またはベクターを含む細胞を包含する。これらは、例えば、本明細書中に記載されるように、発現のために用いられ得る。
本発明の方法において用いられ得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、ポリペプチドの発現および細胞培養物からの回収に適切な条件下で培養され得る。組換え細胞により産生されるタンパク質は、用いられる配列および／またはベクターに細胞内で依存して、分泌され得るか、または含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明の方法において用いられ得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、特定の原核生物細胞膜を介してポリペプチドの分泌を指図するシグナル配列を備えて設計され得る。他の組換え構築物が、本発明の方法において用いられ得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列とを連結させ得る（Ｋｒｏｌｌ ＤＪら、１９９３，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：４４１−５３，融合タンパク質を含むベクターの上記考察もまた、参照のこと）。
本発明の方法において用いられ得る細胞は、任意の適切な形態で提供され得る。例えば、これらの細胞は、単離された形態で、培養物中で、保存された形態などで、提供され得る。保存としては、例えば、低温保存法、緩衝化、滅菌条件などが挙げられ得る。本発明の方法において用いられ得る細胞は、遺伝子クローニング技術により、または任意の他の手段により提供され得る。
好ましくは、本発明の方法において用いられ得るヌクレオチド配列は、転写単位に作動可能に連結される。
本明細書中で記載される場合、用語「転写単位」は、コード配列および他の全てのコード配列から独立してコード配列の発現を達成するためのシグナルを含む核酸の領域である。従って、各々の転写単位は一般に、少なくともプロモーター、必要に応じてエンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを含む。
ハイブリッドプロモーターもまた、発現構築物の誘導可能な調節を改良するために用いられ得る。
用語「形質転換（された）細胞」とは、改変された遺伝子構造を有する細胞を意味する。本発明で、本発明に従うベクターが細胞に導入されている場合、細胞は改変された遺伝子構造を有する。
本発明はまた、本発明の方法において用いられ得るヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換する工程を包含する方法を提供する。
本発明はまた、本明細書中で記載されるような本発明に従うヌクレオチド配列によってコードされる、本発明の方法において用いられ得るポリペプチドの発現に適切な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程を包含する方法を提供する。この細胞は、前記ヌクレオチド配列で形質転換されている。
本発明はまた、本発明に従うヌクレオチド配列によりコードされる本発明の方法において用いられ得るポリペプチドの発現に適切な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程、そして続いてこの形質転換された宿主細胞培養物から前記ポリペプチドを回収する工程を包含する方法を提供する。この細胞は、前記ヌクレオチド配列またはその誘導体、ホモログ、改変体もしくはフラグメントで形質転換されている。
本発明はまた、本明細書中に提示される配列に相補的なヌクレオチド配列またはその任意のフラグメントもしくは誘導体を包含する。配列がそのフラグメントに相補的である場合、この配列は、他の生物中で類似のプロモーター配列を同定するためのプローブとして用いられ得る。
本発明の方法において用いられ得るポリペプチドおよびそのフラグメントは、組換えＥ．ｃｏｌｉまたは組換え真菌において産生され得る。好ましくは、本発明の方法において使用するためのポリペプチドおよびそのフラグメントは、組換え乳酸細菌において産生される。
用語「形質転換ベクター」とは、ある実体から別の実体へ転移されることが可能な構築物を意味する。この実体は、種であり得るか、または異なる種であり得る。構築物が、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドから細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属）へのように、ある種から別の種へ転移されることが可能である場合、この形質転換ベクターは、時々「シャトルベクター」と呼ばれる。
本発明に関連する、用語「宿主細胞」は、本発明に従う組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはそこから得られる産物を含み得る任意の細胞を含み、ここでプロモーターは、宿主細胞中に存在する場合、本発明に従うヌクレオチド配列の発現を可能にし得る。さらに、本発明のベクターおよびポリヌクレオチド（上記のレポーター遺伝子構築物）もまた、ベクター／ポリヌクレオチドを複製するために、宿主細胞中に導入され得る。
好ましい実施形態において、宿主細胞は乳酸細菌である。例として、この乳酸細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、ＢｉｆｉｄｏｂａｔｅｒｉｕｍまたはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓを含むがこれらに限定されない、細菌の群から選択され得る。
（宿主細胞／宿主生物の形質転換）
前に示したように、宿主生物は、原核生物または真核生物であり得る。適切な原核生物宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられる。より好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのような乳酸細菌である。原核生物宿主の形質転換に対する教示は、当該分野で十分記録されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。
前に示したように、宿主生物は、原核生物または真核生物であり得る。適切な原核生物宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられる。より好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのような乳酸細菌である。原核生物宿主の形質転換に対する教示は、当該分野で十分記録されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。
原核生物宿主が用いられる場合、ヌクレオチド配列が、例えばイントロンの除去のように、形質転換の前に適切に改変される必要があり得る。
マーカー遺伝子の発現の存在／不在が、本発明の方法において用いられ得るヌクレオチド配列および／またはポリペプチドがまた存在していることを示すが、これらの存在および発現は確認されるべきである。例えば、本発明の方法において用いられ得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、ポリペプチドコード領域を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの制御下で、本発明の方法において用いられ得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応答するマーカー遺伝子の発現は、通常、ポリペプチドの発現も同様に示す。
