JP6870783B2 - 細胞培養基材 - Google Patents

Description

本開示は、細胞を培養するための基材及びキットに関する。

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は目的細胞に分化誘導することができ、再生医療の分野での応用が期待されている。多能性幹細胞を培養して分化誘導させ、ヒトの組織に近いオルガノイドと呼ばれる構造物を得る方法が研究されている。

例えば、特許文献１では、胚性幹細胞から腸管上皮オルガノイドを作製する方法が記載されている。

また非特許文献２にあるようにＴＮＦ−αを培地中に投与してオルガノイドから上皮以外の細胞を誘導する技術も確立されている。

人工多能性幹細胞から小腸上皮細胞を分化誘導する他の方法としては、特許文献２に記載されている方法が挙げられる。

一方、特許文献３及び非特許文献３には細胞接着部のパターンが形成された基材上で多能性幹細胞を培養し腸管組織を分化誘導する方法が記載されている。

また、生体内において癌細胞は嚢胞を形成することが知られている。嚢胞とは、軟組織内に病的に形成された液状成分を内包し、液状成分の周囲が固有の単層上皮により覆われている球状の構造を有する。生体外で、癌細胞から嚢胞に類似した細胞構造物を培養する方法としては、三次元ゲル包埋培養を含む方法が知られている（例えば非特許文献11）。

ＷＯ２０１１／１４０４４１ 特許第６２９６３９９号公報 特許第６１５１０９７号公報 特許第５０７０５６５号公報 特開２０１３−２１２０８８号公報 特許第５１４０９４６号公報

Workman et al., Nature Medicine 第23巻 49〜59ページ 2017年 Hahn et al., Scientific Reports 第7巻2435 2017年 Uchida et al., JCI Insight 第2巻e86492 2017年 Lee et al., Stem Cell Reports 第6巻257〜272ページ 2016年 Okeyo et al., Tissue Eng PartC 第21巻1105〜1115ページ2015年 Golos et al., Placenta 第34S巻S56〜S61ページ2013年 Chen et al., Biochemical and Biophysical Research Communications第436巻677〜684ページ2013年 Kojima et al., Laboratory Investigation 第97巻1188〜1200ページ2017年 Niwa et al., Nature Genetics 第24巻 372〜376ページ 2000年 Okochi et al., Langmuir 第25巻 6947〜6953ページ 2009年 Spence et al., Nature 第470巻 105〜109ページ 2010年

本開示は、腸組織に類似したオルガノイドや癌組織の嚢胞に類似した細胞構造物等の細胞構造物を細胞培養により製造することを可能にする手段を提供する。

本開示の１以上の実施形態は、
細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材に関する。

本開示の１以上の実施形態は、
第１の細胞非接着部と、
前記第１の細胞非接着部中に配置された１以上の細胞培養部と
を含む表面を有する支持基材を含む細胞培養基材であって、
前記１以上の細胞培養部の各々が、第２の細胞非接着部である中央部と、前記中央部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記中央部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材に関する。

前記細胞培養基材は、好ましくは、細胞を培養して袋状の細胞構造物を誘導するための細胞培養基材である。前記細胞は好ましくは幹細胞又は癌細胞である。

前記細胞培養基材の１以上の実施形態は、好ましくは、幹細胞を培養して小腸上皮細胞を含む細胞構造物を分化誘導するための細胞培養基材である。

前記細胞培養基材の好ましい実施形態では、前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部又は前記中央部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下であり、更に好ましくは、１８０μｍ以上６００μｍ以下であり、特に好ましくは１８０μｍ以上５００μｍ以下である。

前記細胞培養基材の好ましい実施形態では、前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部又は前記中央部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下であり、より好ましくは４０μｍ以上４００μｍ以下であり、更に好ましくは、６０μｍ以上３００μｍ以下である。

前記細胞培養基材の好ましい実施形態では、前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部又は前記中央部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離Ｘ’の、前記細胞接着部の、前記中間点を通る直線に沿った方向の幅Ｗ’に対する比Ｘ’／Ｗ’が、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である。

前記細胞培養基材の好ましい実施形態では、前記細胞非接着部又は前記中央部の周縁と前記細胞非接着部又は前記中央部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下であり、更に好ましくは、１８０μｍ以上６００μｍ以下であり、特に好ましくは１８０μｍ以上５００μｍ以下である。

前記細胞培養基材の好ましい実施形態では、前記細胞接着部の、前記細胞非接着部又は前記中央部の重心を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下であり、より好ましくは４０μｍ以上４００μｍ以下であり、更に好ましくは、６０μｍ以上３００μｍ以下である。

前記細胞培養基材の好ましい実施形態では、前記細胞非接着部又は前記中央部の周縁と前記細胞非接着部又は前記中央部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離Ｘの、前記細胞接着部の、前記細胞非接着部又は前記中央部の重心を通る直線に沿った方向の幅Ｗに対する比Ｘ／Ｗが、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である。

前記細胞培養基材の好ましい実施形態では、前記細胞非接着部（前記第１の細胞非接着部、前記第２の細胞非接着部又は前記中央部であってもよい）が、親水性ポリマーを含む層により被覆された表面である。前記親水性ポリマーは、好ましくは、ポリアルキレングリコール及びリン脂質極性基を有する両性イオンポリマーから選択される１種以上の親水性ポリマーである。前記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。

前記細胞培養基材の好ましい実施形態では、前記細胞培養基材が、支持基材として、ガラス基材を含む。

本開示の別の１以上の実施形態は、
前記細胞培養基材を含む細胞培養用キットに関する。

前記キットの好ましい実施形態は、培地及びプレコート処理剤から選択される１種以上を更に含む。

前記キットの好ましい実施形態は、細胞を培養して袋状の細胞構造物を誘導するためのキットである。前記細胞は、好ましくは幹細胞又は癌細胞である。

本開示の別の１以上の実施形態は、
前記細胞培養基材上に細胞を播種すること、並びに
播種された前記細胞を培養して、袋状の細胞構造物を誘導することを含む、
袋状の細胞構造物の製造方法に関する。
前記細胞は好ましくは幹細胞又は癌細胞である。

本開示の別の１以上の実施形態は、
前記製造方法により製造された、袋状の細胞構造物に関する。

本開示の別の１以上の実施形態は、
前記細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
播種された前記細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む、
小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法に関する。

本開示の別の１以上の実施形態は、
前記製造方法により製造された、小腸上皮細胞を含む細胞構造物に関する。

前記細胞構造物は、好ましくは、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１９−０１４８２０号の開示内容を包含する。

本開示の細胞培養基材又はキットを用いることで、細胞構造物を製造することができる。

図１は、実施例１、実施例８、実施例１０で用いた、複数の環状の細胞接着部を備える細胞培養基材の、細胞接着部が支持基材の露出した表面である実施形態の模式図である。図１（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図１（Ｂ）は図１（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。 図２は、実施例１での、内径の異なる環状細胞接着部を有する各細胞培養基材を用いて培養したときの培養１日目、６日目、１１日目、１８日目の培養物の観察像を示す。 図３は、実施例１での、内径の異なる環状細胞接着部を有する各細胞培養基材を用いて培養したときの培養３週間の培養物の観察像を示す。 図４は、内径３８０μｍの環状細胞接着部を有する基材上で形成され剥離した袋状構造を有する組織の観察像（左がディッシュ全体の写真、右が組織の観察像）を示す。 図５は、比較例１、比較例２、比較例３の各基材上での培養開始後３週間の培養物の顕微鏡観察像を示す。 図６は、実施例２での、培養４日目、９日目、１３日目、２０日目の各時点での１つの環状細胞接着部周辺の細胞の観察像を示す。 図７は、実施例３での、内径の異なる細胞培養基材を用いた培養の培養物の培養１日目及び７日目の観察像と、内径２８０μｍの環状細胞接着部を有する細胞培養基材を用いた培養で培養３週間後に回収された袋状構造を有する組織の観察像を示す。 図８は、実施例４での、免疫染色した培養物の培養４日目の観察像を示す。 図９は、実施例４での、免疫染色した培養物の培養７日目の観察像を示す。 図１０は、実施例５での、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で幹細胞を培養し形成された組織の、抗ＣＤＸ２抗体、抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。 図１１は、実施例５での、内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で培養し形成された組織の、抗平滑筋アクチン（Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）抗体、抗ＰＧＰ９．５抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。 図１２は、実施例６での、各寸法の環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養１８日目の観察像である。 図１３は、実施例６での、各寸法の環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養の評価結果を示す。 図１４は、実施例６での、内径５８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養により得られた袋状構造を有する組織の観察像を示す。 図１５Ａは、実施例７、実施例１０で用いた、内寸が一辺２８０μｍ〜３００μｍの正方形で、幅５０μｍ〜６０μｍの細胞接着部を示す。 図１５Ｂは、実施例７、実施例１０で用いた、内径２８０μｍ、幅６０μｍの環状で、周方向の１／８が欠落している、細胞接着部を示す。 図１５Ｃは、実施例７で用いた、内寸が長辺６００μｍ、短辺３００μｍの長方形で、幅５０μｍの細胞接着部を示す。 図１５Ｄは、実施例７で用いた、内寸が一辺６００μｍ（実施例７）の正方形で、幅５０μｍの細胞接着部を示す。 図１６Ａは、図１５Ａに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。 図１６Ｂは、図１５Ｂに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。 図１６Ｃは、図１５Ｃに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。 図１６Ｄは、図１５Ｄに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。 図１７Ａは、比較例４で用いた、細胞非接着領域１０１と、細胞非接着領域１０１中に２００μｍの間隔で並行に配置された幅３０〜５０μｍの直線状の複数の細胞接着領域１０２とを備える表面を有する細胞培養基材１００を示す。 図１７Ｂは、比較例５で用いた、細胞非接着領域１０１’と、細胞非接着領域１０１’中に配置された幅５０μｍで内径６００μｍの環の周方向の過半が欠落している弧形状の複数の細胞接着領域１０２’とを備える表面を有する細胞培養基材１００’を示す。 図１７Ｃに、比較例４の細胞培養基材１００上での細胞培養の１日目と２０日目の写真を示す。 図１７Ｄに、比較例５の細胞培養基材１００’上での細胞培養の１日目と２０日目の写真を示す 図１８は、実施例８での、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で幹細胞を培養した培養物の培養１日目、７日目、１１日目の観察像を示す。 図１９は、実施例８での、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で幹細胞を３週間培養して得られた袋状構造を有する組織の観察像を示す。 図２０の「実施例」の写真は、実施例９において、ヒト線維芽細胞より樹立されたｉＰＳ細胞（日本ジェネティックス社）を、内径６００μｍ、幅１００μｍの寸法の環状細胞接着部を複数備えた細胞培養基材上で培養して形成された袋状の細胞構造物の代表的な写真である。図２０の「比較例」の写真は、実施例９において、同細胞を、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を複数備えた比較例１の細胞培養基材上で培養して形成された袋状の細胞構造物の代表的な写真である。 図２１は、複数の環状の細胞接着部を備える細胞培養基材の、細胞接着部が細胞接着層の表面である実施形態の模式図である。図２１（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図２１（Ｂ）は図２１（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。 図２２は、実施例１０で用いた、内径２８０μｍ、幅６０μｍの環の周方向の１／２が欠落している半円弧形の細胞接着部を示す。 図２３は、実施例１０において、内径２８０μｍ、幅６０μｍの環状の細胞接着部を有する細胞培養基材上で、大腸上皮癌由来Ｃａｃｏ−２細胞を培養した培養１８日目の培養物の観察像を示す。 図２４は、実施例１０において、内径２８０μｍ、幅６０μｍの環の周方向の１／２が欠落している半円弧形の細胞接着部を有する細胞培養基材上で、大腸上皮癌由来Ｃａｃｏ−２細胞を培養した培養１８日目の培養物の観察像を示す。 図２５は、実施例１０において、内寸が一辺２８０μｍの正方形で、幅６０μｍの細胞接着部を有する細胞培養基材上で、大腸上皮癌由来Ｃａｃｏ−２細胞を培養した培養１８日目の培養物の観察像を示す。 図２６は、実施例１０において、内径２８０μｍ、幅６０μｍの環の周方向の１／８が欠落しているＣ字形の細胞接着部を有する細胞培養基材上で、大腸上皮癌由来Ｃａｃｏ−２細胞を培養した培養１８日目の培養物の観察像を示す。 図２７は、複数の突出部の上面のそれぞれに、細胞非接着部（中央部）とその周囲を囲う細胞接着部とを含む細胞培養部を備える細胞培養基材の一実施形態の模式図である。図２７（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図２７（Ｂ）は図２７（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。 図２８は、複数の窪み部の底面のそれぞれに、細胞非接着部（中央部）とその周囲を囲う細胞接着部とを含む細胞培養部を備える細胞培養基材の一実施形態の模式図である。図２８（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図２８（Ｂ）は図２８（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。 図２９は、細胞非接着部（中央部）とその周囲を囲う細胞接着部と含む細胞培養部が１つの表面の全体を占める細胞培養基材の一実施形態の模式図である。図２９（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図２９（Ｂ）は図２９（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。

