CN114369481A - 一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于煤降解技术领域，涉及一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，包括：1)菌种经发酵、声悬浮处理后得到声悬浮菌液；2)对原煤经破碎、研磨、筛分得到粒径为0.250～0.125mm的煤粉；3)煤粉浸泡于硝酸溶液中，经洗涤、过滤后，取固体干燥，得到煤样；4)将步骤3)的煤样先加入至液体培养基中形成煤浆，经灭菌后，继续向煤浆中加入步骤1)的声悬浮菌液，混合、离心后取固相产物，清洗、烘干、称重，计算煤降解率。本发明利用声悬浮处理提高菌种生长速度，促进碱性蛋白酶的分泌，提高煤的降解率，同时减少二次污染，工艺简单易操作。

Description

一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法
技术领域
本发明属于煤降解技术领域；涉及一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法。
背景技术
能源是经济发展的源动力，是人类赖以生存和发展的物质基础，与人类的生产、生活以及社会发展紧密相关，当前，一次能源在各国能源结构中仍占主导地位，所占比例超过90％，其中煤炭的存储量远远超过了石油与天然气存储量的总和，目前我国能源结构中煤炭所占比例为54％。随着高阶煤炭开采的不断进行，低阶煤在煤炭总量中所占比例越来越高，目前，超过50％的低阶煤用来发电，其次是炼焦，还有制气、液化、直接燃烧供暖等；低阶煤在燃烧过程中除了产生二氧化碳、碳氢化合物外，还会生成大量烟尘、氮氧化物、硫氧化物、重金属化合物等污染物。由此可见，低阶煤作为燃料直接利用越来越不适应当今社会的发展，因此，低阶煤的清洁高效加工利用是煤炭可持续发展的必然途径。
煤的微生物降解是继煤炭的液化、气化加工技术后的最新技术，是一个涉及微生物学、生物化学、酶学、分子生物学、分离工程学、煤化学和矿物加工学等学科的新领域；煤的微生物降解具有反应条件温和、反应设备要求简单、低耗能等优点；在煤炭，特别是低阶煤的清洁高效利用方面，发展前景光明。
目前在煤炭的微生物降解领域已经取得一定的成果和发展，但是煤的生物降解不能实现工业化的主要原因可能是缺少高效降解菌，因为现有的高效降解菌种是通过诱变育种方法获得，而常规的诱变育种方法主要为物理诱变育种和化学诱变育种，存在操作复杂、需要使用诱导剂，容易产生二次污染等问题。
发明内容
针对上述煤降解存在的技术问题，本发明提供一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，利用声悬浮处理提高菌种生长速度，促进碱性蛋白酶的分泌，提高煤的降解率，同时减少二次污染，工艺简单易操作。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，包括以下步骤：
1)菌种经发酵、声悬浮处理后得到声悬浮菌液；
2)对原煤经破碎、研磨、筛分得到煤粉；
3)煤粉浸泡于硝酸溶液中，经洗涤、过滤后，取固体干燥，得到煤样；
4)将步骤3)的煤样先加入至液体培养基中形成煤浆，经灭菌后，继续向煤浆中加入步骤1)的声悬浮菌液，混合、离心后取固相产物，清洗、烘干、称重，计算煤降解率。
进一步的，所述步骤1)中，菌种为地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌或短小芽胞杆菌。
进一步的，所述步骤1)中，声悬浮的条件是，功率150～500W，时间0.5～4min。
进一步的，所述步骤1)中，声悬浮的条件是，功率150～350W，时间0.5～3min。
进一步的，所述步骤3)中，浸泡时间为12～48h，干燥温度80～120℃，干燥时间为6～12h。
