CN102171336A - 超声波加强的微生物生长 - Google Patents

Abstract

一种加强细胞增殖率，用于微生物的产品的生产，或蛋白质的表达，包括将微生物暴露给大于1MHz的超声波频率。

Description

超声波加强的微生物生长

相关申请的交叉参考

这项申请是申报美国临时申请的优先权，这项美国临时专利申请的号码为No.61/091,830。申请日期是2008年8月26日，题目为：“超声波技术用于增强微生物细胞生长”，在此，所有的内容，范围都以此为准。这项技术与增强微生物的蛋白质表达有关。具体来说，此发明用超声刺激细胞的方法来增强微生物的蛋白质表达。

发明领域

细胞培养广泛地应用于科学和工业领域中各种目的的蛋白质生产、制药生产中的食物和饮料发酵。细胞培养在实验室条件下也经常用于科研和疾病诊断，随着基因工程的到来，各种基因改造的微生物也越来越常用于医疗蛋白、抗生素、胰岛素、激素、和其他重要的生物医学分子的生产。

发明背景

发酵是制药工业中最重要的生产过程之一。工业发酵机理大致理解为有机物质的分解与重组为其他有机物质。工业规模的发酵过程通常指高氧和耗氧的生长过程。例如，引人注目的和有巨大利润的青霉素就是以深度发酵过程来大量生产的。当某一特别的微生物被放在一种经特别选择生长培养基中，这种微生物就被接种于这种培养基里。接种后的微生物并不是立即生长，而是滞后一段时间。随后微生物的生长率稳步增加，以对数指数方式增殖。指数增长期后，增长率会减慢，这是由于营养浓度的持续下降和持续增加的有害物质。在此阶段增长率的增加受到抑制，为下降期。下降期后增长停止，微生物培养基进入稳定静止期。

发酵工业依靠细菌和真菌培养基来生产饮用酒精、处理各种食物、将玉米和其他原材料转化为生物燃料、以“生物治理”的过程来中和有毒泄露、降解液态和固态废物、以及生产各种重要的生物学上的复合物。

在几乎所有运用细胞培养的技术中，相关产品的生产率仅受限于在生产过程中的蛋白质表达的发生速率和细胞生长率。工业发酵通常在特别设计的环境下进行，就是细胞在悬浮状态下生长。通过小心的保持理想的温度和搅动混合物以期将营养物转入细胞和将新陈代谢物转移出细胞，从而发酵槽可以最大促进细胞生长。然而，在微观水平上，却难以保证涡流在发酵罐中的均匀遍布而不能最大地影响细胞。在靠近细胞壁和发酵槽壁有一个相对凝滞的区域，从而导致营养物和有毒物质不能有效地进出生长在这个区域的细胞，降低蛋白质表达率，从而在总体上降低了发酵过程的生产率

由于发酵是种广泛应用的技术有许多工业用途，如果有某种促进蛋白质表达率的技术与方法将会是有巨大意义的。

超声刺激产生“微汽孔”，即称为“微孔”的液体中的小气泡。每一轮声波中气泡会扩张和收缩，在微观水平上产生很大的动力和搅动。在某些情况下，声波会导致空穴的崩塌，以至于产生更极端的搅动、高温、和空穴附近的自由基。这些崩塌有足够力量驱除或甚至会破坏细胞。

就是运用这些作用过程发展了许多超声应用技术，一个常用的超声用途是做为一种有效的清洁手段；如果强度足够高，微孔的破裂成为细胞周围的主导因素。这将有害细菌从表面剥离，甚至杀死其中的大部分。此技术的有效性已经被证实，施加超声于玻璃试管的一端，频率大约100kHz，强度大约40W/cm²，约88％的细菌从试管表面除去。类似的实验在各种情形下得到验证，包括从反向渗透薄膜上剥离生物膜。超声目前积极的用于实验室的清洁手段。

