JP7252076B2 - エネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法 - Google Patents
エネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7252076B2 JP7252076B2 JP2019119847A JP2019119847A JP7252076B2 JP 7252076 B2 JP7252076 B2 JP 7252076B2 JP 2019119847 A JP2019119847 A JP 2019119847A JP 2019119847 A JP2019119847 A JP 2019119847A JP 7252076 B2 JP7252076 B2 JP 7252076B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- physics
- cell
- culture
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M31/00—Means for providing, directing, scattering or concentrating light
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
- C12M41/14—Incubators; Climatic chambers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/30—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cancer cells, e.g. reversion of tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2521/00—Culture process characterised by the use of hydrostatic pressure, flow or shear forces
- C12N2521/10—Sound, e.g. ultrasounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
- C12N2529/10—Stimulation by light
Description
本発明は、また、細胞及び培養培地を収容できる培養チャンバーと、前記培養チャンバーの一側に配置され、前記細胞及び培養培地にエネルギーを提供できる装置と、を含み、分化した細胞と培養培地を混合し、前記混合物にエネルギーを提供し、一定時間培養を通じてスフェロイド(spheroid)を形成し、前記スフェロイドは、多能性(pluripotency)特性を有するものである、多能性細胞誘導装置を提供する。
本発明は、培養培地と分化した細胞を混合し、前記混合物にエネルギーを提供し、一定時間培養を通じてスフェロイド(spheroid)を形成することを含み、前記スフェロイドは、多能性(pluripotency)特性を有するものである、分化した細胞から多能性細胞への逆分化方法に関する。
本発明は、分化した細胞への逆分化誘導因子、化学物質などの逆分化誘導物質の導入なしに、適切なエネルギー提供を通じて分化した細胞から多能性(pluripotency)特性を有し、且つ、公知の誘導万能幹細胞に比べて分化属性が強い新しいタイプの多能性細胞を誘導できることを特徴とする。
前記エネルギーは、超音波、レーザー又は熱処理のうちいずれか一つであることができる。
本明細書で、用語「多能性細胞」は、エネルギー、厳格な意味として、超音波、レーザー又は熱処理後、多能性を獲得した細胞を言う。本明細書において前記多能性は、胚芽幹細胞で発現される未分化マーカーを安定的に発現する状態を意味する。また、三つの種類の内胚葉、外胚葉及び中胚葉の3胚葉マーカーを発現する状態を意味する。前記多能性細胞は、「Physics(pluripotent sphere yielded by ultrasonicstimulus)細胞」、又は「Physicsスフェロイド」と混用されて使用され得る。本発明の分化した細胞から多能性細胞への逆分化方法を図1を参照して具体的に説明すれば、次の通りある。
分化した細胞の混合物にエネルギーを提供する前に、細胞培養培地にエネルギーを提供し、多能性細胞への逆分化効率を高めることができる。
前記エネルギーは、超音波、レーザー又は熱処理のうちいずれか一つであることができる。
培養培地に対するレーザー処理は、300~900nm波長帯域のパルス型レーザービームを1秒~20秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを3秒~10秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを4秒~6秒間照射することができる。前記波長帯域は、例えば400nm、808nm、880nmの波長を使用できる。
培養培地に対する熱処理は、40~50℃の温度条件で5分~20分間行うことができる。
前記分化した細胞として、哺乳類由来の線維芽細胞;子宮警部癌細胞(HeLa cell)を含む癌細胞;又は肺上皮細胞(L132 cell)を含む器官内組織細胞などを使用できる。
分化した細胞にエネルギーを提供する場合、所定の強さで露出させることが好ましく、この範囲を脱する場合、細胞生存率が減少できる。