进一步的，所述步骤4)中，煤样、液体培养基和声悬浮菌液用量的质量体积比为0.1～1.5g： 50mL：5～50mL；所述煤样粒径为0.5～0.075mm。
进一步的，所述步骤4)中，液体培养基是由10.0g蛋白胨、10.0g牛肉膏、5.0gNaCl、 20.0g琼脂以及1L蒸馏水配制而成的；液体培养基的pH＝7.2。
进一步的，所述步骤4)中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为10～20min，混合温度为20～40℃，离心速度8000～12000r/min，离心时间10～30min，烘干温度80～120℃，烘干时间为6～12h。
进一步的，所述步骤4)中，混合过程是在摇床中进行，摇床的转速为100～180r/min。
进一步的，所述步骤4)中，煤降解率
Figure RE-GDA0003413144760000021
m0为煤样质量；m为固相产物质量。
本发明的有益效果是：
1、本发明在常温常压下，利用声悬浮处理菌种，提高菌种生长速度，有利于菌种分泌碱性蛋白酶，从而提高菌种对煤的降解率，实现煤的高效降解，工艺简单可操作，能广泛的用于微生物降解煤中。
2、本发明通过声悬浮处理菌种，与其他物理化学技术相比，不使用诱导剂，成本低，且能有效地避免菌种与容器的接触，减少二次污染。
附图说明
图1为声悬浮装置示意图；
图2为不同超声功率下地衣芽胞杆菌的生长曲线；
图3为不同声悬浮时间对地衣芽胞杆菌生长的影响；
图4为声悬浮前后地衣芽胞杆菌的XPS图谱；
图5为声悬浮前后地衣芽胞杆菌的FTIR图谱；
图6为声悬浮前后地衣芽胞杆菌的SEM图；
图7为不同因素对地衣芽胞杆菌降解大南湖煤的影响；
图8为生物降解新疆大南湖煤的实物图(降解时间为7天)；
图9为生物降解新疆红沙泉煤的实物图(降解时间为7天)；
图10为生物降解新疆乌冬煤的实物图(降解时间为7天)。
其中：
1—超声波发生器；2—换能器；3—变幅杆；4—发射端；5—样品；6—反射端；7—支架。
具体实施方式
现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。
本发明提供的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，包括以下步骤：
1)菌种经发酵、声悬浮处理后得到声悬浮菌液；
2)对原煤经破碎、研磨、筛分得到煤粉；
3)煤粉浸泡于硝酸溶液中，经洗涤、过滤后，取固体干燥，得到煤样；
4)将步骤3)的煤样先加入至液体培养基中形成煤浆，经灭菌后，继续向煤浆中加入步骤1)的声悬浮菌液，混合、离心后取固相产物，清洗、烘干、称重，计算煤降解率。
本发明步骤1)中，菌种为地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌或短小芽胞杆菌。
本发明中，地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)，其编号为CICC 10092。该菌种为高产碱性蛋白酶菌株。
本发明中，枯草芽胞杆菌地衣芽胞杆菌(Bacillus subtilis)购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，其编号为CICC 10071。
本发明中，短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)，其编号为CICC 21742。
本发明步骤1)中，声悬浮的条件是，功率150～500W，时间0.5～4min。优选的，声悬浮的条件是，功率150～350W，时间0.5～3min。
本发明步骤3)中，浸泡时间为12～48h，干燥温度80～120℃，干燥时间为6～12h。
本发明步骤4)中，煤样、液体培养基和声悬浮菌液用量的质量体积比为0.1～1.5g：50mL： 5～50mL；煤样粒径为0.5～0.075mm。