＜１．細胞培養基材の細胞非接着部及び細胞接着部＞
本開示の一以上の実施形態に係る細胞培養基材は、細胞培養部を含む表面を有する。

そして、前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む。
前記細胞培養部は、前記細胞培養基材の表面上に１以上含まれる。２以上の細胞培養部が含まれる場合、各々が前記特徴を備えていてもよい。
前記細胞培養部中の前記細胞非接着部は、前記細胞培養部以外の部分に存在する細胞非接着部（後述する第１の細胞非接着部）と区別するために、「第２の細胞非接着部」或いは「中央部」と称する場合がある。

すなわち、本開示の一以上の実施形態に係る細胞培養基材は、その表面に、細胞非接着部と細胞接着部とが、所定の形状となるように形成されたものである。

以下の説明では、本開示の一以上の実施形態に係る細胞培養基材の、細胞非接着部及び細胞接着部を含む細胞培養部以外の特徴を説明するために、前記細胞培養基材のうち前記細胞接着部以外の部分を指して「支持基材」と称する場合がある。すなわち、本開示の一以上の実施形態に係る細胞培養基材は、前記一以上の細胞接着部を含む表面を有する支持基材を含む、ということができる。

そこで先ず、支持基材の実施形態、並びに、細胞非接着部と細胞接着部の形状以外の特徴について以下に説明する。

細胞培養基材に用いられる支持基材としては、その表面に、細胞非接着部と細胞接着部を形成することが可能な材料で形成された支持基材であれば特に限定されるものではない。具体的には、ガラス、金属、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を含む支持基材を挙げることができる。特に、ガラス基材を支持基材として用いることが好ましい。支持基材の形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。

本開示において「細胞接着性」とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。「細胞接着部」とは細胞接着性が良好な表面上の領域を意味し、「細胞非接着部」とは、細胞の接着性が悪い表面上の領域を意味する。従って、細胞接着部と細胞非接着部とが所定のパターンで配置された表面上に細胞を播種すると、細胞接着部には細胞が接着するが、細胞非接着部には細胞が接着しないため、細胞培養基材の表面に細胞がパターン状に配列されることになる。

「細胞接着部」は、実際に培養する細胞、好ましくは幹細胞又は癌細胞、を細胞培養基材に播種した際に接着する部分と定義され、「細胞非接着部」は、実際に培養する細胞、好ましくは幹細胞又は癌細胞、を播種した際に接着しない部分と定義される。細胞培養基材に細胞を播種する際に、細胞培養基材の表面は、タンパク質等でコーティングされ、細胞接着性が高められた状態であってもよい。「幹細胞」及び「癌細胞」の具体例は後述の通りである。細胞非接着部は、細胞接着部に接着し増殖した細胞により被覆されてもよい。

細胞接着部であるか細胞非接着部であるかを判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性を有する細胞接着部の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本開示における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上３００００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％のインキュベータ内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。

上記測定において、細胞の播種は、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に懸濁させて測定対象表面上に播種し、その後、細胞ができるだけ均一に分布するよう、細胞が播種された測定対象表面をゆっくりと振とうすることにより行うものである。さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。細胞接着伸展率の測定では、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所（例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁）を除いた箇所を測定箇所とする。

一方、細胞非接着部は、細胞が接着しにくい性質（細胞非接着性）を有する表面の領域である。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。細胞非接着部の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。

細胞接着部は、支持基材の表面に細胞接着層が形成された領域であってもよいし、支持基材の表面が細胞接着性である場合（例えばガラス基材の表面）は、支持基材の表面が露出した領域であってもよいが、好ましくは、支持基材の細胞接着性の表面が露出した領域である。細胞非接着部は、支持基材の表面に細胞非接着層が形成された領域であることができる。細胞接着部および細胞非接着部は、種々の材料や方法により形成可能である。好ましくは、細胞非接着部は、支持基材の表面が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層等の細胞非接着層により被覆された部分である。細胞非接着部を構成する細胞非接着層の平均厚さは、特許文献４に記載されているように、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、支持基材の細胞非接着層で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。特に、特許文献５に記載されているように、細胞非接着層を、ポリエチレングリコールの層により形成する場合、その膜厚の一例として５ｎｍ〜１０ｎｍが例示できる。親水性有機化合物の具体例は、後述する通りである。

細胞非接着層として親水性ポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む細胞培養基材の製造方法としては、特許文献４及び非特許文献１０に記載された方法を用いることができる。

細胞接着部および細胞非接着部の形成方法の特に好ましい形態として、以下の２つの形態が挙げられる。

第１の形態では、支持基材の表面に細胞非接着層を形成し、次いで、細胞非接着層の一部に所定の処理を施し、細胞接着性を発現させて細胞接着部とする形態である。具体的には、支持基材の表面に、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む細胞非接着性の親水性膜を細胞非接着層として形成し、次いで、細胞非接着層である前記親水性膜の一部を選択的に、酸化処理及び／又は分解処理を施して、前記一部を、細胞接着性を有する細胞接着部に改質する例が挙げられる。この形態では細胞非接着性の親水性膜を形成し、次いで、細胞の接着が望まれる部位に対して、酸化処理及び／又は分解処理を施すことにより、当該部位を、細胞接着性を有する部位に転換して細胞接着部とする。第１の形態により形成された細胞培養基材では、細胞非接着部が、支持基材の表面が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層により被覆された部分であり、細胞接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層が酸化処理及び／又は分解処理により除去されて支持基材の表面が露出した部分、或いは、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層が酸化処理及び／又は分解処理を受けて細胞接着性に改質された層（＝細胞接着層）により被覆された部分である。

第２の形態は、支持基材の表面上での有機化合物の密度の高低によって細胞接着部および細胞非接着部とする形態である。第２の形態により形成された細胞培養基材では、細胞接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物の密度が低い（親水性有機化合物を含まない場合も包含する）表面であり、細胞非接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物の密度が高い表面である形態である。第２の形態は、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を高密度で含む支持基材の表面が細胞非接着性を有するのに対して、前記化合物の密度が低い支持基材の表面が細胞接着性を有することを利用したものである。支持基材表面に前記化合物が結合しやすい第１領域と結合しにくい第２領域とを設け、該基材表面に前記化合物の膜を形成すると、第１領域は細胞非接着部となり、第２領域は細胞接着領域となる。或いは、支持基材表面の一部をフォトレジスト等で選択的にマスキングし、マスキングされていない領域に前記親水性有機化合物の膜を形成して細胞非接着部を形成し、その後マスキングを除去して支持基材の表面を露出させることで細胞接着部を形成することができる。

また、上記の形態に限らず、細胞非接着性の表面（細胞非接着性層の表面であってよい）を有する支持基材を用意し、前記表面の一部をコラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質をパターニングして被覆し、細胞接着性のパターンを形成してもよい。或いは、細胞接着性の表面（細胞接着性層の表面であってもよい）を有する支持基材を用意し、前記表面の一部をシリコーンゴム（例えば三菱ケミカル製 珪樹（登録商標））等の細胞非接着性の樹脂により被覆し、残部を細胞接着性のパターンとしてもよい。或いは、表面に所定のパターンの導電性層が設けられた支持基材を用意し、該支持基材の表面に細胞非接着性層を積層し、前記導電性層への電圧印加により、前記導電性層上を被覆する前記細胞非接着性層を剥離させて、露出した前記導電性層を細胞接着部としてもよい（具体的には特開２０１２−１２０４４３号公報、特開２０１３−１７９９１０号公報参照）。

以下では、支持基材表面上に細胞接着部と細胞非接着部を形成して、細胞接着部と細胞非接着部とを含む表面を有する細胞培養基材を製造する上記の第１の形態及び第２の形態について、順に説明する。

まず、第１の形態について説明する。

第１の形態では、まず、支持基材表面に、細胞非接着層として、親水性有機化合物、好ましくは親水性ポリマー、を含む親水性膜を設ける。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する薄膜であり、酸化及び／又は分解される前は細胞非接着性を有し、酸化及び／又は分解された後の支持基材の露出した表面、或いは、酸化処理及び／又は分解処理を受けて改質された薄膜の表面が細胞接着性を呈するものであれば特に限定されない。

細胞非接着層が、親水性有機化合物により形成される親水性膜である場合、支持基材の表面と親水性膜との間には、必要に応じて結合層を設けることが好ましい。結合層は、親水性膜の前記有機化合物が有する官能基と結合可能な官能基（結合性官能基）を有する材料を含む層であることが好ましい。結合層の材料が有する結合性官能基と、親水性有機化合物が有する官能基との組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれが結合層側の官能基であってもよい。これらの方法においては、親水性有機化合物によるコーティングを行う前に、支持基材上に、所定の官能基を有する材料により結合層を形成する。細胞非接着層における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、結合性官能基を有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、結合性官能基を有する材料の被膜を支持基材の表面に形成することにより得られる。

親水性有機化合物としては、親水性ポリマー（親水性オリゴマーを包含する）、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等が挙げられ、親水性ポリマーが特に好ましい。

具体的な親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール、リン脂質極性基を有する両性イオンポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルアルコール、多糖類等を挙げることができる。親水性ポリマーのこれらの具体例は、その誘導体の形態のものも包含する。親水性ポリマーの分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマー等を挙げることができる。

ポリアルキレングリコールとしては具体的には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７等が好ましい。

リン脂質極性基を有する両性イオンポリマーとしては具体的には、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）（＝ＭＰＣポリマー）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーの共重合体等が好ましい。

