CN107438668B - 利用能量的多能细胞诱导装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用能量的多能细胞诱导装置和方法，更详细地，向已分化细胞施加超声波、激光或热处理等的能量，诱导具有多能性的新型多能细胞。

Description

利用能量的多能细胞诱导装置和方法
技术领域
本发明涉及利用能量的多能细胞诱导装置和方法，通过提供超声波、激光或热处理等能量可以诱导具有多能性的多能细胞。
背景技术
多能性(pluripotency)是分化为3胚叶系统，即外胚叶、中胚叶和内胚叶的能力。多能干细胞在临床上在疾病模型和移植中是重要的，因为其在体内形成任意的细胞或组织类型。因此，目前在胚胎干细胞、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)、体细胞和患者来源细胞的重编程或分化中主要的需求是，为了临床应用，不需要引入外来的遗传物质或化学物质或小分子，需要简单、快速、有效果和安全。在最近的研究中，证明了环境和基因型之间的相互作用与活有机体的基因表达和表型变异密切相关。通过调节结构、机械、磁性、超声波信号等环境刺激可以调节细胞死亡、增殖和细胞吸收效率。与这些方法相近的正确的分子机制还不明朗，因此这些方法只能作为不需要引入遗传物质、化学物质和小分子可以实现安全性的代行方案接受。
在这点上，本发明的发明人在没有基因和化学物质的条件下，通过利用细胞环境信号的能量提供使未分化标记物和由外胚叶、中胚叶和内胚叶组成的3胚叶标记物基因表达，开发诱导分化为3胚叶的具有多能性的新型多能细胞，即Physics(pluripotentsphereyielded by ultrasonic stimulus)细胞的方法。
发明内容
技术方案
本发明的目的是提供一种多能细胞诱导方法以及诱导装置，不需要向已分化细胞引入逆分化诱导因子和化学物质，通过提供能量诱导已分化细胞生成具有多能性的新型多能细胞。
技术手段
为了实现上述目的，本发明提供由已分化细胞逆分化为多能细胞的方法，包括混合培养基和已分化细胞，向所述混合物提供能量，并通过一段时间的培养形成球状体(spheroid)，所述球状体具有多能性。
本发明还提供多能细胞诱导装置，包括可以收纳细胞和培养基的培养室；和设置在所述培养室的一侧，可以向所述细胞和培养基提供能量的供能装置；混合已分化细胞和培养基，向所述混合物提供能量，并通过一段时间的培养形成球状体，所述球状体具有多能性。
技术效果
本发明不需要向已分化细胞引入逆分化诱导因子和化学物质，通过合适的超声波、激光或热处理等提供的能量诱导已分化细胞生成具有多能性并且与公知的诱导性多功能干细胞相比分化特性更强的新型多能细胞。
附图说明
图1为本发明的具有多能性的人类Physics细胞的模拟图；
图2a示出了超声波强度对人类皮肤成纤维细胞的效果，a)比较不同超声波强度下的HDF形态变化，b)不同超声波强度下生成的多细胞球状体的个数。
图2b示出了超声波强度对人类皮肤成纤维细胞的效果，c)超声波处理的HDF的活/死细胞分析结果，d)上述c)中生存和损伤细胞的比例。
图3a示出了在1W/cm2的固定强度下超声波暴露时间的效果，a)比较不同超声波暴露时间下的HDF形态变化，b)不同超声波暴露时间下生成的多细胞球状体的个数。
图3b示出了在1W/cm2的固定强度下超声波暴露时间的效果，c)超声波处理的HDF的活/死细胞分析结果，d)上述c)中生存和损伤细胞的比例。
图4示出了超声波强度对人类ESC培养基的效果，上端的图比较了在超声波处理的培养基中生长的超声波处理的HDF的形态变化，下端的图示出了在上述培养基中生成的多细胞球状体的个数。
图5示出了在5W/cm2的固定强度下超声波暴露时间对人类ESC培养基的效果，a)比较在超声波处理的培养基中生长的超声波处理的HDF的形态变化，b)在上述a)中生成的多细胞球状体的个数。
图6示出了用于生成多细胞球状体的超声波处理条件和培养条件的效果，a)悬浮培养，b)单层培养。
图7a示出了在悬浮培养条件下不同超声波刺激(UC,UM,UCUM)生成的多细胞球状体的尺寸分布，a)整体尺寸分布，b)50-100μm尺寸的球状体分布。
图7b示出了在悬浮培养条件下不同超声波刺激(UC,UM,UCUM)生成的多细胞球状体的尺寸分布，c)100-200μm，d)>200μm尺寸的球状体分布。
图8a示出了在单层培养条件下不同超声波刺激(UC,UM,UCUM)生成的多细胞球状体的尺寸分布，a)整体尺寸分布，b)50-100μm尺寸的球状体分布。
图8b示出了在单层培养条件下不同超声波刺激(UC,UM,UCUM)生成的多细胞球状体的尺寸分布，c)100-200μm，d)>200μm尺寸的球状体分布。
图9a示出了比较悬浮培养和单层培养条件下的人类Physics细胞的多能性标记物基因，OCT3/4(a)和SOX2(b)的表达水平的RT-PCR分析结果。
图9b示出了比较悬浮培养和单层培养条件下的人类Physics细胞的多能性标记物基因，NANOG(c)和TDGF1(d)的表达水平的RT-PCR分析结果。
图10a是分析悬浮培养时OCT3/4表达水平的激光扫描共聚焦显微镜图像。
图10b是分析单层培养时OCT3/4表达水平的激光扫描共聚焦显微镜图像。
图11示出了培养6天期间多能性标记物基因表达的RT-PCR分析结果。
图12示出了RT-PCR分析结果，确定不同培养时间下在超声波处理的HDF球状体中OCT3/4的表达时机。
图13示出了确定ES细胞、HDF和人类Physics细胞中代表性的未分化标记物表达的结果。
图14示出了用于表征多细胞球状体的多能性状态的碱性磷酸酶染色结果。
图15示出了多能性标记物表达的免疫细胞化学结果。
图16a示出了人类ES(H9)细胞表面标记物的FACS分析结果。
图16b示出了人类HDF细胞表面标记物的FACS分析结果。
图16c示出了人类Physics细胞表面标记物的FACS分析结果。
图17示出了在共同培养饲养(Feeder)细胞和Physics细胞时，利用RT-PCR分析多能性标记物的基因表达(a)和利用免疫细胞化学法分析蛋白质表达(b)的结果。
图18示出了亚硫酸氢钠测序结果，示出了COT3/4和NANOG启动子的甲基化状态。