特定の分子の発現を定量化するさらなる方法としては、放射標識（Ｍｅｌｂｙ ＰＣら、１９９３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５９：２３５−４４）またはビオチン化（Ｄｕｐｌａａ Ｃら、１９９３，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２９−３６）ヌクレオチド、コントロール核酸の同時増幅、および実験的結果が内挿される標準曲線が挙げられる。複数のサンプルの定量化が、ＥＬＩＳＡフォーマットでアッセイを行なうことによって加速され得、ここで本発明の方法において用いられ得るポリペプチドは、種々の希釈で調製され得、分光光度的応答および熱量測定的応答が、迅速な定量化を与える。
本発明はまた、発現ベクターおよび形質転換された宿主細胞に関し、この形質転換された宿主細胞は、本発明に従う種々の乳製品の製造を導く、乳汁を発酵させる観点で、ポリペプチドのインビボまたはインビトロでの産生のために本発明の方法において用いられ得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその改変体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体を含む。
ここで、本発明は、参照が以下の図および表に対してなされる、実施例として例示される。
表１ 細菌株およびバクテリオファージ。
表２ ４℃で保存される間の、４２℃および５０℃にてＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ９２０６３で産生されたヨーグルトのｐＨ値の変化。
表１ 細菌株およびバクテリオファージ。
表２ ４℃で保存される間の、４２℃および５０℃にてＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ９２０６３で産生されたヨーグルトのｐＨ値の変化。
（図面のより詳細な説明）
（図１．Ａ．）
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４−１の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン２）および４０℃（レーン３および４）、４５℃（レーン５および６）および５５℃（レーン７および８）での６０分間のインキュベーション後に熱ショックにかけた、Ｓ４ ｗ／ｏのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１は、６．５ｋＤａ；１４．２ｋＤａ；１８．４ｋＤａ；２９ｋＤＡ；４８．５ｋＤａ；および６６ｋＤａの分子量を有するタンパク質サイズマーカーを含む。レーン９は、過剰発現Ｅ．ｃｏｌｉ株から単離された、部分的に精製されたｓＨｓｐを含む。熱ショックを、指示された時間で、インキュベーションの前に３０分間、５２℃で実施した。
（図１．Ａ．）
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４−１の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン２）および４０℃（レーン３および４）、４５℃（レーン５および６）および５５℃（レーン７および８）での６０分間のインキュベーション後に熱ショックにかけた、Ｓ４ ｗ／ｏのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１は、６．５ｋＤａ；１４．２ｋＤａ；１８．４ｋＤａ；２９ｋＤＡ；４８．５ｋＤａ；および６６ｋＤａの分子量を有するタンパク質サイズマーカーを含む。レーン９は、過剰発現Ｅ．ｃｏｌｉ株から単離された、部分的に精製されたｓＨｓｐを含む。熱ショックを、指示された時間で、インキュベーションの前に３０分間、５２℃で実施した。
（図１．Ｂ．）
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４におけるｓＨｓｐ発現の誘導。増殖の後期対数期（ＯＤ２６０ 約１．０）までＬＴＭ１７培地中で増殖したＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４−１を収集し、糖を含まない培地で洗い、そして０．０５％のグルコースを含むＴＭ１７中で再懸濁した。５ｍｌのアリコートを、３７℃、４６℃および５２℃で３０分間インキュベートしたか（Ａ）、または５〜６０分の間５２℃でインキュベートした（Ｂ）。細胞抽出物を調製し、ウェスタンブロット分析を実施した。Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ由来の部分的に精製したｓＨｓｐ（ポジティブコントロール）、レーン１；５２℃、４６℃、および３７℃でインキュベートしたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４、レーン２〜４；５２℃でインキュベートしたＳ４−１（ネガティブコントロール）、レーン５。Ｂ：ポジティブコントロール、レーン１；５分、レーン２；１５分、レーン３；３０分、レーン４；６０分、レーン５。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４におけるｓＨｓｐ発現の誘導。増殖の後期対数期（ＯＤ２６０ 約１．０）までＬＴＭ１７培地中で増殖したＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４−１を収集し、糖を含まない培地で洗い、そして０．０５％のグルコースを含むＴＭ１７中で再懸濁した。５ｍｌのアリコートを、３７℃、４６℃および５２℃で３０分間インキュベートしたか（Ａ）、または５〜６０分の間５２℃でインキュベートした（Ｂ）。細胞抽出物を調製し、ウェスタンブロット分析を実施した。Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ由来の部分的に精製したｓＨｓｐ（ポジティブコントロール）、レーン１；５２℃、４６℃、および３７℃でインキュベートしたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４、レーン２〜４；５２℃でインキュベートしたＳ４−１（ネガティブコントロール）、レーン５。Ｂ：ポジティブコントロール、レーン１；５分、レーン２；１５分、レーン３；３０分、レーン４；６０分、レーン５。
（図２．Ａ．）
４２℃でインキュベートした、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４（黒丸（Ｓ４））、そのプラスミドを取り除いた誘導体Ｓ４−１（白丸（Ｓ４−１））、組換えプラスミドｐ９９−１７−２（ｓｈｓｐ＋）で形質転換されたＳ４−１（黒三角（Ｓ４−１））、およびｐ００−８−１（ｓｈｓｐ−）で形質転換されたＳ４−１（白三角（Ｓ４−１））を示す増殖曲線。
４２℃でインキュベートした、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４（黒丸（Ｓ４））、そのプラスミドを取り除いた誘導体Ｓ４−１（白丸（Ｓ４−１））、組換えプラスミドｐ９９−１７−２（ｓｈｓｐ＋）で形質転換されたＳ４−１（黒三角（Ｓ４−１））、およびｐ００−８−１（ｓｈｓｐ−）で形質転換されたＳ４−１（白三角（Ｓ４−１））を示す増殖曲線。
（図２．Ｂ．）
５２℃でインキュベートした、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４（黒丸（Ｓ４））、そのプラスミドを取り除いた誘導体Ｓ４−１（白丸（Ｓ４−１））、組換えプラスミドｐ９９−１７−２（ｓｈｓｐ＋）で形質転換されたＳ４−１（黒三角（Ｓ４−１））、およびｐ００−８−１（ｓｈｓｐ−）で形質転換されたＳ４−１（白三角（Ｓ４−１））を示す増殖曲線。
５２℃でインキュベートした、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４（黒丸（Ｓ４））、そのプラスミドを取り除いた誘導体Ｓ４−１（白丸（Ｓ４−１））、組換えプラスミドｐ９９−１７−２（ｓｈｓｐ＋）で形質転換されたＳ４−１（黒三角（Ｓ４−１））、およびｐ００−８−１（ｓｈｓｐ−）で形質転換されたＳ４−１（白三角（Ｓ４−１））を示す増殖曲線。
