CN103756989A - 一种利用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法及应用 - Google Patents

一种利用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明将双精氨酸信号肽基因和胆盐水解酶基因融合，将融合基因转化大肠杆菌宿主得到重组菌，利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。胆盐水解酶被成功分泌到了重组菌的胞外，重组菌E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-dmsA-bsh)的胞外BSH活性最高，达到0.72±0.05U mL-1，本发明为BSH的分离纯化和酶学性质研究奠定了基础，也为其它异源蛋白的分泌表达提供了有效的方法。

Description

一种利用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种利用双精氨酸信号肽促进胆盐水解酶基因表达的方法和应用，属于基因工程技术领域。 
背景技术
胆盐水解酶（BSH）是乳酸菌的一种代谢产物。BSH除具有水解结合态胆盐外，还可提高菌体存活率、促进菌体自身营养价值、改变菌体细胞膜的特性以及脱除胆汁对菌体的毒害作用；对于宿主，BSH可降低血清胆固醇、消弱机体对脂肪的消化吸收。目前已经检测到的BSH酶活性的菌有乳杆菌，双歧杆菌，肠球菌，梭状芽孢杆菌，类杆菌和链球菌等。然而，国内利用大肠杆菌产胆盐水解酶的专利和文章报道很少。 
由于用pET-28a(+)对BSH在大肠杆菌的胞内进行表达时，酶活不是很高，给后续BSH的分离纯化带来了巨大挑战。此外，利用大肠杆菌自身的信号肽PelB将BSH进行分泌表达时，在胞内和胞外都没有得到目的蛋白，也没有检测到BSH活性。因此，如何提高BSH的表达量已经成为当前亟需解决的关键问题。 
在细菌中，大量新合成的蛋白都是通过转运被分泌到周质空间或培养基中。而且大多数蛋白都是以未折叠的形式通过Sec系统（secretory system）被转运的。对于通过这一系统进行转运的蛋白适的伴侣蛋白造成的。此外，一些异源蛋白分泌以后会被胞外的蛋白酶降解来说，在细胞壁内的翻译后折叠通常不能有效地进行，这可能是由于细胞壁环境中缺乏合，这也会极大地降低了发酵上清液中目的蛋白的表达量。 
然而，有一类蛋白是通过双精氨酸转运系统（twin-arginine translocation(Tat)pathway）进行转运的。这个系统转运的蛋白都是完全折叠好的或寡聚的蛋白，特别是那些在细胞质以外的环境中不能正确折叠的异源蛋白。在这个系统中，蛋白质都是通过镶嵌在细胞膜上的带有N端信号肽的Tat移位酶（Tat translocase）进行转运的，由于这些信号肽含有保守的（S/T）RRXFLK序列，所以也被称为双精氨酸信号肽（twin-arginine signal peptides）。 
这些信号肽的疏水区的疏水性比Sec途径信号肽相应区域的疏水性要弱，而且它们的c端带有正电荷，而Sec途径的信号肽的c端为中性。蛋白的跨膜转运都是通过双精氨酸信号肽与Tat转运系统的相互作用完成的，在大肠杆菌中，这个转运系统是由膜蛋白TatABC组成的。这三个亚基会形成两个大分子的复合体，包括具有转运蛋白能力的转运通道复合体TatA和能够特异性识别转运蛋白的双精氨酸序列的信号识别复合体TatBC。 
在细菌中，Tat途径已经被成功用于分泌多种蛋白，包括周质配基结合蛋白，毒性因子， 氧化还原酶以及不能用Sec系统转运的绿色荧光蛋白等。与Sec途径只转运未折叠的蛋白不同的是，只有获得正确的折叠构象或含有辅因子的蛋白才能通过Tat途径进行转运。此外，许多不含辅因子的水解酶也是通过大肠杆菌或其它微生物的Tat途径进行转运的。 
本发明利用三种双精氨酸信号肽和四种E.coli宿主对L.plantarum BBE7BSH在E.coli中进行了分泌表达。为BSH的分离纯化和酶学性质研究奠定了基础，也为其它异源蛋白的分泌表达提供了有效的方法。 
发明内容
本发明提供了一种用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法，技术方案如下： 
1）将双精氨酸信号肽基因和胆盐水解酶基因融合； 
2）将融合基因连接到大肠杆菌表达载体； 
3）步骤2）得到重组载体转化大肠杆菌宿主得到重组菌； 
4）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。 
其中，双精氨酸信号肽为torA信号肽，dmsA信号肽或fdnG信号肽中任一一种。表达载体为pET-20b(+)或pET-22b(+)。大肠杆菌宿主为E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)或E.coli Rosetta-gami(DE3)中任一一种。 
步骤如下： 
1）将双精氨酸torA信号肽，dmsA信号肽或fdnG信号肽任一一种和胆盐水解酶基因融合； 
2）融合基因连接到大肠杆菌表达载体pET-20b(+)或pET-22b(+)； 
3）步骤2）得到重组载体转化E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)或E.coli Rosetta-gami(DE3)中任一一种得到重组菌； 
4）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。 
以上方法的具体步骤如下： 
1）合成含有双精氨酸信号肽序列的质粒pUC57-Tat； 
2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh，torA，dmsA和fdnG基因，并将bsh基因分别与torA，dmsA和fdnG基因进行融合； 