图19示出了人类Physics细胞的增殖能力验证结果，a)示出了增殖标记物Ki67的表达，b)示出了利用H33342和PI染色增加的细胞的结果，c)示出了不同培养时间下球状体的尺寸。
图20示出了验证人类Physics细胞的自我再生能力的实验结果。
图21a示出了人类ES(H9)细胞表达3胚叶标记物的免疫细胞化学分析结果。
图21b示出了人类Physics细胞表达3胚叶标记物的免疫细胞化学分析结果。
图22示出了培养人类Physics细胞15天期间，有关OCT3/4和3胚叶标记物的表达模式的免疫细胞化学分析结果。
图23示出了不同超声波刺激条件下人类Physics细胞的SEM图像。
图24示出了在不同的超声波刺激条件下进行超声波处理后并培养2小时后，利用荧光图像示出的人类Physics细胞的活/死细胞分析结果。
图25示出了形成多细胞球状体后，人类Physics细胞活/死细胞分析结果。
图26示出了超声波刺激引起的细胞内Ca2+浓度的变化。
图27示出了因超声波刺激生成的H2O2的分析结果。
图28是为了分析图27中因超声波处理生成的细胞内H2O2，用CM-H2DCFDA染色的人类Physics细胞的荧光图像。
图29示出了超声波刺激引起的细胞内ATP释放的分析结果。
图30示出了人类Physics细胞中P2X和P2Y受体的表达模式。
图31是利用量子点705确定人类Physics细胞更高的渗透能力的共聚焦显微镜图像。
图32示出了在人类Physics细胞培养基中由外来体表达多能性标记物基因的RT-PCR分析结果。
图33是免疫细胞化学结果，示出了人类Physics细胞释放的外来体OCT4向HDF传递的过程，黄色箭头表示周边HDF中的OCT3/4表达。
图34示出了体外分化诱导的人类Physics细胞的3胚叶标记物表达的免疫细胞化学结果。
图35示出了用于确定人类Physics细胞的体外分化的神经系统基因表达的RT-PCR分析结果。
图36示出了用于确定人类Physics细胞的体外分化的心脏系统基因表达的RT-PCR分析结果。
图37示出了用于确定人类Physics细胞的体外分化的神经系统标记物表达的免疫细胞化学结果。
图38示出了用于确定人类Physics细胞的体外分化的心脏系统标记物表达的免疫细胞化学结果。
图39是辅肌动蛋白的免疫细胞化学图像。
图40示出了本发明的人类Physics细胞的核型分析结果。
图41示出了用于确定人类Physics细胞在小鼠睾丸内体内分化的组织免疫荧光染色结果。
图42示出了用于确定人类Physics细胞在小鼠大腿内体内肌肉分化的组织免疫荧光染色结果。
图43示出了细胞培养基的效果，a)利用ES培养基和HDF培养基的结果，b)在ES培养基和HDF培养基中诱导人类Physics细胞确定ES标记物的结果。
图44示出了在其他细胞系内诱导人类Physics细胞的结果，a)示出了细胞形态的变化，b和c分别是在其他细胞系中诱导人类Physics细胞确定b)ES标记物和c)3胚叶标记物的结果。
图45示出了由患者皮肤细胞诱导人类Physics细胞的结果，a)示出了细胞形态的变化，b)在其他细胞系中诱导人类Physics细胞确定ES标记物和3胚叶标记物的结果。
图46示出了利用其他能量源进行热处理诱导人类Physics细胞后确定ES标记物和3胚叶标记物的结果。
图47示出了利用激光作为其他能量源诱导人类Physics细胞后确定ES标记物和3胚叶标记物的结果。
图48示出了在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导小鼠Physics细胞的过程。
图49示出了对转化的小鼠胚胎成纤维细胞(OG2MEF细胞)进行超声波处理后，确定不同的培养时间下细胞形态的变化和Oct4的表达，A示出了确定小鼠Physics球状体中GFP表达的结果，B是利用瓦片扫描(Tile scan)拍摄广范围的多张图像后合成的图像。
图50示出了通过超声波形成的球状体的GFP表达率图表和利用流式细胞仪分析的超声波处理的全体细胞中GFP表达率。
图51示出了利用流式细胞仪分析的小鼠Physics细胞的细胞表面未分化标记物(SSEA1)的表达的结果。
图52示出了小鼠Physics细胞的多能性标记物基因的RT-PCR分析结果。
图53示出了通过免疫细胞化学法分析的小鼠Physics细胞的多能性蛋白质标记物的结果。
图54示出了用于表征小鼠Physics细胞的多能性状态的碱性磷酸酶染色结果。
图55示出了有关小鼠Physics细胞表达3胚叶标记物的RT-PCR分析结果。
图56示出了有关小鼠Physics细胞表达3胚叶标记物的免疫细胞化学法分析结果。
图57示出了小鼠Physics细胞的核型分析结果。
具体实施方式
下文对本发明进行具体说明。
本发明涉及由已分化细胞逆分化为多能细胞的方法，包括混合培养基和已分化细胞，向所述混合物提供能量，并通过一段时间的培养形成球状体(spheroid)，所述球状体具有多能性。
本发明不需要向已分化细胞引入逆分化诱导因子、化学物质等逆分化诱导物质，通过提供合适的能量诱导已分化细胞生成具有多能性并且与公知的诱导性多功能干细胞相比分化特性更强的新型多能细胞。
上述多能细胞在外部环境下可以很好地分化诱导，与祖细胞(progenitor cell)相似，分化特性比干细胞更强，因此与现有的诱导性多能干细胞具有差别。即，当用与诱导性多能干细胞相似的胚胎干细胞作为细胞治疗剂时，需要进行经历一定程度分化过程的准备阶段，考虑可能转变为癌的危险要素，并且引入逆分化诱导因子所使用的病毒载体会引起安全性问题，而本发明的多能细胞，不需要另外引入用于基因变异的逆分化诱导因子或化学物质等逆分化诱导物质即可诱导，不需要与其他种类的细胞共同培养，因此没有细胞污染(与其他细胞混合)问题，在体内实验中，不形成与癌细胞类似的畸胎瘤，因此没有癌症产生的问题，可以确保安全性。换言之，本发明的多能细胞的优点是，诱导过程简单并且用时少，可以显著缩短从处理自体细胞到移植的时间。
本发明特异性地向培养基和已分化细胞两者提供能量，因此可以以优秀的收率生成球状体。
上述能量可以是超声波、激光或热处理中的任意一种。
本发明的多能细胞的特点是，可以稳定地表达OCT3/4、SOX2、NANOG、c-MYC、KLF4、TDGF1、SSEA4、TRA-1-60、PAX6、Nestin、Brachyury、SMA、GATA4或AFP中的任意一种未分化标记物或由外胚叶、中胚叶和内胚叶组成的3胚叶标记物基因。