培養培地と分化した細胞の混合物に対するレーザー処理は、300~900nm波長帯域のパルス型レーザービームを1秒~20秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを3秒~10秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを4秒~6秒間照射するものであることができる。前記波長帯域は、例えば400nm、808nm、880nmの波長を使用できる。
培養培地と分化した細胞の混合物に対する熱処理は、40~50℃の温度条件で1分~10分間露出した後、0℃~4℃の温度条件で5~10秒間露出して行うことができる。
エネルギーが提供された混合物の培養は、浮遊培養(suspended culture)又は単層培養(monolayer culture)方式を通じて未分化マーカーを安定的に発現するスフェロイドが形成される期間、すなわち3日~10日間行うことができる。但し、前記培養時間は、培養方式、細胞又は培養培地の種類によって多能性を有するスフェロイド形成可否が異なるため、当業者の水準で適宜調節され得る。
また、本発明の多能性細胞は、増殖マーカータンパク質であるKi-67を発現し、増殖能を有する特徴がある。
また、前記の逆分化した多能性細胞を栄養細胞と共培養する場合、多能性細胞の増殖が増加し、分化誘導培地で培養後、外胚葉/内胚葉/中胚葉及び神経細胞/心筋細胞に分化することを確認できる。
前記培養チャンバーは、通常、細胞培養に使用される培養器を意味する。例えば、培養チャンバーは、温度制御部と二酸化炭素制御部が具備されていて、培養チャンバー内の細胞培養条件は、目的と細胞の種類によって当業者の水準で適宜調節され得る。
また、前記培養チャンバーは、分化した細胞から多能性細胞に逆分化させるに際して、浮遊培養又は単層培養方式を使用でき、このような培養が可能な構造よりなることが好ましい。例えば、浮遊培養のための撹拌器が具備された培養チャンバーであることができる。
前記超音波発生装置は、周波数が10kHz~100MHzである超音波を発生する公知の超音波装置であれば、制限なしに使用できる。
前記レーザー発生装置は、300~900nm波長帯域のパルス型レーザービームを発生し、1~15W出力で、パルス持続時間が1ms~900msであり、周波数が1~100Hzであるレーザー装置を使用できるが、特にこれに制限されるものではない。
温度調節装置は、-40℃~99.9℃範囲の温度調節が可能な公知の温度調節装置を使用できるが、特にこれに制限されるものではない。
図1は、本発明のPhysics(pluripotent sphere yielded by ultrasonicstimulus)細胞形成を示す模式図であり、5W/cm2の強度で10分間超音波処理したES(embryonic stem)培地にヒト皮膚線維芽細胞(HDFa、Cat.No.C-013-5C、GIBCO(Invitrogen cell culture))(1×106)を混ぜ、細胞を含む混合物に超音波を5秒間1W/cm2の強度で処理した。生きている細胞を選別した後、35mm細菌用ペトリディッシュで2×105のHDFをヒトES培養培地で6日間浮遊培養した。
培養1日目からスフェロイド(spheroid)が形成され、3日後から未分化マーカーが発現される。
ヒト皮膚線維芽細胞は、超音波処理時、スフェロイドを形成するので、スフェロイド形成効率を高めるための最適条件を確立するために、超音波処理条件、細胞培養方式などを異ならしめて、実験を行った。
細胞培養方式は、細胞培養ディッシュの表面がコーティングされていないディッシュ(細菌用ペトリディッシュ)で培養する浮遊培養(Suspended culture)と、細胞培養ディッシュの表面がコーティングされ、細胞が表面によく付くディッシュ(組織培養ディッシュ)で培養する単層培養(Monolayer culture)を使用した。
図2aの(b)は、図2aの(a)で超音波強度別に生成された多細胞スフェロイドの数を示すものである。
1W/cm2の超音波強度で生きている/死んだ細胞分析及びイメージ分析結果、図2bの(c)及び(d)に示されたように、25%の細胞が部分的に損傷を受け、95%以上の細胞生存能が維持された。しかし、1W/cm2より高い超音波強度で、HDFは、深刻に損傷を受け、細胞死滅に至った。
したがって、1W/cm2の固定された超音波強度条件で、露出時間(0、1、2、5、10、20、40秒)を異ならしめて、35mm細菌用ペトリディッシュでヒトES細胞培養培地で3日間培養した。
次に、ES細胞培養培地に超音波露出強度(0、1、5、10W/cm2)を異ならしめて、10分間処理した。35mm細菌用ペトリディッシュで超音波露出した2×105HDF(1W/cm2、5秒)をこれら培地で3日間培養した。
露出時間(0、5、10、20分)の変化は、スフェロイド形成効率に対して有意的な効果を示さなかった。一般的に、短い露出時間が一定のサイズ範囲とさらに多い数を引き起こした(図5)。
浮遊培養又は単層培養の下で超音波刺激別に生成された多細胞性スフェロイドのサイズ分布を観察するために、超音波処理されたHDF又は非処理HDFを細菌用ペトリディッシュ又は組織培養ディッシュで超音波処理又は非処理されたES培養培地で培養した。
また、浮遊培養条件は、さらに高い効率を示し、スフェロイドは、数とサイズ面において大きくて(200μm以上の直径)、単層培養(monolayer culture)条件より一定のサイズ分布を示す。
RT-PCRを通じて分析した結果、図9でHDF及び培養培地の両方が超音波処理されるとき(UCUM)、未分化マーカー遺伝子の発現が安定的に発現され、特に浮遊培養した場合が単層培養細胞に比べてさらに高く現われた。
