BR112020003887A2

BR112020003887A2 - célula de streptococcus thermophilus (st) para fabricação de, por exemplo, queijo mozzarella

Info

Publication number: BR112020003887A2
Application number: BR112020003887-3A
Authority: BR
Inventors: Thomas Janzen; Ditte Ellegaard Christiansen
Original assignee: Chr. Hansen A/S
Priority date: 2017-08-28
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2020-09-01
Also published as: WO2019042881A1; US20200375207A1; US11690384B2; CN111433347A; AR112877A1; EP3676368A1; CN111433347B

Abstract

  A presente invenção refere-se a cepas de Streptococcus thermophilus (ST) que são, por exemplo, adequadas para serem usadas em um método aperfeiçoado para a fabricação de queijo mozzarella de baixo escurecimento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CÉLULA DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS (ST) PARA FABRICAÇÃO DE, POR EXEMPLO, QUEIJO MUSSARELA”.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a cepas de Streptococcus thermophilus (ST) depositadas que são, por exemplo, adequadas para serem usadas em um método aperfeiçoado para a fabricação de queijo Mussarela de baixo escurecimento.

TÉCNICA ANTERIOR

[0002] A indústria alimentícia usa várias bactérias, em particular bactérias lácticas, a fim de melhorar, por exemplo, o gosto e a textura de alimentos. No caso da indústria láctea, bactérias do ácido láctico são usadas intensivamente a fim de causar a acidificação de leite (através de fermentação), mas também a fim de, por exemplo, texturizar o pro- duto ao qual elas são incorporadas.

[0003] Composição/mistura de cultura de partida para fazer queijo Mussarela geralmente compreende a bactéria do ácido láctico (LAB) Streptococcus thermophilus (ST) – ela pode também compreender al- gumas vezes, por exemplo, cepas de Lactobacillus relevantes.

[0004] Uma concentração relativamente alta de galactose pode re- sultar em “escurecimento” durante aquecimento dos queijos como é ge- ralmente descrito quando, por exemplo, queijo Mussarela é produzido por S. thermophilus (ST) para, por exemplo, produção de pizza. O fenô- meno de escurecimento é acreditado ser devido à reação Maillard onde galactose como açúcar de redução está reagindo com aminoáci- dos/peptídeos. Além desse grande problema durante produção de queijo para pizza, quantidades excessivas de galactose livre também podem levar a problemas de pós-acidificação e desequilíbrio na flora de outro produto lácteo tais como, por exemplo, queijos macios.

[0005] O artigo de Mukherjee e outros (1994, J. Dairy Sci. 77:2839-

2849) descreve o uso dos chamados Streptococcus de não liberação de galactose como culturas de partida na fabricação de queijo Mussarela de baixo escurecimento.

[0006] O artigo de Hassan e outros (International Journal of Food Microbiology 64 (2001) 199-203) descreve que a habilidade de algumas cepas de S. thermophilus (ST) em usar galactose em produção de cáp- sulas poderia reduzir o escurecimento de queijo Mussarela durante o cozimento através da remoção de açúcar de redução.

[0007] O WO20111/026863A1 (Chr. Hansen) e o WO2011/092300A1 (Chr. Hansen) descrevem que cepas de S. ther- mophilus (ST) com mutações no gene GalK (galactocinase) geram uma viscosidade maior em leite fermentado. Nenhuma dessas duas publica- ções WO descreve o escurecimento discutido acima de problema rela- cionado a queijo Mussarela.

[0008] O WO2013/160413A1 (Chr. Hansen) descreve a cepa CHCC14994 de Streptococcus thermophilus (ST) aqui discutida, que foi depositada em 3 de abril de 2012 sob o No. de acesso DSM 25838. A cepa CHCC14994 é descrita como uma chamada “cepa-mãe” ade- quada para ser usada como uma cepa de partida para ser mutada a fim de obter cepas mutadas novas com “mutação na sequência de DNA do gene glcK”. Consequentemente, a cepa CHCC14994/DSM25838 não é revelada estar presente/compreendida em uma composição de cultura de partida nem ser usada na fabricação de um alimento ou produto ali- mentício de interesse (por exemplo, um produto lácteo).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] O problema a ser resolvido pela presente invenção é prover novas cepas de Streptococcus thermophilus (ST) depositadas que, por exemplo, sejam adequadas para serem usadas em um método aperfei- çoado para a fabricação de queijo Mussarela de baixo escurecimento.