包括细菌分离，超高强度的超声(＞100W/cm²)已经用于杀死悬浮的细菌，这有赖于微孔的破裂来破坏细菌的薄膜。

低强度超声波却有另外的用途；据信低强度超声波能增强骨骼生长率，约80％北美物理理疗师拥有超声发射器用于物理治疗来加速康复。最近的研究表明只有低强度超声对理疗是有效的，低强度脉冲超声设备(LIPUS)目前已投入市场。其中一种方法由Duarte于1982年注册了美国专利(U.S.Pat.No.4,530,360)。

用低强度脉冲超声帮助组织创伤康复的方法见于美国专利(U.S.Pat.Application 2006/0106424 A1 by Bachem 2005)。此种方法用超声波来增强人体巨噬细胞的吞噬行为。但

美国专利(U.S.Patent Application No.US 2003/0153077 A1)详细描述一种方法用低强度超声波来刺激生物膜和其他细胞生长，靠平衡微孔的破裂导致的有益的扰动与相应的负面效应，低强度超声可以提高细胞生长率可高达50％。实验人员以此测试了人体和细菌细胞，频率范围从20kHz到1MHz而强度范围从1到5000mW/cm²。然而，尽管增加细胞生长对发酵过程是有益的，该研究组的参数没有提供发酵过程中蛋白质表达的最优比率。

发明简述

此发明提供了一种技术，利用校正精确的超声波来刺激原核细胞，从而促进细胞生长或蛋白质表达或两者同时增加。这种增强细胞生长或蛋白质表达的技术可以用于具体的应用过程中，例如发酵或其它生物处理方法。

另一方面，是通过细胞暴露给特定频率和强度的超声波，此发明成为了一种在培养基中增强细胞生长或中蛋白质表达或二者同时增加的方法。超声波在通常液体更粘滞的地方，包括紧邻细胞壁和其他固体表面附近，产生微观尺度的扰动。

超声频率范围在1MHz和10MHz之间，取决于培养液中细胞的种类，更可取的范围是1MHz和2MHz之间。例如，超声波的刺激频率可选在1.4至1.6MHz之间。再例如，脉冲超声波将有助于最大限度的减少环境温度的增加。另一个例子中，脉冲的关：开周期约为4∶1，脉冲时间大约1秒，最为有效。再一个例子中，超声波可以被精确调整，从而在“微孔的破裂”的负面效应与扰动提供给细胞的正面效应之间达到平衡，允许最大限度的增加细胞的营养摄取和新陈代谢物排出。

在另一个方面，这项技术包含可以有监测到超声波实际应用强度的方法，犹如靶细胞可以“感觉”到一样。然而，这并不是在任何情况下都是必需的，超声波刺激方法可以在没有此种探测的情况下进行。只要将任何超声测量仪器连接到超声发射器上，测量就可以进行。例如，利用传感器能将收集到的信息通过有线或无线的连接传回到超声发生器。

另一方面，此发明包括了技术通过利用上述传感器可以根据感测到的超声强度来校正超声发射以达到最大效果。这有助于最大限度的蛋白质表达。

靶细胞可以是真核的或原核的，也可包括真菌和细菌细胞。这些细胞可以是原始细胞或生物改造细胞。

根据细胞在培养液中的脆弱性，超声强度可以大于10mW/cm²至5000mW/cm²。

例如，超声的方向可以被调整以达到最低的反射和干涉作用，或者被调整以达到超声发射的最大效应。

例如，超声波发射器可以放置在发酵罐里，或发酵罐外固定的发射平面，或其他合适的设置。

即使发酵过程在发酵槽里没有发生，可同样应用此方法，超声波发射可以最大覆盖细胞以达到增强的蛋白质表达。比如，在原位细菌的生物修复治疗中，超声发射器可以策略性的放入或周期性的移动。

附图说明

为了更好的理解上述列举的此项发明的特点和优点，以下给出详细的描述。以一个特定的例子为例，结果在附录的图片中描述。此例子只是此发明的实例之一，并不局限于此。在以下的图片中：

图1是一示意图描述了此发明的一个应用实例，如何在工业规模上应用此技术来增产有用的生物材料。用压电传感器产生的超声波作用于传统发酵槽中的细胞培养基。传感器放在能在生长介质中产生最大化超声效果和能均匀分布的位子。