OCT3/4、SOX2、NANOG、SSEA-4及びTRA-1-60の発現は、H9ヒトES細胞と類似していた(図15)。また、多細胞スフェロイドの多能性特性は、フローサイトメトリーを通じて確認した(図16)。SSEA4及びTRA-60の99.5%以上がスフェロイドで発現され、各発現水準は、H9ヒトES細胞と類似していた。
1)ヒトNANOG増幅用プライマー:
正方向プライマー:5’-TAGGAGTAGAGTGTAGAGGAGAATGAGTTA-3’
逆方向プライマー:5’-ATCTATCCCTCCTCCCAAATAATC-3’
増幅産物のサイズ:377bp、Tm:55、産物でCpGs:6
2)ヒトOCT4増幅用プライマー:
正方向プライマー:5’-TTTTTTTAAATTAGAAATTTTAATTATTTG-3’
逆方向プライマー:5/-AATTACAAAAACCATACCTACAACC-3’
増幅産物のサイズ:417bp、Tm:55、産物でCpGs:4
Physics細胞の増殖能は、増殖マーカータンパク質であるKi-67免疫染色方法及びヘキスト(Hoechst33342)とプロピジウムアイオダイド (PI)を利用した時間差細胞核染色を通じて評価した。
これより、さらに確かな証明のために、次のような方法を通じて細胞増殖を確認した。侵透性が良くて、生きている細胞の核に染色が可能なHoechst33342を利用して5日目に培養されたPhysics細胞を染色し、染色試薬を完全に除去後、3日間培養してから、総8日間培養されたPhysics細胞を4%paraformaldehydeで固定した後、さらにPIで細胞核を染色した。重複されない赤色信号は、5日後、細胞分裂により新しく形成されたPhysics細胞を意味する。また、動画を通じて単一スフェロイドを5日間培養し、スフェロイド直径を測定した結果、サイズの増加を通じてPhysics細胞の増殖能を立証する。
また、Physics細胞の初期培養時期の間に、各胚葉で特異マーカー遺伝子の発現を発見した。未分化した及び分化したマーカーの両方を発現するPhysics細胞の独特な遺伝子発現パターンは、ヒトESCに由来するEBと比較できる(図21)。なぜならば、それらの形態が非常に類似しているからである。
Physics細胞発生中に、HDFへの超音波刺激の効果を評価するために、超音波条件別に比較した。超音波処理後及び超音波処理されたHDFの2時間培養後、直接的にSEM分析を行った。
図23に示されたように、複数の細胞膜の気孔がUC及びUCUM条件の両方で発生した。たぶんHDFが超音波に直接的に露出したからであると認められる。しかし、UM条件でHDFは、細胞膜を通過するどんな気孔発生も示さなかった。これは、培養培地にのみ超音波を処理することは、細胞膜の損傷に十分でないからである。特に、細胞培養の2時間後に生成された気孔は、UC及びUCUM条件の両方で消えた。これらの結果は、超音波刺激は、細胞死滅を誘導するほどに深刻なことでないが、細胞膜の一時的な透過を誘導するには十分であり、その後、初期細胞培養時期の間に、損傷された細胞膜が回復されることを示唆する。
また、試薬を超音波刺激を受けた細胞とスフェロイド形成の連関性を確認するために、超音波処理されたHDFにlive/deadキットを付加し、緑色/赤色の二重染色されたHDFは、生きている細胞イメージング装置を利用して24時間追跡した。
また、超音波誘導された細胞膜の損傷及び一時的な透過は、それぞれ、蛍光染料Fluo-4染料及びCM-H2DCFDAを使用して増加した細胞内Ca2+濃度及び細胞内H2O2生産によって特徴を示した。超音波を露出し次第に、Physics細胞のCa2+濃度が急に増加してから、150秒に減少した(図26)。Physics細胞で細胞内H2O2の濃度は、未処理対照群HDFと比べて、超音波露出60分後、6倍さらに高かった(図27及び図28)。
さらに、ATPが多様な細胞性ストレスに対する反応において信号として利用されるため、細胞外に放出されたATPの濃度を分析した。
イオノトロピック型P2X受容体及び代謝型P2Y受容体は、ATP放出によって発現が活性化されものと知られていて、これら受容体の発現を比較した。
Physics細胞の向上した細胞吸収は、さらに、Alexa-705標識された量子点(QD705)を利用して確認した。QD705を培養ディッシュに付加し、24時間後、共焦点顕微鏡イメージを得た。
共焦点顕微鏡イメージは、Physics細胞との共培養中に、Cy5.5感染されたHDFからOCT3/4発現が観察された。OCT3/4発現は、Cy5.5感染されたHDF単独培養では、検出されなかった。これらの結果は、Physics細胞の多能性特性が隣合う正常細胞に伝達され、その後、正常細胞のPhysics細胞へのリプログラミングを強く立証する。一般的に、細胞において遺伝子要素伝達にエキソソームが参加する(図33)。
インビトロ分化のために、5日培養されたPhysics細胞をゼラチンがコーティングされた組織培養ディッシュに移した。移した細胞は、特異分化培地を利用して神経又は心臓系への分化を誘導した。前記特異分化培地は、表3の通りである。分化誘導後、8日になった細胞で3胚葉の主要タンパク質(GATA4、AFP、PAX6、Nestin、Brachyury、SMA)が発現された(図34)。
特に、OCT3/4の発現が分化誘導後に有意に減少した。
神経又は心臓細胞への分化は、また、免疫細胞化学によって確認された。
超音波は、突然変異、遺伝子変形、癌発生などの好ましくない副作用を誘導しなかった。Physics細胞は、正常核型を持っていた(図40)。
Physics細胞のインビボ分化能力を評価するために、5日培養されたPhysics細胞を4~5週齢の欠乏マウス(NOD/SCID mouse)の精巣と股筋肉に1×106細胞を注入し、4週間飼育後、精巣と筋肉を回収し、4%パラホルムアルデヒドで固定した後、冷凍切片(cryosection)し、Human Nuclear antigen染色を通じて注入した細胞の位置を把握し、多様な増殖及び分化関連タンパク質マーカー(Ki67、CD44、SMA)を染色し、注入された細胞の分化有無を確認した。