[0010] A solução se refere às novas cepas de Streptococcus ther- mophilus (ST) depositadas.

[0011] Como mostrado em exemplos de trabalho aqui – as cepas de ST depositadas discutidas aqui são capazes de reduzir extraordina- riamente a liberação de galactose também na presença de quantidades elevadas de lactose (como em leite).

[0012] Como discutido acima, a técnica anterior descreve o uso de chamados Streptococcus de não liberação de galactose como culturas de partida na fabricação de queijo Mussarela de baixo escurecimento. Portanto, uma vez que as cepas aqui depositadas são capazes de pro- ver uma redução extraordinária da liberação de galactose elas podem ser, por exemplo, usadas em um método aperfeiçoado para a fabricação de queijo Mussarela de baixo escurecimento. Como compreendido pelo versado na técnica no presente contexto – as cepas aqui depositadas podem ser também usadas para fabricação de outro produto alimentício à base de leite (por exemplo, à base de leite de vaca), tais como, por exemplo, queijos macios ou cheddar.

[0013] As cepas aqui depositadas são mutantes de cepas paren- tais/mãe relevantes feitas no laboratório dos presentes inventores – isto é, elas são cepas novas não “naturais” compreendendo mutações no- vas não descritas antes em suas respectivas sequências de DNA rele- vantes.

[0014] Em suma, as cepas mutantes ora depositadas foram obtidas após várias rodadas de mutagênese/seleção onde, por exemplo, as se- leções foram realizadas através de novas combinações de critérios de seleção relevantes – dito em outras palavras, as cepas depositadas não foram obtidas através do que foi chamado trabalho de mutagênese/se- leção de rotina na técnica anterior padrão (vide, por exemplo, o presente exemplo de trabalho).

[0015] Como pode ser visto na Tabela 1 do Exemplo 1, através do uso do método especial descrito neste Exemplo para isolamento de mu- tantes de hiperfermentação de galactose a partir de S. thermophilus foi possível obter bactérias de ST capazes de reduzir em torno de 50% (vide, por exemplo, CHCC27912 e CHCC29526) as quantidades de ga- lactose excretada em leite comparado com as bactérias ST CHCC4323 de referência.

[0016] Bactérias ST capazes de reduzir em pelo menos 20% as quantidades de galactose excretada em leite comparado com as bacté- rias ST CHCC4323 de referência podem ser aqui chamadas bactérias ST Gal(++).

[0017] Sem ser limitado à teoria – o Exemplo 1 que descrevia mé- todo especial para isolamento de mutantes de ST Gal(++) de hiperfer- mentação de galactose de S. thermophilus pode ser considerado espe- cial devido ao fato que o nível de redução de galactose é drasticamente aumentado comparado com uma cepa aqui chamada Gal(+). Como des- crito no Exemplo 1, o nível de redução de galactose para CHCC14993, um mutante Gal(+) de CHCC4323, é 17% enquanto o nível de redução de galactose de CHCC14994, um mutante Gal(++) de CHCC4323, é 30%, comparado com CHCC4323 do tipo selvagem. O nível de redução de galactose de CHCC29526, um mutante Gal(++) de CHCC4459, é até mesmo 52% comparado com a CHCC4323 de referência. Ao usar o mé- todo recém-desenvolvido, não descrito anteriormente, de subcultura em caldo M17-gal foi então possível isolar mutantes de hiperfermentação de galactose com uma habilidade de redução de galactose única.