（図２−１）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ８（丸（Ｓ８））、そのプラスミドを除いたＳ８−１（三角（Ｓ８−１））および組換えプラスミドｐ９９−１７−２で形質転換された株Ｓ８およびＳ８−１（ダイヤモンド（ｐ９９−１７−２を有するＳ８）、四角（ｐ９９−１７−２を有するＳ８−１））の、４８℃での増殖。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ８（丸（Ｓ８））、そのプラスミドを除いたＳ８−１（三角（Ｓ８−１））および組換えプラスミドｐ９９−１７−２で形質転換された株Ｓ８およびＳ８−１（ダイヤモンド（ｐ９９−１７−２を有するＳ８）、四角（ｐ９９−１７−２を有するＳ８−１））の、４８℃での増殖。
（図２−２）
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株Ｂｕ２−６０、ＩＬ１４０３、およびＭＧ１３６３ならびに組換え（ｓｈｓｐ＋）プラスミドｐ９９−１７−２で形質転換されたその誘導体の増殖。３７℃または４１／４２℃でのＢｕ２−６０、ＩＬ１４０３、ＭＧ１３６３（１−三角（３７℃）および４−四角（４１／４２℃））；３７℃または４１／４２℃での形質転換された株（２−丸（３７℃）および３−ダイヤモンド（４１／４２℃））。
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株Ｂｕ２−６０、ＩＬ１４０３、およびＭＧ１３６３ならびに組換え（ｓｈｓｐ＋）プラスミドｐ９９−１７−２で形質転換されたその誘導体の増殖。３７℃または４１／４２℃でのＢｕ２−６０、ＩＬ１４０３、ＭＧ１３６３（１−三角（３７℃）および４−四角（４１／４２℃））；３７℃または４１／４２℃での形質転換された株（２−丸（３７℃）および３−ダイヤモンド（４１／４２℃））。
図から、全てのＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株が３７℃（１）で良く増殖するが、４２℃（４）であまり増殖しないことが分かる。プラスミドｐ００−１７−２で形質転換された株は、３７℃での増殖が変わらない一方、４２℃（３）での増殖を増加させる。
図３．プラスミドｐＳｔ０４、ｐ９９−１７−２、およびｐ００−８−１の物理的地図。
図４．６０℃でのＴＭ１７培地におけるＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４（丸、（白丸）５２℃で予めインキュベートしたＳ４、および（黒丸）４２℃で予めインキュンベートしたＳ４））およびそのプラスミドを含まない誘導体Ｓ４−１（三角、（白三角）５２℃で予めインキュベートしたＳ４−１、および（黒三角）Ｓ４−１、４２℃で予めインキュベートした）の熱生存曲線。６０℃に曝す前に、細胞を４２℃（黒印（黒丸）Ｓ４および（黒三角）Ｓ４−１））または５２℃（白印、（白丸）Ｓ４および（白三角）Ｓ４−１））で３０分間、予めインキュベートした。
図４から、Ｓ４がプラスミドを含まない株Ｓ４−１よりも良好な生存を示すことが分かる。
図５．種々のｐＨ値で４℃での保存の間の、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびそのプラスミドを含まない誘導体Ｓ−１の生存。細胞を、乳酸を加えることによって適切なｐＨに予め適合させた増殖培地中に再懸濁し、１５日間まで４℃で保存した。細胞数を、ＬＴＭ１７寒天上に適切な希釈液をプレーティングすることによって３日毎に決定した。（黒丸）Ｓ４，ｐＨ５，５；（白丸）Ｓ４，ｐＨ４，５；（黒三角）Ｓ４、ｐＨ３，５；（白三角）Ｓ４−１，ｐＨ５，５；（黒四角）Ｓ４−１，ｐＨ４，５；（白四角）Ｓ４−１，ｐＨ３，５。
この図から、Ｓ４が、全ての言及されたｐＨ値でより良好な生存を示すことが分かり得る。Ｓ４−１の生存は、１〜２日間の保存後劇的に減少し、そして４〜６日後、生き残っている細菌はほとんどなかった。
図６．種々の温度でのＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびＳ４−１ならびにＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ９２０６３を用いる単一株の発酵および混合株の発酵における脱脂乳の酸化。脱脂乳を、混合株の各々の株について５×１０６ＣＦＵ／ｍｌおよび単一株の発酵について１０７ＣＦＵ／ｍｌで接種した。ｐＨの低下を、マルチチャネルｐＨメーターで自動的に追跡した。
図６．Ａ：５０℃でのＬｂ ９２０６３（１）；５０℃でのＳ４（２）；４２℃でのＳ４（３）；５０℃でのＳ４およびＬｂ（４）；４２℃でのＬｂ（５）；４２℃でのＳ４およびＬｂ（６）。以下：
図６．Ｂ：図６Ｂは、５０℃でのＬｂ ９２０６３（１）；５０℃でのＳ４−１（２）；５０℃でのＳ４−１およびＬｂ（３）；４２℃でのＳ４−１（４）；４２℃でのＬｂ（５）；４２℃でのＳ４−１およびＬｂ（６）を示す。
図６．Ｂ：図６Ｂは、５０℃でのＬｂ ９２０６３（１）；５０℃でのＳ４−１（２）；５０℃でのＳ４−１およびＬｂ（３）；４２℃でのＳ４−１（４）；４２℃でのＬｂ（５）；４２℃でのＳ４−１およびＬｂ（６）を示す。
図６．Ｃ：図６Ｃは、５０℃でのＬｂ ＨＭ（１）；５０℃でのＳ４−１（２）；５０℃でのＳ４（３）；５０℃でのＳ４およびＬｂ ＨＭ（４）；４２℃でのＳ４（５）；４２℃でのＳ４−１；４２℃でのＬｂ ＨＭ（７）；４２℃でのＳ４およびＬｂ ＨＭ（８）を示す。
図６Ａおよび図６Ｂから、両方の図中の曲線番号６は、通常のヨーグルト発酵に相当することが示される。１５〜２０時間発酵の後、約３．６のｐＨに到達する。図６Ａおよび６Ｃの曲線４は、５０℃で行われた発酵を示し、ここで、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓはｓｈｓｐを運ぶ。これらの発酵物は、約４．０〜４．１のｐＨレベルに到達する。図６Ｂの曲線３は、Ｓ４−１およびＬｂ ９２０６３を用いた発酵が、ｐＨ約５．２で終結することを示す。
図７．図７は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４、およびＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの単一株培養または混合株培養における、５０℃での増殖およびそれに続く保存後の生存を示す。最終細胞密度が１０７ＣＦＵ／ｍｌとなるようにスキムミルクに播種し、そして５０℃で２４時間インキュベートした。続いて、発酵させたミルクを４℃で１５日間保存した。各々の株の総細胞数ならびに総細胞数（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＳ４を合わせた数）を３日毎に決定した。
図９．図９は、配列表を示す。
配列番号１
配列番号２
配列番号３
配列番号４
（特定の実施例）
（低分子熱ショックタンパク質についての遺伝子を保有するプラスミドｐＳｔ０４およびｐＥＲ１−１の一般的特性）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のプラスミドのＤＮＡ相同性群Ｉに属する、プラスミドｐＳｔ０４およびｐＥＲ１−１のヌクレオチド配列（Ｊａｎｚｅｎら、１９９２）を決定した（登録番号：ＡＪ ２４２４７７およびＡＪ ２４２４７６）。これらのプラスミドは、９０％以上の相同性で約１２００ｂｐのＤＮＡ領域を共有し、これはプラスミド複製に必要である。
配列番号１
配列番号２
配列番号３
配列番号４
（特定の実施例）
（低分子熱ショックタンパク質についての遺伝子を保有するプラスミドｐＳｔ０４およびｐＥＲ１−１の一般的特性）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のプラスミドのＤＮＡ相同性群Ｉに属する、プラスミドｐＳｔ０４およびｐＥＲ１−１のヌクレオチド配列（Ｊａｎｚｅｎら、１９９２）を決定した（登録番号：ＡＪ ２４２４７７およびＡＪ ２４２４７６）。これらのプラスミドは、９０％以上の相同性で約１２００ｂｐのＤＮＡ領域を共有し、これはプラスミド複製に必要である。
