CN105543200A - 一种稳定性提高的胆盐水解酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定性提高的胆盐水解酶突变体，属于酶工程领域。本发明通过定点突变的方式，将来源于唾液乳酸杆菌的胆盐水解酶BSH2分子中位于疏水腔入口处的氨基酸谷氨酰胺突变成丙氨酸，改变了分子内部疏水性，提高了胆盐水解酶的热稳定性及氧化稳定性。改造后的酶蛋白，稳定性提高，更适合工业生产应用。

Description

一种稳定性提高的胆盐水解酶突变体
技术领域
本发明涉及一种稳定性提高的胆盐水解酶突变体，属于酶工程领域。
背景技术
胆汁是哺乳动物对摄入的脂肪进行初级消化的物质，其主要成分胆汁酸(bileacids)在体内以钠盐或钾盐的形式存在，简称胆盐(bilesalts)。胆盐由盐初级胆汁酸和次级胆汁酸盐组成。初级胆汁酸盐，由肝细胞合成，包括胆酸、鹅脱氧胆酸及其与甘氨酸和牛磺酸结合的产物；次级胆汁酸盐，是初级胆汁酸盐在肠道中受细菌作用生成的脱氧胆酸和石胆酸及其在肝中生成的结合产物。由于胆汁酸作为一种信号物质，在生物循环中，参与了机体脂质、胆固醇和糖的生化代谢及调节，因此，研究人员认为改变胆汁酸的组成和流量可以作为一种治疗代谢综合征的新方向。
胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是降解胆汁的主要组成成份——共轭胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共轭胆酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐水解酶的生理作用体现在两个方面：一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和降低胆固醇水平等；二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。
运用基因工程手段提高胆盐水解酶的稳定性将为研究BSH作用于宿主和菌体提供技术平台，对运用BSH调节宿主健康状况，改善微生物在复杂肠道环境的生存具有重要意义。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种稳定性提高的胆盐水解酶突变体，所述突变是对氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的来源于唾液乳酸杆菌的胆盐水解酶BSH2内部氨基酸进行定点突变，从而提高了胆盐水解酶的稳定性。
所述突变是将胆盐水解酶第58位的谷氨酰胺突变为丙氨酸，得到突变体Q58A。
所述胆盐水解酶突变体Q58A的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述胆盐水解酶突变体的核苷酸片段、含有所述胆盐水解酶突变体的载体，以及表达所述胆盐水解酶突变体的的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为大肠杆菌，是将含有编码所述胆盐水解酶突变体的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是pET-20b(+)为载体、E.coliBL21(DE3)为宿主表达所述突变体。
本发明的第三个目的是提供一种生产胆盐水解酶的方法，是利用编码所述胆盐水解酶突变体的核苷酸片段、含有所述胆盐水解酶突变体的载体或者表达所述胆盐水解酶突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将表达所述胆盐水解酶突变体的基因工程菌诱导培养后收集菌体，并破壁纯化获得；所述破壁纯化是收集菌体后，用0.1M、pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤离心2次，并重悬，超声破碎5min，离心收集上清液，经过镍柱亲和柱层析和截留分子量为10kDa的超滤膜进行纯化浓缩，获得单一重组蛋白。
所述诱导培养，是培养种子液，按接种量为1％接种到TB液体培养基中，37℃培养；菌体长到OD600为0.8时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到20℃，培养24h。
本发明还要求保护所述胆盐水解酶突变体，或者利用生产胆盐水解酶的方法生产得到的胆盐水解酶在食品、农业或制备药物方面的应用，尤其是在制备微生态制剂、药物表达载体或饲料添加剂方面的应用。
本发明的第四个目的是提供一种提高胆盐水解酶BSH2稳定性的方法，是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的胆盐水解酶蛋白质分子内部第58位的谷氨酰胺突变为丙氨酸。
关于突变体命名：
以“亲本氨基酸位点取代后氨基酸”表示突变体，比如S32A，是指在亲本氨基酸序列的基础上将第32位的氨基酸S(丝氨酸，Ser)突变为氨基酸A(丙氨酸，Ala)。
本发明的有益效果：
本发明通过定点突变的方式，将胆盐水解酶分子内部疏水腔入口处的氨基酸谷氨酰胺突变成丙氨酸，改变了分子表面疏水性，将胆盐水解酶热稳定性增加了20℃，氧化稳定性提高了3倍。本发明的基因工程菌生产的胆盐水解酶变异体蛋白，稳定性提高，为工业应用奠定了基础。
附图说明
图1：胆盐水解酶野生型BSH2与突变株Q58A的热稳定性的比较；
图2：胆盐水解酶野生型BSH2与突变株Q58A的氧化稳定性的比较。
具体实施方式
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0；
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/LK2HPO4。
胆盐水解酶活性鉴定方法：滴加5μL受体菌菌液至别含有0.01％猪胆盐(w/v)的LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素和24μg/mLIPTG)上，通过能否产生白色或透明沉淀圈检验胆盐水解酶的活性。