[0018] Como discutido abaixo – em exemplos de trabalho as cepas da invenção ora depositadas foram comparadas com as chamadas ce- pas de referência que seguem: - cepa de ST CHCC4323: ela tem o que pode ser chamada uma se- quência do tipo selvagem natural de GalK (aqui chamada GalK(-)) e pode ser vista como uma cepa de referência de ST que corresponde a uma cepa de ST comercialmente relevante usada hoje para fabricação de queijo Mussarela; - cepa de ST 4323-2 (CHCC14993): ela compreende uma mutação no gene GalK (galactocinase) (aqui chamada Gal(+)) e pode ser vista como uma cepa de referência que corresponde a uma cepa feita de acordo com a descrição do WO2011/026863A1 (Chr. Hansen) e do WO2011/092300A1 (Chr. Hansen).

[0019] É acreditado que as cepas de referência discutidas acima podem ser vistas como cepas de referência que correspondem às cepas relevantes da técnica anterior descritas aqui (vide, por exemplo, discus- são da técnica anterior acima).

[0020] Como discutido abaixo – exemplos de trabalho aqui mostram que as cepas da invenção depositadas discutidas aqui são capazes de reduzir a liberação de galactose também na presença de quantidades elevadas de lactose (como em leite) para um grau que é extraordinaria- mente melhorado comparado com as cepas de referência discutidas acima.

[0021] Portanto, um primeiro aspecto da invenção se refere a uma célula de Streptococcus thermophilus (ST), em que a célula é pelo me- nos uma célula selecionada do grupo consistindo em: (a) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC19097 depositada com o número de registro DSM 32594; (b) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC19100 depositada com o número de registro DSM 32595; (c) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC27912 depositada com o número de registro DSM 32596; (d) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29526 depositada com o número de registro DSM 32597; (e) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29530 depositada com o número de registro DSM 32598;

(f) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29525 depositada com o número de registro DSM 32897; (g) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC30963 depositada com o número de registro DSM 32898; e (h) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC30964 depositada com o número de registro DSM 32900.

[0022] Está claro para o versado que ao usar as cepas depositadas discutidas aqui como material de partida, o versado pode rotineira- mente, através de técnicas de mutagênese ou reisolamento convencio- nais, obter mutantes adicionais ou derivados dos mesmos que retêm os elementos e vantagens relevantes descritos aqui. Portanto, o termo “um mutante do mesmo” ou “um mutante de uma cepa depositada” se refere a uma cepa mutante obtida usando a cepa depositada como material de partida.

[0023] Como acima discutido, o WO2013/160413A1 (Chr. Hansen) descreve a cepa de Streptococcus thermophilus (ST) CHCC14994 aqui discutida, que foi depositada em 3 de abril de 2012 sob o No. de acesso DSM 25838. A cepa CHCC14994/DSM25838 não é revelada estar pre- sente/compreendida em uma composição de cultura de partida nem ser usada na fabricação de um alimento ou produto alimentício de interesse (por exemplo, um produto lácteo).

[0024] Portanto, um segundo aspecto da invenção se refere a um método para obter uma cepa mutante de uma célula depositada do pri- meiro aspecto ou da célula de Streptococcus thermophilus CHCC14994 depositada com número de registro DSM 25838 compreendendo uso de pelo menos uma das cepas depositadas do primeiro aspecto ou DSM 25838 como cepa de partida, produção de mutantes da cepa depositada e isolamento de uma nova cepa mutante, em que a cepa mutante reteve a propriedade de ser capaz de reduzir a liberação de galactose na pre- sença de lactose da cepa depositada.

[0025] A propriedade da cepa mutante obtida em relação a “ser ca- paz de reduzir a liberação de galactose na presença de lactose” pode ser medida como descrito no exemplo de trabalho aqui – com base na presente descrição, isso é trabalho de rotina para o versado. É evidente que uma cepa mutante obtida de acordo com o método do segundo as- pecto pode ser usada para, por exemplo, um método de fabricação de um alimento ou produto alimentício como aqui discutido (por exemplo, um método do quarto aspecto como aqui discutido).