ポリアクリルアミドとしては具体的にはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が例示できる。

ポリメタクリル酸としては具体的にはポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）が例示できる。

多糖類としては具体的にはデキストラン、ヘパリン等が例示できる。

細胞非接着層を備える支持基材の表面は、細胞非接着層により被覆された状態では高い細胞非接着性を有し、細胞非接着層の酸化処理及び／又は分解処理後には、露出した支持基材の表面が、或いは、細胞非接着層が酸化処理及び／又は分解処理により改質されて形成される層の表面が細胞接着性を示すものであることが望ましい。

親水性ポリマーとしては特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましい。ＰＥＧは、１つ以上のエチレングリコール単位（（ＣＨ_２）_２−Ｏ）からなるエチレングリコール鎖（ＥＧ鎖）を少なくとも含むが、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。エチレングリコール鎖は、例えば、次式：
−（（ＣＨ_２）_２−Ｏ）_ｍ−
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。ｍは、好ましくは１〜１３の整数であり、より好ましくは１〜１０の整数である。

ＰＥＧにはエチレングリコールオリゴマーも包含される。また、ＰＥＧには、官能基が導入されたものも包含される。官能基としては、例えば、エポキシ基、カルボキシル基、Ｎ−ハイドロキシスクシイミド基、カルボジイミド基、アミノ基、グルタルアルデヒド基、（メタ）アクリロイル基等が挙げられる。官能基は、場合によりリンカーを介して、好ましくは末端に導入されたものである。官能基が導入されたＰＥＧとして、例えば、ＰＥＧ（メタ）アクリレート、ＰＥＧジ（メタ）アクリレートが挙げられる。

細胞接着部は、支持基材の表面に形成された親水性有機化合物を含む細胞非接着層に酸化処理及び／又は分解処理を施して、細胞接着性を有する支持基材の表面を露出させる、或いは、細胞非接着層を改質して細胞接着層に転換することで形成することができる。

本開示において「酸化」とは狭義の意味であり、有機化合物が酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を意味する。

本開示において「分解」とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。「分解処理」としては典型的には、酸化処理による分解、紫外線照射による分解などが挙げられるがこれらには限定されない。「分解処理」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解処理」と「酸化処理」とは同一の処理を指す。また細胞非接着層を分解して除去することも「分解処理」に含まれる。

紫外線照射による分解とは、有機化合物が紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、有機化合物が、酸素を含む分子種（酸素、水など）とともに存在している系中に紫外線を照射すると、紫外線が化合物に吸収されて分解が起こる以外に、該分子種が活性化して有機化合物と反応する場合がある。後者の反応は「酸化」に分類できる。そして活性化された分子種による酸化により有機化合物が分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類できる。

以上のように「酸化処理」と「分解処理」は操作としては重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない。そこで本明細書では「酸化処理及び／又は分解処理」という用語を使用する。

次に、第２の形態について説明する。第２の形態により形成される細胞培養基材では、支持基材の表面のうち、細胞接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物の密度が低い（親水性有機化合物を含まない場合も包含する）表面であり、細胞非接着部が、親水性有機化合物の密度が高い表面である。すなわち、細胞接着部と細胞非接着部とは、親水性有機化合物の密度が相違する。同密度が高いほど細胞は接着しにくくなる傾向がある。細胞接着部では、親水性有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低い。親水性有機化合物及び親水性ポリマーの好ましい例は第１の形態について既述の通りである。

第２の形態では、細胞接着部及び細胞非接着部を、密度を制御した親水性膜により形成する場合には、支持基材との密着性を高めるために支持基材上に必要に応じて結合層を形成し、次いで親水性有機化合物からなる親水性膜を形成するのが好ましい。結合層は、親水性有機化合物が有する官能基と結合可能な官能基（結合性官能基）を含む材料を含む層であることが好ましい。結合層の材料が有する官能基と、親水性有機化合物が有する官能基との組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれが結合層側の官能基であってもよい。これらの方法においては、親水性材料によるコーティングを行う前に、支持基材上に、所定の官能基を有する材料により結合層を形成する。結合層における前記材料の密度は結合力を規定する重要な因子である。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。なお、水接触角は、協和界面科学社製 ＣＡ−Ｚを用い、マイクロシリンジから純水を滴下して３０秒後に測定した値である。

細胞接着部の結合層における、結合性官能基を有する材料の密度は低い。細胞接着部における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、結合層を構成する結合性官能基を有する材料として、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には、１０°〜４３°、望ましくは１５°〜４０°である。このような結合層を形成する方法としては、結合性官能基を有する材料の被膜（結合層）を支持基材の表面に形成した後、当該結合層の表面を酸化処理及び／又は分解処理する方法が挙げられる。結合層表面を酸化処理及び／又は分解処理する方法としては、結合層表面を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。結合層表面の全面を酸化処理及び／又は分解処理してもよいし、部分的に処理してもよい。部分的な処理は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いたりすることにより行うことができる。また、紫外線レーザー等のレーザーを用いた方式等の直描方式で酸化処理及び／又は分解処理を施してもよい。諸条件などについても、親水性膜の酸化処理及び／又は分解処理により細胞接着部を形成する方法の場合と同様の条件を適用できる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着部が形成できる。

細胞非接着部の結合層における、結合性官能基を有する材料の密度は高い。細胞非接着部における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、結合性官能基を有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、結合性官能基を有する材料の被膜を支持基材の表面に形成することにより得られる。結合層表面を部分的に酸化処理及び／又は分解処理した場合には、処理を受けない残余の部分が前記水接触角を有する結合層となる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞非接着層が形成できる。

第２の形態ではまた、支持基材表面の一部を選択的に感光性フォトレジスト等によりマスキングし、マスキングされていない領域に前記親水性有機化合物の膜を形成して細胞非接着部を形成し、その後マスキングを除去して支持基材の表面を露出させることで細胞接着部を形成してもよい。

続いて、上記の第１の形態又は第２の形態、或いは他の方法により形成された細胞接着部と細胞非接着部の特徴について更に説明する。

細胞接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量は、細胞非接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着部の炭素量が、細胞非接着部の炭素量に対して２０〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、細胞接着部及び細胞非接着部に含まれる親水性有機化合物層の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「炭素量（ａｔｏｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。

また、細胞接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞非接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着部における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞非接着部における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「酸素と結合している炭素の割合（ａｔｏｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。

細胞接着部及び細胞非接着部に含まれる親水性有機化合物層（結合層が存在する場合には結合層も含む）の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、Ｘ線光電子分光測定、各種質量分析法などを用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度（ａｔｏｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）で算出される。以下、本開示におけるＸ線光電子分光分析方法を詳細に説明する。

細胞接着部及び細胞非接着部の「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義される。また、本開示において細胞接着部及び細胞非接着部の「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。具体的な測定は、特開２００７−３１２７３６に記載されるとおりに実施できる。

＜２．細胞培養基材の細胞培養部の形状の特徴＞
本開示で用いる細胞培養基材の特徴について主に図１を参照して説明する。

本開示で用いる細胞培養基材１は、
細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。

そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部（中央部）２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図１では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。本実施形態は、細胞培養基材１の表面Ｓ上に細胞培養部２０が１以上含まれ、１以上の細胞培養部２０の各々が、上記の特徴を有する例である。

図１に示す例では、１以上の細胞培養部２０は、細胞非接着部１０中に島状に点在している。この例では、細胞非接着部１０を「第１の細胞非接着部」と称し、細胞接着部２０の細胞非接着部２１を「第２の細胞非接着部」と称する場合がある。また、以下の説明では「細胞非接着部２１」を「中央部２１」或いは「細胞非接着部である中央部２１」と称する場合がある。第１の細胞非接着部１０は必須の構成ではなく、第１の細胞非接着部１０を備えていない細胞培養基材の例は図２７〜２９を参照して別途説明する。

また、細胞培養基材１のうち、第１の細胞非接着部１０及び細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。

図１に示す例では、第１の細胞非接着部１０、第２の細胞非接着部である中央部２１は、支持基材３０の表面上に積層された第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞非接着層２１Ａの表面である。

図１に示す例では、細胞接着部２２は、露出した支持基材３０の表面である。なお図２１に示す例のように、細胞接着部２２は、支持基材３０の表面上に積層された細胞接着層２２Ａの表面であってもよい。
図１（Ｂ）及び図２１（Ｂ）では、説明の便宜上、細胞非接着層１０Ａ、細胞非接着層２１Ａ及び細胞接着層２２Ａの厚さ、並びに、細胞接着部２２と、細胞非接着層１０Ａ又は細胞非接着層２１Ａとの段差を強調して示しているが、培養される細胞及び細胞構造物の寸法に対して、前記厚さ及び段差は十分に小さいため、１以上の細胞培養部２０を含む表面Ｓは実質的に平坦な表面として細胞を支持することができる。

図１（Ｂ）では、支持基材３０と、第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞非接着層２１Ａとは直接接している例を示しているが、既述のように結合層が間に介在していてもよい。同様に、図２１（Ｂ）では、支持基材３０と、第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞非接着層２１Ａ、細胞接着層２２Ａとは直接接している例を示しているが、既述のように結合層が間に介在していてもよい。

支持基材３０、第１の細胞非接着部１０、第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞接着部２１、第２の細胞非接着層２１Ａ、細胞接着部２２、細胞接着層２２Ａの具体例及び製造方法は既述の通りである。

本発明者らは驚くべきことに、このような構造の細胞培養基材１上で細胞を培養するとき、細胞非接着部（中央部）２１を囲う細胞接着部２２に細胞が接着し増殖することで細胞が密に凝集した凝集部が形成され、袋状の細胞構造物（組織）が形成され易いことを見出した。上記構造の細胞培養基材を用いて細胞の培養を行うと、袋状の細胞構造物が比較的短時間で細胞培養基材から遊離し回収することができ、しかも、回収効率が極めて高いことを本発明者らは見出した。袋状の細胞構造物が形成できる細胞としては、幹細胞又は癌細胞が例示できる。例えば幹細胞を細胞培養基材１上で培養すると、細胞非接着部（中央部）２１を囲う細胞接着部２２に幹細胞が接着し増殖して凝集部が形成され、凝集部において幹細胞が栄養外胚葉細胞のマーカーを発現する腸上皮細胞に分化誘導され、得られた袋状の細胞構造物は、小腸上皮細胞を含み、腸オルガノイドとしての機能を有する。

細胞培養部２０の形状及び寸法は特に限定されないが、好ましい実施形態では、中央部２１の周縁Ｐと、中央部２１の重心Ｃを通る直線Ｌとの二つの交点Ａ１、Ａ２の間の距離Ｘが、８０μｍ超８８０μｍ以下であり、より好ましくは、１８０μｍ以上８８０μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上６００μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上５００μｍ以下である。距離Ｘが小さすぎると、増殖培養時に細胞によりすぐに中央部２１が被覆されてしまい、細胞構造物の外周部に特異的な袋状構造が得られにくい。一方、距離Ｘが大きすぎると、細胞が増殖して中央部２１を完全に被覆するまでの時間が長時間になるため、細胞構造物の生産効率が低下する。距離Ｘが上記の範囲にあるとき、袋状構造の細胞構造物を比較的短時間で高収率で培養することができる。前記距離Ｘは、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径を指し、円が真円である場合は、直線Ｌをどのようにとっても距離Ｘは同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は距離Ｘは、直線Ｌが対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌが短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌに対して）距離Ｘが上記範囲である。