マウス股に注入された細胞は、筋肉繊維層の外部であるラミナ層で発見され、筋肉タンパク質マーカーであるSMA染色が施されたことを確認した(図42)。このような結果は、体内に注入されたPhysics細胞が周辺細胞と環境に合わせて分化したことを示唆するものである。
Physics細胞を発生させるために、ヒトES細胞培養培地を使用した。ES細胞培養培地は、未分化状態でES細胞を維持及び繁殖するための制限培地として開発された。細胞培養培地の効果を調査するために、Physics細胞を発生させるために、正常HDF培養培地を使用した。
Physics細胞発生方法が他の細胞株に適用できるか、今後の臨床適用に適用できるかを評価するために、HeLa細胞、L132ヒト肺上皮細胞及び患者由来皮膚線維芽細胞のような他の細胞株を利用してPhysics細胞発生を照射した。
また、患者皮膚細胞を利用した実験結果でも、Physics細胞のようなスフェロイドを形成し、多能性マーカー及び3胚葉マーカーの発現が免疫細胞化学によって確認された(図45)。
これらの結果は、Physics細胞発生を誘導する超音波刺激が多様な細胞株に適用され得ることを強く立証し、患者細胞を利用した自己細胞治療の可能性を示す。
追加的な外部刺激をHDF及びES細胞培養培地に加えて、Physics細胞の発生機作を確認及び評価した。
超音波処理の代わりに、レーザー処理を用いてPhysics細胞が形成されるかを確認した。このために、超音波処理に使用されたヒト皮膚線維芽細胞を同一に使用し、レーザー処理条件は、Ocla治療用レーザー(Ndlux)を使用して、808nmのレーザーを5秒間照射した後、培養した。
熱処理のために、皮膚線維芽細胞を42℃に2分間露出させた後、アイスで約5秒間静置した。
図48に示された過程によってマウスPhysics細胞を製造した。このために、20KHz超音波を5W/cm2の強度で10分間処理したES培地にOG2マウスMEF(Mouse Embryonic Fibroblast cell;マウス胚芽線維芽細胞)を混ぜ、該細胞に直接的に超音波を5秒間1W/cm2の強度で処理し、培養した。培養された細胞は、1、3、5、8及び10日間隔で蛍光顕微鏡で細胞の形態変化とGFP蛍光の発現を観察した。超音波処理のための培地組成は、表1の通りである。
前記MEF細胞は、OCT4プロモーターが挿入されたGFP遺伝子を形質転換させたマウスの13.5日になった胚芽の線維芽細胞であって、一般的に、OCT4が発現されない細胞であるが、もしOCT4が発現されると、GFPが発現され、緑色蛍光が認められる。
図49のBは、Tile scan写真であって、広い範囲を複数枚の写真を撮って結合した写真を示す図であって、超音波処理効果を示す結果であり、多数のMEF細胞が超音波処理による逆分化でOCT4-GFPを発現し、図50で生成されたスフェロイドのGFP発現効率を分析した結果、約93%程度のOCT4-GFP発現効率が現われ、フローサイトメトリーを利用して全体細胞においてのGFP発現を確認した結果、約85.3%の細胞でGFPが発現され、細胞表面において未分化タンパク質マーカーであるSSEA1の発現を分析した結果でも、約75.5%の発現が現われた(図51)。このような結果は、超音波による逆分化効率が非常に高いことを示唆する。
また、アルカラインフォスファターゼ染色を通じて確認した(図54)。
Claims (4)
- 胚芽幹(ES)細胞培養培地に超音波処理を施した後、当該超音波処理を施したES細胞培養培地と線維芽細胞を混合し、当該超音波処理を施したES細胞培養培地と線維芽細胞の混合物に対して、出力強度0.5W/cm2~3W/cm2で1~5秒間の更なる超音波処理を施し、更にES細胞培養培地を用いてスフェロイド(spheroid)形成浮遊培養を行う工程を含み、
前記スフェロイドは、多能性(pluripotency)特性を有するものである、線維芽細胞から多能性細胞への逆分化方法。 - スフェロイドは、OCT3/4、SOX2、NANOG、c-MYC、KLF4、TDGF1、SSEA4、TRA-1-60、PAX6、Nestin、Brachyury、SMA、GATA4又はAFPのうちいずれか一つの未分化マーカー又は3胚葉マーカー遺伝子を発現するものである、請求項1に記載の線維芽細胞から多能性細胞への逆分化方法。
- 線維芽細胞は、哺乳類由来の線維芽細胞である、請求項1に記載の線維芽細胞から多能性細胞への逆分化方法。
- 超音波処理を施した培養培地と線維芽細胞の混合物は、浮遊培養方式を通じて3日~10日間培養する、請求項1に記載の線維芽細胞から多能性細胞への逆分化方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20140173007 | 2014-12-04 | ||
KR10-2014-0173007 | 2014-12-04 | ||
KR10-2015-0172501 | 2015-12-04 | ||
KR1020150172501A KR101798726B1 (ko) | 2014-12-04 | 2015-12-04 | 에너지를 이용한 다능성 세포 유도 장치 및 방법 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017549154A Division JP6986968B2 (ja) | 2014-12-04 | 2015-12-04 | エネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019154452A JP2019154452A (ja) | 2019-09-19 |