[0026] Um terceiro aspecto da invenção se refere a uma composi- ção de cultura de partida compreendendo pelo menos uma das células de Streptococcus thermophilus (ST) do primeiro aspecto ou a célula de Streptococcus thermophilus CHCC14994 depositada com número de registro DSM 25838, em que a composição de cultura de partida tem uma concentração de células viáveis do primeiro aspecto ou DSM 25838 que está na faixa de 104 a 1014 cfu por grama da composição.

[0027] Como compreendido, a composição do terceiro aspecto pode, por exemplo, compreender 108 cfu por grama de, por exemplo, apenas uma das cepas depositadas aqui descritas ou ela pode, por exemplo, compreender 108 cfu por grama de uma cepa depositada mais 108 cfu por grama de uma outra das cepas depositadas, o que daria uma composição com 2x108 cfu por grama de células viáveis do primeiro as- pecto. Ainda, a composição pode compreender outras células tais como, por exemplo, células de Lactobacillus e/ou Lactococcus.

[0028] Um quarto aspecto da invenção se refere a um método de fabricação de um alimento ou produto alimentício compreendendo adi- ção de uma composição de cultura de partida de acordo com o terceiro aspecto a um material de partida de alimento ou produto alimentício e manutenção do material de partida então inoculado sob condições onde as células de Streptococcus thermophilus (ST) são metabolicamente ati- vas.

[0029] Modalidade da presente invenção é descrita abaixo, a título de exemplo apenas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Cepas/células depositadas

[0030] Uma amostra de célula de Streptococcus thermophilus CHCC14994 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brauns- chweig) sob o número de acesso DSM 25838 com uma data de depósito de 3 de abril de 2012. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Mi- cro-organismos para os Propósitos de Procedimentos de Patente. Como acima discutido, essa cepa de deposito é descrita no WO2013/160413A1 (Chr. Hansen).

[0031] Uma amostra da nova célula de Streptococcus thermophilus CHCC19097 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brauns- chweig) sob o número de acesso DSM 32594 com uma data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi feito sob as condições do Tra- tado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Propósitos de Procedimentos de Patente.

[0032] Uma amostra da nova célula de Streptococcus thermophilus CHCC19100 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brauns- chweig) sob o número de acesso DSM 32595 com uma data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi feito sob as condições do Tra- tado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Propósitos de Procedimentos de Patente.

[0033] Uma amostra da nova célula de Streptococcus thermophilus CHCC27912 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro-

organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brauns- chweig) sob o número de acesso DSM 32596 com uma data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi feito sob as condições do Tra- tado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Propósitos de Procedimentos de Patente.

[0034] Uma amostra da nova célula de Streptococcus thermophilus CHCC29526 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brauns- chweig) sob o número de acesso DSM 32597 com uma data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi feito sob as condições do Tra- tado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Propósitos de Procedimentos de Patente.

[0035] Uma amostra da nova célula de Streptococcus thermophilus CHCC29530 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brauns- chweig) sob o número de acesso DSM 32598 com uma data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi feito sob as condições do Tra- tado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Propósitos de Procedimentos de Patente.

[0036] Uma amostra da nova célula de Streptococcus thermophilus CHCC29525 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brauns- chweig) sob o número de acesso DSM 32897 com uma data de depósito de 16 de agosto de 2018. O depósito foi feito sob as condições do Tra- tado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Propósitos de Procedimentos de Patente.

[0037] Uma amostra da nova célula de Streptococcus thermophilus CHCC30963 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brauns- chweig) sob o número de acesso DSM 32898 com uma data de depósito de 16 de agosto de 2018. O depósito foi feito sob as condições do Tra- tado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Propósitos de Procedimentos de Patente.

[0038] Uma amostra da nova célula de Streptococcus thermophilus CHCC30964 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brauns- chweig) sob o número de acesso DSM 32900 com uma data de depósito de 16 de agosto de 2018. O depósito foi feito sob as condições do Tra- tado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Propósitos de Procedimentos de Patente. Uma cultura de partida compreendendo uma célula de ST como descrito aqui

[0039] A célula de ST como descrito aqui é útil como uma cultura de partida na produção de alimento ou produtos alimentícios.