細胞培養部２０の別の好ましい実施形態では、細胞接着部２２の、中央部２１の重心Ｃを通る直線Ｌに沿った方向の幅Ｗが、３０μｍ超４００μｍ以下であり、より好ましくは４０μｍ以上４００μｍ以下であり、特に好ましくは６０μｍ以上３００μｍ以下である。幅Ｗが小さすぎると培養中に細胞が剥離し易いという問題がある。また、袋状の細胞構造物の誘導のためには、細胞接着部２２の幅方向に複数個の細胞が接着して凝集部を形成することが望ましく、そのためには幅Ｗは大きいほうが好ましいことから、上記の通り幅Ｗは４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましい。一方、幅Ｗが大きすぎると、細胞接着部２２に接着した細胞の密度の偏りが生じ易く、幅方向に均一な細胞の凝集部が形成され難くなり、均一な構造の細胞構造物が得られにくい。幅Ｗが上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。前記幅Ｗは、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径方向の細胞接着部２２の幅を指し、円が真円である場合は、直線Ｌをどのようにとっても幅Ｗは同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は幅Ｗは、直線Ｌが対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌが短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌに対して）幅Ｗが上記範囲である。

細胞培養部２０の別の好ましい実施形態では、中央部２１の周縁Ｐと、中央部２１の重心Ｃを通る直線Ｌとの二つの交点Ａ１、Ａ２の間の距離Ｘの、細胞接着部２２の前記直線Ｌに沿った方向の幅Ｗに対する比Ｘ／Ｗが、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である。前記比Ｘ／Ｗが上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌに対して）前記比Ｘ／Ｗが上記範囲である。

上記の重心Ｃ、距離Ｘ、幅Ｗ、直線Ｌの代わりに下記の中間点Ｃ’、距離Ｘ’、幅Ｗ’、直線Ｌ’により細胞接着部２２の形状及び寸法を規定することができる。中間点Ｃ’、距離Ｘ’、幅Ｗ’、直線Ｌ’について図１５Ａ及び図１５Ｂを参照して説明する。細胞接着部２２の内周Ｑ上の、中央部２１を間に介して対向する最も離れた二つの点Ａ３，Ａ４の中間点Ｃ’を通る直線を直線Ｌ’とする。この直線Ｌ’と、細胞接着部２２の内周Ｑとの２つの交点Ａ５，Ａ６の間の距離を距離Ｘ’とする。また、細胞接着部２２の、中間点Ｃ’を通る直線Ｌ’に沿った方向の幅を幅Ｗ’とする。

前記距離Ｘ’は、好ましくは８０μｍ超８８０μｍ以下であり、より好ましくは、１８０μｍ以上８８０μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上６００μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上５００μｍ以下である。距離Ｘ’が小さすぎると、増殖培養時に細胞によりすぐに中央部２１が被覆されてしまい、細胞構造物の外周部に特異的な袋状構造が得られにくい。一方、距離Ｘ’が大きすぎると、細胞が増殖して中央部２１を完全に被覆するまでの時間が長時間になるため、細胞構造物の生産効率が低下する。距離Ｘ’が上記の範囲にあるとき、袋状構造の細胞構造物を比較的短時間で高収率で培養することができる。前記距離Ｘ’は、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径を指し、円が真円である場合は、直線Ｌ’をどのようにとっても距離Ｘ’は同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は、距離Ｘ’は、直線Ｌ’が対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌ’が短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌ’に対して）距離Ｘ’が上記範囲である。

前記幅Ｗ’は、好ましくは３０μｍ超４００μｍ以下であり、より好ましくは４０μｍ以上４００μｍ以下であり、特に好ましくは６０μｍ以上３００μｍ以下である。幅Ｗ’が小さすぎると培養中に細胞が剥離し易いという問題がある。また、袋状の細胞構造物の誘導のためには、細胞接着部２２の幅方向に複数個の細胞が接着して凝集部を形成することが望ましく、そのためには幅Ｗ’は大きいほうが好ましいことから、上記の通り幅Ｗ’は４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましい。一方、幅Ｗ’が大きすぎると、細胞接着部２２に接着した細胞の密度の偏りが生じ易く、幅方向に均一な細胞の凝集部が形成され難くなり、均一な構造の細胞構造物が得られにくい。幅Ｗ’が上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。前記幅Ｗ’は、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径方向の細胞接着部２２の幅を指し、円が真円である場合は、直線Ｌ’をどのようにとっても幅Ｗ’は同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は幅Ｗ’は、直線Ｌ’が対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌ’が短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌ’に対して）幅Ｗ’が上記範囲である。

比Ｘ’／Ｗ’は、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である。前記比Ｘ’／Ｗ’が上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌ’に対して）前記比Ｘ’／Ｗ’が上記範囲である。

図１及び図１５Ｂでは、中央部２１が円形であり、細胞接着部２２が円形の中央部２１を同心円的に囲う環状形状であり、対称性が高いため、均一な細胞構造物を得るためには特に好ましい。しかし、このような例には限定されず、図１５Ａ、図１５Ｃ、図１５Ｄに示すように、中央部２１が矩形（正方形又は長方形）であり、細胞接着部２２が、矩形の中央部２１の周縁Ｐに沿った、内郭と外郭が矩形の形状であってもよい。また、図示しないが、中央部が楕円形で、細胞接着部が、中央部に沿って延在する楕円の環状形状であってもよい。また、上記で挙げた例では、細胞接着部の内郭と外郭が相似形状であるが、それには限定されず、例えば細胞接着部の内郭（すなわち中央部の外郭）が矩形等の多角形であり、細胞培養部の外郭が円形又は楕円形であってもよいし、逆に、細胞接着部の内郭（すなわち中央部の外郭）が円形又は楕円形であり、細胞培養部の外郭が矩形等の多角形であってもよい。また、中央部２１は、半円形状であってもよい。

図１、図１５Ａ、図１５Ｃ、図１５Ｄの例では、細胞接着部２２は、細胞非接着部である中央部２１の周縁Ｐに沿って連続的に延在し、全周に亘って中央部２１を囲う。しかし、細胞接着部は、断続的に延在する形状であってもよい。具体的には図１５Ｂ、図２２の例に示すように、細胞接着部２２は、細胞非接着部である中央部２１の周縁Ｐに沿って断続的に延在し中央部２１を囲う。このような構造であっても細胞接着部２２上に接着した細胞は、増殖を経て、細胞接着部２２の切れ目の部分を繋ぐような組織を形成することができる。細胞接着部２２が、中央部２１の周縁Ｐに沿って断続的に延在する実施形態では、中断部分は、１か所あたり、中央部２１の周縁Ｐの全周の好ましくは２分の１以下、より好ましくは４分の１以下、より好ましくは６分の１以下、より好ましくは８分の１以下の長さであり、また、複数の中断部分を含む場合は、中断部分の合計が、中央部２１の周縁Ｐの全周の好ましくは２分の１以下、より好ましくは４分の１以下、より好ましくは６分の１以下、より好ましくは８分の１以下の長さである。

本開示で用いる細胞培養基材では、細胞接着部が、細胞非接着性の中央部を囲うように延在している構造であることで、その上に細胞が接着し増殖すると細胞が密になり袋状の細胞構造物の誘導が促進され易い。
特に、本開示に係る細胞培養基材上で幹細胞を培養する場合、細胞接着部に幹細胞が接着し増殖すると細胞が密になり栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞への分化が促進され易く、且つ、増殖した細胞が積層し易い。この結果、外周部に栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞が分布した袋状の細胞構造物を効率的に得ることができる。

これに対して、特許文献２および非特許文献３に記載の手法では、細胞接着部が円形形状であるため、播種された細胞が増殖により内部にまで進展してしまい、外周部に細胞が凝集しにくいため、袋状の細胞構造物が形成され難い。
特に、特許文献２および非特許文献３に記載の、細胞接着部が円形形状である細胞培養基材上に幹細胞を培養した場合には、栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞が増殖により内部にまで進展してしまい、外周部に栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞が分布した袋状の細胞構造物が得られにくく、内胚葉系細胞にも分化誘導され難い。そのため後述する比較例１の結果の通り回収率が下がっていたと考えられる。また細胞接着部が円形形状である場合、細胞接着部の面積が大きいため凝集部を作るために時間を要していたと考えられる。

細胞培養基材１のように複数の細胞培養部２０が存在する場合、それらは互いに隔離されており、好ましくは０．２０ｍｍ以上、より好ましくは０．３０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。各細胞培養部２０を一定距離以上隔離することにより、各細胞培養部２０内の細胞が隣接する他の細胞培養部２０の細胞と細胞間結合を形成することなく均一に一定間隔で培養され、再現性の高い実験系を構築できる。

図１、図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、図２１に示す実施形態に係る細胞培養基材１は、第１の細胞非接着部１０中に、１以上の細胞培養部２０が含まれた構造を有している。第１の細胞非接着部１０を備えていない細胞培養基材の実施形態を、図２７〜２９を参照して別途説明する。

図２７〜２９に示す細胞培養基材１の、図１又は図２１に示す細胞培養基材１との相違点について以下に説明する。図２７〜２９に示す細胞培養基材１における、細胞培養部２０を構成する細胞非接着部（中央部）２１及び細胞接着部２２の特徴及び形成方法は、図１又は図２１に示す細胞培養基材１における細胞非接着部２１及び細胞接着部２２と同様であるため、図２７（Ｂ）、図２８（Ｂ）及び図２９（Ｂ）での細胞培養基材１の断面において、細胞非接着部２１及び細胞接着部２２の断面の特徴については描写を省略する。このほか、図２７〜２９に示す細胞培養基材１について言及しない特徴については図１及び図２１に示す細胞培養基材１と同様であるため説明を省略する。

図２７に示す本開示の一実施形態に係る細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図２７では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図２７に示す細胞培養基材１のうち、細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。

図２７に示す細胞培養基材１は、１以上の突出部３１を有する支持基材３０を有し、各突出部３１の上面Ｓに、細胞非接着部２１とその周囲を囲う細胞接着部２２とを含む。この実施形態では、突出部３１の上面Ｓは円形であるが、他の形状を有していても良い。この実施形態では、平面視において、突出部３１の上面Ｓの周縁部に細胞接着部２２が存在し、細胞接着部２２の外側には支持基材が存在しないため、細胞接着部２２に接着した細胞は、培養されると、細胞接着部２２よりも外側には広がらず、細胞接着部２２及びその内側の細胞非接着部２１上に広がり細胞構造物を形成する。

図２７に示す実施形態によれば、水平方向に隔離した突出部３１の上面Ｓに細胞培養部２０（細胞非接着部２１及び細胞接着部２２からなる）が存在するため各細胞培養部２０内の細胞が隣接する他の細胞培養部２０の細胞と細胞間結合を形成することなく培養され、再現性の高い実験系を構築しやすい。本実施形態において突出部３１が複数存在する場合、それらは、好ましくは０．２０ｍｍ以上、より好ましくは０．３０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。

図２８に示す本開示の一実施形態に係る細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図２８では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図２８に示す細胞培養基材１のうち、細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。