JP7252076B2 true JP7252076B2 (ja) | 2023-04-04 |
Family
ID=56191924
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017549154A Active JP6986968B2 (ja) | 2014-12-04 | 2015-12-04 | エネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法 |
JP2019119847A Active JP7252076B2 (ja) | 2014-12-04 | 2019-06-27 | エネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017549154A Active JP6986968B2 (ja) | 2014-12-04 | 2015-12-04 | エネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11773387B2 (ja) |
EP (1) | EP3241896B1 (ja) |
JP (2) | JP6986968B2 (ja) |
KR (1) | KR101798726B1 (ja) |
CN (1) | CN107438668B (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3241896B1 (en) * | 2014-12-04 | 2019-11-06 | STEMON Inc. | Device and method for inducing pluripotent cells using energy |
KR101855967B1 (ko) | 2016-03-11 | 2018-05-10 | 가톨릭관동대학교산학협력단 | 물리적 자극에 의한 환경유입을 이용한 세포 리프로그래밍 방법 |
US20180127738A1 (en) * | 2016-11-07 | 2018-05-10 | BiomediStem, LLC | Production and therapeutic uses of epinul pluripotent cells and differentiated cells derived therefrom |
KR101978270B1 (ko) | 2017-12-27 | 2019-05-14 | 연세대학교 산학협력단 | 3차원 세포 배양에서의 물질 전달 장치 및 방법 |
KR102416171B1 (ko) * | 2018-10-02 | 2022-07-06 | 주식회사 스템온 | 세포의 리프로그래밍을 유도하는 리프로좀 및 그 제조 방법 |
KR20210091226A (ko) * | 2018-11-08 | 2021-07-21 | 이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디. | 부착 비의존성 세포 및 그 용도 |
CN114264639B (zh) * | 2021-12-23 | 2023-07-04 | 深圳大学 | 一种用于细胞微损诱导的可视化装置及荧光监测方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013134931A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | Reprogramming cells by three-dimensional cultivation |
WO2013163296A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-10-31 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Generating pluripotent cells de novo |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9913979D0 (en) | 1999-06-17 | 1999-08-18 | Univ Wales Medicine | Spheroid preparation |
US20070065420A1 (en) * | 2005-08-23 | 2007-03-22 | Johnson Lanny L | Ultrasound Therapy Resulting in Bone Marrow Rejuvenation |
CA2735415A1 (en) * | 2008-08-26 | 2010-03-04 | Intelligentnano Inc. | Ultrasound enhanced growth of microorganisms |
WO2013180395A1 (ko) | 2012-05-29 | 2013-12-05 | 한국생명공학연구원 | 다능성 줄기세포의 제작, 유지, 증식을 증진하는 대사산물 및 이를 포함하는 조성물과 배양방법 |
EP3241896B1 (en) * | 2014-12-04 | 2019-11-06 | STEMON Inc. | Device and method for inducing pluripotent cells using energy |
-
2015