[0040] Tipicamente, tal composição de cultura de partida compre- ende as bactérias em uma forma concentrada incluindo concentrados congelados, secos ou secos por congelamento tendo tipicamente uma concentração de células viáveis que está na faixa de 104 a 1014 cfu (uni- dades de formação de colônia) por grama de composição incluindo pelo menos 104 cfu por grama da composição, tal como pelo menos 105 cfu/g, por exemplo, pelo menos 106 cfu/g, tal como pelo menos 107 cfu/g, por exemplo, pelo menos 108 cfu/g, tal como pelo menos 109 cfu/g, por exemplo, pelo menos 1010 cfu/g, tal como pelo menos 1011 cfu/g.

[0041] A composição pode conter como componentes adicionais crioprotetores e/ou aditivos convencionais incluindo nutrientes tais como extrato de levedura, açúcares e/ou vitaminas.

[0042] Como é normal na produção de processos de fermentação bacteriana do ácido láctico para aplicar culturas mistas de bactérias do ácido láctico, a composição em certas modalidades compreenderá um grande número de cepas ou pertencentes à mesma espécie ou perten- centes a espécies diferentes. Por exemplo, pode ser preferido que a composição também compreenda outras células tais como, por exem- plo, células de Lactobacillus e/ou Lactococcus. Método de fabricação de um alimento ou produto alimentício

[0043] Como dito acima, um aspecto da invenção se refere a um método de fabricação de um alimento ou produto alimentício compreen- dendo adição de uma composição de cultura de partida como descrito aqui a um material de partida de alimento ou produto alimentício e ma- nutenção do material de partida então inoculado sob condições onde as células de ST são metabolicamente ativas.

[0044] Materiais de partida para produto alimentício úteis incluem qualquer material que seja convencionalmente submetido a uma etapa de fermentação bacteriana do ácido láctico tais como leite (por exemplo, leite de soja ou leite de vaca, preferivelmente leite de vaca), materiais vegetais, produtos de carne, sucos de fruta, vinho doce, massas duras e massas moles.

[0045] Os produtos fermentados, que são obtidos através do mé- todo, incluem como exemplos típicos produtos lácteos tais como leite fermentado, iogurte, queijo incluindo produtos de queijo fresco, produtos de queijo macio, cheddar, Mussarela ou soro de leite coalhado.

[0046] Em uma modalidade preferida, o produto lácteo é queijo ma- cio, queijo cheddar, queijo pasta filata ou queijo Mussarela – mais pre- ferivelmente, o produto lácteo é queijo pasta filata, queijo cheddar ou queijo Mussarela – sobretudo preferivelmente, o produto lácteo é queijo Mussarela ou queijo cheddar (preferivelmente usado para fazer pizza).

[0047] Em modalidades adicionais, o material de substrato é um material de partida para uma ração animal tal como silagem, por exem- plo, gramínea, material de cereal, ervilhas, alfafa ou folha de beterraba- açucareira, onde culturas bacterianas são inoculadas na safra de ração para serem ensiladas a fim de obter uma conservação das mesmas, ou em produtos de refugo de animal ricos em proteínas tais como miúdos de abate e miúdos de peixe, também com os objetivos de conservação deste miúdo para propósitos de alimentação animal.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: cepas de Streptococcus thermophilus (ST) depositadas – capazes de reduzir extraordinariamente a liberação de galactose também na presença de quantidades elevadas de lactose (como no leite) Cepas de referência: - cepa de ST CHCC4323: ela era o que pode ser chamado uma se- quência do tipo selvagem natural de GalK (aqui chamada GalK(-)) e pode ser vista como uma cepa de referência de ST que corresponde a uma cepa de ST comercialmente relevante usada hoje para fabricação de queijo Mussarela; - cepa de ST 4323-2 (CHCC14993): ela compreende uma mutação no gene GalK (galactocinase) (aqui chamado Gal(+)) e pode ser vista como uma cepa de referência que corresponde a uma cepa feita de acordo com a descrição do WO2011/026863A1 (Chr. Hansen) e WO2011/092300A1 (Chr. Hansen) discutidos acima. Cepas depositadas da presente invenção:

[0048] CHCC14994: cepa de ST DSM 25838 – revelada no WO2013/160413A1 (Chr. Hansen).