図２８に示す細胞培養基材１は、１以上の窪み部３２を有する支持基材３０を有し、各窪み部３２の底面Ｓに、細胞非接着部２１とその周囲を囲う細胞接着部２２とを含む。この実施形態では、窪み部３２の底面Ｓは円形であるが、他の形状を有していても良い。この実施形態では、平面視において、窪み部３２の底面Ｓの周縁部に細胞接着部２２が存在し、細胞接着部２２の外側は窪み部３２の周壁面であるため、細胞接着部２２に接着した細胞は、培養されると、細胞接着部２２よりも外側には広がらず、細胞接着部２２及びその内側の細胞非接着部２１上に広がり細胞構造物を形成する。

図２８に示す実施形態によれば、水平方向に隔離した窪み部３２の底面Ｓに細胞培養部２０（細胞非接着部２１及び細胞接着部２２からなる）が存在するため各細胞培養部２０内の細胞が隣接する他の細胞培養部２０の細胞と細胞間結合を形成することなく培養され、再現性の高い実験系を構築しやすい。本実施形態において窪み部３２が複数存在する場合、それらは、好ましくは０．２０ｍｍ以上、より好ましくは０．３０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。

図２９に示す本開示の一実施形態に係る細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図２９では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図２９に示す細胞培養基材１のうち、細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。

図２９に示す細胞培養基材１は、支持基材３０の平坦な表面Ｓの全体に１つの細胞培養部２０が形成されており、細胞接着部２２は、表面Ｓの周縁部に配置されている。この実施形態では、支持基材３０の表面Ｓは円形であるが、他の形状を有していても良い。この実施形態では、平面視において、支持基材３０の表面Ｓの周縁部に細胞接着部２２が存在し、細胞接着部２２の外側には支持基材が存在しないため、細胞接着部２２に接着した細胞は、培養されると、細胞接着部２２よりも外側には広がらず、細胞接着部２２及びその内側の細胞非接着部２１上に広がり細胞構造物を形成する。

図２９に示す実施形態によれば、１つの細胞培養基材１には細胞培養部２０（細胞非接着部２１及び細胞接着部２２からなる）のみが存在するため、細胞培養部２０内の細胞が他の細胞と細胞間結合を形成することなく培養され、再現性の高い実験系を構築しやすい。

＜３．キット＞
本開示の別の１以上の実施形態は、前記細胞培養基材を含む細胞培養用キットに関する。
前記キットにおける細胞培養基材の特徴は既述の通りである。
前記キットは、培地及びプレコート処理剤から選択される１種以上を更に含んでもよい。

培地としては、培養しようとする細胞、特に後述する幹細胞又は癌細胞、を培養するために用いることができる培地が好ましい。幹細胞を培養するための好ましい培地は、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法に使用できる培地として例示する範囲から選択することができる。

プレコート処理剤とは、細胞培養基材に予め適用して、細胞接着部への細胞の接着を促進するための成分である。プレコート処理剤としては、細胞外マトリックス（コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、ビトロネクチン）、ゼラチン、リジン、ペプチド、それらを含むゲル状マトリックス、血清等が挙げられる。プレコート処理剤は適当な溶媒中に溶解又は懸濁された液体組成物としてキットに含まれてもよい。

＜４．幹細胞＞
本開示の１以上の実施形態で用いる幹細胞としては、小腸上皮細胞への分化能を有する幹細胞であればよいが、好ましくは、内胚葉系細胞（小腸上皮細胞等）、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞への分化能を有する幹細胞であり、より好ましくは、多能性幹細胞である。多能性幹細胞としては特に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好適である。

本開示の１以上の実施形態において使用される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、好ましくは哺乳動物由来のＥＳ細胞であり、例えば、マウスなどのげっ歯類又はヒトなどの霊長類由来のＥＳ細胞などを使用することができる。特に好ましくは、マウス又はヒト由来のＥＳ細胞を使用する。ＥＳ細胞は、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞株を指し、生体外にて、理論上すべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させることができる。ＥＳ細胞としては、例えば、その分化の程度の確認を容易とするために、Ｐｄｘ１遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。例えば、Ｐｄｘ１座にＬａｃＺ遺伝子を組み込んだ１２９／Ｓｖ由来ＥＳ細胞株又はＰｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンをもつＥＳ細胞ＳＫ７株などを使用することができる。あるいは、Ｈｎｆ３β内胚葉特異的エンハンサー断片制御下のｍＲＦＰ１レポータートランスジーン及びＰｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンを有するＥＳ細胞ＰＨ３株を使用することもできる。また、国立成育医療研究センターの生殖・細胞医療研究部で樹立し、Akutsu H, et al. Regen Ther. 2015;1:18-29 に開示したＥＳ細胞株である、ＳＥＥＳ１、ＳＥＥＳ２、ＳＥＥＳ３、ＳＥＥＳ４、ＳＥＥＳ５、ＳＥＥＳ６又はＳＥＥＳ７や、これらのＥＳ細胞株に更なる遺伝子を導入した細胞株を使用することもできる。

本開示の１以上の実施形態において使用される人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。人工多能性幹細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ（Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ）らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。

ｉＰＳ細胞の作製に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本開示で言う体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、すい臓細胞、血球細胞、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。

ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本開示におけるｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。

体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子

＜５．幹細胞以外の細胞＞
本開示の細胞培養基材又はキットを用いて培養する細胞は幹細胞には限定されず他の細胞であってもよい。例えば他の細胞は癌細胞であってもよい。
癌細胞の起源生物種は特に限定されない。例えばヒト由来細胞であれば大腸上皮癌由来Ｃａｃｏ−２細胞、肝臓癌由来のＨｅｐＧ２細胞やＨｅｐａＲＧ細胞、乳癌由来のＭＣＦ−７細胞、肺癌由来のＡ−５４９細胞、子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞、皮膚癌由来のＡ−４３１細胞等が挙げられる。特に生体内で嚢胞様袋状組織を形成しやすい癌細胞、例えば各種膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、腎臓癌細胞等を用いることもできる。

＜６．袋状の細胞構造物＞
本開示の細胞培養基材又はキットを用いて細胞を培養することにより、袋状の細胞構造物を誘導することができる。

本開示の１以上の実施形態は、本開示の細胞培養基材上で細胞を培養するとき、細胞非接着部を囲うように延在する細胞接着部において細胞が高密度で凝集し、それが外周部に分布した袋状の細胞構造物が得られるという驚くべき知見に基づくものである。

特に、本開示の細胞培養基材上で幹細胞を培養した場合、外周部に小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物を誘導することができる。幹細胞から分化誘導される小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物は腸オルガノイドとして利用することができる。

また、本開示の細胞培養基材上で癌細胞を培養した場合にも、液状成分を内包する袋状の細胞構造物を誘導することができる。本開示の細胞培養基材上で癌細胞を培養して誘導される袋状の細胞構造物は、癌の嚢胞に類似した構造を有しているため、癌を予防又は治療するための薬剤の開発や、癌の病理研究に有用である。従来、癌細胞から嚢胞に類似した組織を培養するためには、三次元ゲル包埋培養を行う必要があったが、本開示の細胞培養基材上で癌細胞を培養するという簡便な方法で癌細胞から袋状の細胞構造物を誘導することができる。

本開示の細胞培養基材又はキットを用いて細胞を培養し分化誘導して製造される袋状の細胞構造物の全体の形状は特に限定されないが粒状であることが通常である。「粒状」は球状も包含する。

＜７．袋状の細胞構造物の製造方法＞
本開示の細胞培養基材を用いて、袋状の細胞構造物を製造することができる。この製造方法は、例えば、
上記の特徴を有する細胞培養基材上に細胞を播種すること、並びに
播種された前記細胞を培養して、袋状の細胞構造物を誘導することを含む。

前記細胞としては幹細胞又は癌細胞が例示できる。

細胞構造物の製造に用いる際、本開示の細胞培養基材は、細胞の細胞接着部への接着を促進する目的で、プレコート処理剤によりプレコート処理されていることが好ましい。プレコート処理剤の具体例は既述の通りである。プレコート処理を実施することにより、接着性の低い細胞の細胞接着部への接着を促進でき、細胞の接着培養を効果的に実施できる。

細胞培養基材に播種された細胞を培養して袋状の細胞構造物に分化させる工程は、細胞を増殖させ、袋状の細胞構造物に誘導することができる培地中で行えばよい。また培地は、血清含有培地であってもよいし、血清に代替する性質を有する既知成分を含有した無血清培地であってもよい。培地としては、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。培地には、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。幹細胞を培養するための好ましい培地については後述する。

細胞培養基材への細胞の播種密度は常法に従えばよく特に限定されるものではない。例えば、細胞を細胞培養基材に対し３×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度で播種することが好ましく、３×１０^４〜５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種することがより好ましく、３×１０^４〜２．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種することがさらに好ましい。

培養温度は、通常３７℃である。ＣＯ^２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ_２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。

細胞を細胞培養基材へ播種した後の培養期間は、細胞の初期播種密度や細胞接着部の形状、大きさによって差異が生じるが、２〜４週間程度であることが好ましい。

また本開示の細胞培養基材上で細胞から誘導された袋状の細胞構造物は細胞培養基材から自然に浮遊して剥離するが、細胞構造物を破壊しない温和な酵素処理（例えばＡｃｃｕｔａｓｅやＴｒｙｐＬＥなど）やＥＤＴＡ処理、培地等の液体の吹きかけ、スクレーパーによる物理的な剥離等の各種手法を用いて、細胞培養基材からの細胞構造物の剥離を促進してもよい。

袋状の細胞構造物が細胞培養基材から剥離した後、更に浮遊培養を継続してもよい。浮遊培養の期間は限定されない。

＜８．幹細胞から分化誘導される小腸上皮細胞を含む細胞構造物＞

腸は三胚葉（内胚葉、外胚葉、中胚葉）に由来する細胞を含む複雑な器官である。腸は、内胚葉に由来する小腸上皮細胞（腸細胞、杯細胞、内分泌細胞、刷子細胞、パネート細胞、M細胞等）、中胚葉に由来するリンパ組織、平滑筋細胞、カハール介在細胞、外胚葉に由来する腸管神経叢等が複雑に組み合わされて、分泌、吸収、蠕動運動等の機能を奏する。

特許文献１記載の方法で得られた組織は小腸上皮細胞のみを含む。また胚性幹細胞からの分化誘導にアクチビンを使用しているがゆえにほぼ単一の胚葉由来の細胞、ここでは内胚葉由来細胞しかできてない。このため、中胚葉や外胚葉由来の他種細胞を含む腸組織を得るためには、他種細胞を、非特許文献１にあるように別途分化誘導する必要があった。また特許文献１記載の方法は、上皮分化誘導のためにマトリゲルに包埋して培養する工程を含み、この点からも生産性に課題があった。

非特許文献２に記載の方法に関しても培養の手間が課題となっていた。

特許文献２に記載の方法で得られた組織もまた、小腸上皮細胞のみを含むため、特許文献１に記載の方法と同様の課題があった。

一方、特許文献３及び非特許文献３に記載の方法によれば、単一の培養により腸管上皮組織のみならず筋組織や神経組織なども分化誘導することができる。この方法はまた、多くのパターンが形成された一つの基材上で同時に多くの腸管組織を培養することできるため、生産効率が高い。また生物由来物質を用いずに培養を達成しているため移植用途にも適用しやすい。