图2显示了真菌(T.reesei)的显微图像，一组是超声刺激过的真菌而另一是对照组。超声作用后真菌数量显著增加。号码844是指T.reesei(strain Rut-C30 or 844)(a)对照组，经过3天，25倍显微放大；(b)超声波刺激组，3天后，25倍放大(c)对照组，3天后50倍放大；(d)超声波刺激组，3天后50倍放大。

图3显示了对比了T.reesei(strain 844)在超声刺激后或无超声刺激，然后培养3天后的纤维素酶的活性(844对照组，or 844 CK为刺激组)。这里844 A2，844 C2和844 E2代表不同的LIPUS的强度：10mW/cm²，50mW/cm²，及100mW/cm²。这显示了LIPUS的效率与可靠性，及其它超声特性如强度和频率。在这里也显示了如果超声强度过高会妨碍生长。

图4显示了在不同强度超声处理(mg)后真菌重量的对比。CK-2是对照组。A1-3为80mW/cm²，D1-3为60mW/cm²，E1-3为30mW/cm²。

图5显示了一种发酵产物(mycophenolic acid)经过不同强度(图4)超声处理后在培养基中的浓度(μg/ml)。

图6显示了一个超声传感器排列的实例，这种超声传感器用于大体积的培养基。

图7是一个示意图显示了一个包含了监测系统反馈的超声仪器。

发明实例的详细描述

发明实例通过如下描述和图片来理解。本发明方法，可以通过许多方式加以应用和变更来加以概述。因此，如下的详细描述不是用来局限此发明的范围。事实上，此描述

“微生物”一词包含原核生物和单细胞的真核生物。微生物包括细菌、真菌、古真菌、和原生生物以及其他。其中的单细胞微生物可用于有用的工业过程，如发酵、生物治理或生物产品的生产。

发酵”一词广泛的用于微生物的大量生长在一些培养基上或培养基中。如只是“发酵”一词，并没区分耗氧和厌氧的新陈代谢。厌氧发酵是营养分子的厌氧新陈代谢分解而产生能量，如葡萄糖，而无净氧化作用。发酵一般产生乳酸、醋酸、酒精或一些简单产品。

本发明是用高频超声波来增强微生物的生长或增加蛋白质或其他分子或复合物的产量。微生物可以是在液态或固态培养基中，或存在不受控的环境中。利用本发明方法微生物可生产有用的产品，如油、有机酸、酒精或蛋白质。例如，微生物参与了粉粹或消化物资，比如参与厌氧性消化或生物重建过程。

为何本发明中的超声波会增强细胞或蛋白质生长的机理还不明确。不受限于任何理论，已经显明本发明通过允许快速传输基本物质进入细胞和快速从细胞中分散新陈代谢副产品，从而加快细胞生长或蛋白质表达。

尽管许多发酵罐通过用搅拌或摇晃细胞培养物的方法试图解决这个问题，理论上仍有微观的缓冲区存在于固定面或细胞壁附近，从而局限了液体的流动。如果浸泡细胞的液体在紧邻细胞的区域是凝滞的，这无助于传输小分子，如氧、氨基酸、二氧化碳等，进入或从细胞中出来。

当受到超声波刺激，细胞培养液周围的液体包含有小气泡，能够压缩和释放，导致收缩和扩张。这种运动对包围气泡的液体产生了作用力，当气泡压缩时，液体被“推”向小气泡的周围，当气泡扩张时，液体被推开。这在微观尺度上产生了足够的扰动。这种扰动甚至是局部的，因为气泡倾向在细胞壁或固体表面周围形成，正好是原来凝滞的区域。

如果压力足够高(由于高强度的超声所导致)，气泡会完全塌缩。简单的热力学表明在这种情况下温度会突然上升，某一研究声称温度高达5000K，塌缩导致热的激波或“剪切力”，或直接朝向气泡中心的力。塌缩引起大范围的扰动，从而营养和废物的转移更快，但同时，过强的温度和力也会破坏或撕裂细胞壁。本发明中的超声的强度和频率必须能够被调节以达到能平衡空穴效应带来的有害和有益的效果。

本发明意在通过增进细胞膜附近的物质传送以期帮助细胞生长或蛋白质表达。加强的细胞生长和蛋白质表达通常是相互正相关的，一方的增强往往导致另一方的增强。

T.reesei是真菌的变种，用来产生几乎所有的生物燃料，包括酒精、丁醇和纤维素乙醇。后者是有效和相对低廉的生物燃料，从有机肥料和其他非食用植物原料提炼。特别纤维素乙醇被认为是未来化石燃料的替代品，商业化生产已经开始。然而，主要妨碍商业化的是高额的成本和特别耗时的生产时间。优化T.reesei发酵过程将会使丁醇生产者增加T.reesei细胞蛋白质表达的比率，从而增加丁醇的产量。

纤维素乙醇来源于非食用农作物如稻秆和其他有机肥料。尽管倾向于用可食用材料自造燃料，但成本高昂并且耗时过多，本发明的应用可增加纤维素乙醇生产的比率。

高频超声(高于1MHz)可用于不同情形以增强培养基中细胞生长或蛋白质表达。潜在的应用包括增加试验细胞培养的蛋白质表达、快速的测试和诊断、快速生产药物、生长激素、细胞调节因子、蛋白质和广泛的生物医疗产品。

酵母、细菌、真菌和其他用于化学物质转化的微生物的培养基，，包括了其它可能的技术应用，包括以上未提到的应用。

我们发现当超声在高频时，超过1Mhz，对微生物培养液中的细胞生长是有益的。以前手段的超声刺激频率范围在20kHz和1MHz之间。我们惊讶的发现许多情况下优化的频率是高于1MHz。因此，在一个实例中超声频率大于1MHz小于2MHz。在1.5MHz左右，试验表明许多细胞类型，包括干细胞和其他动物细胞，允许最大“微搅动”而只经受最小的细胞结构的损害。因此，在一实例中，超声大于约1.4MHz小于约1.6MHz。在一可取的实例中，1.4MHz和约1.6MHz发现对T.reesei特别有用。

此技术也可能被应用于非培养基的例子，也就是说细胞不在特别控制的环境下。虽然我们描述这项技术主要运用于实验室条件下的微生物细胞培养基，但是，本发明的实例也可用于不受控的条件下，如生物治理的环境，或大规模厌氧消化器。

不同细胞有不同的长处和弱点，不是所有细胞都要同样的频率和强度。比如，不同微生物类别的原核和真核细胞之间的差别为最大。这里的技术就提供了一个窗口对不同细胞上使用不同的频率和强度而达致最优的表现。

超声强度大于约5mW/cm²至约5000mW/cm²。在一实例中，强度范围在约40mW/cm²和约80mW/cm²之间，另一实例中，最优强度约为60mW/cm²。

在一实例中，超声发射器放置在足够靠近目标区域的地方以传递特定频率和强度的超声波来刺激细胞。在另一实例中，超声作用于细胞培养对数增长期；不过有益效应可在任何增长期实现。没有必要用持续的超声刺激，每24小时用低于1小时的超声波刺激就能实现增加的生长率或蛋白质表达的效果。在另一实例中，每24小时刺激间隔为10分钟到20分钟之间，就足以得到有益的效果。

合适的频率和强度的优化，对于任何指定微生物和生长条件，可用经验方法来确定，如果技巧得当可以不必大量试验。一般的，原核细胞比真核细胞更耐久因此能承受更高强度的超声刺激。强度范围简略的讨论于Pitt等的专利申请，题为“促进细胞生长率的方法”，(Pub.No.US 2003/0153077 A1)。结论是真核细胞约为8-50mW/cm²而原核细胞约为2-2.2W/cm²。在所有的Pitt等的专利试验中频率为70kHz。