- 2015-12-04 EP EP15866086.0A patent/EP3241896B1/en active Active
- 2015-12-04 JP JP2017549154A patent/JP6986968B2/ja active Active
- 2015-12-04 CN CN201580075450.XA patent/CN107438668B/zh active Active
- 2015-12-04 KR KR1020150172501A patent/KR101798726B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-04 US US15/532,032 patent/US11773387B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-27 JP JP2019119847A patent/JP7252076B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013134931A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | Reprogramming cells by three-dimensional cultivation |
WO2013163296A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-10-31 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Generating pluripotent cells de novo |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Cancer Res.,1981,Vol.41,No.12,p.5188-5192 |
IEEE Int.Ultrasonics Symp.Proc.,2010,p.1763-1766 |
J.Biol.Chem.,2004,Vol.279,No.52,p.54463-54469 |
Photochem.Photobiol.,1994,Vol.59,No.2,p.167-170 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2019154452A (ja) | 2019-09-19 |
JP2017536853A (ja) | 2017-12-14 |
EP3241896A4 (en) | 2018-05-16 |
KR20160067805A (ko) | 2016-06-14 |
US20170327814A1 (en) | 2017-11-16 |
EP3241896A1 (en) | 2017-11-08 |
KR101798726B1 (ko) | 2017-11-16 |
JP6986968B2 (ja) | 2021-12-22 |
CN107438668B (zh) | 2021-07-27 |
US11773387B2 (en) | 2023-10-03 |
EP3241896B1 (en) | 2019-11-06 |
CN107438668A (zh) | 2017-12-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7252076B2 (ja) | エネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法 | |
US20240101998A1 (en) | Cell reprogramming method using imposition of physical stimulation-mediated environmental transition | |
Patel et al. | Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells | |
Kingham et al. | Embryonic and induced pluripotent stem cells: understanding, creating, and exploiting the nano-niche for regenerative medicine | |
Okamoto et al. | Induction of retinal pigment epithelial cells from monkey iPS cells | |
Wang et al. | Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions | |
Ono et al. | Regenerating salivary glands in the microenvironment of induced pluripotent stem cells | |
KR102050852B1 (ko) | 세포 리프로그래밍 장치 | |
US10080771B2 (en) | Compositions and methods for generation of human epithelial stem cells | |
Lee et al. | Footprint-and xeno-free human iPSCs derived from urine cells using extracellular matrix-based culture conditions | |
WO2016089178A1 (ko) | 에너지를 이용한 다능성 세포 유도 장치 및 방법 | |
