CN114286623A - ST Gal(+)细菌用于生产具有相对高稳定pH的发酵乳制品的用途 - Google Patents
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Abstract
生产在发酵结束时具有相对高的稳定pH值的发酵乳制品(例如酸奶)的方法，包括用嗜热链球菌(ST)Gal(+)细菌接种乳。
Description
技术领域
本发明涉及生产在发酵结束时具有相对高稳定pH值的发酵乳制品(例如奶酪或酸奶)的方法，包括用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(ST)Gal(+)细菌接种乳。
背景技术
食品工业使用大量细菌，尤其是乳酸菌，来改善例如食品的味道和质地。在乳制品工业中，大量使用乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)来实现乳的酸化(通过发酵)，但也用于例如质构化掺入了它们的产品。
后酸化的控制具有显著的商业相关重要性。
在本领域中，通常将术语“后酸化”描述为与发酵终止后LAB产生乳酸有关——例如，EP2957180B1(Chr.Hansen A/S，丹麦)的第[0005]段内容如下：
“即使在包括快速冷却步骤的方法中，也观察到后酸化，即在发酵终止后，即达到所需的pH值后，LAB产生乳酸。后酸化被认为是当今乳制品发酵过程中最重要的问题之一。在发酵乳制品的加工和储存过程中pH值的进一步降低会导致酸度升高和保质期缩短的问题。”
许多目前生产发酵乳制品的方法可以通过以下一系列步骤来表征：
(a)使用起子培养物发酵乳，该起子培养物包含能够代谢从存在于乳中的乳糖获得的葡萄糖的乳酸菌(或LAB)；
(b)发酵导致乳酸产生，乳酸导致pH从最初的6.4-6.8(对于牛奶)降低到pH 3.8-4.2；
(c)一旦达到所讨论的发酵制品所需的pH，就通过快速冷却发酵乳制品来终止发酵。
例如，这种方法用于生产奶酪、酸奶和酸奶饮料。
将预定pH值的发酵乳制品快速冷却，以便终止发酵。在不冷却发酵制品的情况下，发酵会继续进行。然而，快速冷却可能有缺点，因为它例如可能会导致丧失质构。
例如为了避免快速冷却步骤——现有技术描述了许多不同的技术方案来改善对后酸化的控制。
本文相关可商业获得产品的实例是丹麦Chr.Hansen A/S的
培养物，其是“提高质量和货架期、具有优异pH稳定性”的产品(参见例如www.chr-hansen.com)。
如本领域技术人员所理解的，由于优异的pH稳定性而提高的货架期与后酸化的控制改善有关。
EP2957180B1(Chr.Hansen A/S，丹麦)描述了用于改善后酸化控制的不同技术方案，例如：
-使用氨基酸代谢缺陷的保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)菌株和/或使用表征为弱后酸化活性的特定LAB菌株——参见例如[0007]；
-在发酵过程中控制缓冲能力以及将缓冲能力和pH保持在预定范围内——参见例如[0008]；
-使用乳糖缺陷型(Lac(-))嗜热链球菌(ST)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)菌株-参见例如权利要求1。
如本领域已知的，在嗜热链球菌(ST)物种中，半乳糖通过乳糖/半乳糖系统分泌(参见本文图1中的lac/gal代谢示意图)。细胞摄取1mol乳糖，可分泌1mol半乳糖。
如本领域已知的，嗜热链球菌(ST)菌株通常不能显著减少乳中分泌的半乳糖的量——即它们在本领域中和本文中可以称为“ST Gal(-)细菌”——参见例如Anbukkarasi等人的文章(J Food Sci Technol(September 2014)51(9):2183–2189)，该文章在摘要中写道：
“大多数嗜热链球菌菌株是半乳糖阴性(Gal-)的，只能代谢乳糖的葡萄糖部分并将半乳糖排出到培养基中。这种代谢缺陷导致游离半乳糖在酸奶中积累，导致消费者出现半乳糖血症。因此，绝对需要开发低半乳糖酸奶。因此，在本研究中，三种半乳糖阳性(Gal+)嗜热链球菌菌株……用于制备低半乳糖酸奶。”
上面讨论的EP2957180B1(Chr.Hansen A/S)描述的所有ST菌株和上面讨论的产品
都是技术人员和本文认为是ST Gal(-)细菌的菌株。
浓度相对较高的半乳糖会在奶酪加热过程中导致“褐变”，因为当例如由嗜热链球菌(ST)生产马苏里拉奶酪，例如用于比萨生产时，经常描述褐变。
现有技术描述了一些嗜热链球菌(ST)即所谓的半乳糖阳性菌株(在本文称为“STGal(+)细菌”)可以用于减少涉及重要加热步骤(例如温度高于70℃)的过程(例如用于制作比萨)中使用的奶酪(例如马苏里拉奶酪)的可能褐变问题——参见例如Anbukkarasi等人的文章(“Production of low browning Mozzarella cheese:Screening andcharacterization of wild galactose fermenting Streptococcus thermophilusstrains”,International Journal of advanced research,2013,vol.1,no.5,pp.83-96)。
如本领域技术人员已知的，“减少可能的褐变”和“后酸化控制的改善”是可能例如与不同乳制品相关的明显不同的问题。
例如，褐变问题通常可能优选与在涉及重要加热步骤(例如加热到高于70℃的温度)的过程(例如用于制作比萨)中使用的奶酪(例如马苏里拉奶酪)相关。
相反，后酸化问题与不使用重要加热步骤(例如加热到高于70℃的温度)的情况下生产的乳制品相关-例如奶酪、酸奶。
Derkx等人的文章(“The art of strain improvement of industrial lacticacid bacteria without the use of recombinant DNA technology”；Microbial CellFac-tories 2014,13(Suppl 1))是一篇综述性文章，该文章在例如第9页讨论了后酸化问题，并在第9页左栏写到：
“在另一种获得后酸化减少的改良菌株的方法中，研究了寡肽转运对乳中嗜热链球菌生长适应性的重要性……并且发现寡肽转运系统改变的突变体的酸化率降低”。
上面提到的Derkx等人的文章在第9页右栏顶部写到：
“此外，由于常居乳酸菌的生长，过量游离半乳糖可以导致后酸化问题和奶酪菌群失衡。因此，半乳糖阳性野生型菌株或半乳糖发酵突变体很有趣，尤其是对于减少比萨奶酪的褐变而言。”