[0049] CHCC19097: Cepa de ST DSM 32594 nova como descrito aqui.

[0050] CHCC19100: Cepa de ST DSM 32595 nova como descrito aqui.

[0051] CHCC27912: Cepa de ST DSM 32596 nova como descrito aqui.

[0052] CHCC29526: Cepa de ST DSM 32597 nova como descrito aqui.

[0053] CHCC29530: Cepa de ST DSM 32598 nova como descrito aqui. Isolamento de mutantes de hiperfermentação de galactose de S. ther- mophilus:

[0054] Antes do isolamento do mutante as cepas foram empilhadas em placas de ágar M17 com galactose 2% (placas M17-gal). As cepas do tipo selvagem (tipo selvagem) não cresceram significantemente em galactose como fonte de carboidrato única. Culturas de um dia para o outro foram então plaqueadas em placas M17-gal e várias colônias pu- deram ser isoladas após dois dias de crescimento a 37ºC. Vários mu- tantes foram purificados em placas M17-gal e retestados em caldo M17 contendo galactose 2% como carboidrato único. A partir de mutantes positivos para galactose purificados, mutantes de hiperfermentação de galactose de segunda geração foram isolados através de subcultura em caldo M17-gal com reinoculação diária de 1% a partir da cultura de um dia para o outro totalmente crescida; incubação ocorreu a 37ºC. Após plaqueamento de diluição, 100 colônias simples foram isoladas de pla- cas M17-gal e inoculadas em placas de microtitulação com caldo M17- gal. O OD foi seguido por uma leitora de OD e os clones mostrando um aumento melhor de OD durante 16 horas de incubação a 37ºC como a cepa tipo selvagem foram purificados mais e caracterizados.

[0055] As cepas de S. thermophilus tipo selvagem das quais mutan- tes de hiperfermentação de galactose foram isolados são: CHCC9861 CHCC4459 CHCC4426 CHCC4323 CHCC7018 CHCC3050

[0056] Os mutantes de hiperfermentação de galactose mostrando uma habilidade de fermentação de galactose incomumente alta e excre- ção de galactose reduzida no meio são (mutante/tipo selvagem): CHCC27912 / CHCC9861 CHCC29526 / CHCC4459 CHCC29530 / CHCC4426 CHCC14994 / CHCC4323 CHCC19100 / CHCC7018 CHCC19097 / CHCC3050

[0057] O exemplo inclui também uma cepa positiva para galactose típica, isolada como mutante de primeira geração de CHCC4323, cha- mada CHCC14993. CHCC14993 mostrou uma redução de galactose tí- pica em leite de 17% (redução de excreção de galactose em leite com- parado com CHCC4323 tipo selvagem). Fermentação de leite

[0058] Cepas mutantes foram inoculadas em leite 1% de culturas de um dia para o outro e incubadas por 24 horas a 37ºC. A atividade de acidificação de mutantes era similar para a cepa tipo selvagem. No final da fermentação, as amostras foram pegas para medir o teor de galac- tose no leite fermentado e com isso a redução de galactose excretada comparada com a cepa de referência negativa para galactose CHCC4324 e cepa de referência 4323-2 (CHCC14993). Resultados – análise de acidificação e galactose excretada no leite fer- mentado

[0059] Todas as cepas de ST testadas tinham perfis de acidificação similares – isto é, as cepas de ST depositadas da presente invenção não tinham perdido sua capacidade de acidificar rápido em leite.