US10662409B2 (en) | Methods of generating neural stem cells | |
JP6870783B2 (ja) | 細胞培養基材 | |
Kang et al. | Adipose stromal cells are a more efficient source than adipose stem cells in retrovirus-mediated iPS induction | |
Xu et al. | Road to future: iPSC clinical application in Parkinson’s disease treatment | |
Sanong Suksaweang et al. | Induction of mESCs into Hepatic Stem Cells by using Embryonic Chicken Hearts | |
Parameswaran et al. | Noncell autonomous reprogramming to a pluripotent state | |
이정아 | Generation and characterization of disease-specific induced pluripotent stem cells | |
Nori et al. | Neuron Regeneration Using iPS Cells | |
Go et al. | Comparative Analysis for In Vitro Differentiation Potential of Induced Pluripotent Stem Cells, Embryonic Stem Cells, and Multipotent Spermatogonial Stem Cells into Germ-lineage Cells | |
Heine et al. | Reprogramming: a new era in regenerative medicine | |
Kanemura et al. | Tumorigenicity Studies of Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Retinal | |
Parameswaran et al. | Nucleic Acid and Non-Nucleic Acid-Based Reprogramming of |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190716 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200720 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200924 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210113 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210301 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210415 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20210415 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20210422 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20210426 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20210611 |
|
C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20210621 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20220111 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20220411 |
|
C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20221011 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221026 |
|
C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20230104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230118 |
|
C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20230130 |
|
C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20230227 |
|
C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20230227 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230323 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7252076 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |