CN103992991A - 一种胆盐水解酶突变体及其应用 - Google Patents

一种胆盐水解酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胆盐水解酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对胆盐水解酶氨基酸序列比对分析和3-D结构的同源模拟及叠加分析，确定胆盐水解酶底物特异性氨基酸突变位点，利用定点突变技术将底物特异性氨基酸突变为非极性氨基酸，将突变体导入宿主菌，获得突变菌株。突变体所产胆盐水解酶均为活性酶，且与野生型相比，突变体对甘氨结合胆盐的水解能力都有下降的趋势，而对牛磺结合胆盐的水解能力则有增加的趋势。这为提高BSH对牛磺结合胆盐的水解能力和揭示其对底物的结合机制奠定了基础。

Description

一种胆盐水解酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种胆盐水解酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
通过底物特异性的研究发现，胆盐水解酶有很强的底物选择性，其水解甘氨结合胆盐（glyco-conjugated bile salts）的能力远远高于水解牛磺结合胆盐（tauro-conjugated bile salts）的能力，这与报道的大多数BSH的底物特异性一致。然而正常人体中甘氨结合胆盐与牛磺结合胆盐的比例为3:1，这将导致牛磺结合胆盐不能被BSH很好的水解。
胆盐水解酶的底物是由类固醇核部分和氨基酸基团（甘氨酸/牛磺酸）两部分组成的。Huijghebaert和Hofmann发现，修饰底物的酰胺键或减少底物氨基酸部分末端基团的负电荷会显著降低胆盐水解酶对相应底物的水解能力。Batta等也发现胆酰甘氨酸水解酶（CGH）能有效水解由带有一到两个亚甲基的甘氨酸或牛磺酸类似物制成的底物。而且目前大多数文献中的动力学数据都表明BSH优先识别底物的氨基酸基团。然而Moser and Savage等发现BSH优先识别底物的类固醇核部分。此外，Batta等和Rossocha等的研究证实，类固醇部分的羟基取代基或异构化的羟基取代基对BSH的底物特异性没有影响，而且BSH是通过疏水相互作用而不是氢键与底物的类固醇部分结合的。因此，关于BSH对底物的识别位点还存在一定的争议，胆盐水解酶可能对类固醇核部分和氨基酸基团都有识别作用。也有可能是BSH对底物没有特异性的结合条件，只要氨基酸部分和类固醇部分合适且与底物结合口袋互补就行。为了增强BSH水解牛磺结合胆盐的能力以及揭示BSH与底物的结合机制，有必要寻找和研究决定其底物特异性的氨基酸残基（specificity-determining residue,SDR）。
本发明根据现有的报道，通过氨基酸序列比对分析以及同源建模等发现，L.plantarumBBE7 BSH 65位氨基酸的极性对BSH的底物特异性有一定的影响。并利用定点突变研究了突变体对酶的底物特异性的影响。
发明内容
本发明提供了一种胆盐水解酶突变体及其应用，主要涉及改变胆盐水解酶氨基酸序列的底物特异性。
所述突变体是胆盐水解酶，来源于植物乳杆菌L.plantarum BBE7，突变位点为第65位酪氨酸，突变后65位氨基酸是非极性氨基酸，具体为丙氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸中的任一一种。
另外，本发明还提供了一种获得胆盐水解酶突变的方法，是利用定点突变技术将胆盐水解酶底物特异性氨基酸突变为非极性氨基酸。具体为将植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶第65位酪氨酸突变为非极性氨基酸：丙氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸中任一一种。
通过本方法除可将L.plantarum BBE7BSH65位氨基酸分别突变成了3个非极性氨基酸外，还可突变为2个极性氨基酸。方法的具体操作步骤如下：
1、利用在线工具ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对底物特异性已知的BSH的氨基酸序列进行比对和分析。
2、采用在线软件Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)对L.plantarum BBE7的BSH进行3-D结构的同源模拟。并利用软件Accelrys Discovery Studio Client 2.5对该结构与C.perfringens 13 CBAH的结构（PDB code:2BJF,2BJG）进行叠加和分析。
突变菌株的构建，包括如下步骤：
1）以质粒pET-20b(+)-dmsA-bsh为模板，分别以下几对引物进行PCR扩增；
65A-F：5’-CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACGCCGATG-3’
65A-R：5’-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGGCGTAAAG-3’
65C-F：5’-CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACTGTGATG-3’
65C-R：5’-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCACAGTAAAG-3’
65F-F：5’-CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACTTCGATG-3’
65F-R：5’-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGAAGTAAAG-3’
65I-F：5’-CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACATTGATG-3’
65I-R：5’-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCAATGTAAAG-3’
65N-F：5’-CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACAACGATG-3’
65N-R：5’-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGTTGTAAAG-3’
PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：5×PrimeSTAR Buffer 10μL;dNTPMixture 4μL;模板DNA 1μL；上下游引物各2μL；PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5μL；加双蒸水至终体积为50μL。
PCR扩增条件：94℃预变性10min；98℃变变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min（30个循环）；72℃延伸10min。
2）将PCR产物直接用限制性内切酶Dpn I进行消化（37℃,1h），取10μL酶切产物转化E.coli JM109感受态细胞，直接挑取含有抗生素的LB固体平板上的单菌落进行培养，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序；
3）将测序正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞，即得到突变菌株。
突变体的表达与纯化；
1）培养基：种子和斜面培养基为LB培养基（1L）：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，用1N NaOH将pH调至7.0；斜面培养基添加琼脂15g；基本发酵培养基为TB培养基（1L）：去离子水900mL，胰蛋白胨12g，酵母抽提物24g，甘油10mL，高压灭菌，冷却至60℃，加100mL灭菌磷酸钾缓冲液；
2）培养方法：将20℃、200rpm下过夜培养的种子以2%的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养至OD600=0.6，加入0.4mM IPTG于20℃诱导35h；通过SDS-PAGE和酶活测定，分析突变体的表达情况。
SDS-PAGE蛋白电泳的方法：SDS-PAGE胶的组成为：上层浓缩胶为5%，下层分离胶为12%，电泳缓冲液为Tris-HCl缓冲液（pH8.0）。具体方法见碧云天SDS-PAGE配制试剂盒说明书。酶活的测定方法是分别将10mM的底物甘氨胆酸（GCA），甘氨脱氧胆酸（GDCA），甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA），牛磺胆酸（TCA），牛磺脱氧胆酸（TDCA）和牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）添加到反应体系中，37℃反应30min，用茚三酮法进行比酶活的测定，比酶活最高者为100%。
具体方法为：取0.1mL样品加入1.8mL 0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）和0.1mL结合胆盐（200mM）中混合，并置于37℃孵育30min，取0.5mL上述反应液加入0.5mL15%(w/v)三氯乙酸终止反应，混合均匀后，离心10min(离心机最大转速,4℃)取上清。将0.1mL上清液与1.9mL茚三酮显色液（包括0.5mL1%茚三酮（溶解于0.5M柠檬酸缓冲液（pH5.5）中）、1.2mL甘油和0.2mL 0.5M的柠檬酸缓冲液（pH5.5））混合，震荡混匀，沸水浴14min。冷却3min后测定570nm下的吸收值。标准曲线用甘氨酸或牛磺酸制作。并用Brandford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白的含量，计算比酶活。
3）利用硫酸铵沉底、透析、Ni2+亲和层析和凝胶过滤层析纯化突变体。
突变体的分离纯化方法如下：
结合缓冲液（24mL）：3mL8×磷酸盐缓冲溶液，0.24mL 2M咪唑，加水至24mL，调pH至7.4～7.6。此缓冲液含有20mM的磷酸盐（1×），500mM NaCl和20mM咪唑。
洗脱缓冲液（8mL）：1mL8×磷酸盐缓冲溶液，2mL2M咪唑，加水至8mL，调pH至7.4～7.6。此缓冲液含有20mM的磷酸盐，500mM NaCl和500mM咪唑。
8×磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）：1.42g Na2HPO42H2O（177.99g mol-1），1.11g NaH2PO4H2O（137.99g mol-1），23.38g NaCl（58.44g mol-1），加入90mL蒸馏水，充分溶解，将pH调至7.4，再定容至100mL，用0.45μm滤膜过滤。
2M咪唑（pH7.4）：13.62g咪唑（68.08g mol-1），加入90mL蒸馏水，完全溶解，用HCl调pH至7.4，定容至100mL，用0.45μm滤膜过滤。
1）盐析
在800mL发酵上清液中加入10%（v/v）的甘油，随后将其放在磁力搅拌器上进行搅拌，再缓慢加入研磨的、干燥的硫酸铵粉末至其饱和度为40%。在冰上放置1h后，离心（7000rpm；30min；4C）取上清，加硫酸铵至其饱和度为80%。在4C放置4h以上，离心收集沉淀，并将其溶解到20mL 50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）。
2）透析
将硫酸铵沉淀后的样品用透析袋（截留分子量为50kDa）在50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）中透析24h，每隔三四个小时换一次缓冲液，直至样品中硫酸铵全部透析出来。
3）Ni2+亲和层析
用5～10mL的结合缓冲液以1mL min-1的流速平衡HisTrap FF crude柱（1mL），将样品以1mL min-1的流速进样至层析柱上，随后用10mL的结合缓冲液洗脱未结合蛋白，再用洗脱缓冲液对目的蛋白进行梯度洗脱，并进行收集（固定体积和峰收集），最后对收集液进行SDS-PAGE电泳分析和酶活测定。
4）凝胶柱纯化
利用超滤离心管将含有重组BSH的组分离心（4000rpm；4℃）浓缩至2mL左右。然后用Superdex G-200预装柱对浓缩的样品进行纯化，所用的缓冲液为20mM的磷酸钠缓冲液（pH6.0），流速为0.5mL min-1。收集含有BSH的组分。
3、突变体底物特异性的测定。
通过对不同底物酶活的测定，分析野生型BSH和突变型BSH的底物特异性。
本发明的有益效果：与野生BSH相比，突变体Y65A，Y65F和Y65I对甘氨结合胆盐的水解能力都有下降的趋势，而对牛磺结合胆盐的水解能力则有增加的趋势。这为提高BSH对牛磺结合胆盐的水解能力和揭示其对底物的结合机制奠定了基础。
附图说明
图1：与已知的胆盐水解酶的氨基酸序列比对图。
图2：L.plantarum BBE7 BSH和脱氧胆酸（DCA）、牛磺酸（Taurine）的复合体的结构及保守氨基酸空间位置。
图3：E.coli BL21(DE3)pLysS表达突变体的SDS-PAGE分析。
图4：SDS-PAGE分析纯化的突变体。
图5：野生BSH与突变体的底物特异性。
具体实施方式
实施例1：pET-20b(+)-dmsA-bsh构建方法
具体操作如下：
质粒pUC57-Tat(Tat-dependent protein targeting in prokaryotes and chloroplasts)为模板，扩增dmsA基因，PCR条件为：95℃预变性10min；98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 20s，30个循环；72℃延伸10min。同时以L.plantarum BBE7的基因组DNA为模板，PCR扩增（延伸时间为1min）不含终止密码子的bsh基因，将这两个片段进行胶回收，以等摩尔的这两个片段为模板，得到融合片段dmsA-bsh。
2)用Nde I和Xho I进行双酶切，与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)进行连接，得到重组质粒pET-20b(+)-dmsA-bsh。并将重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞，并筛选阳性重组子进行测序。
实施例2：氨基酸序列比对分析
利用在线工具ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对底物特异性已知的BSH的氨基酸序列进行比对和分析。进行比对分析的胆盐水解酶基因包括以下23种，具体氨基酸序列见图1：
LSB-30514_bsh1,L.salivarius B-30514 BSH1(AFP87505.1);
LSUCC118_bsh1,L.salivarius UCC118 BSH1(ACL98201.1);LSLGM14476_bsh1,L.
salivarius LGM14476 BSH1(ACL98197.1);LSLGM14476_bsh2,L.salivarius LGM14476(ACL98205.1);
LSJCM1046_bsh1.L.salivarius JCM1046BSH1(ACL98194.1);
LPST-III-bsh1,L.plantarum subsp.plantarum ST-III BSH1(ADO00098.1);LPBBE7_bsh,L.
plantarum BBE7BSH;
LPWCFS1_bsh1,L.plantarum WCFS1(CCC80500.1);
LP80_bsh,L.plantarum80(AAB24746.1);
LRCRL1098_bsh,L.reuteri CRL 1098(ACH81023.1);
LJ100_chshalpha,L.johnsonii100-100CBSH-α(AAG22541.1);
LJ100_chshbeta,L.johnsonii100-100CBSH-β(AAC34381.1);
LJPF01_bshA,L.johnsonii PF01 BSHA(EGP12224.1);
LJPF01_bshB,L.johnsonii PF01 BSHB(EF536029.1);
LJPF01_bshC,L.johnsonii PF01 BSHC(EGP12391.1);
LANCFM_bshA,L.acidophilus NCFM BSHA(YP_193782.1);
LANCFM_bshB L.acidophilus NCFM BSHA(AAV42923.1);
LGAM1_bsh,L.gasseri Am1 BSH(FJ439777.1);
CPERF13_cbah1,Clostridium perfringens 13 CBAH-1(P54965.3);
BLBB536_bsh,Bifidobacterium longum BB536 BSH(AEK27050.1);BLSBT2928_bsh,B.
longum SBT2928 BSH(AAF67801.1);
BBATCC11863_bsh,B.bifidum ATCC 11863 BSH(AAR39435.1);
BABI30_bsh,B.animalis subsp.lactis Bi30 BSH(AEK27050.1)。
氨基酸序列比对表明，这些序列之间的相似度为30.57%-99.69%，平均值为46.78%。根据C.perfringens CBAH的晶体结构的数据，确定了保守的活性位点氨基酸、底物结合口袋和二级结构。从图1中可以看出，活性位点氨基酸在所有的BSH中都是高度保守的。而底物结合口袋（β6,β7和β11）的氨基酸都不是保守的，除了严格保守的Leu142（具体原因尚不清楚）。在所有的BSH中，底物结合口袋的氨基酸主要是疏水氨基酸，这表明BSH可能通过疏水相互作用与底物的疏水性的类固醇部分结合。
此外，位于C.perfringens CBAH中的68位氨基酸（Ala68）（在L.plantarum BBE7 BSH中是Tyr65）的极性对BSH的底物特异性有一定的影响，这可能是因为Ala68位于形成底物结合口袋的β7上。当这个氨基酸为非极性氨基酸（丙氨酸（A）和苯丙氨酸（F））时，BSH偏向于水解牛磺结合胆盐；而当这个氨基酸为极性氨基酸（酪氨酸（Y）和半胱氨酸（C））时，BSH则偏向于水解甘氨结合胆盐，这与Chae等的研究结果一致。此外，尽管存在少数例外，如BABI30_bsh的68为氨基酸为非极性的苯丙氨酸，而它却偏向于水解甘氨结合胆盐，但这至少可以表明68位氨基酸是许多决定底物特异性的氨基酸残基（SDR）中的一个，可能还有其它的SDR需要进一步挖掘。
实施例3：同源结构模拟和叠加
利用在线软件Swiss Model对L.plantarum BBE7 BSH的3-D结构进行了同源模拟，用于同源建模的模板是C.perfringens 13 CBAH的突变体C2a（PDB ID:2rf8B）。二者序列的同源性为37.69%。模拟后BSH模型的估计绝对模型质量（QMEAN Z-Score）和α碳原子的均方根偏差（Root-Mean-Square Deviation,RMSD）分别为-3.61和将该模型与CBAH和底物的复合体结构（PDB code:2BJF,2BJG）进行叠加（RMSD为），得到了L.plantarum BBE7BSH和脱氧胆酸（DCA）、牛磺酸（Taurine）的复合体的结构（图2a）。图2a中L.plantarum BBE7 BSH与C.perfringens 13 CBAH结构的叠加，深灰为BSH，浅灰为CBAH；图2b描述了L.plantarum BBE7 BSH中保守的氨基酸（Cys2，Arg16，Asp19，Asn79，Asn170和Arg223）以及Tyr65与底物DCA的空间位置关系，其中Tyr65位于底物DCA的异戊酸侧链以及催化中心Cys2附近。而且这个异戊酸侧链离C12位的羟基取代基很近，在这里增加亲水性的（极性的）氨基酸会改变酶的底物亲和力。此外，Tyr65还与β-11有紧密的相互作用，而β-11位于αββα核心结构内，因此它对Ntn水解酶家族的酶的底物结合和催化都起到重要作用。
综合氨基酸序列比对以及同源结构模拟和叠加的结果，L.plantarum BBE7 BSH的65位氨基酸的极性和空间位置决定了它对酶的底物特异性有一定的影响。
实施例4：定点突变及突变体的表达和纯化
采用一步法对65位的氨基酸进行了定点突变，将它分别突变成两个极性的氨基酸（C和N）以及三个非极性的氨基酸（A,F和I）。通过蛋白电泳和酶活测定发现，突变体Y65A，Y65F和Y65I都以活性酶的形式被分泌到胞外（图3-3a，其中（a）全细胞；（b）破壁沉淀；1，Y65C；2，Y65N；3，Y65A；4，Y65F；5，Y65I；6，含有pET-20b(+)的E.coli BL21(DE3)pLysS；M，蛋白分子量标准），而突变体Y65C和Y65N则以包涵体的形式存在于胞内（图3-3b）。而且这两个突变体的信号肽DMSA与BSH形成的前体（分子量约为42kDa）没有被信号肽切割，也在胞内形成了包涵体（图3-3b）。这可能是因为C和N为极性氨基酸，而A，F和I为非极性氨基酸。而且Tyr65离催化反应中心Cys2很近。因此，L.plantarum BBE7 BSH65位氨基酸的极性对蛋白的正确折叠至关重要，这也进一步证实了底物结合口袋的氨基酸一般为非极性的疏水氨基酸。
采用Ni2+柱和凝胶柱分别对突变体Y65A，Y65F和Y65I进行了纯化。SDS-PAGE电泳分析的结果表明，纯化后的重组酶均达到了电泳纯（图4，其中1，Y65A；2，Y65F；3，Y65I；M，蛋白分子量标准）。
实施例5：突变体底物特异性的测定
分别将10mM的底物甘氨胆酸（GCA），甘氨脱氧胆酸（GDCA），甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA），牛磺胆酸（TCA），牛磺脱氧胆酸（TDCA）和牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）添加到反应体系中，37℃反应30min，用茚三酮法进行比酶活的测定。比酶活最高者为100%。
通过酶活测定分析了野生BSH与突变体的底物特异性，具体结果见图5，其中GCA为甘氨胆酸；GDCA为甘氨脱氧胆酸；GCDCA为甘氨鹅脱氧胆酸；TCA为牛磺胆酸；TDCA为牛磺脱氧胆酸；TCDCA为牛磺鹅脱氧胆酸；误差线表示的是标准偏差。从图中可以看出，与野生BSH相比，突变体Y65A、Y65F和Y65I对甘氨结合胆盐的水解能力都有所下降，其中Y65A和Y65I的下降趋势最明显，Y65I对GCDCA的比酶活比野生BSH下降了70.46%。这三个突变体对牛磺结合胆盐的水解能力却明显增加，Y65I的增加趋势最明显，它对TDCA的比酶活比野生BSH增加了4倍多。此外，这三个突变体对甘氨结合胆盐和牛磺结合胆盐的水解能力的总体趋势为：Y65I>Y65A>Y65F。除了Y65F外，Y65A和Y65I对甘氨结合胆盐和牛磺结合胆盐的水解能力与它们的疏水性参数大小（I(4.5)>A(1.8)）有关。
突变体的底物特异性的结果还表明，突变体对含有不同类固醇核的底物的水解能力如下：(G/T)CDCA>(G/T)DCA>(G/T)CA。这可能是因为CDCA的C12位和DCA的C7分别比CA少了一个羟基，导致了它们的疏水性强于CA。且DCA缺少的羟基在C7位，离Tyr65比较远，对它们之间的相互作用的影响比CDCA小。
综上所述，将65位的氨基酸突变为非极性氨基酸时，BSH对牛磺结合胆盐的水解能力增强，而对甘氨结合胆盐的水解能力减弱；且底物的C7和C12位羟基取代基对酶的底物特异性也有一定的影响，为揭示其对底物的结合机制奠定了基础。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种胆盐水解酶突变体，其特征在于，改变胆盐水解酶氨基酸序列的底物特异性。
2.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，植物乳杆菌胆盐水解酶第65位酪氨酸为突变为非极性氨基酸。
3.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶第65位酪基酸为突变为非极性氨基酸。
4.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶第65位酪氨酸为突变为丙氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸中的任一一种。
5.根据权利要求4所述突变体，其特征在于，植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶第65位酪氨酸为丙氨酸。
6.根据权利要求4所述突变体，其特征在于，植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶第65位酪氨酸为苯丙氨酸。
7.根据权利要求4所述突变体，其特征在于，植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶第65位酪氨酸为异亮氨酸。
8.一种获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，将植物乳杆菌L.plantarum BBE7底物特异性氨基酸突变为非极性氨基酸。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶第65位酪氨酸为突变为非极性氨基酸。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶第65位酪氨酸为突变为丙氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸中任一一种。
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