本发明步骤4)中，液体培养基是由10.0g蛋白胨、10.0g牛肉膏、5.0g NaCl、20.0g琼脂以及1L蒸馏水配制而成的；液体培养基的pH＝7.2。
本发明步骤4)中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为10～20min，混合温度为20～40℃，离心速度8000～12000r/min，离心时间10～30min，烘干温度80～120℃，烘干时间为6～12h。
本发明步骤4)中，混合过程是在摇床中进行，摇床的转速为100～180r/min。
本发明步骤4)中，煤降解率
Figure RE-GDA0003413144760000041
m0为煤样质量；m为固相产物质量。
本发明中，声悬浮采用声悬浮装置来完成的。具体的参见图1，声悬浮装置包括超声波发生器1、换能器2、变幅杆3、发射端4、样品5、反射端6和支架7。支架7顶端设置反射端6，超声波发生器1的输出端依次与换能器2、变幅杆3、发射端4相连，且发射端4与反射端6对向设置，发射端4位于反射端6上方；声悬浮开启时，样品5悬浮在发射端4与反射端6之间。
本发明中，灭菌是在BL-50A灭菌锅内完成的；摇床型号为HZQ-F100。
本发明中，如破碎、研磨、筛分、过滤、干燥、离心、洗涤等工序均采用常规试验设备装置来完成。
下面通过具体的实施例说明本发明降解煤的方法。
实施例1
本实施例中，在降解前，对声悬浮的条件进行了优选。具体如下：
本实施例采用地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，其编号为CICC 10092。该菌种为高产碱性蛋白酶菌株。
液体培养基采用CICC提供的配方，组成为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，NaCl5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1L，pH＝7.2。
(1)不同超声功率对地衣芽胞杆菌生长的影响
将地衣芽胞杆菌种进行纯化、活化，培育3代后进行扩大培养。取OD600＝0.5的地衣芽胞杆菌发酵液200uL，在悬浮时间为2.0min和不同超声功率下进行悬浮。超声功率分别150， 200，250，300，350，400，450，500W。空白组为不经过声悬浮处理的菌种。悬浮结束后收集悬浮液，加入到200mL的液体培养基中，在30℃，160r/min的摇床培养3d。测定吸光度600nm。空白组为不经过声悬浮处理的菌种。结果参见图2，不同超声功率对地衣芽胞杆菌生长的影响图。
参见图2可以得出，随着功率增加，菌种的吸光度OD600出现先增加再减少的趋势，分析原因可能是当功率低于350W时，低功率超声可能通过空化产生的微流使细胞膜通透性增加，促进离子和代谢产物的跨膜扩散，增加了细胞膜的通透性，有利于菌种更好的吸收营养物质，进一步引起细胞生化方面的改变，从而调节细胞信号传导和基因调控表达。而当功率大于350W时，高功率的超声被组织吸收后，可以产生大量热能，使得部分酶失活，抑制细胞代谢。
(2)不同声悬浮时间对地衣芽胞杆菌生长的影响
取OD600＝0.5的地衣芽胞杆菌发酵液200uL，超声功率为300W和不同超声功率下进行悬浮，悬浮时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0min，悬浮结束后收集悬浮液，在200mL的液体培养基进行培养；每天测定吸光度OD600。空白组为不经过声悬浮处理的菌种。结果参见图3，不同声悬浮时间对地衣芽胞杆菌生长的影响图。
由图3可以得到，在悬浮时间为0.5-3.0min之内，可以促进地衣芽胞杆菌的生长，超出个范围，出现抑制。分析原因可能是随着悬浮时间的增加，声波振动能量大量转化为分子热运动能量，使得细胞过热导致酶失活，破坏代谢活动，抑制菌种生长。