ｒｅｐＡ遺伝子に加えて、プラスミドｐＳｔ０４およびプラスミドｐＥＲ１−１は、それぞれ、第２ＯＲＦを有し、これらの第２ＯＲＦは、それぞれ、１５５アミノ酸残基および１４２アミノ酸残基（配列番号１および配列番号２）をコードし、１８，０４２Ｄａおよび１６，４２２Ｄａの分子量に相当する。これらのＯＲＦは、ｒｅｐＡ−遺伝子に対して反時計回りに配置される。推定のリボソーム結合部位（ＧＡａ／ｇＧＡＡＡＧ）（開始コドンの８ｂｐ上流）は、５’−ＴＴＧＡＡＡ．．．（１６ｂｐ）．．．ＴＡＴＡＡＴプロモーター領域の後に続く。予想遺伝子産物は、他のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株に認められる低分子熱ショックタンパク質（ｓＨｓｐ）に対して高度に類似（＞９０％）している（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９９、Ｓｏｍｋｕｔｉら、１９９８）。これらのｓＨｓｐは、原核生物および真核生物に共通のショック応答タンパク質のファミリーに属す。ｓＨｓｐ合成は、ｐＨ４．５より低いｐＨ値で、または４５℃を超える温度で、低い基本的レベルから有意に増加し、そしてｐＨ４．０または５２℃で、短い、３０分のショックによって、さらに増加され得る（図１）。
（低分子熱ショックタンパク質の機能）
ｉ）高温での増殖および熱耐性
プラスミドｐＳｔ０４およびプラスミドｐＥＲｌ−１を有するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓ４およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＥＲ１の異なる温度での増殖挙動を、それぞれ、これらの株のプラスミドの無い誘導体Ｓ４−１およびＥＲ１−１の異なる温度での増殖挙動と比較した。４２℃では、全ての株は、約２×１０９ＣＦＵ／ｍｌの最終細胞密度まで、同じ速度で増殖した。４５℃では、これらのプラスミドの無い株は、幾分か遅いが、ほとんど同じ最終細胞密度まで増殖した。５２℃では、前記プラスミド（ｓｈｓｐ）を有する株のみが、１×１０９の最終細胞密度まで、低い増殖速度で増殖可能であった（図２）。
ｉ）高温での増殖および熱耐性
プラスミドｐＳｔ０４およびプラスミドｐＥＲｌ−１を有するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓ４およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＥＲ１の異なる温度での増殖挙動を、それぞれ、これらの株のプラスミドの無い誘導体Ｓ４−１およびＥＲ１−１の異なる温度での増殖挙動と比較した。４２℃では、全ての株は、約２×１０９ＣＦＵ／ｍｌの最終細胞密度まで、同じ速度で増殖した。４５℃では、これらのプラスミドの無い株は、幾分か遅いが、ほとんど同じ最終細胞密度まで増殖した。５２℃では、前記プラスミド（ｓｈｓｐ）を有する株のみが、１×１０９の最終細胞密度まで、低い増殖速度で増殖可能であった（図２）。
ｓｈｓｐ遺伝子が、高温で増殖する能力の原因であることを確認するために、プラスミドの無い株Ｓ４−１を、組換えプラスミドｐ９９−１７−２およびｐ００−８−１で形質転換させた。プラスミドｐ９９−１７−２は、Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）中にクローン化された全ｐＳｔ０４配列を含み、グラム陽性細菌についての選択マーカーとして、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプラスミドｐＥ１９４由来のエリスロマイシン耐性遺伝子を保有する。プラスミドｐ００−８−１は、ｐ９９−１７−２の全ｓｈｓｐ配列が欠失した欠失誘導体である（図３）。株Ｓ４−１（ｐ９９−１７−２）および株Ｓ４−１（ｐ００−８−１）は、それぞれＳ４およびＳ４−１と同じ増殖挙動を示し、ｓｈｓｐ遺伝子の存在が５２℃までの温度で増殖する能力の原因であることを証明した（図２）。
組換えプラスミドｐ９９−１７−２は、続いて、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓ８およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓ１１中、同様に中温性のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ株ＩＬ１４０３およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ株Ｂｕ２−６０ならびにＬ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ株ＭＧ１３６３中に、エレクトロポレーションによって導入された。Ｓ８およびＳ１１についての最大増殖温度は、４５℃から４８℃まで（図２−１）および５２℃まで（図２）それぞれ上昇し、そしてｌａｃｔｏｃｏｃｃａｌ株については３７℃から４２℃まで（図２−２）上昇した。
そのプラスミドの無い誘導体Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓ４およびＥＲ１は、より高い熱耐性を示した。６０℃で２時間のインキュベーションにより、このプラスミドを有する細胞の約５０％が生き残ったが、プラスミドの無い細胞は全く生き残らなかった。短時間熱ショック（５２℃で３０分）によって、熱耐性がさらに改善され得た（図４）。
ｉｉ）酸耐性
高められた最大増殖温度および改善された熱耐性に加え、ｓＨｓｐの存在によって、酸耐性が高められた。ｓｈｓｐを発現している細胞は、低ｐＨでの保存に対して強力に改善された生存度を示した。大抵の発酵乳製品よりもさらに低いｐＨ値であるｐＨ３．５でさえ、４０％以上の細胞が４℃で１５日間の保存に生き残り、一方、ｓｈｓｐ陰性変異体の細胞は、同一条件で７日後には検出不可能であった（図５）。
高められた最大増殖温度および改善された熱耐性に加え、ｓＨｓｐの存在によって、酸耐性が高められた。ｓｈｓｐを発現している細胞は、低ｐＨでの保存に対して強力に改善された生存度を示した。大抵の発酵乳製品よりもさらに低いｐＨ値であるｐＨ３．５でさえ、４０％以上の細胞が４℃で１５日間の保存に生き残り、一方、ｓｈｓｐ陰性変異体の細胞は、同一条件で７日後には検出不可能であった（図５）。
ｉｉｉ）塩耐性
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびそのプラスミドの無い誘導体Ｓ４−１を、０〜３％の塩化ナトリウム濃度で増殖した。増殖速度または最終細胞密度のいずれにおいても、１％までのＮａＣｌ濃度で明白な相違は認められなかった。１．５〜２．５％の塩濃度で、野生型株は、プラスミドの無い株よりもより速く増殖した。３％ＮａＣｌの塩濃度では、増殖は起こらなかった。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびそのプラスミドの無い誘導体Ｓ４−１を、０〜３％の塩化ナトリウム濃度で増殖した。増殖速度または最終細胞密度のいずれにおいても、１％までのＮａＣｌ濃度で明白な相違は認められなかった。１．５〜２．５％の塩濃度で、野生型株は、プラスミドの無い株よりもより速く増殖した。３％ＮａＣｌの塩濃度では、増殖は起こらなかった。
（乳発酵のためのＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを用いた混合培養における熱耐性Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株の適用）
プラスミドをコード化したＳｈｓｐ遺伝子を保有するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株は、熱耐性および耐酸性が有意に増大した。入手可能な２つのｓｈｓｐ陽性Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓ４およびＥＲ１がヨーグルト生成に適するか否かを証明するために、各々の株をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）９２０６３およびＨＭと組み合わせて（１：１）、スキムミルク発酵に使用した。Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓならびにｓｈｓｐ遺伝子を含むプラスミドを含まないＳ４およびＥＲ１の同系誘導体を、コントロールとして用いた。