在一实例中，因为长时间的超声波刺激会积累热量并破坏处理的细胞，最好超声波为脉冲。脉冲的持续时间可以通过有技巧的经验方法确定。在一实例中，1∶4的工作周期和1秒的周期时间被用在测试中(也就是200微秒的作用之后是800微秒的‘安静期’)。开/关比率和周期长度可以根据需要或要求改变。根据细胞种类及细胞其他的特征，超声波频率和强度，其他脉冲周期也许更合适。

当将本技术中的几种机制联合在一起，这项技术可称为“LIPUS”，即低频脉冲超声。

在一实例中，此发明除包含了超声感应器，有效地连于超声发射器外，还包含有频率和强度反馈控制机制。超声波的强度测量可用任何商用的超声测量仪器。在一实例中，本技术涵盖了利用上述传感器传递收集到的信息通过有线或无线连接传给超声发射器的步骤。此反馈传感器的设置由图1B表示。这种环形反馈被用来保持超声频率和强度在预先设定的程度或范围内。

如上所述，此方法适用于在受控以及许多非受控环境下的细胞生长，包括悬浮状态下的细胞生长。在一实例中，超声波作用于大容量液体细胞培养基，超声波通过一个传感器阵列提供更加均匀的超声能量。如图6所示，一个包含许多传感器的超声平板安置在细胞培养液容器中。在一实例中，此阵列放置在容器底部。通过不断的扰动，在任一个作用周期，细胞培养基里都能得到相对均匀的超声能量。图6显示了一个5L的烧杯，可以将此设计伸延至巨型的发酵罐，如图1所示。在设计中，由许多的超声传感器排列而成的超生盘产生的超声波辐射透过容器壁对烧杯里的液体进行刺激，这种刺激比在局部的单一超声传感器的刺激更为均匀。

正如在这里的描述和以后随之而来的申报，本发明可具体实现于其他特定形式，而不偏离其结构、方法、或其它基本特性。正如附录的申报所指，所有被描述的例子在每一方面都被认为是就其所是的具体实例，因此，而不仅仅是之前的描述。任何在申报中的含义上的变化和等同的改变将都包含在其范围内。

以下的例子仅仅作为示范，而不对此发明有任何局限。

例子

以下例子意在描画所指的发明而不以任何形式限制所指的发明。

例一，青霉菌Penicillium brevicompactum的生长。

一小瓶冷藏的P.brevicompactum孢子用无菌水稀释成1/20。在含有75毫升的PDA琼脂的500毫升烧瓶中，加入1毫升的孢子悬浮液，在室温下孵化9天。50毫升无菌0.01％Tween80加入孢子培养烧瓶，孢子被刮掉悬浮在溶液中。溶液转移到一无菌容器。200微升的孢子悬浮液被接种于125毫升的烧瓶(内含25毫升的接种培养基)。接种的烧瓶在27度，200rpm(2”throw)下孵化48小时。然后，0.5毫升的接种培养基被加入包含25毫升生产培养基的烧瓶并孵化，在27度200rpm(2”throw)下孵化。每天用不同强度的超声处理每个烧瓶10分钟。

	接种培养基含量(g/L)	生产培养基含量(g/L)
			蔗糖	52.0	150.0
甘氨酸	7.5	14
			酵母菌提取物	2.0	0
MgSO4 7H2O	1.0	1.0
			KH2PO4	1.0	1.0
JEC TE溶液	1.0ml	1.0ml

*JEC TE溶液含有NaMoO4·2H2O，H3BO3，CuSO4·5H2O，FeSO4·7H2O，MnSO4·H2O，ZnSO4·7H2O和柠檬酸。

经过4天孵化，培养液收集起来并用Agilent system作MPA量化。从发酵培养基中萃取MPA是通过加入一体积的50％乙腈入水，然后室温以200rpm晃动一小时。萃取液以8000rpm离心30分钟。所得到的上清液用0.22微米的过滤膜过滤并用HPLC作MPA浓度分析。