(3)声悬浮对碱性蛋白酶活性的影响
取1mL，OD600＝0.5的地衣芽胞杆菌发酵液，在功率300W，时间2.5min下进行声悬浮，得到的声悬浮菌种，加入到100mL的液体培养基中，在30℃，160r/min进行摇床培养。培养时间为3d；测定碱性蛋白酶活性。空白组为不经过声悬浮处理的菌种。
采用Folin-Phenol显色法来测定蛋白酶活性。具体测定方法是，将发酵液离心取上清液1 mL加入试管中，40℃预热5min，加入1mL 1％酪蛋白溶液(pH＝7.2)，40℃水浴反应10min，迅速加入2mL 0.4mol/L三氯乙酸来终止反应，40℃下反应15min，反应结束后10000r/min 离心10min，过滤，取上清液1mL，置于试管中，加入5mL 0.4mol/L碳酸钠和1mL1mol/L 福林酚，混合均匀，40℃保温20min，然后冷却至室温，测定680nm处的吸光度。空白组为加2mL 0.4mol/L三氯乙酸，然后再加入1mL pH 7.2的1％酪蛋白溶液，其他条件相同。酶活力定义为：每分钟水解酪蛋白产生lμg酪氨酸为1个蛋白酶活单位。结果参见表1。
表1声悬浮对地衣芽胞杆菌分泌的碱性蛋白酶活性的影响
菌种 碱性蛋白酶活性(U)
悬浮前地衣芽胞杆菌 60.3±0.64
悬浮后的地衣芽胞杆菌 77.9±0.57
由表1可以看出：与未悬浮的菌种相比，悬浮后碱性蛋白酶活性由60.3U增加到77.9U，由此可见，声悬浮处理能促进地衣芽胞杆菌的生长，进而增加了碱性蛋白酶的释放量。
(4)同时利用红外光谱、X射线光电子能谱和扫描电镜对声悬浮前后的地衣芽胞杆菌进行分析与表征。
将声悬浮前后的地衣芽胞杆菌，分别与溴化钾混合，质量比为1：200，研磨制成薄片，使用美国Thermo Scientific红外光谱进行扫描，扫描范围为4000-400cm-1。采用英国KRATOS 的X射线光电子能谱仪进行测试。激发源采用Al ka射线(hv＝1486.6eV)。结果如图4和图5 所示。图4为声悬浮前后地衣芽胞杆菌的XPS图谱。图5为声悬浮前后地衣芽胞杆菌的FTIR 图谱。
由图4可知，声悬浮处理后，地衣芽胞杆菌的碳含量减少，氧和氮含量增加，表明声悬浮改变了细胞表面的元素分布，促进菌种生长，增加了蛋白酶的释放量。
由图5可知，与未悬浮的地衣芽胞杆菌相比，悬浮后的菌种的-OH、N-H和C-N官能团含量增加，-CH2含量减少与XPS分析一致。因此地衣芽胞杆菌经过声悬浮后，增加了表面含氧官能团，促进了地衣芽胞杆菌的生长和碱性蛋白酶的活性。
(5)对声悬浮前后的地衣芽胞杆菌进行电镜分析。
收集10mL培养液，8000rpm离心3min，加入2.5％戊二醛进行固定5h，使用乙醇梯度脱水，放入真空干燥箱中，40℃，干燥6h得到样品。采用日本电子株式会社，型号为JSM-7610F 的场发射扫描电子显微镜观察悬浮前后地衣芽胞杆菌的形貌，如图6所示。图6为声悬浮前后地衣芽胞杆菌的SEM图，其中：(a)为悬浮前，(b)为悬浮后。
由图6可知，声悬浮后地衣芽胞杆菌表面出现一些丝状物质，这是地衣芽胞杆菌应对声悬浮做出的改变，分泌一些丝状物质，这有利于地衣芽胞杆菌释放蛋白酶，促进菌种生长。
由此可见，通过声悬浮能促进菌种的生长，促进碱性蛋白酶的释放，增强活性。
本发明利用声悬浮处理后的菌种，对煤进行降解。考虑到煤降解过程反应因素对降解率的影响，进行单因素试验，优选出适宜的煤浆浓度、菌液用量、煤样破碎粒径以及煤降解时的培养方式条件。
试验样品选择：地衣芽胞杆菌，大南湖煤、液体培养基
(1)煤浆浓度的影响
取1mL，OD600＝0.5的地衣芽胞杆菌发酵液，在功率300W，时间2.5min下进行声悬浮，得到的声悬浮菌液；
大南湖煤经过粉碎、筛分、硝酸处理后，得到粒径在0.250-0.125mm之间的煤样；
取8份50mL液体培养基，对应加入煤样0.1g、0.3g、0.5g、0.7g、0.9g、1.1g、1.3g、1.5g 形成不同浓度的煤浆；相同条件下灭菌后，继续向上述煤浆中加入10mL的声悬浮菌种液；在摇床上培养，培养7d后，离心10000rpm，20min，取上清液在波长450nm下测定吸光度值，结果如图7(a)所示。
由图7(a)可知，随着煤浆浓度的增加，地衣芽胞杆菌对大南湖煤呈现先增加再减少的趋势，当煤浆浓度为0.3g/50mL液体培养基时，吸光度A450值最大为0.742；这是因为当煤浆浓度增加时，地衣芽胞杆菌的生长受到抑制，繁殖空间有限，不能更好利用大南湖煤作为碳源，因此最佳煤浆浓度为0.5g/50mL液体培养基。
(2)声悬浮菌液的用量
取1mL，OD600＝0.5的地衣芽胞杆菌发酵液，在功率300W，时间2.5min下进行声悬浮，得到的声悬浮菌液；
大南湖煤经过粉碎、筛分、硝酸处理后，得到粒径在0.250-0.125mm之间的煤样；
取6份50mL液体培养基，对应加入煤样0.5g形成煤浆；相同条件下灭菌后，继续向上述煤浆中加入5mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL的声悬浮菌种液；在摇床上培养，培养7d后，离心10000rpm，20min，取上清液在波长450nm下测定吸光度值，结果如图7 (b)所示。
由图7(b)可知，当菌液用量为10mL时，吸光度A450值最大为0.679，若是继续增加菌液用量，降解效果变化不明显，因此最佳菌液用量为10mL，这是因为当细菌受到生长环境的限制，细菌个数到达一定数量时，继续增加菌液用量，细菌数量不能再增加，因此生物降解效果趋于平缓。
(3)煤样粒径
取1mL，OD600＝0.5的地衣芽胞杆菌发酵液，在功率300W，时间2.5min下进行声悬浮，得到声悬浮菌液；
煤经过粉碎、筛分、硝酸处理后，分别得到粒径在0.500-0.250、0.250-0.125、0.125-0.075 mm的煤样；
取3份50mL液体培养基，对应加入不同粒径的煤样0.5g形成煤浆；相同条件下灭菌后，继续向上述煤浆中加入20mL的声悬浮菌种液，培养7d后，离心10000rpm，20min，取上清液在波长450nm下测定吸光度值，结果如图7(c)所示。
如图7(c)所示，当煤样的粒径为0.250～0.125mm时，吸光度A450值最大为0.687。分析原因是当粒径太大时，煤样与微生物的接触面积减小，降解效果减小，当煤样粒径过小时，煤样则会漂浮在培养基上，降解效果减弱。因此，最佳粒径为0.250～0.125mm。
(4)培养方式
取1mL，OD600＝0.5的地衣芽胞杆菌发酵液，在功率300W，时间2.5min下进行声悬浮，得到的声悬浮菌液；
煤经过粉碎、筛分、硝酸处理后，得到粒径在0.125～0.075mm的煤样；
取2份50mL液体培养基，对应加入煤样0.5g形成煤浆，相同条件下灭菌后，继续向上述煤浆中加入10mL的声悬浮菌种液，培养7d后，离心10000rpm，20min，取上清液在波长450nm下测定吸光度值，结果如图7(d)所示。
图7(d)为两种不同培养方式下地衣芽胞杆菌降解大南湖煤的效率，发现摇床培养的 A450吸光度值远大于静置培养，因此，最佳培养方式为摇床培养。
实施例2
采用实施例1声悬浮处理的地衣芽胞杆菌进行煤的降解。
(1)煤样选择及预处理
本实施例在实施时，选用的原煤为新疆大南湖褐煤、红沙泉褐煤和乌冬褐煤。
不同产地原煤的预处理过程是：原煤先经破碎、研磨，得到煤粉；再将煤粉用8mol/L 的硝酸溶液浸泡48h后，用蒸馏水进行洗涤、过滤，直至中性，取固体在80℃下干燥12h，得到煤样，保存备用；
(2)取上述0.3g，粒径0.250～0.125mm不同产地的煤样，分别加入50mL液体培养基形成三个煤浆，并分别放入BL-50A灭菌锅中，121℃，灭菌15min，最后向三个煤浆中对应加入10mL的声悬浮菌液，混合放入HZQ-F100摇床中，在温度30℃，摇床转速为160r/min 中培养。实验结束后，在9000r/mim速度下离心20min，收集固相产物(剩煤)和液相产物。用蒸馏水对固相产物(剩煤)进行清洗，直至固相产物(剩煤)中无菌体残留，90℃烘干12h，计算降解率；
本实施例中，声悬浮菌液是取1mL，OD600＝0.5的地衣芽胞杆菌发酵液，在功率300W，时间2.5min下进行声悬浮得到的。
(3)降解率的计算
降解完的煤液过滤，取固相产物烘干称重为m，起始加入煤样质量m0，计算降解率η；
Figure RE-GDA0003413144760000081
(4)计算结果
根据公式(1)计算不同产地煤的降解率，结果如表2所示。
此外，实施时，采用未声悬浮的地衣芽胞杆菌作为空白，按照上述方法进行不同产地煤的降解，结果如表2所示。
表2悬浮前后地衣芽胞杆菌对不同煤样的降解率
Figure RE-GDA0003413144760000091
参见表2，与未悬浮的地衣芽胞杆菌相比，悬浮后的菌种降解率均有所提高，其中，新疆红沙泉煤降解率可提升22％，新疆大南湖煤和新疆乌冬煤降解率均提升12％，这是因为悬浮后的菌种生长旺盛，分泌更多的碱性蛋白酶，更有利于与煤样接触，增加降解率，实现煤的高效生物降解。
本实施例中，还对煤降解圈进行考察。具体的，观察煤样降解7天时，悬浮前后地衣芽胞杆菌降解不同产地煤粉的降解圈；结果如图8-10所示。
图8是生物降解新疆大南湖煤的实物图，其中：(a)为悬浮前，降解圈大小为D＝19.96 ±1.04mm；(b)为悬浮后，降解圈大小为D＝42.50±1.12mm；
图9是生物降解新疆红沙泉煤的实物图，其中：(a)为悬浮前，降解圈大小为D＝8.34± 1.13mm；(b)为悬浮后，降解圈大小为D＝30.68±1.26mm；
图10为生物降解新疆乌冬煤的实物图，其中：(a)为悬浮前，降解圈大小为D＝14.72± 0.91mm；(b)为悬浮后，降解圈大小为D＝35.72±0.75mm。
从图8-10可知，声悬浮后的地衣芽胞杆菌对红沙泉煤、大南湖煤和乌冬煤的降解圈增加。因此，声悬浮处理地衣芽胞杆菌有利于煤炭的生物降解。
上述实施例2中，对影响煤降解的煤样粒径、煤样质量、液体培养基体积、声悬浮菌液用量以及培养方式等因素进行了优选。
但是步骤3)中原煤与硝酸处理时的条件还可以在以下范围内选择，具体的，浸泡时间在12～48h内任意选择，干燥温度在80～120℃内任意选择，干燥时间在6～12h内任意选择。
步骤4)中，煤浆的灭菌时间保持在10～20min内；煤浆与声悬浮菌液的混合温度为20～40℃内选择，离心速度在8000～12000r/min内选择，离心时间在10～30min内选择，烘干温度在80～120℃内选择，烘干时间在6～12h内选择。
实施例3
与实施例2不同的是，本实施例采用枯草芽胞杆菌对煤进行降解。
首先，优选出声悬浮处理的条件，优选方法与实施例1的方法相同。经过优选，声悬浮的功率150～350W，时间0.5～3min。
进一步的，测定声悬浮后的枯草芽胞杆菌的碱性蛋白酶活性，发现声悬浮后枯草芽胞杆菌的碱性蛋白酶活性提升22.4％。
进一步的，采用与实施例2相同的方法进行不同产地煤的降解，并与未悬浮的枯草芽胞杆菌对煤的降解率进行对比，结果如表3所示。
表3悬浮前后枯草芽胞杆菌对不同煤样的降解率
Figure RE-GDA0003413144760000101
从表3可知，经过声悬浮处理后的枯草芽胞杆菌，在用于煤降解时，降解率明显提升，尤其是对新疆乌冬煤的降解提升较为明显。
实施例4
与实施例2不同的是，本实施例采用短小芽胞杆菌对煤进行降解。
首先，采用与实施例1相同的方法优选出声悬浮处理的条件，声悬浮的功率150～350W，时间0.5～3min。
进一步的，测定声悬浮后的短小芽胞杆菌的碱性蛋白酶活性，发现声悬浮后短小芽胞杆菌的碱性蛋白酶活性提升20.9％。
进一步的，采用与实施例2相同的方法进行不同产产地煤的降解，并与未悬浮的短小芽胞杆菌对煤的降解率进行对比，结果如表4所示。
表4悬浮前后短小芽胞杆菌对不同煤样的降解率
Figure RE-GDA0003413144760000102
由表4可知，经过声悬浮处理后的短小芽胞杆菌用于煤降解时，三种新疆煤的降解率明显提升，其中新疆乌冬煤的降解提升较为明显由50.7％提高60.7％。
综上所述，本发明经过对菌种进行声悬浮处理，能增强碱性蛋白酶的释放，促进菌种的生长，提高菌种对煤的降解率。

Claims (10)

1.一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种经发酵、声悬浮处理后得到声悬浮菌液；
2)对原煤经破碎、研磨、筛分得到煤粉；
3)煤粉浸泡于硝酸溶液中，经洗涤、过滤后，取固体干燥，得到煤样；
4)将步骤3)的煤样先加入至液体培养基中形成煤浆，经灭菌后，继续向煤浆中加入步骤1)的声悬浮菌液，混合、离心后取固相产物，清洗、烘干、称重，计算煤降解率。
2.根据权利要求1所述的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，所述步骤1)中，菌种为地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌或短小芽胞杆菌。
3.根据权利要求2所述的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，所述步骤1)中，声悬浮的条件是，功率150～500W，时间0.5～4min。
4.根据权利要求3所述的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，所述步骤1)中，声悬浮的条件是，功率150～350W，时间0.5～3min。
5.根据权利要求1所述的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，所述步骤3)中，浸泡时间为12～48h，干燥温度80～120℃，干燥时间为6～12h。
6.根据权利要求1所述的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，所述步骤4)中，煤样、液体培养基和声悬浮菌液用量的质量体积比为0.1～1.5g：50mL：5～50mL；所述煤样粒径为0.5～0.075mm。
7.根据权利要求6所述的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，所述步骤4)中，液体培养基是由10.0g蛋白胨、10.0g牛肉膏、5.0g NaCl、20.0g琼脂以及1L蒸馏水配制而成的；液体培养基的pH＝7.2。
8.根据权利要求7所述的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，所述步骤4)中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为10～20min，混合温度为20～40℃，离心速度8000～12000r/min，离心时间10～30min，烘干温度80～120℃，烘干时间为6～12h。
9.根据权利要求8所述的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，所述步骤4)中，混合过程是在摇床中进行，摇床的转速为100～180r/min。
10.根据权利要求9所述的一种利用声悬浮仪筛选微生物用于降解煤炭的方法，其特征在于，所述步骤4)中，煤降解率
Figure RE-FDA0003413144750000011
m0为煤样质量；m为固相产物质量。
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