プラスミドをコード化したＳｈｓｐ遺伝子を保有するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株は、熱耐性および耐酸性が有意に増大した。入手可能な２つのｓｈｓｐ陽性Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓ４およびＥＲ１がヨーグルト生成に適するか否かを証明するために、各々の株をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）９２０６３およびＨＭと組み合わせて（１：１）、スキムミルク発酵に使用した。Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓならびにｓｈｓｐ遺伝子を含むプラスミドを含まないＳ４およびＥＲ１の同系誘導体を、コントロールとして用いた。
（乳発酵中の酸性化）
組み合わせ株であるＳ４／Ｌｂ９２０６３は、４２℃および５０℃での発酵において、有意な前共生（ｐｒｏｔｏｓｙｍｂｉｏｔｉｃ）効果を示した。４２℃では、ｐＨは、７時間後にｐＨ４．０より低い値に落ち、そして２４時間後にｐＨ３．６に低下した。５０℃では、ｐＨ値は、８〜１０時間後に４．３であり、そして２４時間後に４．１であった（図６Ａ）。Ｓ４−１とＬＢ ９２０６３の組み合わせ株は、４２℃で有意な前共生効果を示したが、５０℃では酸性化は全く認められなかった（図６Ｂ）。
組み合わせ株であるＳ４／Ｌｂ９２０６３は、４２℃および５０℃での発酵において、有意な前共生（ｐｒｏｔｏｓｙｍｂｉｏｔｉｃ）効果を示した。４２℃では、ｐＨは、７時間後にｐＨ４．０より低い値に落ち、そして２４時間後にｐＨ３．６に低下した。５０℃では、ｐＨ値は、８〜１０時間後に４．３であり、そして２４時間後に４．１であった（図６Ａ）。Ｓ４−１とＬＢ ９２０６３の組み合わせ株は、４２℃で有意な前共生効果を示したが、５０℃では酸性化は全く認められなかった（図６Ｂ）。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＥＲ１およびＬｂ ９２０６３の組み合わせ株を用いて、同様の結果が得られた。しかしながら、酸性化活性は、わずかにより低かった。４２℃でのコントロール発酵（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＥＲ１−２およびＬｂ ９２０６３）は、この温度での試験発酵と非常に類似しており、５０℃での酸性化は不十分であった。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４をＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＨＭと組み合わせて、組み合わせＳ４／Ｌｂ ９２０６３と類似の結果を得た（図６Ｃ）。
（乳発酵および続く保存中の細胞数）
各株について、約２×１０６ｃｆｕ／ｍｌの細胞数で開始し、混合培養物Ｓ４／Ｌｂ９２０６３を用いた５０℃での発酵中に、細胞数が、１０９ｃｆｕ／ｍｌ（Ｓ４）および６×１０８ｃｆｕ／ｍｌ（Ｌｂ）まで増大した。単一株発酵において、株Ｓ４は、約５×１０８ｃｆｕ／ｍｌの細胞数まで増殖し、一方、プラスミドの無いｓｈｓｐ陰性株Ｓ４−１およびＬｂ ９２０６３は、約８×１０６の最終細胞密度まで、緩徐にしか増殖しなかった。２４時間発酵の後、発酵させたミルクを、４℃で１５日間保存した。単一株の細胞数および総細胞数を、３日毎に決定した。保存期間の終わりに、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびＬｂ ９２０６３について、細胞数のわずかな減少しか認められなかった。Ｌｂ ９２０６３の高い生存度は、特に意外であった。なぜなら、この株は、５０℃での単一株培養において増殖させた場合、１２日間の保存後にもはや検出不可能であったためである（図７）。熱耐性Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとの混合培養において５０℃で増殖させたＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの生存度に対するポジティブな効果についての理由は、今なお不明である。
各株について、約２×１０６ｃｆｕ／ｍｌの細胞数で開始し、混合培養物Ｓ４／Ｌｂ９２０６３を用いた５０℃での発酵中に、細胞数が、１０９ｃｆｕ／ｍｌ（Ｓ４）および６×１０８ｃｆｕ／ｍｌ（Ｌｂ）まで増大した。単一株発酵において、株Ｓ４は、約５×１０８ｃｆｕ／ｍｌの細胞数まで増殖し、一方、プラスミドの無いｓｈｓｐ陰性株Ｓ４−１およびＬｂ ９２０６３は、約８×１０６の最終細胞密度まで、緩徐にしか増殖しなかった。２４時間発酵の後、発酵させたミルクを、４℃で１５日間保存した。単一株の細胞数および総細胞数を、３日毎に決定した。保存期間の終わりに、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびＬｂ ９２０６３について、細胞数のわずかな減少しか認められなかった。Ｌｂ ９２０６３の高い生存度は、特に意外であった。なぜなら、この株は、５０℃での単一株培養において増殖させた場合、１２日間の保存後にもはや検出不可能であったためである（図７）。熱耐性Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとの混合培養において５０℃で増殖させたＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの生存度に対するポジティブな効果についての理由は、今なお不明である。
（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ４およびＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ９２０６３の混合株培養を用いた４２℃および５０℃でのヨーグルトの生成）
低温殺菌ミルク（３．５％脂肪）に、Ｓ４およびＬｂ ９２０６３の混合培養物を播種し、４２℃および５０℃で１２時間インキュベートした。発酵の終わりに、ヨーグルト生成物を、舌触り、ｐＨ、細胞数、食味および香りについて試験した。これらのヨーグルト生成物を、続いて４℃で２週間保存し、そして３日毎に上記のように試験した。４２℃で生成したヨーグルトは、わずかな乳清分離を伴ったしっかりと固い舌触り、３．６〜３．５のｐＨ値および各々の株について約１０９ｃｆａ／ｍｌの細胞数を有した。このヨーグルトは、非常に酸っぱい味がし、そして酸っぱい香りを有した。５０℃で生成したヨーグルトもまた、乳清分離を伴わないしっかりと固い舌触りを示し、ｐＨ値は、発酵後は約４．３であり、保存期間の終わりには４．０であった（表２）。細胞数は、４２℃発酵に匹敵し、保存中にわずかに減少したのみであった。このヨーグルトは、よく発酵した「Ｊｏｇｈｕｒｔ−Ｍｉｌｄ」に匹敵するマイルドな味がし、そして芳醇な香りを有した。熱耐性Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを適切に組み合わせた５０℃での発酵により、「Ｊｏｇｈｕｒｔ−Ｍｉｌｄ」の特性を有するヨーグルトになったが、古典的なヨーグルトの本来のミクロフローラを有し、そして生成物の少なくとも貯蔵寿命（ｓｈｅｌｆ ｌｉｖｅ）の保存後さえも、高い細胞密度を有した。