[0060] As quantidades de galactose excretada para as cepas testa- das diferentes são mostradas na Tabela 1 abaixo: a Tabela 1 indica a quantidade de galactose em leite e a redução de galactose comparado com a referência CHCC4323. Enquanto mutante gal+ típico CHCC14993 mostrou uma redução de galactose de menos de 20%, as mutantes de hiperfermentação mostraram uma redução muito maior de até 52%, significando que a quantidade de galactose li- vre é muito menor quando, por exemplo, queijo de pizza é produzido com os mutantes novos, o que está levando a escurecimento reduzido durante cozimento. Cepa Galactose Redução de Galactose (%) CHCC4323 7,1 0 CHCC14993 5,9 17 CHCC27912 3,4 52 CHCC29526 3,4 52 CHCC29530 4,9 31 CHCC14994 5,0 30 CHCC19100 4,1 42 CHCC19097 5,1 28 Tabela 1. Média de duas medições para análise de carboidrato. Os re- sultados são mostrados em mg/g. Conclusões

[0061] Os resultados demonstraram que as cepas ora depositadas da presente invenção são capazes de reduzir a liberação de galactose também na presença de quantidades elevadas de lactose (como em leite) para um grau que é extraordinariamente melhorado comparado com as cepas de referência discutidas acima. Exemplo 2: cepas de Streptococcus thermophilus (ST) depositadas – capazes de reduzir extraordinariamente a liberação de galactose tam- bém na presença de quantidades elevadas de lactose (como em leite) Cepas de referência:

[0062] As mesmas que o Exemplo 1 acima.

Cepas depositadas da presente invenção:

[0063] CHCC29525: cepa DSM 32897 nova como aqui descrito.

[0064] CHCC30963: cepa DSM 32898 nova como aqui descrito.

[0065] CHCC30964: cepa DSM 32900 nova como aqui descrito. Isolamento de mutantes de hiperfermentação de galactose a partir de S. thermophilus:

[0066] Antes do isolamento de mutante, as cepas foram riscadas em placas de ágar M17 com 2% de galactose (placas M17-gal). As ce- pas do tipo selvagem não cresceram significantes em galactose como a fonte de carboidrato única. Culturas de um dia para o outro foram então plaqueadas em placas M17-gal e várias colônias puderam ser isoladas após dois dias de crescimento a 37ºC. Vários mutantes foram purifica- dos em placas M17-gal e retestados em caldo M17 contendo 2% de galactose como carboidrato único. A partir de mutantes positivos para galactose purificados, mutantes de hiperfermentação de galactose de segunda geração foram isolados através de subcultura em caldo M17- gal com reinoculação diária de 1% a partir da cultura que tinha cresci- mento totalmente de um dia para o outro; a incubação ocorreu a 37ºC. Após plaqueamento de diluição, 100 colônias simples foram isoladas de placas M17-gal e inoculadas em placas de microtitulação com caldo M17-gal. O OD foi seguido por uma leitora de OD e os clones mostrando um aumento de OD melhor durante 16 horas de incubação a 37ºC como a cepa tipo selvagem foram purificados e caracterizados adicional- mente.

[0067] As cepas de S. thermophilus tipo selvagem a partir das quais mutantes de hiperfermentação de galactose foram isolados são: CHCC4458 CHCC4459

[0068] Os mutantes de hiperfermentação de galactose mostrando uma habilidade de fermentação de galactose incomumente alta e excre- ção de galactose reduzida no meio são (mutante/tipo selvagem): CHCC30963 / CHCC4458 CHCC30964 / CHCC4458 CHCC29525 / CHCC4459

[0069] Os exemplos incluem também uma cepa positiva para galac- tose tópica, isolada como mutante de primeira geração a partir de CHCC4323, chamada CHCC14993. CHCC14993 mostrou uma redução de galactose em leite típica de 17% (redução de excreção de galactose em leite comparado com CHCC4323 tipo selvagem). Fermentação de leite

[0070] Igual ao Exemplo 1 acima. Resultado – análise de acidificação e galactose excretada no leite fer- mentado

[0071] Todas as cepas de ST testadas tinham perfis de acidificação similares – isto é, as cepas de ST depositadas da presente invenção não tinham perdido sua capacidade de acidificar rápido em leite.