3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)和pET-22b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序； 
4）将测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)和E.coli Rosetta-gami(DE3)，得到重组菌； 
5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。 
参见参考文献： 
C.Robinson,A.Bolhuis,Tat-dependent protein targeting in prokaryotes and chloroplasts,Bio chim.Biophys.Acta.,1694(2004)135-147. 
利用双精氨酸torA信号肽具体步骤如下： 
1）合成含有双精氨酸torA信号肽序列的质粒pUC57-Tat; 
2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh和torA基因，并将bsh基因与torA基因进行融合； 
3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序； 
4）将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS，得到重组菌； 
5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。 
利用双精氨酸dmsA信号肽具体步骤如下： 
1）合成含有双精氨酸dmsA信号肽序列的质粒pUC57-Tat; 
2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh和dmsA基因，并将bsh基因与dmsA基因进行融合； 
3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序； 
4）将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS，得到重组菌； 
5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。 
利用双精氨酸fdnG信号肽具体步骤如下： 
1）合成含有双精氨酸fdnG信号肽序列的质粒pUC57-Tat; 
2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh和fdnG基因，并将bsh基因与fdnG基因进行融合； 
3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-22b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序； 
4）将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS，得到重组菌； 
5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。 
以上方法中所述的质粒pUC57含有三甲胺N-氧化物还原酶（trimethylamine N-oxide reductase;TORA）,二甲亚砜还原酶亚基DmsA（dimethyl sulphoxide reductase subunit DmsA;DMSA）和甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase;FDNG）的双精氨酸信号肽序列，且这些信号肽序列已根据Escherichia coli的密码子偏好性进行了优化。 
本发明利用双精氨酸信号肽和E.coli宿主对L.plantarum BBE7BSH在E.coli中进行了分泌表达，包括如下步骤： 
1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成质粒pUC57-Tat，它含有三甲胺N-氧化物还原酶（trimethylamine N-oxide reductase;TORA）,二甲亚砜还原酶亚基DmsA（dimethyl sulphoxide reductase subunit DmsA;DMSA）和甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase;FDNG）的双精氨酸信号肽序列，而且这些信号肽序列是根据Escherichia coli的密码子偏好性进行了优化以后合成的； 
2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增出bsh，torA，dmsA和fdnG基因，并将bsh基因分别与torA，dmsA和fdnG基因进行融合； 
3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)和pET-22b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆送公司测序； 
4）将测序正确的六个重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)和E.coli Rosetta-gami(DE3)，得到24株重组菌。 
所述引物序列如下： 
bsh(F)：5’-CATGCCATGGCGATGTGTACTGCCATAACTTATCAATCTT-3’ 
bsh(R)：5’-CCGCTCGAGTTAGTTAACTGCATAGTATTGTGCTTCTG-3’ 
torA(F)：5’-GGAATTCCATATGAACAATAACGACCTGTTCC-3’ 
torA(R)：5’-AAGATTGATAAGTTATGGCAGTACACATCGCGGCCTGGGCC-3’ 
torA-bsh(F)：5’-GGCCCAGGCCGCGATGTGTACTGCCATAACTTATCAATCTT-3’ 
dmsA(F)：5’-GGAATTCCATATGAAAACCAAGATCCCGGA-3’ 
dmsA(R)：5’-AAGATTGATAAGTTATGGCAGTACACATTGCGTGTGCGATACGGCTA-3’ 
dmsA-bsh(F)：5’-TAGCCGTATCGCACACGCAATGTGTACTGCCATAACTTATCAATCTT-3’ 
fdnG(F)：5’-GGAATTCCATATGGACGTGTCTCGTCGC-3’ 
fdnG(R)：5’-AAGATTGATAAGTTATGGCAGTACACATCGCCAGTGCTTGTTTTGG-3’ 
fdnG-bsh(F)：5’-CCAAAACAAGCACTGGCGATGTGTACTGCCATAACTTATCAATCTT-3’ 
所述重组菌的构建方法如下：以由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的质粒pUC57-Tat为模板，利用引物torA(F)和torA(R)通过PCR扩增编码TORA信号肽的torA基 因。同时，以L.plantarum BBE7的基因组DNA为模板，以torA-bsh(F)和bsh(R)为引物，PCR扩增不含终止密码子的bsh基因。将这两个片段进行胶回收，以等摩尔的这两个片段为模板，用引物torA(F)和bsh(R)进行融合PCR扩增得到包含torA-bsh基因的片段。再将这个片段用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)和pET-22b(+)进行连接，得到两个重组质粒pET-20b(+)-torA-bsh和pET-22b(+)-torA-bsh。用相同的方法构建得到其它四个重组质粒pET-20b(+)-dmsA-bsh，pET-22b(+)-dmsA-bsh，pET-20b(+)-fdnG-bsh和pET-22b(+)-fdnG-bsh。 
将这六个重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞，并筛选阳性重组子测序，测序正确的质粒分别转化到四种大肠杆菌宿主（E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)和E.coli Rosetta-gami(DE3)）中，得到24株重组菌，并利用TB培养基和IPTG培养重组菌并诱导BSH表达。 
所述胞内和胞外胆盐水解酶的酶活测定方法：将发酵液离心10min（10000×g，4℃）收集菌体，再用0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.0）洗涤离心2次，调整菌浓在600nm下吸光度为10。取1mL上述细胞悬浊液，超声破碎3min（工作时间:间歇时间=2:3），随即离心10min(10,000×g,4℃)去除细胞碎片，得到无细胞提取物(cell free extract,CFE)。取0.1mL上述上清液（或发酵上清液）加入1.8mL0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）和0.1mL甘氨脱氧胆酸（200mM）中混合，并置于37℃孵育30min，取0.5mL上述反应液加入0.5mL15%(w/v)三氯乙酸终止反应，混合均匀，离心10min(离心机最大转速,4℃)取上清。将0.1mL上清液与1.9mL茚三酮显色液（包括0.5mL1%茚三酮（溶解于0.5M柠檬酸缓冲液（pH5.5）中）、1.2mL甘油和0.2mL0.5M的柠檬酸缓冲液（pH5.5））混合，震荡混匀，沸水浴14min。冷却3min后测定570nm下的吸收值。标准曲线用甘氨酸或牛磺酸制作。 
重组菌发酵上清液中的蛋白样品的处理方法如下：首先将发酵液进行离心（10,000rpm;5min;4℃）收集上清。然后在上清液中加入三氯乙酸使其终浓度为15%(w/v)，混匀后离心，将沉淀溶解到1/20体积的50mM NaOH中。最后加入等体积的2×loading buffer，99℃煮10min，取10μL进行蛋白电泳。全细胞蛋白、细胞质可溶组分和细胞质不溶组分等蛋白样品的处理方法见pET System Manual。 
本发明的有益效果：胆盐水解酶被成功分泌到了重组菌的胞外，在所有重组菌中，信号肽DMSA的分泌效率高于其它两个信号肽，并且E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-dmsA-bsh)的胞外BSH活性最高，达到0.72±0.05U mL-1，为BSH的分离纯化和酶学性质研究奠定了基础，也为其它异源蛋白的分泌表达提供了有效的方法。 
附图说明
图1：重组质粒的构建过程； 
（（a）表达质粒pET-20b(+)-SP(Tat)-bsh的构建过程；（b）融合蛋白SP(Tat)-BSH的示意图）。 
图2：PCR扩增产物电泳图。 
图3：SDS-PAGE分析不同信号肽对BSH在不同菌株中的胞内和胞外表达的影响。 
图4：SDS-PAGE分析BSH在E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-dmsA-bsh)中的表达。 
具体实施方式
实施例1：重组菌的构建 
1）重组质粒的构建过程如图1所示，图1：（a）表达质粒pET-20b(+)-SP(Tat)-bsh的构建过程，SP(Tat)，Tat途径的信号肽；（b）融合蛋白SP(Tat)-BSH的示意图。双精氨酸途径的信号肽直接与BSH融合。下划线部分为双精氨酸基序“SRRXXXX”；箭头表示的是信号肽酶I的切割位点。 
具体操作如下：以质粒pUC57-Tat为模板，利用引物torA(F)和torA(R)通过PCR扩增编码TorA信号肽的torA基因（图2a），PCR条件为：95℃预变性10min；98℃10s，55℃30s，72℃20s，30个循环；72℃延伸10min。同时以L.plantarum BBE7的基因组DNA为模板，以torA-bsh(F)和bsh(R)为引物，PCR扩增（延伸时间为1min）不含终止密码子的bsh基因（图2a），将这两个片段进行胶回收，以等摩尔的这两个片段为模板，用引物torA(F)和bsh(R)进行融合PCR扩增（延伸时间为80s）得到包含torA-bsh基因的片段（图2b），以相同的方法得到融合片段dmsA-bsh和fdnG-bsh（图2b）。 
2)将这三个融合片段用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)和pET-22b(+)进行连接，得到六个个重组质粒pET-20b(+)-torA-bsh，pET-22b(+)-torA-bsh，pET-20b(+)-dmsA-bsh，pET-22b(+)-dmsA-bsh，pET-20b(+)-fdnG-bsh和pET-22b(+)-fdnG-bsh。并将这六个重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞，并筛选阳性重组子进行测序。 
3）将测序正确的质粒分别转化到四种大肠杆菌宿主（E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)和E.coli Rosetta-gami(DE3)）中，得到24株重组菌。 
实施例2：重组菌BSH的诱导表达及酶活测定和蛋白电泳 
将20℃、200rpm下过夜培养的种子以2%的接种量转入25mL TB培养基中，于37℃、200rpm条件下培养至OD600=0.6，加入0.4mM IPTG诱导6h；通过SDS-PAGE和酶活测定，分析胆盐水解酶的表达情况。 
通过SDS-PAGE分析了三种信号肽对BSH的胞内表达的影响。BSH在重组菌胞内表达 的情况如图3a，3c，3e和3g所示。图3中(a),(c),(e),(g)为全细胞蛋白；(b),(d),(f),(h)为发酵上清液中的蛋白；M，蛋白分子量标准；–，未用IPTG诱导；+，用0.4mM IPTG诱导。从图中可以看出，BSH在所有重组菌的胞内都得到了不同程度的表达。但是，这些重组BSH的分子量约为42.0kDa，高于BSH的理论分子量（37.0kDa）。这是由于BSH前面融合的双精氨酸信号肽还没有被信号肽酶切割造成的，而且信号肽酶作用后的胞外BSH的分子量为37.0kDa也证实了这一点（图3b，3d，3f和3h）。如表1所示，不同重组菌胞内的BSH活性差别很大。没有经过IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-dmsA-bsh)胞内BSH活性最高，为1.00±0.05U mL-1。然而在一些经过IPTG诱导的菌的胞内没有检测到BSH活性，比如E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-torA-bsh)和E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-fdnG-bsh)等，这可能是因为IPTG抑制了菌体生长。此外，破壁沉淀和破壁上清的蛋白电泳结果表明，胞内的BSH大部分都以包涵体的形式存在（图4）。图4左边四个泳道，破壁沉淀；右边四个泳道，破壁上清；M，蛋白分子量标准；–，未用IPTG诱导；+，用0.4mM IPTG诱导。SDS-PAGE和酶活测定的结果证实，信号肽和宿主都对BSH的胞内表达有很大的影响。 
SDS-PAGE（图3-2b，3-2d，3-2f和3-2h）和胞外酶活测定（表1）的结果都表明，BSH被成功分泌到了重组菌的胞外。但是，只有一小部分重组BSH被分泌出去，大部分都在胞内形成了包涵体（图4）。酶活测定的结果显示，不同重组菌的胞外BSH活性差别很大，这表明三种信号肽的分泌效率（secrection efficiency,SE；即胞外BSH活性与BSH总酶活的比）不同，且受到所用宿主和IPTG浓度的影响。在所有重组菌中，信号肽DMSA的分泌效率高于其它两个信号肽，并且E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-dmsA-bsh)的胞外BSH活性最高，达到0.72±0.05U mL-1。但在一些经过IPTG诱导的重组菌的胞外没有检测到BSH活性，包括E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-fdnG-bsh)和E.coli Rosseta(DE3)(pET-20b(+)-torA-bsh)等。由于E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-dmsA-bsh)的胞内和胞外BSH活性最高，它成为下一步研究的对象。 
表1重组菌胞内和胞外的BSH活性 
Figure 2013105575706100002DEST_PATH_IMAGE001
表1重组菌胞内和胞外的BSH活性（续表） 
Figure 2013105575706100002DEST_PATH_IMAGE002
注：数据是三次重复实验的平均值±标准偏差 
1)–，未用IPTG诱导；+，pET-20b(+)构建的重组菌用0.4mM IPTG诱导，pET-22b(+)构建的重组菌用1mM IPTG诱导； 
2)菌株无细胞提取物或发酵上清液中的酶活； 
3)ND,not detected（未检出） 
实施例3：重组菌胞外的BSH活性的优化 
在大肠杆菌中，培养基的组成成分和发酵条件，如温度、诱导剂浓度以及其它参数，都会影响异源蛋白的分泌和表达量。本章通过正交实验设计（L9(34)）研究了诱导温度、接种量、诱导OD600以及IPTG浓度对重组菌E.coli BL21(DE3)pLysS(pET-20b(+)-dmsA-bsh)胞外BSH活性的影响。实验通过软件正交设计助手3.1.1进行设计和分析。具体的实验设计和结果如表2所示。这些发酵条件都对重组菌胞外BSH的活性有很大影响，它们的影响顺序为：诱导温度＞IPTG浓度＞诱导OD600＞接种量。当诱导温度，IPTG浓度，诱导OD600和接种量 分别为20℃，0.4mM，0.6和1%时，重组菌胞外的BSH活性最高，达到1.21±0.03U mL-1，比原来提高了68.1%，比酶活为1.13±0.04U mg-1。 
