CN105567619A - 一种产胆盐水解酶变异体的基因工程菌及其制备方法 - Google Patents

一种产胆盐水解酶变异体的基因工程菌及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产胆盐水解酶变异体的基因工程菌及其制备方法，属于基因工程技术领域。本发明将胆盐水解酶变异体基因克隆连接到大肠杆菌表达载体pET-20b(+)，转化至Escherichia？coli？BL21(DE3)，经筛选鉴定得到一株过量表达胆盐水解酶变异体的重组大肠杆菌Escherichia？coli？BL21(DE3)-pET20b(+)-bsh1v；蛋白纯化步骤为分步超滤结合分子筛，获得了单一重组蛋白。本发明制备的重组蛋白底物专一性提高，能够改善作为信号物质的胆汁组成，应用于医药、食品领域。

Description

一种产胆盐水解酶变异体的基因工程菌及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种产胆盐水解酶变异体的基因工程菌及其制备方法，属于酶工程领域。
背景技术
胆汁是哺乳动物对摄入的脂肪进行初级消化的物质，其主要成分胆汁酸(bileacids)在体内以钠盐或钾盐的形式存在，简称胆盐(bilesalts)。胆盐由盐初级胆汁酸和次级胆汁酸盐组成。初级胆汁酸盐，由肝细胞合成，包括胆酸、鹅脱氧胆酸及其与甘氨酸和牛磺酸结合的产物；次级胆汁酸盐，是初级胆汁酸盐在肠道中受细菌作用生成的脱氧胆酸和石胆酸及其在肝中生成的结合产物。由于胆汁酸作为一种信号物质，在生物循环中，参与了机体脂质、胆固醇和糖的生化代谢及调节，因此，研究人员认为改变胆汁酸的组成和流量可以作为一种治疗代谢综合征的新方向。
胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是降解胆汁的主要组成成份——共轭胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共轭胆酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐水解酶的生理作用体现在两个方面：一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和降低胆固醇水平等；二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。
目前发现的野生型的胆盐水解酶具有广泛的底物特异性，能够水解多种结合胆盐，而运用基因工程手段获得底物专一性较高的胆盐水解酶将为研究BSH作用于宿主和菌体提供技术平台，对运用BSH调节宿主健康状况，改善微生物在复杂肠道环境的生存具有重要意义。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种产胆盐水解酶变异体的大肠杆菌基因工程菌，所述大肠杆菌基因工程菌生产的胆盐水解酶底物专一性得到显著提高，仅对胆盐中的甘氨(GCA)和牛磺(TCA)结合胆盐具有水解能力。
所述大肠杆菌基因工程菌，表达氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的胆盐水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述胆盐水解酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌基因工程菌是以EscherichiacoliBL21(DE3)为宿主、pET-20b(+)为载体构建得到的。
本发明的第二个目的是提供一种所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，是先扩增或者化学合成SEQIDNO.2所示的编码产胆盐水解酶变异体的核苷酸序列，然后连接到pET-20b(+)载体上，调整多克隆位点处的序列以防止胆盐水解酶发生移码突变，得到的重组载体再转化到EscherichiacoliBL21(DE3)中；筛选得到正确的转化子，即为大肠杆菌基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述构建方法，具体是：(1)采用化学合成或者PCR扩增的方法得到含有氨基酸序列如SEQIDNO.1、核苷酸序列如SEQIDNO.2的bsh1v基因片段(两端分别含有BamHI、XhoI酶切位点)；(2)bsh1v基因片段用BamHI和XhoI双酶切后连接到大肠杆菌表达载体pET-20b(+)，得到重组载体pET-20b(+)-bsh；(3)敲除重组载体pET-20b(+)-bsh中NdeI到BamHI之间的密码子，得到重组载体pET-20b(+)-bsh1v；(4)重组载体pET-20b(+)-bsh1v转化至EscherichiacoliBL21(DE3)，经筛选鉴定获得重组菌EscherichiacoliBL21(DE3)-pET20b(+)-bsh1v。
本发明的第三个目的是提供一种制备底物专一性提高的胆盐水解酶的方法，是构建重组表达氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的胆盐水解酶的重组大肠杆菌，然后培养重组大肠杆菌，收集重组菌的菌体，依次经过超声破壁、分步超滤、分子筛纯化获得单一重组蛋白，即为底物专利性提高的胆盐水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是收集菌体，用0.1M、pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤离心2次，并重悬，超声破碎5min，离心收集上清液，经过截留分子量为30kDa的超滤膜，透过液再经过截留分子量为20kDa的超滤膜，未透过液经具有分子筛作用的凝胶色谱纯化获得单一重组蛋白。