生物固体样本分析用标准的滤纸烘干法进行。用超声D(60mW/cm²)和E(30mW/Gm²)级别处理过的溶液中固体生物产物分别提升了10％和9％，如图4所示。

例2，用HPLC作MPA定量分析。

校正和质量控制标准通过用乙腈稀释MPA原液来准备。标样浓度为0.5，1.0，10，50，100，250，500μg/ml的MPA。用1/x²线形回归的方法来建立标准曲线。

HPLC测试用Agilent的1100HPLC系统进行。分析柱是SymmetryShield RP-8(100X4.6mm，3.5μm)连同一保护柱(SymmetryShield 20X3.9mm，5μm).流动相A是35∶65％(v/v)MeOH：5mM NaH2PO4(pH 4.0)以及流动相B是90∶10％(v/v)MeOH：2.5mM NaH2PO4(pH 4.0).线性梯度流动相洗提MPA，线性梯度流动相的流速为1.0ml/min从0 to 80％B共8分钟，从80％到100％B共4分钟，100％B维持4分钟，从100％B到0％B 1分钟，以及0％B维持5分钟.监测MPA吸收光谱是215nm波长。

当微生物培养基被D和E级别的超声处理后，MPA浓度有6-14％的增加，如图5所示。

例3，高强度超声

一定高级别的超声处理可能抑制微生物生长。如图4和图5，在特定生长条件下，P.brevicompactum被80mW/cm²处理后显示真菌干重和MPA产量又轻微的减少了，不过30和60mW/cm²的超声后真菌干重以及MPA产量增加了。

例4，Trichoderma reesei的生长

如下两种类型的Trichoderma reesei被使用，#843-ALK01120＝QM9414；#844-ALK02374＝Rut C-30(Roal Oy，2007)。CMT方法在生长中使用，条件为12小时/12小时(光线/黑暗)。1毫米直径量的真菌栓从原来的盘子取出并接种到60毫米培养皿的中央，培养皿中含1％刚果红的羧甲基纤维素(CMC)琼脂处理过的琼脂。盘子在室温下待2小时让琼脂固化。在接种之后2小时、4小时、21小时、24小时、48小时时，不同强度的LIPUS用来处理真菌10分钟，不同超声波强度分别为20mW/cm2 for 844 A2，50mW/cm2 for 844 C2，and 100mW/cm2 for 844 E2。1M的氯化钠被用来给培养基退色而细胞酶活性用ICMC index procedure(Teather and Wood，1982；Bradneret al，1999)来测量并用显微镜观察。如图2所示，LIPUS在20和40mW/cm²时确实刺激了培养基生长，相对于没有LIPUS处理的情形(844CK)。但高强度可能抑制生长。所以选取优化的LIPUS强度是可取的。

Claims (14)

1.一个增加微生物细胞或细胞培养基的生长率、有效物资的产量、或蛋白质表达的方法，包括的步骤是将细胞或细胞培养基暴露在频率范围在1MHz和10MHz之间的超声波之下。

2.权利要求1的方法，其中的超声波是脉冲形式。

3.权利要求2的方法，超声频率从约1MHz到2MHz。

4.权利要求3的方法，其中的频率在约1.4MHz和约1.6MHz之间。

5.权利要求4的方法，其中超声频率约为1.5MHz。

6.权利要求1的方法，其中超声强度从约1mW/cm²到约5W/cm²。

7.权利要求6的方法，其中超声强度从约10mW/cm²到约150mW/cm²。

8.权利要求1的方法，其中细胞或细胞培养液包含真核细胞。

9.权利要求8的方法，其中细胞或细胞培养液包含真菌。

10.权利要求9的方法，其中真菌包括青霉菌属(Penicillium)或木霉菌属(Trichoderma)。

11.之前任何权利要求的方法，其中超声在周期间隔中使用。

12.权利要求10的方法，其中超声使用了1个或多个间隔，作用时间在24小时期间小于60分钟。

13.权利要求11的方法，其中超声在24小时期间使用了一个长为10或20分钟的间隔。

14.与权利要求1的方法共同使用反馈系统的方法，测量了目标点的超声发射，调整发射强度以确保到达细胞的频率和强度最优。

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