胆盐水解酶酶活测定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释至90μL，加入10μL结合胆盐(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等体积的15％(w/v)三氯乙酸终止反应，离心后取10μL上清液与190μL茚三酮试剂混合，于100℃反应15min，冷却后于570nm处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成为：0.5mL1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5柠檬酸盐缓冲液)，1.2mL甘油，0.2mL0.5M、pH5.5的柠檬酸缓冲液。
实施例1：重组菌的构建
以前期构建的携有胆盐水解酶BSH2编码基因(氨基酸序列如SEQIDNO.1)的重组质粒pET22的DNA为模板，按照KOD-Plus-Neo试剂盒说明书进行PCR扩增，引物序列为：
Q58A-F:5’-ACTGGGATGGCGCTAGTGGCTGATAACTATCCACTATAT-3’(序列如SEQIDNO.4)
Q58A-R:5’-ATATAGTGGATAGTTATCAGCCACTAGCGCCATCCCAGT-3’(序列如SEQIDNO.5)
PCR产物为重组质粒pET22Q58A转化至克隆宿主E.coilJM109的感受态细胞，于氨苄青霉素的LB平板上，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，经上海生工测序鉴定。测序正确的质粒(含有氨基酸序列如SEQIDNO:2、核苷酸序列如SEQIDNO:3的序列)，转化大肠杆菌E.coilBL21(DE3)，得到重组菌。
实施例2：重组菌中酶蛋白的诱导表达及活性鉴定
将表达胆盐水解酶突变体的重组大肠杆菌，挑选单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1％，于37℃、200rpm条件下培养至菌体长到OD600为0.8时，加入IPTG诱导，IPTG浓度为0.1mM，并将培养温度降到20℃，培养24h。按照胆盐水解酶活性鉴定方法，检测到受体菌在含有0.01％猪胆盐(w/v)的LB固体平板出现透明的沉淀圈，表明受体菌表达的胆盐水解酶突变体有活性。
实施例3：突变株Q58A的制备及稳定性测定
收集实施例2发酵后的菌体，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤离心2次，并重悬，超声破碎5min(工作时间:间歇时间＝2:4)，离心收集上清液，经过镍柱亲和柱层析和截留分子量为10kDa的超滤膜获得纯化浓缩后的胆盐水解酶突变体蛋白。测定并比较野生型胆盐水解酶BSH2和本发明的突变体Q58A的稳定性。
(1)热稳定性
热稳定性的测定通过将蛋白置于不同温度下孵育30min后，测定残留酶活。定义标准处理方法下测定的残留活性为100％。结果如图1所示。
与野生型胆盐水解酶BSH2相比，胆盐水解酶突变体Q58A的热稳定性提高了20℃；野生型BSH2在60℃的残留酶活为0，而突变体Q58A还能保持75％左右的酶活；在70℃处理30min也还能爆出42％左右的酶活。说明本发明的突变体Q58A具有显著提高的热稳定性。
此外，发明人还将疏水腔入口处的氨基酸Phe24位点由苯丙氨酸突变成丙氨酸，得到突变体F24A，结果发现，与野生型BSH2相比，突变体F24A的热稳定性也有所提高，在60℃时可保持50％左右的酶活，但提高的程度低于突变体Q58A。
(2)氧化稳定性
氧化稳定性的测定通过将蛋白置于不同浓度H2O2下孵育10min后，测定残留酶活。定义未经H2O2处理的酶蛋白的残留活性为100％。结果如图2所示。
与野生型胆盐水解酶BSH2相比，胆盐水解酶突变体Q58A的氧化稳定性提高了3倍。野生型BSH2在1mM的H2O2处理10min后残留酶活不足20％，而突变体Q58A仍能保持90％左右的酶活，用4mM的H2O2处理10min也能保持50％的酶活。
此外，发明人还将疏水腔入口处的氨基酸Phe24位点由苯丙氨酸突变成丙氨酸，得到突变体F24A，结果发现，与野生型BSH2相比，突变体F24A在1mM的H2O2处理10min后残留酶活能够保持80％，4mM的H2O2处理10min能保持30％的酶活，氧化稳定性高于野生型BSH2，但低于突变体Q58A。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种稳定性提高的胆盐水解酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
3.编码权利要求1所述胆盐水解酶突变体的核苷酸片段。
4.含有权利要求1所述胆盐水解酶突变体的载体。
5.表达权利要求1所述胆盐水解酶突变体的的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是pET-20b(+)为载体、E.coliBL21(DE3)为宿主表达所述突变体。
8.在一种生产胆盐水解酶的方法，其特征在于，是利用权利要求3所述的核苷酸片段、权利要求4所述的载体或者权利要求5-7任一所述的基因工程菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是将基因工程菌诱导培养后收集菌体，并破壁纯化获得；所述破壁纯化是收集菌体后，用0.1M、pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤离心2次，并重悬，超声破碎5min，离心收集上清液，经过镍柱亲和柱层析和截留分子量为10kDa的超滤膜进行纯化浓缩，获得单一重组蛋白。
10.权利要求1-2任一所述胆盐水解酶突变体，或者权利要求8-9任一所述方法得到的胆盐水解酶在食品、农业或制备药物方面的应用。
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