本发明还要求保护所述大肠杆菌基因工程菌生产得到的胆盐水解酶，以及该胆盐水解酶在食品、农业或制备药物方面的应用，尤其是在制备微生态制剂、药物表达载体或饲料添加剂方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明的胆盐水解酶变异体在大肠杆菌中实现了过量表达，获得了较高的产量；经过超滤与分子筛的纯化工艺获得纯度较高的重组蛋白。本发明的基因工程菌生产的胆盐水解酶变异体蛋白，具有显著提高的底物专一性，仅对宿主六种主要结合胆盐中的甘氨(GCA)和牛磺(TCA)结合胆盐具有水解能力，酶活分别为37.51U/mg和69.74U/mg。本发明为开发改善哺乳动物胆汁组成、改善代谢综合征的重组蛋白产品奠定了基础，在医药、农业等领域具有应用前景。
附图说明
图1：蛋白电泳(SDS-PAGE)实验结果；M：蛋白质分子量标准；1：含有pET-20b(+)的E.coliBL21(DE3)菌株细胞提取液；2：经过0.1mMIPTG诱导后的重组菌的细胞提取液。
图2：重组菌的表现型分析；WT：含有pET-20b(+)的E.coliBL21(DE3)；BSH1：表达野生型酶蛋白BSH1的E.coliBL21(DE3)；BSH变异体：表达胆盐水解酶变异体的E.coliBL21(DE3)。
图3：纯化后胆盐水解酶变异体的蛋白电泳(SDS-PAGE)分析；M：蛋白质分子量标准；3：经过纯化后的胆盐水解酶变异体。
图4：底物特异性比较；六种底物分别为甘氨结合胆盐(GCA)、甘氨脱氧结合胆盐(GDCA)、甘氨鹅脱氧结合胆盐(GCDCA)、牛磺结合胆盐(TCA)、牛磺脱氧结合胆盐(TDCA)、牛磺鹅脱氧结合胆盐(TCDCA)。
具体实施方式
胆盐水解酶活性鉴定方法：滴加5μL受体菌菌液至别含有0.01％猪胆盐(w/v)的LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素和24μg/mLIPTG)上，通过能否产生白色或透明沉淀圈检验胆盐水解酶的活性。
胆盐水解酶酶活测定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释至90μL，加入10μL结合胆盐(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等体积的15％(w/v)三氯乙酸终止反应，离心后取10μL上清液与190μL茚三酮试剂混合，于100℃反应15min，冷却后于570nm处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成为：0.5mL1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5柠檬酸盐缓冲液)，1.2mL甘油，0.2mL0.5M、pH5.5的柠檬酸缓冲液。
实施例1：重组菌的构建及鉴定
1)以前期筛选鉴定的含有胆盐水解酶变异体编码基因(氨基酸序列如SEQIDNO.1、核苷酸序列如SEQIDNO.2)的重组载体pNZ8148-bsh1v的DNA为模板，进行PCR扩增，引物序列为：
bsh1v-F:5’-CGCggatccATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGG-3’(序列如SEQIDNO.3)
bsh1v-R:5’-CCGctcgagTTTATTATTTGTTTTCTTTATAGCTTTTT-3’(序列如SEQIDNO.4)
参照KOD-Plus-Neo试剂盒说明书配制PCR反应体系；PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，45℃退火30s，68℃延伸1min，5个循环；95℃变性30s，55℃。
2)以1.5％琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物。
3)用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切消化纯化后的bsh1v基因和载体pET-20b(+)，用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌EscherichiacoliJM109，转化菌液涂布在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，以bsh1v-F和bsh1v-R为引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子，最终获得含有bsh1v基因的重组质粒pET20b(+)-bsh，用双酶切进行验证。
4)以重组质粒pET20b(+)-bsh的DNA为模板，设计引物敲除重组载体pET-20b(+)-bsh1v中NdeI到BamHI之间的密码子(仅仅是为了克服移码突变)，得到重组质粒pET-20b(+)-bsh1v。
所述引物序列如下：