低温殺菌ミルク（３．５％脂肪）に、Ｓ４およびＬｂ ９２０６３の混合培養物を播種し、４２℃および５０℃で１２時間インキュベートした。発酵の終わりに、ヨーグルト生成物を、舌触り、ｐＨ、細胞数、食味および香りについて試験した。これらのヨーグルト生成物を、続いて４℃で２週間保存し、そして３日毎に上記のように試験した。４２℃で生成したヨーグルトは、わずかな乳清分離を伴ったしっかりと固い舌触り、３．６〜３．５のｐＨ値および各々の株について約１０９ｃｆａ／ｍｌの細胞数を有した。このヨーグルトは、非常に酸っぱい味がし、そして酸っぱい香りを有した。５０℃で生成したヨーグルトもまた、乳清分離を伴わないしっかりと固い舌触りを示し、ｐＨ値は、発酵後は約４．３であり、保存期間の終わりには４．０であった（表２）。細胞数は、４２℃発酵に匹敵し、保存中にわずかに減少したのみであった。このヨーグルトは、よく発酵した「Ｊｏｇｈｕｒｔ−Ｍｉｌｄ」に匹敵するマイルドな味がし、そして芳醇な香りを有した。熱耐性Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを適切に組み合わせた５０℃での発酵により、「Ｊｏｇｈｕｒｔ−Ｍｉｌｄ」の特性を有するヨーグルトになったが、古典的なヨーグルトの本来のミクロフローラを有し、そして生成物の少なくとも貯蔵寿命（ｓｈｅｌｆ ｌｉｖｅ）の保存後さえも、高い細胞密度を有した。
（バクテリオファージ感受性に対する発酵温度の影響）
ファージ感受性に対する発酵温度の影響を試験するために、ｓｈｐｓ−プラスミドｐＳｔ０４で形質転換されたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ８の酸性化活性を、約１０の感染多重度（Ｍ．ｏ．ｉ．）での毒性ファージ ｓ８の非存在下または存在下で、４２℃および４８℃で決定した。４２℃では酸性化は認められなかったが、４８℃では、約５．０の最終ｐＨが認められた（図８）。これは、この非現実的な高いファージ負荷でさえ、より高い発酵温度がファージ攻撃に対する保護効果を有することを示す。
ファージ感受性に対する発酵温度の影響を試験するために、ｓｈｐｓ−プラスミドｐＳｔ０４で形質転換されたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ８の酸性化活性を、約１０の感染多重度（Ｍ．ｏ．ｉ．）での毒性ファージ ｓ８の非存在下または存在下で、４２℃および４８℃で決定した。４２℃では酸性化は認められなかったが、４８℃では、約５．０の最終ｐＨが認められた（図８）。これは、この非現実的な高いファージ負荷でさえ、より高い発酵温度がファージ攻撃に対する保護効果を有することを示す。
（材料および方法）
（菌株、バクテリオファージおよび培地）
本研究に使用した株を、表１に記載する。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを、１％ラクトースを補充したＴＭ１７培地（Ｋｒｕｓｃｈら、１９８７）中で増殖させ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを、ＭＲＳ培地（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で増殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉを、Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）中で３７℃で増殖させた。適切な場合、抗体を以下のように添加した：Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓに対して各々３μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌエリスロマイシン、およびＥ．ｃｏｌｉに対して１００μｇ／ｍｌエリスロマイシン。ブルーホワイト選択（Ｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるように行った。酸性化を、９％スキムミルク培地中で決定し、ｐＨを、８−チャネル ｐＨメーター（Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒｂｕｒｏ Ｍｅｓｓｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ、Ｃｈｅｍｎｉｔｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によってモニターした。バクテリオファージ ｓ８を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるように増殖させ、約１０の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）で発酵アッセイに添加した。
（菌株、バクテリオファージおよび培地）
本研究に使用した株を、表１に記載する。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを、１％ラクトースを補充したＴＭ１７培地（Ｋｒｕｓｃｈら、１９８７）中で増殖させ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを、ＭＲＳ培地（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で増殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉを、Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）中で３７℃で増殖させた。適切な場合、抗体を以下のように添加した：Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓに対して各々３μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌエリスロマイシン、およびＥ．ｃｏｌｉに対して１００μｇ／ｍｌエリスロマイシン。ブルーホワイト選択（Ｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるように行った。酸性化を、９％スキムミルク培地中で決定し、ｐＨを、８−チャネル ｐＨメーター（Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒｂｕｒｏ Ｍｅｓｓｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ、Ｃｈｅｍｎｉｔｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によってモニターした。バクテリオファージ ｓ８を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるように増殖させ、約１０の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）で発酵アッセイに添加した。
（ＤＮＡの単離および操作）
プラスミドＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＥ．ｃｏｌｉから単離し、そしてこの方法を適宜に適応させることによって、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓから単離した。酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、Ｍａｓｓから購入し、メーカーの使用説明書に従って使用した。
プラスミドＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＥ．ｃｏｌｉから単離し、そしてこの方法を適宜に適応させることによって、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓから単離した。酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、Ｍａｓｓから購入し、メーカーの使用説明書に従って使用した。
（形質転換）
Ｅ．ｃｏｌｉを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆによって推奨される手順によって電気形質転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ）し、Ｌ．ｌａｃｔｉｓを、ＨｏｌｏおよびＮｅｓ（１９８９）によって記載されるように電気形質転換し、そしてＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを、Ｍｏｈａｍｅｄ（ＰｈＤ−ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖ．Ｋｉｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００２）に従って、電気形質転換した。
Ｅ．ｃｏｌｉを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆによって推奨される手順によって電気形質転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ）し、Ｌ．ｌａｃｔｉｓを、ＨｏｌｏおよびＮｅｓ（１９８９）によって記載されるように電気形質転換し、そしてＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを、Ｍｏｈａｍｅｄ（ＰｈＤ−ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖ．Ｋｉｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００２）に従って、電気形質転換した。
（プラスミドｐ９９−１７−２およびプラスミドｐ００−８−１の構築）
プラスミドｐＳｔ０４を、ＨｉｎＰ１Ｉを用いた消化によって直線化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｓ ＩＩ ＳＫ＋（ＣｌａＩ）中にクローン化した。続いて、組換えプラスミドｐ９９−１６−５を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ部位へのエリスロマイシン耐性遺伝子カセットの挿入によって、遺伝学的にマークした。小さいＥｃｏＲＩフラグメントが除去された結果、完全なｓｈｓｐ遺伝子が欠如したｐ００−８−１が生じた。組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−ｂｌｕｅ中で増殖させ、エレクトロポレーションによってＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｉｌｕｓ中に移入させた。
プラスミドｐＳｔ０４を、ＨｉｎＰ１Ｉを用いた消化によって直線化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｓ ＩＩ ＳＫ＋（ＣｌａＩ）中にクローン化した。続いて、組換えプラスミドｐ９９−１６−５を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ部位へのエリスロマイシン耐性遺伝子カセットの挿入によって、遺伝学的にマークした。小さいＥｃｏＲＩフラグメントが除去された結果、完全なｓｈｓｐ遺伝子が欠如したｐ００−８−１が生じた。組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−ｂｌｕｅ中で増殖させ、エレクトロポレーションによってＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｉｌｕｓ中に移入させた。
（プラスミド除去（ｐｌａｓｍｉｄ ｃｕｒｉｎｇ））
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株は、本質的にＧａｓｓｏｎ（１９８３）に記載されるように、プロトプラスト誘導性除去によって、そのプラスミドを除去した。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株は、本質的にＧａｓｓｏｎ（１９８３）に記載されるように、プロトプラスト誘導性除去によって、そのプラスミドを除去した。
（参考文献）
記載された本発明の方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、請求された本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことが、理解されるべきである。実際に、食品発酵または関連分野の当業者に明らかである本発明を実行するために記載されたモードの種々の改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
（表１：菌株およびバクテリオファージ）
Claims (47)
- 乳製品を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
乳と、低分子熱ショックタンパク質を発現し得る乳酸菌とを合わせる工程、および該乳／細菌混合物を、通常の醗酵温度より高い温度でかつ／または通常の醗酵塩濃度より高い塩濃度で培養する工程であって、ここで該乳製品は、低分子熱ショックタンパク質を発現しない対応する乳酸菌を用いて製造した乳製品と比較した場合、より口当たりが柔らかい特性を有する、方法。 - 請求項１に記載の乳製品を調製する方法であって、前記より口当たりが柔らかい特性の製品は、前記低分子熱ショックタンパク質を発現しない対応する細菌を用いて製造した乳製品のｐＨ値と比較した場合、より高いｐＨ値を有する、方法。
- 請求項１または２に記載の方法であって、前記製品のｐＨは、４．０より高い、方法。
- 請求項１、２または３に記載の方法であって、前記細菌は、中温性乳酸菌および／または好熱性乳酸菌を含む、方法。
- 請求項４に記載の方法であって、該方法は、乳と、第１および第２の乳酸菌とを合わせる工程であって、ここで該第１および／または第２の乳酸菌の各々は、低分子熱ショックタンパク質を発現し得る、工程、ならびに該乳／細菌混合物を指定のように培養する工程を包含する、方法。
- 請求項５に記載の方法であって、前記第１の乳酸菌および前記第２の乳酸菌の各々は、中温性細菌を含む、方法。
- 請求項６に記載の方法であって、前記乳は、第２の中温性乳酸菌を添加する前に、第１の中温性乳酸菌を含むスターター培養物と合わせられる、方法。
- 請求項５に記載の方法であって、前記第１の乳酸菌および前記第２の乳酸菌の各々は、好熱性細菌を含む、方法。
- 請求項８に記載の方法であって、前記乳は、第２の好熱性乳酸菌を添加する前に、第１の好熱性乳酸菌を含むスターター培養物と合わせられる、方法。
- 請求項５に記載の方法であって、前記第１の乳酸菌は、中温性乳酸菌を含み、前記第２の乳酸菌は、好熱性乳酸菌を含む、方法。
- 請求項１０に記載の方法であって、前記乳は、好熱性乳酸菌を添加する前に、中温性乳酸菌を含むスターター培養物と合わせられる、方法。
- 請求項１１に記載の方法であって、前記乳は、中温性乳酸菌を添加する前に、好熱性乳酸菌を含むスターター培養物と合わせられる、方法。
- 請求項７または９のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の乳酸菌および前記第２の乳酸菌を含む前記スターター培養物は、同時に前記乳に添加される、方法。
- 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、前記スターター培養物および前記第２の培養物は、同時に添加される、方法。
- 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、前記中温性細菌は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、およびＬａｃｔａｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌａｃｔｉｓからなる群より独立して選択される、方法。