基于上文所述的不需要向已分化细胞引入逆分化诱导因子即可生成多能细胞的观点，本发明的发明人考虑了其与外泌体之间的关系。即，超声波、激光或热处理可以通过能量诱导温度上升、诱导活性氧(ROS，reactive oxygen species)产生，诱导通过超声波生成的微气泡的振动、诱导液体的流动，即，诱导沿着细胞膜生成微波传输带，从而在细胞膜上产生微小的损伤，诱导孔的形成，从而增加对外部物质的吸收，这可以通过分析细胞内Ca2+浓度变化和确定H2O2生成与否进行证明。即，分析细胞内Ca2+浓度变化，在细胞膜有损伤或膜的流动性增加时反应为细胞内(胞质溶胶)Ca2+浓度的瞬间增加，从而确定细胞膜流动性增加。根据本发明的一个实施例，超声波处理之后，Ca2+浓度立刻快速增加，随后逐渐减小，通过减小至未进行超声波处理的对照组的水平，可以确定诱导细胞膜损伤后进行了恢复。另外，确定细胞内H2O2生成与否的实验也是类似的模式，初期超声波处理之后，H2O2生成量立即增加，随后逐渐减小至对照组水平，从而可以确定诱导细胞膜损伤后进行了恢复。另外，利用ATP作为对多种细胞性应激的反应信号，分析超声波处理后多能细胞中的ATP浓度的结果，与未经处理的对照组相比，以更高的水平释放ATP。同时，因ATP释放引起的促离子型P2X受体和代谢性P2Y受体的表达也是在多能细胞中比在对照组中更活跃。
另一方面，已知外泌体内部包含遗传信息物质(DNA、mRNA、microRNA、蛋白质)，因细胞膜损伤排出到细胞膜外部的外泌体再次进入周边的其他细胞中，通过这一过程可以传递外泌体内部存在的遗传信息物质。因此，利用超声波处理引起的刺激诱导乃至促进在细胞内低表达或维持在表达受到抑制的状态的未分化标记物的表达，同时在细胞膜上产生损伤，使包含上述表达受到诱导乃至促进的未分化标记物的细胞内部存在的外泌体排出到外部，从而向周边的细胞传递，因周边的细胞也是细胞膜部分受到损伤的状态，所以推测细胞膜流动性增加，外泌体进入细胞内部的效率比正常状态更高，认为这种外泌体内部存在的上述表达受到诱导乃至促进的未分化相关遗传信息被传递从而生成多能细胞。本发明的一个具体实施例中，在多能细胞诱导过程中回收培养基，提取培养基内的外泌体，确认外泌体内部是否存在与多能细胞相关的未分化标记物的结果，发现并确定已知的未分化标记物的表达水平高，从而支持发明人的上述假设。同时发现即使在上述超声波、激光或热处理下，核型也是正常的，没有变异。
上述假设使通过细胞膜损伤诱导外泌体排出从而生成多能细胞成为可能。
在本说明书中，术语“多能细胞”是指通过能量，严格来讲，通过超声波、激光或热处理后获得多能细胞。在本说明书中，多能性是指使在胚胎干细胞中表达的未分化标记物稳定表达的状态。同时，也是指使三个种类的内胚叶、外胚叶和中胚叶的3胚叶标记物表达的状态。上述多能细胞可以与“Physics(pluripotent sphere yielded by ultrasonic stimulus)细胞”或“Physics球状体”混用。下文将参考图1对本发明的由已分化细胞逆分化为多能细胞的方法进行详细说明。
首先，混合细胞培养基和已分化细胞，向上述混合物提供能量。
在向上述已分化细胞的混合物提供能量之前，先向细胞培养基提供能量，可以提高逆分化为多能细胞的效率。
上述能量可以是超声波、激光或热处理中的任意一种。
对上述培养基进行的超声波处理可以是输出强度为1W/cm2至20W/cm2的超声波处理1分钟至20分钟，具体地，输出强度为2W/cm2至10W/cm2的超声波处理5分钟至15分钟，更具体地，输出强度为3W/cm2至7W/cm2的超声波处理7分钟至13分钟。
对培养基进行的激光处理可以是300nm至900nm波段的脉冲激光光束照射1秒至20秒，具体地，上述波段的脉冲激光光束照射3秒至10秒，更具体地，上述波段的脉冲激光光束照射4秒至6秒。举例说明，上述波段可以使用400nm、808nm、880nm的波长。
对培养基进行的热处理可以是在40℃至50℃的温度条件下热处理5分钟至20分钟。
上述培养基可以使用胚胎干细胞培养基、干细胞分化诱导培养基等。
上述已分化细胞可以使用哺乳动物来源的成纤维细胞；包括宫颈癌细胞(HeLacell)在内的癌细胞，或包括肺上皮细胞(L132cell)在内的器官内组织细胞等。
向已分化细胞提供能量时，最好暴露在一定强度下，如果脱离这个范围，细胞生存率可能会减少。
因此，对培养基和已分化细胞的混合物进行的超声波处理可以是输出强度为0.5W/cm2至3W/cm2处理1秒至5秒，具体地，输出强度为0.7W/cm2至2W/cm2处理1秒至5秒，更具体地，输出强度为0.8W/cm2至1.5W/cm2处理1秒至5秒。
对培养基和已分化细胞的混合物进行的激光处理可以是300nm至900nm波段的脉冲激光光束照射1秒至20秒，具体地，上述波段的脉冲激光光束照射3秒至10秒，更具体地，上述波段的脉冲激光光束照射4秒至6秒。举例说明，上述波段可以使用400nm、808nm、880nm的波长。
对培养基和已分化细胞的混合物进行的热处理可以是在40至50℃的温度条件下暴露1分钟至10分钟后，在0℃至4℃的温度条件下暴露5秒至10秒。
之后，对提供能量的混合物进行一定时间的培养，形成具有多能性的球状体。
对提供能量的混合物进行的培养可以通过悬浮培养(suspended culture)或单层培养(monolayer culture)的方式，使未分化标记物稳定表达的球状体形成的时间可以是3天至10天。只是，因培养方式、细胞或培养基的种类的不同多能性球状体是否形成也不同，所以本领域技术人员可以根据实际情况适当地调整上述培养时间。
根据本发明的一个具体实施例，与单层培养相比，悬浮培养的球状体形成效率更高。并且，与单层培养相比，悬浮培养的球状体个数和尺寸更大，具有一定的尺寸分布。
根据本发明的一个具体实施例，在对超声波或激光处理的人类皮肤成纤维细胞进行悬浮培养时，从约第3天开始，观察到未分化标记物的表达增加或稳定化，从这时开始逆分化开始。此外，在对热处理的人类皮肤成纤维细胞进行悬浮培养时，从约第8天开始，观察到未分化标记物的表达增加或稳定化，从这时开始逆分化开始。
