KR101812016B1

KR101812016B1 - 락토바실러스 존소니 유래의 산성 조건에서 발현이 증가되는 프로모터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101812016B1
Application number: KR1020160131755A
Authority: KR
Inventors: 강대경; 에드워드 파자릴로; 채종표
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2016-10-12
Filing date: 2016-10-12
Publication date: 2017-12-26

Abstract

본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 유래의 산성 조건에서 발현이 증가되는 PFKA 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 유산균 발현벡터, 상기 유산균 발현벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 재조합된 유산균 발현벡터로 형질전환하여 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 산성 조건에서 발현되는 형질전환 유산균의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 유산균 및 상기 형질전환 유산균을 배양하여 산성 조건에서 목적 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 프로모터는 목적 유전자의 발현을 산성 조건에서 증가시키므로, 산성의 배양 조건을 가지는 유용 단백질의 생산에 활용 가능하다.

Description

락토바실러스 존소니 유래의 산성 조건에서 발현이 증가되는 프로모터 및 이의 용도{Promoter having increased expression under acidic condition from Lactobacillus johnsonii and uses thereof}

본 발명은 락토바실러스 존소니 유래의 산성 조건에서 발현이 증가되는 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 유래의 산성 조건에서 발현이 증가되는 PFKA 프로모터 및 상기 프로모터를 이용한 유산균 발현벡터에 관한 것이다.

유산균은 당류를 발효하여 50% 이상의 젖산을 생성하는 세균으로서, 발효식품 뿐만 아니라 사람이나 동물의 장관을 비롯하여 자연계에 널리 분포하는 세균이다. 전세계적으로 오랫동안 발효식품 등을 통하여 유산균을 섭취해 왔으며, 건강에 유익한 역할을 하는 것으로 인식되고 있다. 특히, 유산균은 인체나 동물에 안전하다는 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물로 인정받고 있기 때문에, 유산균을 이용하여 고부가가치를 가진 물질을 대량생산하기 위한 연구와 함께, 유산균을 이용한 유전자 발현시스템에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

유산균을 이용한 유전자 발현시스템은 유산균이 가지고 있는 고유의 특성 이외의 새로운 기능을 가진 유산균을 개발하기 위한 것으로서, 적절한 환경에서 효율적으로 목적단백질을 발현시킬 수 있는 프로모터가 필요하다. 지금까지 유산균에서 분리된 프로모터로는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) MG1614, 락토코커스 크레모리스(Lactococcus cremoris), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)(Slos et al., Appl. Environ. Microbial., 1991; Koivula et al., Appl. Environ. Microbial., 1991; van der Vossen et al., Appl. Environ. Microbial., 1987; Panya et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012; Heiss et al., Microb. Cell. Fact, 2016) 등이 알려져 있다.

그동안 연구된 발현벡터로는 항시적으로 발현되거나 유도제를 첨가해야 하는 유도성인 경우가 대부분으로서, 특정 외부환경, 특히 산성 조건에서 발현이 유도되는 프로모터는 개발된 바가 없다. 예를 들어, 유산균을 활용하여 유기산을 생산할 경우에는 배양액이 산성이므로, 유기산 생합성에 필요한 유전자를 산성조건에서 효율적으로 발현시킬 수 있어야 하며, 유산균을 장관내 백신 전달체로 활용하고자 할 때에도 낮은 pH(산성 조건)의 위를 통과하는 동안 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있어야 한다.

이에 본 발명자들은 산성 스트레스 조건에서 발현이 유도되는 프로모터를 선별하는 연구를 수행하여, 산성조건에서 목적단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 프로모터를 확보하였고, 상기 프로모터를 함유한 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 유산균을 확보하였다.