表2重组菌胞外BSH活性的优化 
Figure 2013105575706100002DEST_PATH_IMAGE003
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。 
Figure IDA0000411569910000021
Figure IDA0000411569910000031
Figure IDA0000411569910000041

Claims (9)

1.一种利用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法，其特征在于，步骤如下：
1）将双精氨酸信号肽基因和胆盐水解酶基因融合；
2）将融合基因连接到大肠杆菌表达载体；
3）步骤2）得到重组载体转化大肠杆菌宿主得到重组菌；
4）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双精氨酸信号肽为torA信号肽，dmsA信号肽或fdnG信号肽中任一一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2）表达载体为pET-20b(+)或pET-22b(+)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌宿主为E.coli BL21(DE3)，E.coliBL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)或E.coli Rosetta-gami(DE3)中任一一种。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤如下：
1）将双精氨酸torA信号肽，dmsA信号肽或fdnG信号肽任一一种和胆盐水解酶基因融合；
2）融合基因连接到大肠杆菌表达载体pET-20b(+)或pET-22b(+)；
3）步骤2）得到重组载体转化E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)或E.coli Rosetta-gami(DE3)中任一一种得到重组菌；
4）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）合成含有双精氨酸信号肽序列的质粒pUC57-Tat；
2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh，torA，dmsA和fdnG基因，并将bsh基因分别与torA，dmsA和fdnG基因进行融合；
3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)和pET-22b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序；
4）将测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coliRosetta(DE3)和E.coli Rosetta-gami(DE3)，得到重组菌；
5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）合成含有双精氨酸torA信号肽序列的质粒pUC57-Tat;
2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh和torA基因，并将bsh基因与torA基因进行融合；
3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序；
4）将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS，得到重组菌；
5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）合成含有双精氨酸dmsA信号肽序列的质粒pUC57-Tat;
2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh和dmsA基因，并将bsh基因与dmsA基因进行融合；
3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序；
4）将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS，得到重组菌；
5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）合成含有双精氨酸fdnG信号肽序列的质粒pUC57-Tat;
2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh和fdnG基因，并将bsh基因与fdnG基因进行融合；
3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-22b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序；
4）将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS，得到重组菌；
5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。
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