通过未分化标记物，例如，OCT3/4、SOX2、NANOG、c-MYC、KLF4、TDGF1、SSEA4、TRA-1-60等的表达，可以确定球状体具有多能性。未分化标记物的确定可以通过RT-PCR或免疫细胞化学法进行分析，对此没有特别的限制。
此外，本发明的多能细胞使3胚叶标记物，即外胚叶(PAX6,Nestin)、中胚叶(Brachyury,SMA)、内胚叶(GATA4,AFP)标记物以高水平表达。
此外，本发明的多能细胞使增殖标记物蛋白Ki-67表达，具有增殖能力。
此外，上述逆分化的多能细胞与营养细胞共同培养时，多能细胞的增殖增加，可以确定在分化诱导培养基中培养后，分化为外胚叶/内胚叶/中胚叶和神经细胞/心肌细胞。
本发明还提供多能细胞诱导装置，包括可以收纳细胞和培养基的培养室；和设置在所述培养室的一侧，可以向所述细胞和培养基提供能量的供能装置，混合已分化细胞和培养基，向所述混合物提供能量，并通过一段时间的培养形成球状体，所述球状体具有多能性。
上述培养室是指在常用的细胞培养中使用的培养器。例如，培养室具有温度控制部和二氧化碳控制部，本领域技术人员可以根据目的和细胞的种类适当地调整培养室内的细胞培养条件。
此外，因为可以通过悬浮培养或单层培养的方式使已分化细胞逆分化为多能细胞，所以，较佳地，上述培养室具有使这种培养成为可能的结构。例如，可以是用于悬浮培养的具有搅拌器的培养室。
上述可以提供能量的供能装置可以包括发射超声波的超声波发生装置，发射激光的激光发生装置，或温度控制装置。
上述超声波发生装置可以是产生频率为10kHz至100MHz超声波的现有的超声波装置，但不受此限制。
上述激光发生装置可以使用产生300nm至900nm波段的脉冲激光光束，以1W至15W的输出，脉冲持续时间为1ms至900ms，频率为1Hz至100Hz的激光装置，但不受此限制。
温度控制装置可以使用温度调节范围可以在-40℃至99.9℃的现有的温度控制装置，但不受此限制。
本发明的多能细胞诱导装置，利用上述超声波发生装置、激光发生装置或温度控制装置，对培养基和已分化细胞的混合物进行超声波、激光或热处理，通过一段时间的培养，形成具有多能性的球状体，可以由已分化细胞逆分化为多能细胞。此时，为了提高逆分化效率，可以在混合培养基和已分化细胞之前，先对培养基进行超声波、激光或热处理。
下文将根据实施例对本发明进行详细说明，但是，下述实施例仅是本发明的示例，本发明的内容不限制于下述实施例。
实施例
<实施例1>Physics细胞的制备
图1是本发明的Physics(pluripotent sphere yielded by ultrasonic stimulus)细胞形成模拟图，在用5W/cm2强度的超声波处理10分钟的ES(embryonic stem)培养基中混合人类皮肤成纤维细胞(HDFa,Cat.No.C-013-5C,GIBCO(Invitrogen cellculture))(1×106)，用1W/cm2强度的超声波处理含有细胞的混合物5秒钟。筛选生存的细胞后，在35mm细菌用皮氏培养皿(Petri dish)中，在人类ES培养基中悬浮培养2×105的HDF 6天。
培养第1天开始形成球状体，3天后未分化标记物表达。
<实验例1>球状体形成的最佳条件试验
人类皮肤成纤维细胞在超声波处理时形成球状体，为了确定用于提高球状体形成效率的最佳条件，改变超声波处理条件、细胞培养方式等进行实验。
细胞培养方式采用的是，在表面没有涂层的细胞培养皿(细菌用皮氏培养皿)中培养的悬浮培养(Suspended culture)，和在表面有涂层，细胞更易粘附到表面的细胞培养皿(组织培养皿)中培养的单层培养(Monolayer culture)。
此外，对照组分为未进行任何处理的对照组(Null)、对培养基进行超声波处理的对照组(UM:Ultrasound treated Media,用5W/cm2强度的超声波处理10分钟)、对细胞进行超声波处理的对照组(UC:Ultrasound treated Cell,用1W/cm2强度的超声波处理5秒钟)和对细胞和培养基两者进行超声波处理的对照组(UCUM:UM+UC)，观察随培养时间变化的细胞形态，测定球状体的个数，分析随培养时间变化的球状体个数和尺寸，从而确定球状体形成效率。实验对象细胞是人类皮肤成纤维细胞。
首先，为了确定超声波强度条件，使HDF(1×106)直接暴露在不同的超声波强度下(5秒，0、0.5、1、3、5、10W/cm2)。筛选生存的细胞后，在35mm细菌用皮氏培养皿中，在人类ES培养基中培养2×105的HDF 6天。
【表1】ES培养基成分
Figure GDA0001369763080000131
如图2a的(a)所示，在0.5、1和3W/cm2的超声波强度下，超声波处理的大部分HDF自发凝集，形成多细胞球状体。对照组则附着在培养皿表面，以5和10W/cm2强度的超声波处理的HDF不形成球状体，细胞凋亡增多。
图2a的(b)示出了图2a的(a)中不同超声波强度下生成的多细胞球状体的个数。
在1W/cm2的超声波强度下活/死细胞分析和图像分析结果，如图2c和2d所示，25％的细胞部分受到损伤，95％以上的细胞保持生存能力。然而，在比1W/cm2更高的超声波强度下，HDF受到严重损伤导致细胞凋亡。
因此，在1W/cm2的固定超声波强度条件下，改变暴露时间(0、1、2、5、10、20、40秒)，在35mm细菌用皮氏培养皿中，在人类ES细胞培养基中培养3天。
如图3a和3b的(a)-(d)所示，与其他暴露时间相比，在超声波下暴露5秒时，生成的球状体个数最高。然而，暴露10秒以上时，细胞凋亡戏剧性地增加，认为这是因细胞膜损伤引起的。
随后，改变超声波暴露强度(0、1、5、10W/cm2)，处理ES细胞培养基10分钟。在35mm细菌用皮氏培养皿中，培养超声波暴露下的2×105HDF(1W/cm2，5秒)3天。
如图4所示，与1W/cm2相比，5W/cm2超声波处理的培养基中，形成约2倍的球状体。
暴露时间(0、5、10、20分)的变化并没有对球状体形成效率产生有益的效果。一般来讲，短暴露时间会造成一定的尺寸范围和更多的个数(图5)。
随后，改变培养条件后，为了验证球状体形成效果，对ESC培养基进行超声波处理(5W/cm2，10分)，对HDF(1×106)进行超声波处理(1W/cm2，5秒)。筛选生存的HDF(1×106)后，在细菌用皮氏培养基中进行悬浮培养，或者在组织培养基中进行单层培养。
如图6所示，悬浮培养的超声波处理的HDF与单层培养的相比，表现出更高的球状体形成效率。另外，当超声波刺激对细胞和培养基两者施加刺激时，表现出更高的球状体形成效率。
为了观察悬浮培养或单层培养时，不同的超声波刺激生成的多细胞球状体的尺寸分布，在细菌用皮氏培养皿或组织培养皿中，在超声波处理或未处理的ES培养基中培养超声波处理的HDF或未处理的HDF。
如图7和图8所示，在两种培养皿中，HDF和培养基都被超声波处理时(UCUM)观察到更高的球状体形成效率。
并且，悬浮培养条件表现出更高的效率，球状体的个数和尺寸更大(200μm以上的直径)，与单层培养条件相比，表现出一定的尺寸分布。
在未处理的ES细胞培养基中生长的超声波处理的HDF(UC)形成球状体。然而，与UCUM条件相比，球状体的个数和尺寸(至200μm)非常低。在超声波处理的ES细胞培养基中培养正常HDF(UM)时，形成小尺寸(100μm以下)的少量球状体。利用组织培养皿的单层培养的UC和UM条件，球状体形成效率非常低。大部分的HDF附着在培养皿表面，球状体个数非常少。
另外，为了分析悬浮培养或单层培养时，不同的超声波刺激生成的多细胞球状体的培养时间与代表性的未分化基因表达的关系，根据上述实施例1的方法，按培养时间(1、2、3、4、5和6天)回收对照组和超声波处理组(Null、UM、UC、UCUM)的细胞，用
Figure GDA0001369763080000141
mRNA direct kit(ambion)提取mRNA，合成SuperScrip-II(invtrogen)cDNA后，利用表2中记载的引物，通过PCR扩增，进行电泳分析。
通过RT-PCR分析的结果示于图9，HDF和培养基两者都被超声波处理时(UCUM)，未分化标记物基因稳定表达，特别是，悬浮培养与单层培养细胞相比表达更高。
为了确定与培养环境有关的未分化属性的球状体形成的差异，比较了悬浮培养或单层培养时未分化标记物OCT3/4的表达水平。为此，将超声波处理后培养一段时间(0、1、2、3、4、5和6天)的细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，为了提高抗体的渗透能力，在添加有0.1％Triton X100的PBS缓冲液中暴露40分钟后，为了阻止非特异性蛋白反应，利用添加有5％非山羊血清的PBS缓冲液在室温下进行30分钟的封闭过程。之后，洗涤细胞后，分别添加一次抗体(OCT4；1:200,abcam)，在4℃反应过夜，利用添加有0.03％Triton X100的PBS缓冲液洗涤三次后，用D-PBS缓冲液将二次抗体(IgG anti-rabbit conjugate alexa 488)分别稀释至1:1000，在室温下染色2小时。利用添加有0.03％Triton X100的PBS缓冲液洗涤染色的细胞四次后，在载玻片上喷洒添加有DAPI的封固溶液(mounting sol.)，盖上盖玻片，利用指甲油密封边角后，用激光扫描共聚焦显微镜观察。
如图10所示，有趣的是，UCUM条件下超声波处理1天后立即观察到OCT3/4表达。OCT3/4表达逐渐增加，悬浮培养条件比单层培养条件观察到更高的表达水平。
之后，通过悬浮培养在UCUM条件下培养球状体6天，利用RT-PCR分析六种未分化标记物基因OCT3/4、SOX2、NANOG、TDGF1、c-MYC和KLF4的结果如图11所示，处理后1天内OCT3/4和NANOG基因表达增加，之后，其他基因的表达也随着培养时间的增加而增加，在2天内观察到所有标记物基因的表达，在3天后观察到稳定表达。最早的OCT3/4表达的时间点在超声波处理10小时后即观察到(图12)。
为了确定Physics细胞的未分化能力，4种随机筛选的球状体的RT-PCR结果确定了包括OCT3/4、SOX2、NANOG、REX1、TDGF1、FOXD3、FGF4、UTF1、ESG1、LIN28a、KLF4、c-MYC的多能性标记物基因的表达，比较了人类H9ESC和正常HDF(图13)。实验包括回收培养5天的Physics细胞，利用
Figure GDA0001369763080000151
mRNA direct kit(ambion)提取mRNA，合成SuperScrip-II(invtrogen)cDNA后，利用表2中记载的引物，通过PCR扩增，进行电泳分析。
【表2】
Figure GDA0001369763080000161
碱性磷酸酶(AP)染色结果显示出多细胞球状体的多能性状态的特征。悬浮培养的球状体与单层培养的球状体相比，显示出明显的红色(图14)。OCT3/4、SOX2、NANOG、SSEA-4和TRA-1-60的表达与H9人类ES细胞类似(图15)。并且，通过流式细胞仪确定了多细胞球状体的多能性(图16)。SSEA-4和TRA-1-60的99.5％以上在球状体中表达，各表达水平与H9人类ES细胞类似。
此外，转移球状体在有凝胶涂层的组织培养皿中与小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)营养细胞共同培养时，观察到细胞扩散和生长。并且，多能性标记物基因的表达仍保持依旧(图17)。
此外，为了追加确定未分化标记物的表达进行了DNA甲基化分析。在基因表达开始的启动子部分出现甲基化，可以知道在这部分没有基因表达，脱甲基化的情况，即甲基从DNA脱离的情况，意味着这部分的基因有表达。因此，通过确定ES细胞的主要基因即未分化干细胞的主要基因OCT3/4和NANOG这两种基因的启动子部分是否甲基化，确定这两种基因是否表达。
为此，利用蛋白酶K和苯酚从Physics球状体提取DNA后，利用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Reaserch)分析了Physics球状体的OCT3/4和NANOG的DNA甲基化。在上述分析中使用的DNA扩增用引物如下：
1)人类NANOG扩增用引物：
正向引物：5'-TAGGAGTAGAGTGTAGAGGAGAATGAGTTA-3'
反向引物：5'-ATCTATCCCTCCTCCCAAATAATC-3'
扩增产物的大小：377bp，Tm:55，产物中CpGs:6
2)人类OCT4扩增用引物：
正向引物：5'-TTTTTTTAAATTAGAAATTTTAATTATTTG-3'
反向引物：5/-AATTACAAAAACCATACCTACAACC-3'
扩增产物的大小：417bp，Tm:55，产物中CpGs:4
在通过亚硫酸氢钠测序法评价的多能性-特异OCT3/4和NANOG基因的启动子区域胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)甲基化，Physics细胞与ES细胞类似高度脱甲基化，而在原始的HDF细胞中，这一区域的CpG二核苷酸则低度脱甲基化(图18)。这些结果表示OCT3/4和NANOG启动子通过超声波处理被活性化。
<实施例2>Physics细胞的增殖能力和多分化能力
通过增殖标记物蛋白Ki-67免疫染色法和利用烟酸己可碱(Hoechst 33342)和碘化丙啶(PI)的时间差细胞核染色评价Physics细胞的增殖能力。
如图19所示，在第5天时检测出Physics细胞中Ki-67的表达。
为了更明确地证明Physics细胞的增殖能力，通过下述方法证明细胞增殖。利用渗透性好可染色生存细胞的细胞核的Hoechst 33342对培养第5天的Physics细胞进行染色，完全除去染色试剂后，培养3天，将总培养8天的Physics细胞用4％多聚甲醛固定后，再利用PI对细胞核进行染色。不重复的红色信号意味着5天以后因细胞分裂形成新的Physics细胞。另外，培养单一球状体5天，通过影像测定球状体直径，通过球状体直径尺寸的增加证明Physics细胞的增殖能力。
为了评价Physics细胞的自我再生能力，将用Hoechst 33342染色的Physics细胞追加培养5天，用4％多聚甲醛固定后，再利用PI和OCT3/4再次染色。PI信号表示Physics细胞内核。几乎与Hoechst 33342合并的OCT3/4复染的细胞核表示Hoechst 33342在5天前对Physics细胞进行了染色。
如图20所示，追加培养5天期间，多能性(OCT3/4)不传递到子Physics细胞。这些结果表示Physics细胞可以增殖，但是5天以后不进行自我再生。
另外，在Physics细胞的早期培养时期，在各胚叶中发现了特异性标记物基因的表达。表达未分化的和分化的标记物两者的Physics细胞的独特的基因表达模式可以与人类ESC来源的EB进行比较(图21)。这是因为它们的形态非常相似。
免疫细胞化学分析结果发现Physics细胞和EB高表达内胚叶(GATA4和AFP)、外胚叶(PAX6和Nestin)、中胚叶(Brachyury和SMA)的标记物。除了OCT3/4，PAX6的表达也在超声波处理后的第一天即检测到。3胚叶的其他基因的表达则在Physics细胞生成后第3天开始。培养15天期间，3胚叶标记物的表达水平逐渐增加。但是，OCT3/4表达在8天以后减少(图22)。
<实施例3>超声波刺激引起的细胞变化
为了评价Physics细胞形成期间超声波刺激对HDF的效果，比较了不同的超声波条件。超声波处理后和培养超声波处理的HDF2小时后，直接进行SEM分析。
如图23所示，UC和UCUM条件下都形成了几个细胞膜气孔。可能是因为HDF直接暴露在超声波下的原因。然而，UM条件下，HDF没有形成任何通过细胞膜的气孔。这是因为只对培养基进行超声波处理，对细胞膜的损伤不充分的原因。特别是，细胞培养2小时后，生成的气孔在UC和UCUM条件下都消失了。这些结果意味着超声波刺激没有严重到诱导细胞凋亡的程度，但是足以诱导细胞膜的短暂渗透，从而在之后的早期细胞培养期间，受损的细胞膜得到恢复。
损伤的细胞膜的恢复过程也是利用活/死细胞检测试剂盒(live/dead kit)，通过细胞膜没有损伤的细胞(绿色荧光)/死亡或细胞膜受到损伤的细胞(红色荧光)的分析得以验证。对HDF细胞进行超声波处理后立即和经过2小时后进行的荧光试剂染色的结果，2小时后红色荧光的比例减小，SEM分析结果也是一样，2小时后因超声波引起的细胞膜损伤得以恢复(图24)。
另外，为了确定受到超声波刺激的细胞和球状体形成的关系，利用试剂，将超声波处理的HDF添加到活/死细胞检测试剂盒，利用活细胞成像装置对绿色/红色双重染色的HDF进行24小时追踪。
如图25所示，HDF与只有绿色染色的或红色/绿色双重染色的其他HDF凝集形成多细胞球状体。24小时后，大部分的轻微损伤的HDF形成稳定的Physics细胞。
另外，超声波诱导的细胞膜损伤和短暂渗透还分别利用荧光染料Fluo-4染料和CM-H2DCFDA，根据增加的细胞内Ca2+浓度和细胞内H2O2的产生进行表征。一暴露在超声波下，Physics细胞的Ca2+浓度突然增加，随后在150秒减少(图26)。Physics细胞的细胞内H2O2浓度与未处理对照组HDF比较，超声波暴露60分后又提高了6倍(图27和图28)。
附加地，在响应多种细胞性应激的反应中，利用ATP作为信号，分析向细胞外释放的ATP的浓度。
如图29所示，与未处理的HDF相比，超声波刺激Physics细胞中的ATP多释放22倍。已知促离子型P2X受体和代谢性P2Y受体的表达因ATP的释放活性化，因此比较了这两种受体的表达。
检测到Physics细胞中P2X4、P2X7、P2Y1、P2Y2和P2Y11的表达更高(图30)。
附加地，利用Alexa-705标记的量子点(QD705)确定改善的Physics细胞的细胞吸收。在培养皿中添加QD705，24小时后获取共聚焦显微镜图像。球状体类型内的Physics细胞和不与相邻的单一Physics细胞凝集的单一细胞类型都吸收了QD705。然而，正常HDF没有吸收QD705(图31)。这验证了超声波刺激改善了细胞对外部要素的吸收。
另一方面，由Physics细胞培养基制备外泌体RNA，通过RT-PCR分析研究Physics细胞形成期间细胞培养环境的基因表达模式。一般地，外泌体包括几种基因要素，例如，RNA、microRNA、DNA、蛋白质。另外，外泌体中基因要素的表达曲线是细胞状态依赖性的。
如图32所示，在由Physics细胞培养基提纯的外泌体中观察到多能性标记物基因的高表达。最值得注意的基因表达是OCT3/4和NANOG。随着培养时间的增加，OCT3/4表达也显著增加。NANOG表达在4天后下降。c-MYC表达在悬浮培养条件下保持一定，在单层培养条件下在2天后减少。所有的多能性标记物基因，例如，REX1、TDGF1、FOXD3、UTF1和LIN28，虽然表达水平低，但是在悬浮培养条件下被检测到。然而，这些基因没有在单层培养条件下检测到。这些结果意味着超声波处理的HDF中基因要素的传递可能性。
为了验证上述假设，将未经超声波处理的HDF与Physics细胞共同培养。为了进行图像分析，利用阳离子脂质体(Lipofectamine)使HDF染上Cy5.5红色荧光染料。Physics细胞另外生成，保持2天后，将Physics细胞添加到Cy5.5着色的HDF培养皿中。共同培养期间，不对培养皿进行超声波处理。这是因为UM条件也会诱导多能性标记物基因表达。
在共聚焦显微镜图像中，观察到在与Physics细胞共同培养期间，Cy5.5着色的HDF中有OCT3/4表达。在Cy5.5着色的HDF单独培养中没有检测到OCT3/4表达。这些结果强有力地说明Physics细胞的多能性向相邻的正常细胞传递，之后重编程为正常细胞的Physics细胞。一般来讲，外泌体参与细胞中的基因要素传递(图33)。
<实施例4>Physics细胞的体外分化
为了体外分化，将培养5天的Physics细胞转移到有凝胶涂层的组织培养皿中。利用特异性分化培养基诱导转移的细胞分化为神经或心脏系统。上述特异性分化培养基如表3所示。在诱导分化后8天的细胞中发现3胚叶主要蛋白质(GATA4、AFP、PAX6、Nestin、Brachyury、SMA)的表达(图34)。
【表3】
Figure GDA0001369763080000221
【表4】
Figure GDA0001369763080000222
Figure GDA0001369763080000231
如图35和图36所示，在1-2周的分化时期内，通过RT-PCR观察SRY-box的表达，SRY-box包括基因17(SOX17，内胚叶)、成对盒6(PAX6，外胚叶)、Nestin(神经细胞标记物)、微管相关蛋白2(MAP2，外胚叶)、III型β微管蛋白(TuJ1，神经细胞标记物)、MSH同源蛋白1(MSX1，中胚叶)、Brachyury(中胚叶)、肌球蛋白轻链7(MYL7，心肌细胞)、NK2同源蛋白5(NKX2.5，心肌细胞)、和肌钙蛋白T2(TnnT2，心肌细胞)。
特别是，OCT3/4的表达在分化诱导后有益地减少。
还是通过免疫细胞化学法确定向神经或心脏细胞的分化。
如图37至图39所示，在生长细胞培养基中生长的Physics细胞中观察到神经前体细胞标记物(PAX6和Nestin)。将生长细胞培养基转换为少突胶质细胞培养基或神经细胞培养基后，诱导这些分化的Physics细胞再次分化2周的时间。分别观察到少突胶质细胞标记物(MAP2和O4)或神经细胞标记物(MAP2和Tuj1)的表达。2周的分化时间对检测包括MHC、SMA、Actinin、NKX2.5和TnTc在内的心脏标记物是充分的。特别是，在辅肌动蛋白中检测出典型的分节的肌动蛋白模式。然而，在相同的培养条件下，HDF没有表达任何神经或心脏标记物。
<实施例5>稳定性测试
超声波没有诱导突变、基因改变、癌产生等不希望的副作用。Physics细胞具有正常核型(图40)。
<实施例6>Physics细胞的体内分化能评价
为了评价Physics细胞的体内分化能力，将培养5天的Physics细胞1×106个注入4-5周的免疫缺陷小鼠(NOD/SCID mouse)的睾丸和大腿肌肉中，饲养4周后，回收睾丸和肌肉，用4％多聚甲醛固定后，冷冻切片(cryosection)，通过人核抗原染色判断注入的细胞的位置，染色多种与增殖和分化相关的蛋白质标记物(Ki67、CD44、SMA)，确定注入的细胞是否分化。
图41中，注入睾丸的Physics细胞在4周后在睾丸内的血管内皮细胞中被观察到，从而通过Ki67染色确定有增殖发生，如图所示，用箭头标示的细胞中观察到血管内皮细胞标记物CD44被染色。
向小鼠大腿注入的细胞在肌肉纤维层外部，即薄片层中被发现，从而确定肌肉蛋白质标记物SMA被染色(图42)。与此相同的结果意味着注入体内的Physics细胞适应周边细胞和环境进行分化。
<实施例7>细胞培养基的效果
利用人类ES细胞培养基形成Physics细胞。ES细胞培养基作为确定成分培养基开发，用于在未分化状态下保持和繁殖ES细胞。为了研究细胞培养基的效果，利用正常HDF培养基形成Physics细胞。
如图43a和43b所示，与ES细胞培养基比较，形态和球状体形成效率有一定差异。在超声波处理的HDF培养基中接种后，第一天少量形成多细胞球状体。然而，2天后，大多数的球状体附着到培养皿表面。培养第4天时，所有球状体附着到培养基表面，生长成典型的成纤维细胞形态。免疫细胞化学结果还显示两种不同的培养基条件之间表现出不同的基因表达模式。利用ES细胞培养基生成的典型的Physics细胞中OCT3/4、SOX2、NANOG、SSEA-4和TRA-1-60的表达水平高。DMEM培养基没有表现出任何用于诱导未分化标记物基因和3胚叶标记物基因表达的效果。这些结果意味着球状体形成和特异性标记物基因的表达与细胞培养基的成分密切相关。
<实施例8>细胞系的效果
为了评价Physics细胞形成方法是否适用于其他细胞系和是否适用于以后的临床应用，利用HeLa细胞、L132人类肺上皮细胞和来源于患者的皮肤成纤维细胞等其他细胞系研究Physics细胞的形成。
如图44a-44c所示，使2种细胞系直接暴露在超声波下之后，在细菌用皮氏培养皿中在超声波处理的ES细胞培养基中培养，形成多细胞球状体。有趣的是，与HDF生成的Physics细胞比较，这2种细胞系生成的新Physics细胞的形态和尺寸分布有一定差异。HeLa细胞来源的Physics细胞的尺寸分布相当没有一贯性，尺寸太大。L132细胞来源的Physics细胞表现出更复杂的凝集的形态。各球状体追加融合形成板状结构。
如图44b和44c所示，通过免疫细胞化学法确定由2种其他的Physics细胞表达的OCT3/4、SOX2、NANOG、SSEA4和TRA-1-60等多能性标记物和GATA4、AFP、PAX6、Nestin、Brachyury和SMA等3胚叶标记物基因。
另外，在利用患者皮肤细胞的实验结果中也形成与Physics细胞相似的球状体，通过免疫细胞化学法确定多能性标记物和3胚叶标记物的表达(图45)。
这些结果强有力地证明了诱导Physics细胞形成的超声波刺激可以适用于多种细胞系，从而显示出利用患者细胞的细胞自我治疗的可能性。
<实施例9>其他能量源的效果
向HDF和ES细胞培养基施加附加外部刺激，确定并评价Physics细胞的形成机制。用激光处理代替超声波处理并确定Physics细胞有没有形成。为此，同样使用在超声波处理时使用过的人类皮肤成纤维细胞，激光处理条件是使用Ocla治疗用激光(Ndlux)，照射808nm的激光5秒后进行培养。
为了进行热处理，使皮肤成纤维细胞暴露在42℃下2分钟后，在冰上静置约5秒钟。
如图46和47所示，对HDF和ES细胞培养基两者进行激光或热处理后，成功地形成了多细胞球状体。激光处理的HDF也是在激光诱导后立即形成多细胞球状体。虽然球状体的形状不规则，尺寸分布不均匀，但是也观察到多能性标记物和3胚叶标记物高水平表达。热处理同样诱导球状体形成。然而，效率比超声波和激光处理低。保持8天期间利用热诱导的多细胞球状体的一半以上附着到培养皿表面。尽管球状体形成效率更低，但是观察到多能性标记物和3胚叶标记物的表达水平高。这些结果强有力地证明了Physics细胞的形成与物理刺激密切相关。
<实施例10>制备小鼠Physics细胞
根据图48所示的过程制备小鼠Physics细胞。为此，在用20KHz超声波以5W/cm2的强度处理10分钟的ES培养基中混合OG2小鼠MEF(Mouse Embryonic Fibroblast cell：小鼠胚胎成纤维细胞)，对上述细胞直接照射超声波，以1W/cm2的强度处理5秒钟进行培养。利用荧光显微镜，以1、3、5、8和10天的间隔观察培养的细胞的细胞形态变化和GFP荧光的表达。用于超声波处理的培养基成分如表1所示。
上述MEF细胞是使插入OCT4启动子的GFP基因转化的小鼠的13.5日大的胚胎成纤维细胞，一般是OCT4没有表达的细胞，如果OCT4表达则GFP表达，呈现出绿色荧光。
图49A中，对照组的OG2MEF细胞图像中没有呈现绿色荧光(OCT4没有表达)。然而，进行超声波处理的OG2MEF的情况，随着培养时间的增加细胞球状体的尺寸增加，可以知道绿色荧光的强度增强。这表示超声波处理诱导了OCT4表达，OCT4是未分化干细胞的主要特征，因此可以知道超声波处理引起了OG2MEF细胞逆分化为干细胞。
图49B是瓦片扫描图像，是拍摄广范围的多张图像后合成的图像，示出了超声波处理效果，多数的MEF细胞因超声波处理引起的逆分化表达OCT4-GFP，图50中示出了生成的球状体的GFP表达效率分析结果，显示出约93％左右的OCT4-GFP表达效率，利用流式细胞仪确定整体细胞中GFP表达的结果，在约85.3％的细胞中GFP有表达，分析细胞表面未分化蛋白质标记物SSEA1表达的结果也是有约75.5％的表达(图51)。这些结果意味着超声波引起的逆分化效率非常高。
之后，利用下述表5中示出的引物组，通过RT-PCR和细胞免疫化学法确定代表性的小鼠胚胎干细胞(ESc)的未分化标记物基因和蛋白质标记物(OCT4、SOX2、NANOG、SSEA1)的表达。
如图52和53所示，确定了小鼠Physics细胞中有未分化标记物表达。
另外，还通过碱性磷酸酶染色进行确定(图54)
【表5】用于确定小鼠ES未分化标记物表达的RT-PCR用引物
Figure GDA0001369763080000281
【表6】用于确定小鼠分化标记物表达的RT-PCR用引物
Figure GDA0001369763080000291
确认3胚叶标记物的结果，mPhysics使内胚叶(GATA6)、外胚叶(Nestin)、中胚叶(Brachyury)的标记物高表达。3胚叶的其他基因的表达在形成Physics细胞后第3天开始。培养20天期间，3胚叶标记物的表达水平逐渐增加(图55)。并且，在图56中，通过免疫染色确定了3胚叶蛋白质标记物的表达。
在小鼠细胞中，因超声波形成的mPhysics细胞也具有正常的核型(图57)。
产业应用可能性
本发明的多能细胞可以用于细胞治疗剂领域。
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Claims (5)

1.一种将已分化细胞逆分化为多能细胞的方法，包括：
在将所述已分化细胞与培养基混合之前，向培养基提供能量以提高所述已分化细胞的球状体形成效率，包括：用输出强度为3W/cm2至7W/cm2的超声波处理所述培养基7至13分钟、用300nm至900nm波段的脉冲激光光束照射所述培养基1秒至20秒、或在40℃至50℃的温度条件下热处理所述培养基5分钟至20分钟；
将所述已分化细胞与所述培养基混合；和
向所述培养基与所述已分化细胞的混合物提供能量、并将该混合物培养预定时间来形成球状体，
其中，所述球状体具有多能性特征；
其中向所述混合物提供的所述能量包括选自超声波、激光和热处理中的一种，
其中对所述培养基和已分化细胞的混合物的超声波处理是以0.5W/cm2至3W/cm2的输出强度进行1至5秒，
其中，对所述培养基和已分化细胞的混合物的激光处理通过用300nm至900nm波段的脉冲激光光束照射混合物1秒至10秒来进行，
并且其中对所述培养基和已分化细胞的混合物的热处理通过将所述混合物暴露在40℃至50℃的温度条件下1分钟至10分钟的热量后，在0℃至4℃的温度条件下暴露5至10秒来进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述球状体表达选自OCT3/4、SOX2、NANOG、c-MYC、KLF4、TDGF1、SSEA4、TRA-1-60、PAX6、Nestin、Brachyury、SMA、GATA4和AFP中的任意一种未分化标记物基因或3胚叶标记物基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述已分化细胞包括选自哺乳动物来源的成纤维细胞、癌细胞或器官内组织细胞中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包括选自胚胎干细胞培养基和干细胞分化诱导培养基中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用悬浮培养或单层培养方式将被提供能量的所述混合物培养3～10天。
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