MpET-F:5’-ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACA-3’(序列如SEQIDNO.5)
MpET-R:5’-ATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGG-3’(序列如SEQIDNO.6)。
参照2×PFU酶试剂盒说明书配制PCR反应体系；PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。
5)将重组表达质粒pET20b(+)-bsh1v转化EscherichiacoliBL21(DE3)感受态细胞，得到能在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上正常生长的基因工程菌，并经过鉴定命名为EscherichiacoliBL21(DE3)-pET20b(+)-bsh1v。
实施例2：重组菌中酶蛋白的诱导表达及活性鉴定
培养基为LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g；斜面培养基添加琼脂15g；高压灭菌，冷却至60℃，添加终浓度为100μg/mL(w/v)的氨苄青霉素；
培养方法：将37℃、200rpm下培养12h的种子以1％的接种量转接，于37℃、200rpm条件下培养；诱导条件：诱导OD值为0.6，重组菌在20℃诱导24h，IPTG浓度为0.1mM。
发酵后收集菌体，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤离心2次，并重悬，超声破碎5min(工作时间:间歇时间＝2:4)，离心收集上清液，经过截留分子量为30kDa的超滤膜，透过液再经过截留分子量为20kDa的超滤膜，未透过液经具有分子筛作用的凝胶色谱纯化获得胆盐水解酶变异体蛋白。
以携有空载体的菌株作为对照，通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为6kDa的蛋白条带(见图1)；同时，以分别携有空载体和野生型酶蛋白BSH1的菌株作为对照，根据菌株的表现型可知重组菌成功表达了有活性的胆盐水解酶变异体(见图2)。
实施例3：重组菌产胆盐水解酶变异体的底物专一性检测
纯化后的胆盐水解酶变异体蛋白达到电泳纯(见图3)；由图4可知：与野生型的BSH1(是指来源于LactobacillussalivariusLMG14476的bsh1基因，本发明的BSH1V是在野生型BSH1的基础上进行基因改组得到的)相比，本发明得到的BSH变异体(BSH1V)的底物专一性明显提高，仅对宿主六种主要结合胆盐中的甘氨(GCA)和牛磺(TCA)结合胆盐具有水解能力，酶活分别为37.51U/mg和69.74U/mg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种产胆盐水解酶变异体的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌表达氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的胆盐水解酶。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述胆盐水解酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌是以EscherichiacoliBL21(DE3)为宿主、pET-20b(+)为载体构建得到的。
4.权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌生产得到的胆盐水解酶。
5.权利要求4所述的胆盐水解酶在食品、农业或制备药物方面的应用。
6.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用是用于微生态制剂、药物表达载体或饲料添加剂。
7.权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，所述方法是先扩增或者化学合成SEQIDNO.2所示的编码产胆盐水解酶变异体的核苷酸序列，然后连接到pET-20b(+)载体上，调整多克隆位点处的序列以防止胆盐水解酶发生移码突变，得到的重组载体再转化到EscherichiacoliBL21(DE3)中；筛选得到正确的转化子，即为大肠杆菌基因工程菌。
8.一种制备底物专一性提高的胆盐水解酶的方法，其特征在于，所述方法是构建重组表达氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的胆盐水解酶的重组大肠杆菌，然后培养重组大肠杆菌，收集重组菌的菌体，依次经过超声破壁、分步超滤、分子筛纯化获得单一重组蛋白，即为底物专利性提高的胆盐水解酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是收集菌体，用0.1M、pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤离心2次，并重悬，超声破碎5min，离心收集上清液，经过截留分子量为30kDa的超滤膜，透过液再经过截留分子量为20kDa的超滤膜，未透过液经具有分子筛作用的凝胶色谱纯化获得单一重组蛋白。
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