正如本领域技术人员所理解的，在上文引用的Derkx等人(2014)文章的段落中讨论的后酸化问题涉及“常居乳酸菌的生长”——即发酵终止后常居LAB的乳酸生产。
WO2011/026863A1(Chr.Hansen)和WO2011/092300A1(Chr.Hansen)描述了具有galK(半乳糖激酶)基因突变的嗜热链球菌(ST)菌株在发酵乳中产生更高的黏度。
WO2019/042881A1(Chr.Hansen)描述了一些ST Gal(+)细菌的实例。
这三篇WO公开都没有描述/涉及本文讨论的“后酸化”相关问题。
总之，在本领域中，通常将“后酸化”问题描述为与常居LAB在此类发酵终止后产生乳酸有关，本领域描述了与控制/减少后酸化问题相关的许多不同解决方案-例如使用STLac(-)细菌或使用寡肽转运系统改变的ST细菌。
发明内容
本发明要解决的问题是，提供生产在发酵结束时具有相对高稳定pH值的发酵乳制品(例如酸奶)的方法，其中生产的发酵乳制品(例如酸奶)的优点可以是，例如，在例如生产的发酵乳制品的储存期内较低的后酸化。
该解决方案基于本发明人已经在嗜热链球菌(ST)半乳糖阳性菌株(在本文称为“ST Gal(+)细菌”)与在此类发酵结束时获得稳定的相对高pH的可能性之间确定了本文令人惊讶的相关联系。
如上文所讨论的，在本领域中，通常将“后酸化”问题描述为与常居乳酸菌(LAB)在此类发酵终止后产生乳酸有关，例如在此类发酵后在储存过程中。
显然，上文讨论的令人惊讶的联系的、上文讨论的这类发酵结束时相对高的pH是基于Gal(+)ST细菌的生长曲线在此类发酵过程中引发的作用。
不受理论限制——本发明人不知道直接且毫无疑义地描述ST Gal(+)细菌与在此类发酵结束时获得稳定相对高pH的可能性之间的上述令人惊讶的联系的单独现有技术文献。
如在例如本文的实施例中所讨论的，并且如图2和图3所示——本文所述的ST Gal(+)细菌在这类发酵结束时比相应野生型ST Gal(-)细菌具有显著更高的稳定pH(高约0.2-0.6个点)。
从例如图2可以看出——使用本文所述的ST Gal(+)细菌在发酵结束时产生4.3-4.8的pH，使用野生型CHCC27806 ST Gal(-)产生约4.15的pH(即小于pH 4.3)。
换言之，与使用相应野生型CHCC27806 ST Gal(-)菌株相比，使用ST Gal(+)细菌产生了显著更高的稳定的最终pH值(高约0.3-0.6个点)。
此外，初始酸化活性相对不变(参见例如图2或图3)，这表明，观察到的低酸化活性(即发酵结束时相对高的稳定pH值)并不是由于总体较低的酸化率所致。
不受理论限制——相信在此类发酵结束时较高的最终pH将影响货架期内的后酸化，这可能是乳制品例如酸奶的重要问题(参见上文)。
因此，本文讨论的在发酵结束时具有稳定的较高pH的ST Gal(+)菌株例如在储存过程中会导致较低的后酸化，这是例如商业相关乳制品的期望性状。
有人可能会说，ST Gal(+)菌株与在此类发酵结束时获得稳定的相对高pH的可能性之间的本文确定的新颖联系可以认为是技术人员的“改变行为”——例如，如果有人想要“低后酸化”的酸奶培养物，那么他在本发明公开之后会选择合适的ST Gal(+)细菌，而不是其他现有技术已知的不同的“低后酸化”培养物(见上文)。
如本文的实施例所讨论的——约20％的测试ST Gal(+)菌株实际上像本文所要求的那样起作用(即在发酵结束时产生本文讨论的相对高的稳定pH值)。
因此，在没有本发明的知识的情况下，技术人员可能已经容易地测试了感兴趣的ST Gal(+)菌株，未确定本文相关的“在发酵结束时稳定的相对高pH”积极效果。
然而，一旦本发明公开了ST Gal(+)与“发酵结束时稳定的相对高pH”效果之间的本文讨论的新颖联系——则鉴定具有这种“发酵结束时稳定的相对高pH”积极效果的新STGal(+)菌株，就是技术人员的常规筛选/选择工作。
例如首先通过常规程序简单地分离/选择例如约100种不同的ST Gal(+)菌株，然后从该不同ST Gal(+)菌株的池(如本文所述，约20％阳性)中筛选/选择具有本文所述“发酵结束时稳定的相对高pH”积极效果的ST Gal(+)菌株。
因此并在下文进一步详细讨论——有人可能说，本发明是基于本发明人开发了新的选择方法，用于鉴定具有本文所述的“发酵结束时稳定的相对高pH”积极效果的新ST Gal(+)菌株。
如下文的实施例所讨论的——本发明人试图基于不同ST Gal(-)菌株的池来鉴定“发酵结束时稳定的相对高pH”的阳性ST菌株，但没有鉴定到单个阳性菌株/细胞——即在没有本发明的知识的情况下，将不可能(或需要很长时间)鉴定到具有本文所述的“发酵结束时稳定的相对高pH”积极效果的ST菌株。
因此，本发明的第一方面涉及生产在发酵结束时具有相对高的稳定pH值的发酵乳制品的方法，包括以下步骤：
(a)：用(I)接种至少100L乳：
(I)：包含104至1014CFU/g ST细菌细胞的嗜热链球菌(ST)细菌组合物，其特征在于，所述ST细菌与参考ST CHCC4323(DSM 32826)细菌相比，能够将乳中分泌的半乳糖的量减少至少10％(在本文称为“ST Gal(+)细菌”)；
其中通过以下方式进行对比测试：以过夜培养物的1％，将所述ST细菌接种于脱脂牛乳中，在37℃下孵育18小时，并在发酵结束时采集样品以测量发酵乳中的半乳糖含量，并且从而测量与参考CHCC4323相比，分泌的半乳糖的减少；和
(b)：用(a)的细菌发酵乳，其中在发酵过程中以确保确定此步骤(b)的pH值的方式测量pH，并且其中在发酵以相对高稳定pH值(定义为在发酵结束时的pH为4.3-4.9的pH)结束的条件下进行发酵，并且其中在发酵的最后2小时期间pH的变化不超过pH 0.1，并且其中在发酵24小时前(例如15小时前)pH达到4.3-4.9；和
(c)：使用(b)的pH为4.3-4.9的发酵乳进行其他适当步骤，以最终得到生产的发酵乳制品。
或者，本发明的第一方面可以被表述为所谓的用途权利要求——即嗜热链球菌(ST)Gal(+)细菌在用于生产在发酵结束时具有pH为4.3-4.9的相对高稳定pH值的发酵乳制品的方法中的用途，其中该方法包括以下步骤：
(a)：用(I)接种至少100L乳：
(I)：包含104至1014CFU/g ST细菌细胞的嗜热链球菌(ST)细菌组合物，其特征在于，所述ST细菌与参考ST CHCC4323(DSM 32826)细菌相比，能够将乳中分泌的半乳糖的量减少至少10％(在本文称为“ST Gal(+)细菌”)；
其中通过以下方式进行对比测试：以过夜培养物的1％，将所述ST菌接种于脱脂牛乳中，在37℃下孵育18小时，并在发酵结束时采集样品以测量发酵乳中的半乳糖含量，并且从而测量与参考CHCC4323相比，分泌的半乳糖的减少；和
(b):用(a)的细菌发酵乳，其中在发酵过程中以确保确定此步骤(b)的pH值的方式测量pH，并且其中在发酵以相对较稳定pH值(定义为发酵结束时的pH为4.3-4.9的pH)结束的条件下进行发酵，并且其中在发酵的最后2小时期间pH的变化不超过pH 0.1，并且其中在发酵24小时前pH达到4.3-4.9；和
(c):使用(b)的pH为4.3-4.9的发酵乳进行其他适当步骤，以最终得到生产的发酵乳制品。
第一方面的“(a)(I)”的ST Gal(+)细菌测试可以视为本领域技术人员可以常规进行的本文相关标准测试。
相信上文讨论的现有技术中描述的许多ST Gal(+)细菌会符合ST Gal(+)测试——即基于现有技术和本文提供的技术信息，获得符合第一方面“(a)(I)”的对比测试的ST Gal(+)细菌可以视为相对常规的工作。
在本文的实施例1中，描述了获得符合第一方面步骤“(a)(I)”的对比测试的不同ST Gal(+)细菌的方法——即根据实施例1优选进行第一方面步骤“(a)(I)”的对比测试。
如上文所讨论的，本发明人不知道直接且毫无疑义地描述ST Gal(+)细菌与在这类发酵结束时获得稳定相对高pH的可能性之间的上述令人惊讶的联系的单独现有技术文献。
与此一致的是步骤(b)，本身是一个新颖步骤——即现有技术没有直接且毫无疑义地描述这样一种方法：其中根据第一方面的步骤(a)，用ST Gal(+)细菌接种乳，然后如第一方面步骤(b)所要求的，在发酵步骤(b)中监测/测量pH。
这样做的一个原因涉及在本发明之前，技术人员根本不知道ST Gal(+)细菌可具有本文所述“发酵结束时稳定的相对高pH”的积极效果的可能性——因此，技术人员不会考虑如第一方面步骤(b)所要求的那样监测/测量pH以控制/监测这种积极效果。
如本领域技术人员所理解的——第一方面的步骤(b)至少需要某种pH监测/测量，其足以确定“发酵结束时的pH为4.3-4.9的pH，并且其中在发酵的最后2小时期间pH的变化不超过0.1，并且其中在发酵24小时之前pH达到4.3-4.9”。
如技术人员所理解的——可以以不同方式进行该pH监测/测量以能够客观地确定/评估相关pH值。
例如，可能不需要严格地在发酵结束前2小时测量pH——例如，如果在例如发酵结束前3小时、发酵结束前1小时和发酵结束时测量pH，且所有三次确定时的pH值都在正确的范围内，那么技术人员会客观地理解在发酵的最后2小时内pH也正确地在步骤(b)的要求之内。
在本文的实施例中(参见例如本文的图2)，连续监测/测量pH——这可以是优选的程序。
第一方面的步骤(b)写到“发酵结束时的pH”。
技术人员知道何时处于发酵结束，这在本发明的上下文中基本上可以视为与何时pH不再显著下降/降低有关。
如本领域已知的，当例如发酵培养基不再包含足够的相关养分(例如糖，例如乳糖、半乳糖等)供细菌生长/代谢时，发酵可以结束/停止，或者发酵可以通过将温度改变(例如通过快速冷却)为明显不同于细菌生长的最佳温度的温度而结束/停止。
或者，发酵以乳酸或其他生长抑制化合物的浓度增加而自然地结束。
步骤(b)的发酵条件通常可以是与感兴趣的ST细菌相关的标准合适ST发酵条件——诸如，例如本文实施例所用的约37℃。
如本领域技术人员所理解的——这样做的理由与本质上本文所述的所用ST Gal(+)细菌的固有特征是例如发酵结束时的pH的原因有关——即在本文中不起作用的ST细菌会例如在标准ST发酵条件下在发酵结束时产生约pH 4.1的最终pH值。
鉴于本文的技术公开和公知常识——选择/鉴定本文中的阳性/有用ST Gal(+)菌株并发现符合第一方面步骤(b)的要求的合适条件，是技术人员的常规工作。
第一方面的步骤(c)可以视为技术人员的常规工作——即技术人员知道如何制作感兴趣的发酵乳制品(例如奶酪或酸奶)。
如本领域技术人员所理解的——在第一方面的步骤(a)中，可以用其他例如感兴趣的乳酸菌(LAB)接种乳——例如保加利亚乳杆菌，来制作例如酸奶(即发酵乳制品是例如酸奶)。
本发明的第二方面涉及筛选和分离新颖嗜热链球菌(ST)细菌细胞的方法，包括以下步骤：
(i)：从个体ST细菌的池中选择和分离新选择的ST细菌池，其特征在于，所述ST细菌能够如第一方面步骤(a)(I)所要求的那样减少半乳糖(在本文称为“ST Gal(+)细菌”)；
(ii)：从步骤(i)的选择的ST Gal(+)细菌池中选择和分离新的分离的ST Gal(+)细菌细胞，该细菌细胞能够如第一方面步骤(b)所要求的那样在发酵结束时产生相对高的稳定pH值。
下面仅以举例的方式描述本发明的实施方案。
附图说明
图1：lac/gal代谢示意图
图2的图显示，本文所述的ST Gal(+)细菌在此类发酵结束时比相应野生型CHCC27806 ST Gal(-)细菌具有显著更高的稳定pH(高约0.3-0.6个点)。该图显示例如本文首次保藏的新ST Gal(+)菌株(CHCC28380＝DSM 33158；CHCC32045＝DSM 33159)在此类发酵结束时具有非常好的稳定的相对高pH。有关更多详细信息，参阅本文的实施例。
图3的图显示，本文描述的ST Gal(+)细菌在此类发酵结束时比相应野生型CHCC4426 ST Gal(-)细菌具有显著更高的稳定pH(高约0.2-0.5个点)。有关更多详细信息，参阅本文的实施例。
具体实施方式
保藏的菌株/细胞
嗜热链球菌细胞CHCC4323的样品已保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124(Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen und ZellkulturenGmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschwe-ig))，保藏号为DSM 32826，保藏日为2018年6月5日。保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty onthe Interna-tional Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurposes of Patent Procedure)的条件下进行的。
下文的保藏菌株是首次关于本申请保藏的菌株——即它们本身是新菌株。