しかしながら、特許文献３及び非特許文献３に記載の方法は、培養する細胞の種類によっては目的とする組織の収率が大幅に低下することが課題であり、培養法の改良により目的とする組織の収率を向上させる必要があった。

すなわち、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を、培養細胞の起源に関わらず効率良く製造するための手段が求められていた。

そこで上記の課題を解決する手段として、本開示の１以上の実施形態は、本開示の細胞培養基材又はキットを用いて幹細胞を培養し分化誘導して、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を製造することを含む。
前記小腸上皮細胞は、典型的には、栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞である。

本開示の１以上の実施形態は、幹細胞の培養時に、細胞非接着部（中央部）を囲うように延在する細胞接着部において細胞が高密度で凝集し、栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞に分化し、それが外周部に分布した袋状構造の細胞構造物が得られるという驚くべき知見に基づくものである。実施例では、栄養外胚葉細胞のマーカーであるサイトケラチン７と、小腸上皮細胞及び栄養外胚葉細胞のマーカーであるＣＤＸ２とが、細胞接着部に凝集した細胞で強く発現していることを確認している。

なお、小腸上皮細胞は、細胞核に転写因子のＣＤＸ２及びＨＮＦ４、絨毛層にｖｉｌｌｉｎが発現し、かつ内胚葉系マーカーのＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎなどが発現していることを指標に確認することができる。これらのマーカーの存在は、抗体を使用した組織免疫染色やｍＲＮＡによるＰＣＲ評価などで検出可能である。

本開示の細胞培養基材又はキットを用いて幹細胞を培養し分化誘導して製造される細胞構造物の１以上の実施形態は、小腸上皮細胞を含んでおり、腸と同等の機能を有する腸オルガノイドとして有用である。「腸オルガノイド」とは、細胞の起源生物の腸、特にヒト等の哺乳動物の腸、特にヒト腸に類似した機能（具体的には、蠕動運動する機能、粘液分泌機能、物質吸収機能等）を有する細胞構造体（組織）を指す。本開示の細胞培養基材又はキットを用いて幹細胞を培養し分化誘導して製造される細胞構造物は、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究に有用である。

本開示の細胞培養基材又はキットを用いて幹細胞を培養し分化誘導して製造される細胞構造物の全体の形状は特に限定されないが粒状であることが通常である。「粒状」は球状も包含する。

非特許文献４にあるようにマウスＥＳ細胞でＣＤＸ２が強く発現することで栄養外胚葉細胞に分化する事が示されている。本実施例においてもマーカーとなるＣＤＸ２やＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７が凝集部において強く発現していることが確認されており、同様に栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞に分化していると考えられる。

さらにヒトｉＰＳ細胞からＣＤＸ２陽性細胞を含む袋状構造を有する組織が得られることは非特許文献５に記載されている。よって本開示の１以上の実施形態では、幹細胞の培養により細胞接着部上で細胞が密集した凝集部において、幹細胞からＣＤＸ２陽性細胞に分化し、それが同様に袋状構造の形成に寄与している可能性が考えられる。

また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が栄養外胚葉細胞への分化能を有することは非特許文献６〜８にも示されている。

以上の過去知見、並びに、後に示されるように本開示では細胞接着部に凝集した細胞ではＯｃｔ３／４遺伝子の低下が観察されていることから、本開示の細胞培養基材を用いた培養では、幹細胞が細胞接着部に接着し増殖して凝集部を形成し、凝集部から栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞に分化していることが推定される。

非特許文献９では、マウスＥＳ細胞を用いた検討ではＯｃｔ遺伝子の発現が低下すると栄養外胚葉に分化することが示されており、本開示の細胞培養基材又はキットを用いて製造される細胞構造物でも同様の分化が生じていると推定される。

本開示の細胞培養基材又はキットを用いて幹細胞を培養し分化誘導して製造される細胞構造物は、より好ましくは、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む。

内胚葉は消化管のほか肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などを形成する。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、ＡＦＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＳＴ、ＩＳＬ１、ＩＰＦ１、ＩＡＰＰ、ＥＯＭＥＳ、ＨＧＦ、ＡＬＢＵＭＩＮ、ＰＡＸ４、ＴＡＴ等を挙げることができる。

本開示の細胞培養基材又はキットを用いて幹細胞を培養し分化誘導して製造される細胞構造物に含まれ得る内胚葉系細胞としては特に小腸上皮細胞が挙げられる。腸オルガノイドは、小腸上皮細胞として、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞及びパネート細胞から選択される１以上を含むことが好ましく、小腸上皮細胞として、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞及びパネート細胞を全て含むことが特に好ましい。本開示の細胞培養基材又はキットを用いて製造される細胞構造物に内胚葉系細胞が存在することは内胚葉系細胞のマーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。腸細胞マーカーとしてはＣＤＸ２、杯細胞マーカーとしてはＭＵＣ２、腸管内分泌細胞マーカーとしてはＣＧＡ、パネート細胞マーカーとしてはＤＥＦＡ６が挙げられる。そのほか、ＥＣＡＤ、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ビリンが腸上皮細胞のマーカーである。また、胚体内胚葉マーカーＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４も内胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。また、初期内胚葉及び中胚葉のマーカーであるＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６又はＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）も、内胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。

外胚葉は皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体などを形成する。外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。また末梢神経系も形成する。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から外胚葉系細胞への分化は、外胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。外胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、β−ＴＵＢＬＩＮ、ＮＥＳＴＩＮ、ＧＡＬＡＮＩＮ、ＧＣＭ１、ＧＦＡＰ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＯＬＩＧ２、ＳＹＮＡＰＴＰＨＹＳＩＮ、ＤＥＳＭＩＮ、ＴＨ等を挙げることができる。

本開示の細胞培養基材又はキットを用いて幹細胞を培養し分化誘導して製造される細胞構造物に含まれ得る外胚葉系細胞としては特に腸管神経叢を構成する細胞が挙げられる。本開示の細胞培養基材又はキットを用いて製造される細胞構造物に外胚葉系細胞が存在することは外胚葉系細胞のマーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。外胚葉系細胞を判別するためのマーカーとしては腸管神経叢マーカーＰＧＰ９．５や、神経前駆細胞マーカーＳＯＸ１が利用できる。

中胚葉は体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）を形成する。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から中胚葉系細胞への分化は、中胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。中胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、ＦＬＫ−１、ＣＯＬ２Ａ１、ＦＬＴ１、ＨＢＺ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＲＵＮＸ２、ＰＥＣＡＭ１等を挙げることができる。

本開示の細胞培養基材又はキットを用いて幹細胞を培養し分化誘導して製造される細胞構造物に含まれ得る中胚葉系細胞としては特に平滑筋細胞、カハール介在細胞が挙げられる。腸オルガノイドに中胚葉系細胞が存在することは、中胚葉系細胞マーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。中胚葉系細胞マーカーとしては、平滑筋細胞マーカーのα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、カハール介在細胞マーカーのＣＤ３４及びＣＫＩＴ（二重陽性の場合）が利用できる。また、初期内胚葉及び中胚葉のマーカーであるＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６又はＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）も、中胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。

本開示の細胞培養基材又はキットを用いて幹細胞を培養し分化誘導して製造される細胞構造物は、好ましくは、外表面の少なくとも一部に小腸上皮細胞を含む。この実施形態によれば、細胞構造物の外側にある物質を、外表面の小腸上皮細胞を介して内部に吸収することができるため好ましい。

＜９．小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法＞
本開示の細胞培養基材を用いて、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を製造することができる。この製造方法は、例えば、
上記の特徴を有する細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む。

細胞構造物の製造に用いる際、本開示の細胞培養基材は、幹細胞の細胞接着部への接着を促進する目的で、プレコート処理剤によりプレコート処理されていることが好ましい。プレコート処理剤の具体例は既述の通りである。プレコート処理を実施することにより、接着性の低い幹細胞の細胞接着部への接着を促進でき、細胞の接着培養及び分化誘導を効果的に実施できる。

幹細胞は、播種前に未分化性を維持した条件で培養することができる。このときの培養に用いる培地は、幹細胞を分化誘導させない培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳ細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ ＦＧＦを含む培地等が挙げられる。

細胞培養基材に播種された幹細胞を培養してその一部を小腸上皮細胞に分化させる工程は、幹細胞を増殖させ、分化誘導することができる培地中で行えばよく、培地は特に限定されない。例えば、具体例として特許文献３、非特許文献３で使用した培地や、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＲｅｐｒｏＦＦ（リプロセル社）などの市販の培地が挙げられる。また培地は、血清含有培地であってもよいし、血清に代替する性質を有する既知成分を含有した無血清培地であってもよい。

培地としては、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。培地には、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。例えば、０．１〜２％のピルビン酸、０．１〜２％の非必須アミノ酸、０．１〜２％のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１〜１％のグルタミン、０．１〜２％のβメルカプトエタノール、１ｍＭ〜２０ｍＭのＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）を添加してもよい。

細胞培養基材への幹細胞の播種密度は常法に従えばよく特に限定されるものではない。例えば、幹細胞を細胞培養基材に対し３×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度で播種することが好ましく、３×１０^４〜５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種することがより好ましく、３×１０^４〜２．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種することがさらに好ましい。

培養温度は、通常３７℃である。ＣＯ^２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ_２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。

幹細胞を細胞培養基材へ播種した後の培養期間は、細胞の初期播種密度や細胞接着部の形状、大きさによって差異が生じるが、２〜４週間程度であることが好ましい。本発明者らは、本明細書に記載の構造の細胞培養基材上で幹細胞を培養し分化誘導するとき、播種後２〜４週間で、分化誘導された小腸上皮細胞を含む細胞構造物が自然に浮遊して剥離し、回収できること、そしてこうして回収された細胞構造物の回収率は顕著に高いこと見出した。非特許文献３に記載の、円形の細胞接着部を有する基材上では３０日以上経過後に細胞構造物が剥離し、しかもその回収率が非常に低いことと比較して、本開示の方法は有利である。

また本開示の細胞培養基材上で幹細胞から分化誘導された細胞構造物は細胞培養基材から自然に浮遊して剥離するが、細胞構造物を破壊しない温和な酵素処理（例えばＡｃｃｕｔａｓｅやＴｒｙｐＬＥなど）やＥＤＴＡ処理、培地等の液体の吹きかけ、スクレーパーによる物理的な剥離等の各種手法を用いて、細胞培養基材からの細胞構造物の剥離を促進してもよい。

細胞構造物が細胞培養基材から剥離した後、更に浮遊培養を継続してもよい。浮遊培養の期間は限定されない。

以下、具体的な実験結果を参照して本開示を説明するが、本開示の範囲は実験結果の範囲には限定されない。

＜実施例１＞
（細胞培養基材の作製）
細胞培養基材として、ガラス基材上に形成された、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）の層が酸化分解されて形成された領域である、内径１８０μｍ、２８０μｍ又は３８０μｍ且つ幅６０μｍの環状パターンからなる細胞接着部（図１参照）と、前記細胞接着部の環状パターンの内側及び外側の、ガラス基材の表面がポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）で被覆された領域である細胞非接着部とを備える細胞培養基材を作製した。前記細胞培養基材は、複数個の、３００〜５００μｍ間隔で形成された前記環状パターンからなる細胞接着部を備える（図１参照）。以下の説明では、環状パターンからなる細胞接着部を「環状細胞接着部」と称する。