[0072] As quantidades de galactose excretada para as cepas testa- das diferentes são mostradas na Tabela 2 abaixo: a Tabela 2 indica a quantidade de galactose em leite e a redução de galactose comparado com a referência CHCC4323. Enquanto o mu- tante gal+ típico CHCC14993 mostrou uma redução de galactose de menos de 20%, os mutantes de hiperfermentação mostraram uma re- dução muito maior de até 57%, significando que a quantidade de galac- tose livre é muito menor quando, por exemplo, queijo para pizza é pro- duzido com os novos mutantes, o que está levando a escurecimento reduzido durante cozimento. Cepa Galactose Redução de Galactose (%) CHCC4323 7,0 0 CHCC14993 5,9 16

CHCC29525 3,0 57 CHCC30963 3,7 47 CHCC30964 4,8 31 Tabela 2. Média de duas medições a partir de análise de carboidrato. Os resultados são mostrados em mg/g. Conclusões

[0073] Os resultados demonstraram que as cepas da presente in- venção ora depositadas são capazes de reduzir a liberação de galac- tose também na presença de quantidades elevadas de lactose (como em leite) para um grau que é extraordinariamente melhorado compa- rado com as cepas de referência discutidas acima.

REFERÊNCIAS

1. Mukherjee e outros (1994, J Dairy Sci 77:2839-2849)

2. Hassan e outros (International Journal of Food Microbiology 64 (2001) 199-203)

3. WO2011/026863A1 (Chr. Hansen)

4. WO2011/092300A1 (Chr. Hansen)

5. WO2013/160413A1 (Chr. Hansen)

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula de Streptocuccus thermophilus (ST) caracterizada pelo fato de que é pelo menos uma célula selecionada do grupo consis- tindo em: (a) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC19097 depositada com o número de registro DSM 32594; (b) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC19100 depositada com o número de registro DSM 32595; (c) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC27912 depositada com o número de registro DSM 32596; (d) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29526 depositada com o número de registro DSM 32597; (e) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29530 depositada com o número de registro DSM 32598; (f) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29525 depositada com o número de registro DSM 32897; (g) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC30963 depositada com o número de registro DSM 32898; e (h) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC30964 depositada com o número de registro DSM 32900.

2. Método para obter uma cepa mutante de uma célula de- positada como definida na reivindicação 1 ou da célula de Streptococcus thermophilus CHCC14994 depositada com número de registro DSM 25838, caracterizado pelo fato de que compreende uso de pelo menos uma das cepas depositadas como definidas na reivindicação 1 ou DSM 25838 como cepa de partida, produção de mutantes da cepa depositada e isolamento de uma cepa mutante nova, em que a cepa mutante reteve a propriedade de ser capaz de reduzir a liberação de galactose na pre- sença de lactose da cepa depositada.

3. Composição de cultura de partida compreendendo pelo menos uma das células de Streptocuccus thermophilus (ST) como defi- nidas na reivindicação 1 ou da célula de Streptocuccus thermophilus CHCC14994 depositada com número de registro DSM 25838, caracte- rizada pelo fato de que a composição de cultura de partida tem uma concentração de células viáveis da reivindicação 1 ou DSM 25838 que está na faixa de 104 a 1014 cfu por grama da composição.

4. Composição de cultura de partida, de acordo com a rei- vindicação 3, caracterizada pelo fato de que a concentração de células viáveis está na faixa de 107 a 1014 cfu por grama da composição.

5. Método de fabricação de um alimento ou produto alimen- tício, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar uma compo- sição de cultura de partida como definida em qualquer uma das reivin- dicações 3 a 4 a um material de partida de alimento ou produto alimen- tício e manutenção do material de partida então inoculado sob condi- ções onde as células de Streptocuccus thermophilus (ST) são metabo- licamente ativas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o produto é um produto alimentício.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é um produto lácteo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o produto lácteo é leite fermentado, iogurte, queijo in- cluindo produtos de queijo fresco, produtos de queijo macio, cheddar, mozzarela ou soro de leite coalhado.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o produto lácteo é queijo macio, queijo cheddar, queijo pasta filata e queijo mozzarela.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o produto lácteo é queijo mozzarela ou queijo cheddar (preferivelmente usado para fazer pizza).