新嗜热链球菌细胞CHCC28380的样品已保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124)，保藏号为DSM 33158，保藏日为2019年6月12日。保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的。
新嗜热链球菌细胞CHCC32045的样品已保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124)，保藏号为DSM 33159，保藏日为2019年6月12日。保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的。
正如本文的实施例中所讨论的，本文的新保藏菌株在此类发酵结束时具有非常好的稳定的相对高的pH。
因此，本发明的一个单独方面涉及以保藏号DSM 33158保藏的嗜热链球菌细胞CHCC28380或以保藏号DSM 33159保藏的嗜热链球菌细胞CHCC32045。
因此，本发明的另一方面涉及具有以保藏号DSM 33158保藏的CHCC28380的功能特征的嗜热链球菌细胞，或具有以保藏号DSM 33159保藏的CHCC32045的功能特征的嗜热链球菌细胞。在对此相关方面，功能特征意味着与参考ST CHCC4323(DSM 32826)细菌相比，ST细菌能够将乳中分泌的半乳糖的量减少至少10％(在本文称为“ST Gal(+)细菌”)。
本发明的单独方面涉及获得以下的方法：
-以保藏号DSM 33158保藏的嗜热链球菌细胞CHCC28380的突变菌株；或
-以保藏号DSM 33159保藏的嗜热链球菌细胞CHCC32045的突变菌株，
包括使用保藏菌株作为起始菌株，制备保藏菌株的突变体，并分离新的突变菌株，其中突变菌株保留了保藏菌株的作为ST Gal(+)的特性。
发酵乳制品
第一方面步骤(a)的乳和由此第一方面发酵乳制品的乳可以例如是豆乳或动物乳(例如山羊乳、水牛乳、绵羊乳、马乳、骆驼乳或牛乳)。
优选，乳是牛乳。
发酵乳制品优选为例如酸奶、奶酪、开菲尔或酪乳等乳制品。
可能优选的是，奶酪是例如新鲜奶酪制品、软奶酪制品、切达奶酪、欧陆式奶酪(continental cheese)、帕斯塔菲拉塔奶酪(pasta filata cheese)、比萨奶酪或马苏里拉奶酪。
可能优选的是，该制品是酸奶。
接种乳——第一方面的步骤(a)
如上文所讨论的——在第一方面的步骤(a)中，也可以用其他例如感兴趣的乳酸菌(LAB)接种乳——例如保加利亚乳杆菌，来制作例如酸奶(即发酵乳制品是例如酸奶)。
可以优选的是，在第一方面的步骤(a)中，还用104至1014CFU/g乳杆菌属(Lactobacillus)细菌细胞(例如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)))接种乳——这在发酵乳制品是例如酸奶时可能特别相关。
可以优选的是，在第一方面的步骤(a)中，还用104至1014CFU/g乳球菌属(Lactococcus)细菌细胞(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))接种乳——这在发酵乳制品是例如奶酪时特别相关。
可以优选的是，在第一方面的步骤(a)中，还用104至1014CFU/g的明串珠菌属(Leuconostoc)细菌细胞接种乳——这在发酵奶制品是例如奶酪时特别相关。
可以优选的是，第一方面的步骤(a)涉及接种至少200L乳或接种至少1000L乳。
第一方面步骤“(a)(I)”的ST Gal(+)细菌
在本文的实施例1中，描述了获得符合第一方面步骤“(a)(I)”的对比测试的不同ST Gal(+)细菌的方法。
从实施例1的表1可以看出，通过使用本实施例中描述的从嗜热链球菌中分离半乳糖超发酵突变体的具体方法，可以获得与参考ST CHCC4323细菌相比能够将乳中分泌的半乳糖的量减少约50％的ST细菌(参见例如CHCC27912和CHCC29526)。
与参考ST CHCC4323细菌相比，能够将乳中分泌的半乳糖的量减少至少20％的ST细菌在本文中可以称为ST Gal(++)细菌。
不受理论限制——实施例1描述的从嗜热链球菌中分离半乳糖超发酵ST Gal(++)突变体的方法可以被认为是特殊的，这是因为与本文称为Gal(+)的菌株相比，半乳糖减少水平显著增加。如实施例1所述，与野生型CHCC4323相比，CHCC14993(CHCC4323的Gal(+)突变体)的半乳糖减少水平为17％，而CHCC14994(CHCC4323的Gal(++)突变体)的半乳糖减少水平为30％。与参考CHCC4323相比，CHCC29526(CHCC4459的Gal(++)突变体)的半乳糖减少水平甚至是52％。
通过使用在实施例1的M17-gal肉汤中继代培养的方法，因此可以分离具有独特的半乳糖减少能力的半乳糖超发酵突变体。
优选地，第一方面步骤“(a)(I)”的ST细菌是以以下为特征的ST细菌：与参考STCHCC4323细菌相比，所述ST细菌能够将乳中分泌的半乳糖的量减少至少20％(例如至少25％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％)。
优选地，嗜热链球菌(ST)细菌细胞是至少一种选自以下的细胞：
(a)：以保藏号DSM 33158保藏的嗜热链球菌细胞CHCC28380；和
(b)：以保藏号DSM 33159保藏的嗜热链球菌细胞CHCC32045。
优选地，在第一方面的步骤“(a)(I)”中，用每克乳104至1015cfu(或104至1014cfu)(菌落形成单位)活ST细菌细胞接种乳，包括至少105cfu/g乳，例如至少106cfu/g乳，例如至少107cfu/g乳，例如至少108cfu/g乳，例如至少109cfu/g乳，例如至少1010cfu/g乳或例如至少1011cfu/g乳。
ST细菌细胞可以是不同ST菌株的混合物(例如本文讨论的CHCC28380和CHCC32045的混合物)——例如108cfu/g乳的一种ST菌株(例如CHCC28380)+108cfu/g乳的另一种ST菌株(例如CHCC32045)，这总的来说意味着用2x108 cfu/g乳的活ST细菌细胞接种乳。
通常，细菌(例如起子培养物组合物)呈浓缩形式，包括冷冻、干燥或冻干浓缩物。
如本文实施例所讨论的——并非所有测试的ST Gal(+)菌株实际上都按本文所要求的起作用(即在发酵结束时产生本文讨论的相对高的稳定pH值)。
因此并且如本文实施例所讨论的——进行基因组分析以在优选的起良好作用的阳性ST Gal(+)菌株中找到共同的结构元件。
结果表明，大多数优良的ST Gal(+)菌株都在半乳糖激酶基因(galK)启动子的-10区/框中具有突变。
此类galK突变体描述于例如WO2011/026863A1(Chr.Hansen)中——如上文所讨论的，该WO公开没有描述/涉及本文讨论的“后酸化”相关问题。
以下显示了WO2011/026863A1(Chr.Hansen)第10页中的图:
如上图所示并如WO2011/026863A1所讨论的——所述-10区/框的野生型/共有序列是“TACGAT”，并且称为“CHCC11379”的菌株包含-10区/框内的突变。
半乳糖激酶基因(galK)的野生型/共有启动子序列如上图中的SEQ ID NO:8所示，其与本文中的SEQ ID NO:8相同。
简而言之，技术人员可以常规地确定感兴趣的ST Gal(+)菌株是否在半乳糖激酶基因(galK)启动子的-10区/框中具有突变。
因此，在优选实施方案中，第一方面步骤“(a)(I)”的ST Gal(+)细菌优选是在半乳糖激酶基因(galK)启动子(SEQ ID NO:8)的-10区中具有突变的细菌，其中突变导致野生型-10区(TACGAT，SEQ ID NO:1)的C和G中的一个或两个被独立地选自由A和T组成的组的核苷酸取代。
优选地，突变导致-10区具有核苷酸序列TATGAT(SEQ ID NO:2——参见例如下文讨论的例如CHCC28380和CHCC32045的非常积极的结果)或TACTAT(SEQ ID NO:4——参见例如下文讨论的例如CHCC29248的积极结果)——最优选地，突变导致-10区具有核苷酸序列TATGAT(SEQ ID NO:2)。
如本文实施例所讨论的——本文的新的保藏的ST Gal(+)菌株(CHCC28380＝DSM33158；CHCC32045＝DSM 33159)在此类发酵结束时具有非常好的稳定的相对高pH——这些保藏菌株包含突变“TATGAT”(SEQ ID NO:2)——因此它在本文中是最优选的。
不受理论限制，相信galK基因高于野生型的表达会产生本文讨论的在发酵结束时获得相对高稳定pH的积极效果——因此，在优选的实施方案中，第一方面步骤“(a)(I)”的ST Gal(+)细菌优选是具有高于野生型表达的galK基因的细菌，并且其中ST Gal(+)细菌优选在SEQ ID NO:8的-35、-10或核糖体结合位点(RBS)中具有突变。
用细菌发酵乳——第一方面的步骤(b)
第一方面的步骤(b)涉及用(a)的细菌发酵乳。
如上文所讨论的，步骤(b)的发酵条件通常可以是与感兴趣的ST细菌相关的标准的合适的ST发酵条件——例如本文实施例所用的约37℃。
如上文所讨论的，这样做的理由与本质上本文所述的所用ST Gal(+)细菌的固有特征是例如发酵结束时的pH的原因有关——即在本文中不起作用的ST细菌会例如在标准ST发酵条件下在发酵结束时产生约4.1的最终pH。
技术人员知道如何用相关细菌发酵乳来制备感兴趣的发酵乳制品(例如奶酪)——因此，在本发明的上下文中无需对此进行详细描述。
根据现有技术并取决于例如所用的ST，发酵温度可以例如为25℃至48℃，例如35℃至48℃或例如36℃至38℃。
根据本领域，第一方面的步骤(b)中的发酵时间可以为2-96小时，例如3-72小时或例如4-48小时。
可以优选的是，第一方面的步骤(b)中的发酵时间可以为2-30小时，例如3-24小时。
第一方面的步骤(b)写到：“发酵结束时的pH”。
如上文所讨论的，技术人员知道何时处于发酵结束，这在本发明的上下文中基本上可以视为与何时pH不再显著下降/降低有关。
如本领域已知的，当例如发酵培养基不再包含足够的相关养分(例如糖，例如乳糖、半乳糖等)供细菌生长/代谢时，发酵可以结束/停止，或者发酵可以通过将温度改变(例如通过快速冷却)为明显不同于细菌生长的最佳温度的温度而结束/停止。
或者，发酵以乳酸或其他生长抑制化合物的浓度增加而自然地结束。
可以优选的是，发酵结束时的pH为4.3-4.8，例如4.4-4.8或4.4-4.7的pH。
在优选的实施方案中，在发酵的最后2小时期间pH的变化不超过pH 0.05。
在优选的实施方案中，在发酵15小时之前(更优选在10小时之前，甚至更优选在8小时之前)pH达到4.3-4.9。
关于大规模的本文相关的乳发酵——本领域已知，有时可以在约5小时内完成乳的发酵。
如本文所讨论的，ST菌株CHCC4323(DSM 32826)可以视为对应于当今商业相关使用的用于制作例如本文相关乳制品的ST Gal(-)菌株的ST参考菌株。
因此，在第一方面步骤(b)的优选实施方案中，发酵结束时的pH是比通过在可比较的相同发酵条件下进行的使用参考ST CHCC4323(DSM 32826)细菌获得的发酵结束时相应对比pH高0.1-0.8个点(优选0.2-0.8个点，例如0.2-0.6个点)的pH。
技术人员当然知道如何进行这样的对比实验——即其中通过使用第一方面的STGal(+)菌株进行步骤(b)中的发酵，然后在相同条件下用参考ST CHCC4323(DSM 32826)细菌进行重复，然后比较最终pH值。
制作感兴趣的发酵乳制品的其他适当步骤-第一方面的步骤(c)
第一方面的步骤(c)涉及进行其他适当的步骤，以最终得到所生产的感兴趣的发酵乳制品。
如上文所讨论的，技术人员知道如何制作感兴趣的发酵乳产品(例如奶酪或酸奶)——因此，在本发明的上下文中无需对此进行详细描述。
生产的发酵乳制品的储存——第一方面的任选步骤(d)
如上文所讨论的——相信此类发酵结束时较高的最终pH会影响货架期内的后酸化，这可能是乳制品例如酸奶的重大问题(见上文)。
因此，本文讨论的具有稳定的较高pH的ST Gal(+)菌株会导致较低的后酸化，这是例如商业相关乳制品的所需性状。
因此，在第一方面方法的优选实施方案中——该方法还包括与以下相关的额外步骤：
(d)：将步骤(c)生产的发酵乳制品储存至少1天(例如至少1周、至少2周、至少1个月或至少2个月)的储存期，并且其中所述储存期结束时制品的pH为4.3-4.9的pH。
优选，在储存期间pH的变化不超过pH 0.3(优选变化不超过pH 0.2或甚至优选变化不超过pH 0.1)。
储存可以在乳制品生产商处和/或在销售发酵乳制品(例如酸奶)的零售商/商店处。
关于步骤(d)——如果步骤(d)的储存期是例如至少一天并且已经测量了制品的pH以确定一天后制品的pH在步骤(b)的4.3-4.9范围的pH内(例如pH 4.4)，则已经进行了步骤(d)–即使制品可能储存较长时间(例如一年)并且例如一年后制品的pH低于4.3(即超出步骤(d)的范围)，这也是真实的。
技术人员知道如何储存生产的感兴趣的发酵乳制品——例如可以将酸奶储存在例如2℃到10℃——例如5℃左右。
技术人员知道如何测量所储存的感兴趣的发酵乳制品的pH，并且由此可以常规地确定步骤(d)的条件是否得到满足。
筛选和分离新ST细菌的方法——第二方面
如上文所讨论的，本发明的第二方面涉及筛选和分离新嗜热链球菌(ST)细菌细胞的方法，包括以下步骤：
(i)：从个体ST细菌池中选择和分离新的选择的ST细菌池，其特征在于，所述ST细菌能够如第一方面步骤(a)(I)所要求的减少半乳糖(在本文称为“ST Gal(+)细菌”)；
(ii)：选择和分离——从步骤(i)的选择的ST Gal(+)细菌池中——新的分离的STGal(+)细菌细胞，该细菌细胞能够如第一方面步骤(b)所要求的在发酵结束时产生相对高的稳定pH值。
第二方面的方法的步骤(i)写到“从个体ST细菌池中选择和分离”。
众所周知——制备/产生这样的个体细菌细胞池是技术人员的常规工作。
它可以例如由合适的优选起始细胞制备，该起始细胞可以进行适当的诱变(例如，使用化学诱变剂或UV诱变)以制备所述起始细胞的突变体池——即产生个体细菌细胞池。
如本文所讨论的，鉴于本文的技术公开和公知常识——通过第二方面的筛选和分离方法来选择/鉴定本文中阳性/有用的ST菌株，是技术人员的常规工作。
实施例
实施例1：ST Gal(+)细菌——即使在存在大量乳糖(如在乳中)的情况下也能显著减少半乳糖的释放——即第一发明步骤“(a)(I)”的ST Gal(+)细菌
参考菌株：
-ST菌株CHCC4323：它具有可被称为的galK天然野生型序列(在本文称为GalK(-))，并可以视为对应于当今商业相关使用的用于制作例如奶酪的ST菌株的ST参考菌株；
-ST菌株4323-2(CHCC14993)：它包含galK(半乳糖激酶)基因中的突变(在本文中称为Gal(+))，并且可以视为对应于根据上文讨论的WO2011/026863A1(Chr.Hansen)和WO2011/092300A1(Chr.Hansen)的描述制备的菌株的参考菌株。
保藏的菌株：
CHCC14994：DSM 25838 ST菌株-公开于WO2013/160413A1(Chr.Hansen)。
CHCC19097：DSM 32594ST菌株
CHCC19100：DSM 32595ST菌株
CHCC27912：DSM 32596ST菌株
CHCC29526：DSM 32597ST菌株
CHCC29530：DSM 32598ST菌株
WO2019/042881A1(Chr.Hansen)中讨论了一些保藏的ST Gal(+)菌株——如上所述，该WO公开未描述/涉及本文讨论的“后酸化”相关的问题。
从嗜热链球菌中分离半乳糖超发酵突变体：
在突变体分离之前，将菌株划线接种在具有2％半乳糖的M17琼脂平板上(M17-gal平板)。野生型(wt)菌株在半乳糖作为唯一碳水化合物源时生长不明显。
然后将过夜培养物平板接种在M17-gal平板上，在37℃下生长两天后可以分离到几个菌落。在M17-gal平板上纯化了几个突变体，并在含有2％半乳糖作为唯一碳水化合物的M17肉汤中进行了重新测试。
通过在M17-gal肉汤中用来自完全长出的过夜培养物的每日1％重新接种进行继代培养，从纯化的半乳糖阳性突变体中分离出第二代半乳糖超发酵突变体；在37℃下进行孵育。
在稀释平板接种后，从M17-gal平板中分离出100个单菌落，并接种在具有M17-gal肉汤的微量滴定板中。OD之后是OD读取器，并且进一步纯化和表征(如wt菌株)在37℃下孵育16小时期间表现出更好的OD增加的克隆。
分离出半乳糖超发酵突变体的wt嗜热链球菌菌株是：
CHCC9861
CHCC4459
CHCC4426
CHCC4323
CHCC7018
CHCC3050
显示出异常高的半乳糖发酵能力和分泌到培养基中的半乳糖减少的半乳糖超发酵突变体是(突变体/wt)：
CHCC27912/CHCC9861
CHCC29526/CHCC4459
CHCC29530/CHCC4426
CHCC14994/CHCC4323
CHCC19100/CHCC7018
CHCC19097/CHCC3050
本实施例还包括典型的半乳糖阳性菌株，称为CHCC14993，作为第一代突变体分离自CHCC4323。CHCC14993表现出乳中17％的典型半乳糖减少(与wt CHCC4323相比，乳中的半乳糖分泌减少)。
乳发酵
以过夜培养物的1％，将突变菌株接种到脱脂牛乳中，并在37℃下孵育24小时。突变体的酸化活性类似于wt菌株。在发酵结束时，采集样品以测量发酵乳中的半乳糖含量，并且基于此将分泌的半乳糖减少与半乳糖阴性参考菌株CHCC4323进行比较。
结果-对发酵乳中酸化和分泌的半乳糖的分析
所有测试的ST菌株都具有相似的酸化曲线——即保藏的ST菌株并未失去其在乳中的酸化能力。
不同测试菌株分泌的半乳糖的量如下文的表1所示：
表1显示了发酵脱脂牛乳中半乳糖的量以及与参考CHCC4323相比半乳糖的减少。而典型的gal+突变体CHCC14993显示出小于20％的半乳糖减少，超发酵突变体显示出高达52％的更得多的减少，这意味着当例如用新突变体生产比萨奶酪时游离半乳糖的量要低得多，这导致烘焙过程中褐变减少。
| 菌株 | 半乳糖 | 半乳糖减少(％) |
| CHCC4323 | 7.1 | 0 |
| CHCC14993 | 5.9 | 17 |
| CHCC27912 | 3.4 | 52 |
| CHCC29526 | 3.4 | 52 |
| CHCC29530 | 4.9 | 31 |
| CHCC14994 | 5.0 | 30 |
| CHCC19100 | 4.1 | 42 |
| CHCC19097 | 5.1 | 28 |
表1.碳水化合物分析中两次测量结果的平均值。结果以mg/g表示。
结论
结果证明，保藏菌株也能够在存在大量乳糖(如在乳中)的情况下将半乳糖的释放减少到一定程度，与上文讨论的参考菌株相比，其是被显著改善的。
实施例2：ST Gal(+)细菌——发酵结束时的pH值
菌株
本实施例讨论的所有ST Gal(+)菌株都是符合本文第一方面(即权利要求1)的要求(a)的ST Gal(+)菌株，其中根据上文的实施例1进行对比测试。
新的保藏菌株：
针对本发明第一次保藏了以下新的保藏菌株。
CHCC28380：DSM 33158ST菌株
CHCC32045：DSM 33159ST菌株
乳发酵
以具有2％乳糖的M17中过夜培养物的1％，将ST Gal(+)突变菌株和参考/野生型ST Gal(-)菌株接种于脱脂牛乳中，并在37℃下孵育24小时。
在发酵过程中连续监测/测量pH(intab PC记录器，EasyView软件)。
结果
本文的图2显示，本文所述的ST Gal(+)细菌CHCC28380、CHCC32045和CHCC32046在此类发酵结束时具有比相应野生型ST Gal(-)细菌CHCC27806显著更高的稳定pH(高约0.3-0.6个点)。
本文的图3显示，本文所述的ST Gal(+)细菌CHCC29249和CHCC29529在此类发酵结束时具有比相应野生型ST Gal(-)细菌CHCC4426显著更高的稳定pH(高约0.2-0.5个点)。此外，在发酵结束时，CHCC4426的pH不断降低，而突变体CHCC29249和CHCC29529的pH似乎更稳定。
本文相关的其他测试菌株的pH结果如下表所示。
表1.发酵结束时ST Gal(-)野生型菌株与半乳糖阳性突变体之间的pH差异。野生型菌株的相应gal+突变体显示在各自的野生型菌株下方。
如上表所示，在此类发酵结束时，不同ST Gal(+)细菌的实例具有比相应的野生型ST Gal(-)细菌显著更高的稳定pH(高约0.2-0.6个点)。
如上表所示，一些测试的ST Gal(+)菌株没有按本文的要求起作用(即没有在发酵结束时产生本文讨论的相对高的稳定pH值)。例如，包括了ST Gal(+)突变体4459-GAL6。该菌株是CHCC4459的半乳糖发酵突变体。然而，孵育24小时后的最终pH类似于24小时后野生型菌株的pH。
在发酵结束时具有相对最高pH的突变体通常是所谓的半乳糖超发酵ST Gal(++)突变体——即(如上文所讨论的)，根据上文的实施例1，与参考ST CHCC4323细菌相比，它们能够将乳中分泌的半乳糖的量减少至少20％(例如至少25％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％)。
未显示所有测试的不起作用的ST Gal(+)菌株的数据——但约20％的测试ST Gal(+)菌株实际上按本文的要求起作用(即在发酵结束时产生本文讨论的相对高的稳定pH值)。
结论：
结果证明，在此类发酵结束时，不同ST Gal(+)细菌的实例具有比相应野生型STGal(-)细菌显著更高的稳定pH(高约0.2-0.6个点)。
对于许多测试的不同ST Gal(+)细菌——根据本文第一方面的步骤(b)，在发酵结束时，乳的发酵产生相对高的稳定pH值。
数据还表明，约20％的测试ST Gal(+)菌株实际上按本文的要求起作用(即在发酵结束时产生本文讨论的相对高的稳定pH值)。
结果还证明，基于本文的技术教导和公知常识——鉴定具有本文所述的“发明结束时稳定的相对高pH”积极效果的新颖ST Gal(+)菌株，是技术人员的常规筛选/选择工作。
所测试的ST Gal(-)菌株均未呈阳性——即这些菌株均未产生根据本文第一方面的步骤(b)的在发酵结束时的pH值。
实施例3：对测试的ST Gal(+)菌株的基因组分析
如上文所讨论的——并非所有测试的ST Gal(+)菌株实际上都按本文的要求起作用(即在发酵结束时产生本文讨论的相对高的稳定pH值)。
因此，进行了基因组分析，以在优选的起良好作用的阳性ST Gal(+)突变菌株中找到共同的结构元件。
结果：
下表显示了上文实施例2讨论的一些菌株的半乳糖激酶基因(galK)启动子-10区中的突变——即上文实施例2的一些阳性和阴性(无效)菌株。
表2.与野生型菌株相比，半乳糖阳性突变体的半乳糖激酶基因(galK)基因启动子-10区的DNA序列。野生型菌株的相应gal+突变体显示在各自的野生型菌株下方。
结论：
结果证明，本文相关的起良好作用的ST Gal(+)菌株优选是在半乳糖激酶基因(galK)启动子(SEQ ID NO:8)的-10区具有突变的ST Gal(+)细菌，其中突变导致野生型-10区(TACGAT，SEQ ID NO:1)的C和G中的一个或两个被独立地选自由A和T组成的组的核苷酸取代。
更优选，突变导致-10区具有核苷酸序列TATGAT(SEQ ID NO:2–例如参见例如CHCC28380和CHCC32045的非常阳性的结果)或TACTAT(SEQ ID NO:4–例如参见例如CHCC29248的非常阳性的结果)。
在本文中新颖的保藏ST Gal(+)菌株(CHCC28380＝DSM 33158；CHCC32045＝DSM33159)在此类发酵结束时具有非常好的稳定的相对高pH——这些保藏的菌株包含突变“TATGAT”(SEQ ID NO:2)——因此，在本文中是最优选的。
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<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)
<400> 1
tacgat 6
<210> 2
<211> 6
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<400> 2
tatgat 6
<210> 3
<211> 6
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<400> 3
tattat 6
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<211> 6
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<400> 4
tactat 6
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<400> 5
aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt atgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60
gagatacatc 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<400> 6
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gagatacatc 70
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<213> 嗜热链球菌
<400> 8
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Claims (17)
1.生产在发酵结束时具有相对高的稳定pH值的发酵乳制品的方法，包括以下步骤：
(a)：用(I)接种至少100L乳：
(I)：包含104至1014CFU/g ST细菌细胞的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(ST)细菌组合物，其特征在于，与参考ST CHCC4323(DSM 32826)细菌相比，所述ST细菌能够将乳中分泌的半乳糖的量减少至少10％(在本文称为“ST Gal(+)细菌”)；
通过以下方式进行对比测试：以过夜培养物的1％，将所述ST菌接种于脱脂牛乳中，在37℃下孵育18小时，并在所述发酵结束时采集样品以测量所述发酵乳中的半乳糖含量，从而测量与所述参考CHCC4323相比，分泌的半乳糖的减少；和
(b)：用(a)的所述细菌发酵所述乳，其中在所述发酵过程中以确保确定此步骤(b)的pH值的方式测量所述pH，并且其中在所述发酵以相对高稳定pH值结束的条件下进行所述发酵，所述相对高稳定pH值定义为所述发酵结束时的pH为4.3-4.9的pH，并且其中在所述发酵的最后2小时期间所述pH的变化不超过pH 0.1，并且其中在所述发酵24小时前所述pH达到4.3-4.9；和
(c)：使用(b)的pH为4.3-4.9的发酵乳进行其他适当步骤，以最终得到生产的发酵乳制品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中权利要求1的步骤(a)的所述乳是牛乳，并且权利要求1的步骤(c)的所述发酵乳制品是酸奶、奶酪、开菲尔或酪乳。
3.根据权利要求2所述的方法，其中权利要求1的步骤(c)的发酵乳制品是酸奶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在第一方面的步骤(a)中，还用104至1014CFU/g乳杆菌属(Lactobacillus)细菌细胞(例如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus))接种所述乳。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中权利要求1的步骤“(a)(I)”的所述ST细菌是以以下为特征的ST细菌：与参考ST CHCC4323细菌相比，所述ST细菌能够将所述乳中分泌的半乳糖的量减少至少25％。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜热链球菌(ST)细菌细胞是至少一种选自由以下组成的组的细胞：
(a)：以保藏号DSM 33158保藏的嗜热链球菌细胞CHCC28380；和
(b)：以保藏号DSM 33159保藏的嗜热链球菌细胞CHCC32045。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中权利要求1的步骤“(a)(I)”的所述STGal(+)细菌优选是在半乳糖激酶基因(galK)启动子(SEQ ID NO:8)的-10区中具有突变的细菌，其中所述突变导致野生型-10区(TACGAT,SEQ ID NO:1)的C和G中的一个或两个被独立选自由A和T组成的组的核苷酸取代。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述突变导致-10区具有核苷酸序列TATGAT(SEQID NO:2)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
-其中连续测量权利要求1的步骤(b)的所述pH值，直至所述发酵结束；
-权利要求1的步骤(b)的发酵温度为25℃至48℃；
-权利要求1的步骤(b)中的发酵时间为2-30小时；
-权利要求1的步骤(b)中所述发酵结束时的pH为4.4-4.8的pH；
-在权利要求1的步骤(b)中，在所述发酵的最后2小时期间所述pH的变化不超过0.05；和
-在权利要求1的步骤(b)中，在发酵10小时之前所述pH达到4.3-4.9。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在权利要求1的步骤(b)中，所述发酵结束时的pH是比通过在可比较的相同发酵条件下进行的使用所述参考ST CHCC4323(DSM32826)细菌获得的发酵结束时相应对比pH高0.2-0.8个点的pH。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中权利要求1的方法包括下述额外步骤：
(d)：将所述步骤(c)生产的发酵乳产品储存至少1周的储存期，并且其中在所述储存期结束时所述制品的pH为4.3-4.9的pH。
12.根据权利要求11所述的方法，其中储存温度为2℃至10℃，并且其中所述发酵乳制品是酸奶或奶酪。
13.筛选和分离新颖嗜热链球菌(ST)细菌细胞的方法，包括以下步骤：
(i)：从个体ST细菌池中选择和分离新的选择的ST细菌池，所述新的选择的ST细菌池的特征在于所述ST细菌能够如权利要求1的步骤(a)(I)所要求的减少半乳糖(在本文中称为“ST Gal(+)细菌”)；
(ii)：选择和分离——从步骤(i)的所述选择的ST Gal(+)细菌池中——新的分离的STGal(+)细菌细胞，所述细菌细胞能够如权利要求1的步骤(b)所要求的在所述发酵结束时产生相对高的稳定pH值。
14.以保藏号DSM 33158保藏的嗜热链球菌细胞CHCC28380，或以保藏号DSM 33159保藏的嗜热链球菌细胞CHCC32045。
15.嗜热链球菌细胞，其具有以保藏号DSM 33158保藏的CHCC28380的功能特征，或嗜热链球菌细胞，其具有以保藏号DSM33159保藏的CHCC32045的功能特征。
16.根据权利要求15所述的嗜热链球菌细胞，其中所述功能特征是指，与参考STCHCC4323(DSM 32826)细菌相比，所述ST细菌能够将乳中分泌的半乳糖的量减少至少10％(在本文称为“ST Gal(+)细菌”)。
17.获得以下的方法：
-以保藏号DSM 33158保藏的嗜热链球菌细胞CHCC28380的突变菌株；或者
-以保藏号DSM 33159保藏的嗜热链球菌细胞CHCC32045的突变菌株，
包括使用所述保藏菌株作为起始菌株，制备所述保藏菌株的突变体，并分离新的突变菌株，其中所述突变菌株保留了所述保藏菌株的作为ST Gal(+)的特性。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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