細胞培養基材は、上記の特許文献及び非特許文献に記載の手順により作製した。以下にその概要を説明する。

（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．４８ｇ、トリエチルアミン０．９７gを混合し、室温で１０分間攪拌した。このシラン溶液にＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を洗浄面が上向きとなるように浸漬した。室温で１６時間放置した後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。

（二段階目の反応）
５０ｇの平均分子量４００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）を攪拌しながら２５μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記の基板を浸漬し、８０℃で２０分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス表面に均一な親水性薄膜が形成された。

（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、複数個の、３００〜５００μｍ間隔で形成された上記寸法の環状細胞接着部に対応する形状の開口部が形成され、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチサイズのものを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。このフォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ^２の水銀ランプで５０秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、細胞接着基板として使用した。細胞培養に使用する前に、細胞培養基材に対しＥＯＧ滅菌処理を２２時間施した。

前記細胞培養基材を、３．５ｃｍペトリディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の底面上に設置し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１／１００希釈したビトロネクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と室温で３０分間以上接触させてコーティングした後に、ＰＢＳで３回洗浄してから使用した。
こうして得られた細胞培養基材は図１（Ｂ）に示すような断面構造を有する。

（培養）
国立研究開発法人国立成育医療研究センターは、月経血から取得した細胞に山中４因子をセンダイウイルスベクターによって一過的に発現させて、ヒトｉＰＳ細胞株であるＥｄｏｍ ｉＰＳ細胞を樹立している（PLoS Genet. 2011 May; 7(5): e1002085. Published online 2011 May 26. doi: 10.1371/journal.pgen.1002085PMCID: PMC3102737）。Ｅｄｏｍ ｉＰＳ細胞を、ビトロネクチンコートした細胞培養用ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中でＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社）を用いてあらかじめ増殖させた。増殖した細胞を、ＰＢＳで１／１０００に希釈したＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて３７℃で１０分間処理することにより前記ディッシュから剥離し、前記細胞培養基材に１×１０^６個播種し培養した。培地として、非特許文献３記載のＸＦ ｈＥＳＣ培地を用いた。播種当日は前記培地にＹ２７６３２を含ませたが、翌日培地交換しＹ２７６３２を含まない前記培地で維持した。４日目以降、培地交換を３〜４日に１回行った。培養中、細胞培養基材から自然剥離した組織を回収し、別のペトリディッシュ内で同じ培地で浮遊培養させて維持した。

図２に、内径の異なる環状細胞接着部を有する各細胞培養基材を用いて培養したときの培養１日目、６日目、１１日目、１８日目の培養物の観察像を示す。培養１日目の写真は他の物と比較して拡大倍率が高い。先に環状細胞接着部で細胞が増殖し、続いて、環状細胞接着部で囲われた内側の細胞非接着部が増殖した細胞により被覆される様子が観察された。

図３に、培養３週の培養物の観察像を示す。図３に示す観察像は、各細胞培養基材上での培養により、袋状構造を有する組織が高い割合で形成されたことを示す。

この培養の結果、袋状構造を有する組織が培養開始後２〜３週間で表面から自然剥離し回収できることが示された。図４に、内径３８０μｍの環状細胞接着部を有する基材上で形成され剥離した袋状構造を有する組織の観察像（左がディッシュ全体の写真、右が組織の観察像）を示す。図４の左の写真において、ディッシュに見える白い点状の物が、袋状構造を有する組織である。図４の右の写真は、本実施例で得た袋状構造を有する組織の顕微鏡による観察像である。本実施例で得た袋状構造を有する組織の観察像は、ｉＰＳ細胞を類似した培地中で培養して得た、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載の、腸機能を有する袋状の組織（腸オルガノイド）の観察像と類似していること及び後述する実施例４、実施例５の結果から、本実施例で得た袋状構造を有する組織もまた、腸オルガノイドであることが分かる。

細胞培養基材上の環状細胞接着部の数に対する、回収された袋状構造を有する組織の割合（以下「組織回収率」と称することがある）は８０％以上であり、高収率であった。

＜比較例１〜３＞
比較例１として、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載されている、ポリエチレングリコール層で被覆された領域である細胞非接着部と、ポリエチレングリコール層が酸化分解されて形成された直径１５００μｍの円形の複数の細胞接着部とが形成された細胞培養基材を用意した。

比較例２として、複数の円形の細胞接着部の各々の直径が２８２μｍである点を除いて比較例１と同じ構造の細胞培養基材を用意した。

比較例１及び比較例２の細胞培養基材の製造方法は、実施例１の細胞培養基材の製造方法と同様であり、フォトマスクの開口部の形状を細胞接着部に応じて適宜変更すればよい。

比較例３として接着パターンが作られていないガラス基材を用意した。

比較例１〜３の各基材上で、実施例１と同様の条件で、Ｅｄｏｍ ｉＰＳ細胞の播種及び培養を行った。

図５に、比較例１、比較例２、比較例３の各基材上での培養開始後３週間の培養物の顕微鏡観察像を示す。

比較例１では、袋状構造を有する組織の表面からの剥離開始が、培養開始後３〜４週間で観察され、組織回収率は４〜５％であった。前記実施例１と比較し比較例１では剥離までの培養期間が長く、組織回収率が低かった。

比較例２では、培養開始後２〜３週間で袋状構造を有する組織が得られたが、観察像が暗い細胞凝集塊が多く得られた。袋状構造を有する組織の組織回収率は１０％以下であった。また、図５の「比較例２」にて矢印で示す組織のように、隣接する複数の円形パターンでの培養物が融合して形成される、寸法の大きな袋状構造を有する組織が形成されることもあった。

比較例３では、小さな袋状構造が１〜２個程度得られる場合もあったが、袋状構造を有する組織が形成されるまでに基材の表面全体での細胞増殖が必要であり培養に１ヶ月以上の時間を要し、形成される袋状構造を有する組織の数は、実施例１での場合と比較して著しく少なかった。なお細胞接着部のパターンの数が定められていないため、この場合では組織回収率の計算はできていない。

以上の結果は、実施例１のように、環状パターンからなる細胞接着部を複数備えた基材でのｉＰＳ細胞の培養により、袋状構造を有する組織を、短い培養期間で得ることができ、且つ、組織向上率が顕著に高いことを示す。

＜実施例２＞
実施例１でのパターン培養の経過観察を行うため、下記のタイムラプス観察を実施した。
実施例１で用いた内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を複数備えた細胞培養基材を、ディッシュの底面上に固定した器材を作製した、この器材を用いて、実施例１と同様の条件で、Ｅｄｏｍ ｉＰＳ細胞の播種及び培養を行った。

培養４日目から２１日目まで１２時間おきにＢｉｏＳｔａｔｉｏｎ（ニコン社）を用いて撮影を行った。撮影作業は添付のマニュアルに従い、培地交換は２〜３日に１回行った。

図６に、培養４日目、９日目、１３日目、２０日目の各時点での１つの環状細胞接着部周辺の細胞の観察像を示す。これより、細胞はまず環状パターン上で増殖及び積層し、その後、培養２１日目までに袋状構造を形成することが確認された。

＜実施例３＞
他の細胞種を用いて袋状構造を有する組織の形成を試みた。
ヒトＥＳ細胞のＳＥＥＳ２細胞株を、実施例１と同じ内径１８０μｍ、２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備えた細胞培養基材を用いて培養した。まず、１／１０００で希釈したｒｈＬＩＦ（和光純薬工業社）を添加したＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社）を用い、ビトロネクチンコートした細胞培養用ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中で増殖培養した。増殖培養した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を３７℃５分間処理することで剥離処理して回収し、前記基材に播種し、実施例１と同様の手順で培養した。

図７に、各細胞培養基材を用いた培養の１日目及び７日目の観察像と、内径２８０μｍの環状細胞接着部を有する細胞培養基材を用いた培養で培養３週間後に回収された袋状構造を有する組織の観察像を示す。袋状構造を有する組織の観察像、及び、組織回収率はｉＰＳ細胞を用いた実施例１と同様であった。

この結果は、環状細胞接着部を含む細胞培養基材上での幹細胞の培養により袋状構造を有する組織が効率良く作成することができること、並びに、このような組織の形成は、ＥＳ細胞を用いた場合でも実施例１のようにｉＰＳ細胞を用いた場合と同様に生じ、多能性幹細胞の種類を問わないことを示す。

＜実施例４＞
実施例１での培養過程を検討するために、実施例１と同じ内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で細胞培養を行い、マーカーの発現を免疫染色により調べた。

内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材及び細胞培養の条件は実施例１に記載の通りである。

培養４日目、培養７日目または培養１２〜１４日目の組織を含む細胞培養基材を４％パラホルムアルデヒド（和光純薬社）により室温で２０分間固定した後にＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢＳにより室温で３０分間ブロッキング操作を行った後に、前記基材を、マウスＩｇＧ１標識抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７抗体（Ａｂｃａｍ社 希釈率１／５００）、マウスＩｇＧ３ｂ標識抗Ｏｃｔ３／４抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社 希釈率１／２００）、ウサギＩｇＧ標識抗Ｋｉ６７抗体（Ａｂｃａｍ社 希釈率１／５００）又はウサギＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体（Ａｂｃａｍ社 希釈率１／１０００）と室温で１時間インキュベートした。インキュベート後の前記基材をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社 希釈率１／１０００）またはＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社 希釈率１／１０００）と室温で３０分インキュベートした。インキュベート後の前記基材を更にＰＢＳで３回洗浄し、次いで、前記基材上の細胞の細胞核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社 希釈率１／１０００）により室温で１０分間染色させた後に封入し、共焦点顕微鏡で観察した。なお抗体の種類に関しては適切に取捨選択を行った。

図８に、培養４日目の観察像を示す。これより培養４日目の段階で、環状細胞接着部上に、Ｋｉ６７陽性且つＯｃｔ３／４陽性な、増殖能を有する未分化細胞が存在しており、凝集部が形成され得ることが示唆された。

図９に、培養７日目の観察像を示す。図９の上段の観察像は、主に内部に多分化能を有するＯｃｔ３／４陽性の未分化細胞が存在し、外周部にＣＤＸ２陽性細胞が存在する組織が形成されたことを示す。図９の下段の観察像は、前記ＣＤＸ２陽性細胞は、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７陽性の栄養外胚葉細胞であったことを示す。

以上の結果より、実施例１の環状細胞接着部を有する細胞培養基材上で多能性幹細胞を培養し形成される組織において、外周部の細胞が特に密な凝集部を形成する部分は栄養外胚葉細胞からなっており、その後増殖により未分化細胞が内部に浸潤していることが示唆された。

＜実施例５＞
実施例１において、内径２８０μｍ又は内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養し、培養開始後３〜４週間で自然に剥離した組織を回収し、別のディッシュ内で培養開始後６週間まで浮遊培養して得られた袋状構造を有する組織について、組織中の腸細胞及び三胚葉由来細胞の有無を検討するために免疫染色による評価を行った。