한편, 한국공개특허 제2005-0077376호에는 'rplL 프로모터를 이용한 고효율 유산균 발현벡터 pKH10-luc'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1613897호에는 '담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터를 포함하는 셔틀벡터 및 이를 포함하는 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 산성 조건에서 발현이 증가되는 프로모터 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 산성 스트레스 조건에서 락토바실러스 존소니의 PFKA(6-phosphofructokinase) 단백질의 발현양이 현저히 증가되는 것을 확인하였고, PFKA 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 서열을 확보하여 PFKA 프로모터를 포함하는 유산균 발현벡터를 제작하였다. 그 후, 상기 유산균 발현벡터를 세 종의 유산균에 형질전환하여 형질전환된 유산균체를 확인하였고, 특히 형질전환된 유산균에서 리포터 유전자의 활성을 분석한 결과, 산성 조건에서의 리포터 유전자의 활성이 중성 조건에서보다 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 유래의 산성 조건에서 발현이 증가되는 PFKA 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 유산균 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유산균 발현벡터로 형질전환된 유산균을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유산균 발현벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합하는 단계; 및 상기 재조합된 유산균 발현벡터로 유산균을 형질전환시키는 단계를 포함하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 산성 조건에서 발현되는 형질전환 유산균의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 산성 조건에서 발현되는 형질전환 유산균을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 유산균을 배양하는 것을 특징으로 하는 산성 조건에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 PFKA 프로모터 및 상기 프로모터를 포함하는 유산균 발현벡터는 산성 스트레스 조건에서 목적 단백질의 발현을 효과적으로 유도할 수 있으므로, 본 발명에 따른 프로모터를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 유산균은 산성의 배양 조건을 가지는 유용 단백질의 생산에 사용될 수 있으며 산성의 위(stomach)를 통과해야하는 장관내 백신 전달체로서의 활용 또한 가능하다.

도 1은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)로부터 분리한 플라스미드 DNA(pFD3.1)의 전기영동 사진(A)과, 플라스미드 pFD3.1의 지도(B)이다.
도 2는 pFD3 플라스미드와 대장균 벡터 pUC19를 결합하고, PFKA 프로모터와 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase) 리포터 유전자를 삽입하여 완성된 유산균 발현벡터 pPFKA-glu의 플라스미드 지도이다.
도 3은 유산균 발현벡터 pPFKA-glu로 형질전환된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)과 야생주의 배양 사진이다.
도 4는 PFKA 프로모터의 pH 조건에 따른 발현 세기를 비교하기 위해, 리포터 유전자인 베타-글루쿠로니다제의 발현 수준을 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 유래의 산성 조건에서 발현이 증가되는 PFKA 프로모터를 제공한다.

상기 산성 조건에서 발현이 증가되는 PFKA 프로모터는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)에서 분리된 것으로, PFKA(6-phosphofructokinase) 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터이다. 상기 산성 조건은 pH 2~6, 바람직하게는 pH 3~5, 더 바람직하게는 pH 4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

PFKA(6-phosphofructokinase) 단백질은 해당과정(glycolysis) 최초의 방향에서 fructose-6-phosphate를 더 인산화하여 fructose-1,6-diphosphate로 가는 반응을 촉매하는 효소이다. 이 효소는 알로스테릭효소(allosteric enzyme)로 해당과정의 중요 조절점이 되고 있다. ATP 또는 시트르산에 의해 활성이 저해되고, fructose-2,6-diphosphate, F6P, ADP 또는 AMP에 의해 활성화된다. 특히 fructose-2,6-diphosphate는 대단히 낮은 농도에서 작용 활성을 나타내며 생리적으로 가장 중요한 PFKA 단백질의 활성화 인자이다.

일반적으로 프로모터는 RNA 중합효소가 결합하여 전사개시를 유도하는 부분을 포함하며 프로모터의 염기서열에 따라 RNA 합성 정도가 결정되기 때문에 프로모터에 따라 유전자의 발현 강도가 다를 수 있다.