- 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、前記好熱性細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｒｕｅｃｋｉｉまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓからなる群より独立して選択される、方法。
- 請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の好熱性細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｒｕｅｃｋｉｉまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓであり、前記第２の好熱性細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである、方法。
- 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、前記中温性乳酸菌は、４３℃までで、乳を醗酵し得る、方法。
- 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記好熱性乳酸菌は、５５℃までで乳を醗酵し得る、方法。
- 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、前記低分子熱ショックタンパク質を発現しない対応する細菌とともに乳を培養するためのｐＨ範囲より低いｐＨ範囲で前記乳／細菌混合物を培養する工程を包含する、方法。
- 請求項２０に記載の方法であって、前記乳酸菌は、３．９〜４．５の間の範囲のｐＨで生存し続ける、方法。
- 請求項２０または２１に記載の方法であって、ｐＨ３．９において、前記培養物中の少なくとも１０６の前記乳酸菌は、１５日間４℃で保存された場合に、生存し続ける、方法。
- 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、前記乳酸菌は、組換え乳酸菌を含み、該組換え細菌は、対応する非改変細菌より高いレベルで、低分子熱ショックタンパク質を発現するように操作されている、方法。
- 低分子熱ショックタンパク質を発現しない対応する乳酸菌より高いレベルで、低分子熱ショックタンパク質を発現するように操作されている、組換え乳酸菌。
- 請求項２４に記載の組換え乳酸菌であって、前記細菌は、通常の醗酵温度および／または塩濃度より高い温度および／または塩濃度で、乳醗酵を行い得る、組換え乳酸菌。
- 請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、前記乳酸菌は、請求項２４または２５のいずれか１項に記載の組換え細菌である、方法。
- 請求項１〜２３または請求項２６のいずれか１項に記載の方法、あるいは請求項２４または２５に記載の組換え細菌であって、前記乳酸菌または前記組換え乳酸菌は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結された低分子熱ショックタンパク質をコードする核酸配列を含む、方法あるいは組換え細菌。
- 請求項１〜２７に記載の方法または組換え乳酸菌であって、前記低分子熱ショックタンパク質は、ｓｈｓｐ配列またはその一部、好ましくは、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のｓｈｓｐ配列またはその一部を含む、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜２８に記載の方法または組換え乳酸菌であって、前記低分子熱ショックタンパク質は、１８〜１６ｋＤａの範囲の分子量を有する、ｐＳｔ０４またはｐＥＲｌ−１由来である、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜２９に記載の方法または組換え乳酸菌であって、前記低分子熱ショックタンパク質は、配列番号１または配列番号２として提示されるアミノ酸配列またはその改変体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体を含む、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜３０に記載の方法または組換え乳酸菌であって、前記核酸配列は、配列番号３または配列番号４として提示される配列、またはその改変体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体を含む、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法または組換え乳酸菌であって、低分子熱ショックタンパク質をコードする染色体外核酸、好ましくは、低分子熱ショックタンパク質をコードするエピソーム核酸を含む、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法または組換え乳酸菌であって、ベクター中、好ましくは、プラスミドベクター中に、低分子熱ショックタンパク質をコードする核酸を含む、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法または組換え乳酸菌であって、前記乳は、部分脱脂乳または脱脂乳またはダイズもしくはコメ由来の乳、または合成乳を含む、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法または組換え乳酸菌であって、前記乳は、反芻動物、好ましくは、水牛、ウシ、ヒツジ、ラマ、ヤギまたはラクダからなる群より選択される反芻動物から得られる、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法または組換え乳酸菌であって、前記乳は、高濃度のＮａＣｌを含む、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法または組換え乳酸菌であって、前記乳酸菌または組換え乳酸菌は、高温の醗酵温度において、バクテリオファージの攻撃に対する減少した感受性を示す、方法または組換え乳酸菌。
- 請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法または組換え乳酸菌であって、前記乳製品は、前記方法または前記低分子熱ショックタンパク質を発現しない対応する組換え乳酸菌によって製造されたヨーグルトと比較した場合、口当たりが柔らかい特性のヨーグルトである、方法または組換え乳酸菌。
- 乳製品を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
乳と、低分子熱ショックタンパク質を発現し得る乳酸菌とを合わせる工程、および該乳／細菌混合物を、通常の醗酵温度より高い温度でかつ／または通常の醗酵塩濃度より高い塩濃度で培養する工程を包含し、ここで該乳製品は、酸カードチーズ、硬質チーズ、モツァレラ様半硬質チーズ、フレッシュチーズ、クワルク、バターミルク、スイスタイプチーズまたはカッテージチーズからなる群より選択される、方法。 - 請求項１〜２３、または２６〜３９に記載の方法によって調製される、乳製品。
- 請求項２６〜３９のいずれかに記載の組換え乳酸菌と、乳または乳製品を含む組成物。
- 請求項３１に記載の低分子熱ショックタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
- 請求項４２に記載のヌクレオチド配列を含む、構築物。
- 請求項４３に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
- 請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を組み込んでいる、宿主細胞。
- 請求項４５に記載の宿主細胞であって、前記ヌクレオチド配列は、発現され得る、宿主細胞。
- 本明細書中に本質的に記載される低分子熱ショックタンパク質を発現する乳酸菌によって、乳を醗酵する方法。
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