프로모터의 발현 활성의 수준은 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 특정 조건에서 측정된 프로모터의 발현수준을 일반적인 정상 조건 또는 비교 조건에서의 것과 비교함으로써 평가되는데, 프로모터의 조절 하에서 발현된 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 및 RNA 등의 생성량(발현수준) 또는 생성된 단백질의 활성에 의해 프로모터의 발현수준 또는 강도(세기)를 측정할 수 있다.

pH 조건에 따른 본 발명의 PFKA 프로모터에 의한 발현유도 능력을 측정하기 위하여 상기 프로모터를 포함하는 발현벡터에 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase) 유전자를 삽입하고, 상기 유전자가 재조합된 벡터를 사용하여 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 형질전환시킨 다음, 형질전환체를 선별할 수 있는 항생제를 포함하고 있는 중성(pH 7.0) 또는 산성(pH 4.0)의 배양액에 락토바실러스 플란타룸을 배양시켜 세포를 회수하고, 세포 용해물을 준비하여 베타-글루쿠로니다제의 기질인 4-nitrophenyl-β-D-glucuronide와 세포 용해물을 반응시켜 베타-글루쿠로니다제의 효소 활성에 의해 기질로부터 분해되어 생성된 4-nitrophenyl의 수준을 흡광도로 측정하여 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 PFKA 프로모터를 포함하는 형질전환체는 중성 조건의 배양액에서 배양한 경우보다 산성 조건의 배양액에서 배양한 경우에 베타-글루쿠로니다제 효소의 발현유도 활성이 높은 것으로 판명되었으며, 따라서 본 발명의 PFKA 프로모터의 발현유도 세기는 중성 조건보다 산성 조건에서 더 강하다는 사실을 확인하였다.

또한, 상기 프로모터 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체의 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 2의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 2의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프로모터를 포함하는 유산균 발현벡터 및 상기 유산균 발현벡터로 형질전환된 유산균을 제공한다.

발현벡터는 통상적으로 전사를 가능하게 하는 프로모터, 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 발현하는 유전자, 미생물 내에서 자기 복제하여 증폭할 수 있는 유전자 및 목적하는 벡터를 선별하기 위한 항생물질의 선택마커 유전자가 최소한 필요하며, 목적 유전자를 제외한 상기 유전자들은 벡터의 백본(backbone) 및 선택된 숙주에 따라 달라질 수 있다. 벡터 제작에 있어서 상기 최소한으로 필요한 유전자들은 당업자에게는 널리 알려져 있으며, 유전자 발현 조건 및 목적에 따라 용이하게 선택할 수 있다.

발현벡터를 적절한 숙주세포에 삽입한 다음, 당업계에 알려진 통상의 기술을 사용하여 형질전환체만을 선별할 수 있는 항생물질을 포함하는 숙주의 생장에 적합한 선택배지를 사용하여 목적 유전자를 발현할 수 있는 벡터를 함유하는 형질전환체를 선별할 수 있다.

상기 '목적 단백질' 또는 '외래 단백질'은 상기 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포에서는 정상적으로는 존재할 수 없는 단백질을 의미한다. 예를 들면, 유산균에서 바이러스 유래 또는 종양 유래 단백질을 인위적으로 발현하도록 조작하였을 경우, 상기 단백질을 목적 단백질 또는 외래 단백질이라 한다. 또한, 목적하는 생성물은 그 자체가 생물학적으로 활성인 단백질이거나 전사 후 특정 유전자의 불활성에 관여하는 RNA(예컨대 RNAi에 관여하는 siRNA)일 수 있다. 이러한 목적 유전자는 일반적으로 센스 방향으로 벡터 내에 존재할 것이지만, 특정 유전자를 불활성화시키기 위하여 안티센스 방향으로 존재할 수도 있다. 목적 유전자가 생물학적으로 활성인 단백질을 암호화하는 유전자라면 그 유전자는 통상 5' 비번역서열(5'UTR), 코딩 서열 및 3' 비번역서열(3'UTR)을 포함할 것이며, 그 외 절단된 형태의 단백질, 융합된 형태의 단백질, 태그된 형태의 단백질을 암호화하는 서열일 수 있으며, cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있고, 천연 형태의 생성물을 암호화하는 서열이거나 원하는 돌연변이 형태의 생성물을 암호화하는 서열일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 유산균 발현벡터에서, 상기 유산균 발현벡터는 본 발명의 PFKA 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결시켜 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다. 상기 프로모터와 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 연결 방법은 PCR, 제한효소 절단 및 라이게이션법 등 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있는 통상의 기술을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 유산균에서, 상기 유산균은 락토바실러스 속의 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 존소니(L. johnsonii), 락토바실러스 뮤코세(L. mucosae), 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 퍼멘툼(L. ferementum), 락토바실러스 델브루엑키(L. delbrueckii), 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 또는 락토바실러스 불가리커스(L. bulgaricus) 등일 수 있으며, 보다 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 존소니 또는 락토바실러스 뮤코세일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

상기 유산균 발현벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합하는 단계; 및

상기 재조합된 유산균 발현벡터로 유산균을 형질전환시키는 단계를 포함하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 산성 조건에서 발현되는 형질전환 유산균의 제조방법을 제공한다.

상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 유산균 내에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 산성 조건에서 발현이 증가되는 PFKA 프로모터를 함유하는 유산균 발현벡터에서 상기 프로모터의 하류에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 유산균 발현벡터를 유산균에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 유산균은 전술한 바와 같다.

본 발명에 따른 형질전환 유산균은 산성 조건에서 발현이 증가되는 PFKA 프로모터를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 것으로, 상기 프로모터의 하류에 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 산성 스트레스 조건 또는 산성 배양액 조건에서 더욱 발현 증가되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 유산균을 배양하는 것을 특징으로 하는 산성 조건에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환된 유산균을 배양하는 방법은 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있는 통상의 기술을 사용할 수 있으며 특정 방법에 특별히 제한되지 않으나, 배양액의 pH 조건을 산성 조건으로 조절하여 PFKA 프로모터의 강도를 높여 목적 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 락토바실러스 존소니( Lactobacillus johnsonii ) 유래의 PFKA 프로모터의 확보

락토바실러스 존소니를 중성(pH 7.0) 및 산성(pH 4.0) 조건으로 각각 조정한 MRS 배지(프로테오스 펩톤(proteose peptone) No.3 10g/ℓ, 쇠고기 추출물(beef extract) 10g/ℓ, 효모 추출물 5g/ℓ, 덱스트로스 20g/ℓ, 폴리소르베이트 80(polysorbate 80) 1g/ℓ, 시트르산암모늄(ammonium citrate) 2g/ℓ, 아세트산나트륨(sodium acetate) 5g/ℓ, 황산마그네슘(magnesium sulfate) 0.1g/ℓ, 황산망간(manganese sulfate) 0.05g/ℓ 및 인산이수소칼륨(dipotassium phosphate) 2g/ℓ)에서 24시간동안 배양하였으며, 각각의 조건에서 배양된 세포를 원심분리하여 회수한 후에 파쇄하고 세포내 단백질체를 확보하였다. 세포내 단백질체 시료를 초고압액체 크로마토그래피(Ultra High Pressure Liquid Chromotography, Thermo Fisher Scientific, 미국)에 주입한 후에 연이어 사중극자 기반 질량 분석계(Quadrupole-based Mass Spectrometer, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 해당작용 및 에너지 대사에 관여하는 PFKA(6-phosphofructokinase) 단백질이 산성 조건에서 발현량이 현저히 증가하는 것을 확인하였고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1) 및 프로모터 부위(서열번호 2)를 각각 확보하였다.

실시예 2. 유산균 발현벡터의 백본(backbone)으로 사용할 플라스미드의 분리

발현벡터의 백본으로 사용할 플라스미드를 락토바실러스 유산균으로부터 분리하기 위해, 먼저 발효식품 및 건강한 유아의 분변을 MRS 평판배지에 도말하고 37℃에서 48시간 배양한 후, 전형적인 유산균 콜로니를 다수 선발하였다. 각각의 콜로니를 배양하여 플라스미드 DNA를 추출하였으며, 2-5 kb 내외의 크기를 가진 플라스미드를 분리한 후, DNA 서열을 분석하였다.

분리한 플라스미드는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)로부터 분리된 것으로 pFD3.1(서열번호 3)로 명명하였다(도 1).

실시예 3. pFD3.1 플라스미드를 이용한 유산균 발현벡터의 구축

실시예 2에서 분리한 pFD3.1 플라스미드와 대장균 벡터 pUC19(Takara-Bio, 일본)를 연결한 후에, 프로모터 세기를 확인하기 위한 리포터 유전자로서 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase) 유전자를 SacI 및 XbaI 제한효소 사이트에 삽입하였고, XhoI 및 SacI 제한효소 사이트에 PFKA 유전자의 프로모터 영역(서열번호 2)을 삽입함으로써 유산균 발현벡터 pPFKA-glu를 완성하였다(도 2).

실시예 4. 유산균 발현벡터를 이용한 유산균 형질전환체의 제조

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 뮤코세(Lactobacillus mucosae) 등의 유산균을 숙주로 하여 상기 실시예 3에서 제작한 발현벡터를 다음과 같은 방법으로 도입하였다. 먼저, 유산균을 1% 글리신이 함유된 MRS 액체배지에 접종하여 OD₆₆₀=0.3~0.5에 도달할 때까지 배양한 후에 얼음에 10분간 방치하였다. 그 후, 5,000xg에서 20분간 원심분리하여 유산균을 회수한 후, 인산완충용액(5mM 인산나트륨(sodium phosphate), 1 mM 염화마그네슘(MgCl₂), pH 7.4)으로 2회 세척하였다. 1mM 수크로스(sucrose)와 1mM 염화마그네슘(pH 7.4)로 구성된 용액 100㎕에 현탁한 후에 발현벡터(pPFKA-glu)와 혼합하였다. 유산균과 발현벡터를 혼합한 용액을 얼음에 잠시 방치한 후 1~5kV, 10~50μF의 조건으로 전기천공법(electroporation)을 실시하였다. 상기 형질전환을 수행한 혼합액에 MRS 배지 500㎕를 첨가하고 37℃에서 2~3시간 배양한 후, 세포를 침전시켜 5~10㎍/㎖ 농도의 에리트로마이신(erythromycin)이 함유된 MRS 고체배지에 도말하였다. 37℃에서 48~72시간 동안 배양한 후에 생성된 콜로니를 취하여 푸른색을 나타내는 형질전환체를 선별하였다(도 3). 각 유산균을 숙주로 한 형질전환 효율은 표 1에 나타난 바와 같이, 각 종에 따라 형질전환 효율은 차이가 나지만 락토바실러스 종 모두에게서 형질전환체를 수득할 수 있었다.

pPFKA-glu 발현벡터의 형질전환 효율

균종	형질전환효율(cfu/㎍ of DNA)
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)	2.8 x 10³
락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)	5.2 x 10²
락토바실러스 뮤코세(Lactobacillus mucosae)	3.6 x 10²

실시예 5. 리포터 유전자 활성 측정을 통한 프로모터 세기 비교

산성 및 중성 조건에서 PFKA 프로모터의 발현 세기를 비교하기 위해, 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase) 리포터 유전자의 활성을 측정해보았다. 먼저, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 3㎍/㎖의 에리트로마이신이 첨가된 MRS 배지에 접종하였다. 37℃에서 24시간동안 배양한 후 원심분리방법으로 균체를 회수하였으며, 회수한 균체를 PBS 완충용액으로 2회 세척하였다. pH 4.0 및 pH 7.0로 조정한 각각의 MRS 액체배지에 동량의 균체를 접종한 후에, 37℃에서 OD₆₀₀=0.5~0.6이 될 때까지 배양하였다. 균체를 각각 회수한 후에 파쇄하였으며, 원심분리방법으로 세포 용해물(lysate)을 회수하여 베타-글루쿠로니다제 활성 측정을 위한 조효소액으로 사용하였다. 상기 조효소액 500㎕에 기질인 4-nitrophenyl-β-D-glucuronide(Sigma, 미국)가 1mM의 농도로 포함된 용액(0.05M 인산나트륨, pH 7.0, 10mM β-mercaptoethanol, 1mM EDTA 및 0.1%(v/v) Triton X-100) 500㎕를 첨가하고 37℃에서 10분간 효소반응을 유도한 후, 100㎕의 반응정지용액(0.4M 수산화나트륨)을 첨가하여 반응을 종료시키고, 분광광도계를 사용하여 540mm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 1 유닛(unit)은 37℃에서 1분간 기질을 반응시켜 1μmole의 4-니트로페닐(nitrophenyl)이 생성되는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

리포터 유전자 베타-글루쿠로니다제의 활성 측정 결과, 중성 조건(pH 7.0)에서의 PFKA 프로모터의 세기는 평균 531 유닛인 반면에, 산성 조건(pH 4.0)에서의 PFKA 프로모터의 세기는 평균 1,151 유닛으로서, 중성 조건보다 산성 조건에서 약 217% 더 높은 활성을 나타내었다(도 4). 상기의 결과를 통해, 본 발명의 PFKA 프로모터는 산성 조건에서 목적단백질의 발현을 더욱 효율적으로 발현시킬 수 있는 프로모터임을 확인할 수 있었다.

<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Promoter having increased expression under acidic condition from Lactobacillus johnsonii and uses thereof <130> PN16382 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 960 <212> DNA <213> Lactobacillus johnsonii <400> 1 atgaaacgga ttggtatttt aactagtggt ggagatgccc ctggtatgaa cgctgccatt 60 agagctgtta ctcgtacagc tttggcaaac ggtatcgaag tttgcggaat tcgttatgga 120 tatgctggtt tagttgctgg tgatattttc caaatgactt ctgaaacagt tgcggataaa 180 attagccgcg gcggtacttt tctttattca gctcgtttcc cagaatttaa ggaagaagaa 240 gttcaactta agggaatcga acaattaaag aagcacggaa tcgatgcttt agttgtcatt 300 ggtggtgatg gttcttacca cggtgcattg aagcttacaa gccatggcta taatgctatt 360 ggtcttcctg gttcaattga caacgatatt ccttatactg attacacaat tggttttgac 420 actgcatgta atactgcaat ggaagccatt gataagattc gtgatactgc aacaagtcac 480 caacgtgtat ttgttgtaaa tgttatgggt cgtgattgtg gggatatcgc aatgcacgtt 540 ggtgttgcta ccggtgctga cgcaattgtt attccagaag aaccttatga cattaaggaa 600 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Claims

서열번호 2의 염기서열로 이루어진 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 유래의 산성 조건에서 발현이 증가되는 PFKA 프로모터.
제1항의 프로모터를 포함하는 유산균 발현벡터.
제2항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결시켜 제조된 유산균 발현벡터.
제3항의 유산균 발현벡터로 형질전환된 유산균.
제2항의 유산균 발현벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합하는 단계; 및
상기 재조합된 유산균 발현벡터로 유산균을 형질전환시키는 단계를 포함하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 산성 조건에서 발현되는 형질전환 유산균의 제조방법.
제5항의 방법에 의해 제조된 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 산성 조건에서 발현되는 형질전환 유산균.
제6항의 형질전환된 유산균을 배양하는 것을 특징으로 하는 산성 조건에서 목적 단백질을 발현시키는 방법.