ｉＰＧｅｌｌ（ＧｅｎｏＳｔａｆｆ社）および４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬工業社）を用いて組織を製品添付のプロトコールに従い１晩固定した。固定した組織をパラフィン包埋した後に厚さ４〜６μｍの組織切片を作製した。Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載された方法で抗体染色を行った。抗体染色の方法は下記の通りである。

前記組織切片を、ウサギＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体（Ａｂｃａｍ社；希釈率１／１０００）及びマウスＩｇＧ標識抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；希釈率１／２００）、又はマウスＩｇＧ標識抗Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ社；希釈率１／５００）、又はウサギＩｇＧ標識抗ＰＧＰ９．５抗体（ＤＡＫＯ社；希釈率１／２００）と４℃で１晩インキュベートすることで１次抗体染色を行った。１次抗体染色後の前記組織切片を、ＰＢＳで５分３回洗浄した後にＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体及びＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（共にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社；希釈率１／１０００）と室温で１時間インキュベートすることで２次抗体染色を行った。２次抗体染色後の前記組織切片をＰＢＳで５分３回洗浄した後に細胞核を（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ社；希釈率１／１０００）で染色し、封入した。

図１０に、実施例１において内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で培養し形成された組織の、抗ＣＤＸ２抗体、抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。図１０に示す結果は、実施例１で形成された組織が、細胞核がＣＤＸ２陽性かつ上皮がＶｉｌｌｉｎ陽性な、絨毛層を有する腸管上皮組織を含むことを示す。図１１に、実施例１において内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で培養し形成された組織の、抗平滑筋アクチン（Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）抗体、抗ＰＧＰ９．５抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。図１１に示す結果は、実施例１で形成された組織が、内胚葉由来の腸管上皮組織に加えて、中胚葉由来の平滑筋アクチン陽性な筋組織や、外胚葉由来のＰＧＰ９．５陽性な神経線維様組織を有することを示す。図１０及び図１１に示す結果は、実施例１で形成された組織が、三胚葉由来組織を含むことを示す。

＜実施例６＞
環状細胞接着部の適切なサイズ及び接着部の幅を検討するために下記の解析を行った。 内径と幅が異なる環状細胞接着部を備える細胞培養基材を、実施例１と同じ方法で作製し、実施例１と同じ方法でＥｄｏｍ ｉＰＳ細胞の培養を行い、目視による評価で袋状構造を有する組織の出来具合により＋＋（袋状構造を有する組織が効率良く得られている）、＋（袋状構造を有する組織の分化は起きているが剥離が多い、或いは、組織の生成が比較例１と同等で遅い）、−（培養過程での細胞剥離や細胞増殖による被覆ができない等の理由で組織が得られない）の３段階に分類した。

代表的な例の観察像を図１２に示す。図１２は、各寸法の環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養１８日目の観察像である。評価が「＋＋」の場合（左列）は、３週間以内に袋状構造を有する組織が剥離して回収できた。

結果を図１３に示す。なお図１３には、実施例１での解析結果内容も含まれている。この結果は、環状細胞接着部の内径は好ましくは１８０〜８８０μｍ、より好ましくは１８０〜６００μｍであることを示し、環状細胞接着部の幅は好ましくは３０〜４００μｍの範囲であり、より好ましくは４０〜４００μｍの範囲であり、特に好ましくは６０〜３００μｍであることを示す。

内径５８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養により得られた袋状構造を有する組織の観察像を図１４に示す。

＜実施例７＞
細胞接着部の形状に関して下記の検討を行った。
検討した実施例の細胞培養基材における細胞接着部の形状は図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄの通りである。
（１５Ａ）内寸が一辺２８０μｍ〜３００μｍの正方形で、幅５０〜６０μｍの細胞接着部
（１５Ｂ）内径２８０μｍ、幅６０μｍの環状で、周方向の１／８が欠落している、細胞接着部
（１５Ｃ）内寸が長辺６００μｍ、短辺３００μｍの長方形で、幅５０μｍの細胞接着部
（１５Ｄ）内寸が一辺６００μｍの正方形で、幅５０μｍの細胞接着部
細胞培養基材の製造方法及び細胞培養方法は実施例１に記載の通りである。

前記（１５Ａ）〜（１５Ｄ）の形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いてＥｄｏｍ ｉＰＳ細胞を培養した培養物の観察像を図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄにそれぞれ示す。いずれの形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いた場合も、他の実施例と同様に短期間で袋状構造を有する組織が得られた。また（１５Ｂ）の、周方向の１／８が欠落した環状の細胞接着部であっても、欠落した部分が増殖した細胞に被覆されるため、全周に亘り完全な環状の細胞接着部と同様に、袋状構造を有する組織が形成された。

以上の結果より、細胞接着部の形状には特に制限は無く、必ずしも円形である必要はないことが分かる。また、培養によって閉鎖系になればよく、必ずしも初期パターンが閉鎖パターンでなくても良い。さらに細胞非接着部を囲う長方形の形状の細胞接着部でも同様に腸構造物が得られたことから、細胞接着部で囲われる細胞非接着部は、縦横の長さが等しくなくても良く、細胞接着部で囲われる細胞非接着部が例えば楕円や半円形状であってもよいことが示唆された。

＜比較例＞
細胞培養基材における細胞接着部の形状について以下の検討を行った。
比較例４の細胞培養基材として、図１７Ａに示す、細胞非接着領域１０１と、細胞非接着領域１０１中に２００μｍの間隔で並行に配置された幅３０〜５０μｍの直線状の複数の細胞接着領域１０２とを備える表面を有する細胞培養基材１００を用いた。

比較例５の細胞培養基材として、図１７Ｂに示す、細胞非接着領域１０１’と、細胞非接着領域１０１’中に配置された幅５０μｍで内径６００μｍの環の周方向の過半が欠落している弧形状の複数の細胞接着領域１０２’とを備える表面を有する細胞培養基材１００’を用いた。

比較例４の細胞培養基材１００及び比較例５の細胞培養基材１００’の製造方法は実施例１に記載の通りである。

比較例４の細胞培養基材１００及び比較例５の細胞培養基材１００’上で、実施例１と同様の条件で細胞培養を行った。

図１７Ｃに、比較例４の細胞培養基材１００上での細胞培養の１日目と２０日目の写真を示す。図１７Ｃの２０日目の上段の写真のように、隣接する一対の細胞接着領域１０２に接着して形成された組織が融合して１つの袋状の細胞構造物を形成する場合や、１つの細胞接着領域１０２に接着して形成された組織が単独で１つの袋状の細胞構造物を形成する場合があった。しかし、多くの場合は、図１７Ｃの２０日目の中段又は下段の写真のように、比較例４の細胞培養基材１００上では袋状の細胞構造物は形成されなかった。

図１７Ｄに、比較例５の細胞培養基材１００’上での細胞培養の１日目と２０日目の写真を示す。図１７Ｄの２０日目の写真のように、比較例５の細胞培養基材１００’上では袋状の細胞構造物は形成されなかった。比較例５の細胞培養基材１００’では、弧形状の細胞接着領域１０２’上に接着し増殖した組織は閉じた細胞構造物を形成することができなかったのに対し、図１５Ｂに示す、細胞非接着部の中央部２１を断続的に囲う細胞接着部２２を備える細胞培養基材１上では、細胞接着部２２に接着し増殖した組織は、細胞接着部２２が欠落した部分を跨ぐように閉じた細胞構造物を形成することができた。すなわち細胞非接着部である中央部の周囲を囲うように細胞接着部が配置されており、前記中央部の周囲に目的の細胞凝集体が形成できる構造の細胞培養基材であれば、袋構造物を得る目的は達成することができると言える。

＜実施例８＞
実施例１では細胞非接着部をポリエチレングリコールの被覆により形成した。本実施例では、ポリエチレングリコールの代わりに他の化合物を用いて同様の効果が得られるかを検討した。そこで、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの複数の環状細胞接着部を備える細胞培養基材を以下の方法で作製した。

基材としてガラス（１７０μｍ厚）を１２５ｍｍ四方に切り出し、前洗浄としてアルカリ洗浄液であるパーケム（パーカーコーポレーション社、ＰＫ−ＬＣＧ２３）で４８時間以上浸漬し、純水でリンスした。その後、窒素雰囲気中で真空紫外線（１７２ｎｍ）を６分照射した。次に、環状パターンの形成プロセスとして、前記洗浄したガラス基材上に感光性ドライフィルムレジスト（ニチゴー・モートン社、ＮＩＴ９１５）を１００℃のホットプレー上でラミネートし、５分間加熱保持した。その後、上記寸法の環状パターンと同寸法の開口を有するフォトマスクを介してＵＶ光（ブロードバンド）を２００ｍＪ照射した。炭酸ナトリウム水溶液で２分処理することによりレジストでのパターンを形成し、１００℃で５分のベーク後に１８０℃５分のステップベークを行った。この状態で、１５ｍｍ×２５ｍｍ四方に切り出し、別途９９．５％エタノールに０．５ｗｔ％Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標、日油株式会社）を溶解させた溶液を準備し、これを、切り出した前記基材上に２００μｌ程度キャストコートにより被覆した。一日間の自然乾燥後、ＡＺリムーバー１００（東京応化社）中に５分間超音波を印加した状態で前記基材を浸漬し、レジストを除去後、リンスを行った。最後に、ＥＯＧ滅菌処理を２２時間行った。こうして、ガラス基材の表面が露出した内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの複数の環状細胞接着部と、環状細胞接着部の内側及び外側の、ガラス基材の表面がＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）で被覆された細胞非接着部とを有する基材を得た。この実施例での細胞培養基材は実施例１と同様に図１（Ｂ）に示すような断面構造を有する。

前記基材を実施例１と同じく１５ｍｍ×２５ｍｍサイズに切断しｉＰＳ細胞を播種して検討した。

なお、前記基材上の細胞非接着部を形成するＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）の被膜の膜厚を段差計で測定したところ、平均２８８ｎｍであった。

図１８に各基材上での培養物の培養１日目、７日目、１１日目の観察像を示す。なお培養１日目と７日目の観察像の拡大倍率は、培養１１日目の観察像よりも高倍率である。図１９に、３週間培養した後に得られた袋状構造を有する組織を示す。

実施例１等では、細胞接着を抑制する化合物であるポリエチレングリコールにより基材表面を被覆して細胞非接着部とした。本実験の結果は、細胞接着を抑制する化合物として、ポリエチレングリコール以外の物質を用いた場合でも、ポリエチレングリコールと同様に細胞非接着部を形成することができることを示す。

＜実施例９＞
実施例６で用いた内径６００μｍ又は８００μｍ、幅１００μｍ又は２００ｍの計４種類の寸法の環状細胞接着部を複数備えた細胞培養基材を実施例１と同じ方法で作製し用意した。これらの４種の実施例の細胞培養基材のそれぞれを、５ｃｍ四方の正方形に切り出し、直径１０ｃｍの円形の細胞培養用ディッシュ内に設置した。

比較例として、比較例１の、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を複数備えた細胞培養基材を用意し、同様に、５ｃｍ四方の正方形に切り出し、直径１０ｃｍの円形の細胞培養用ディッシュ内に設置した。

培養する細胞として、ヒトＴ細胞より樹立されたｉＰＳ細胞（ケー・エー・シー社）、及び、ヒト線維芽細胞より樹立されたｉＰＳ細胞（日本ジェネティックス社）を用いた。

上記の細胞を、上記の各細胞培養基材が設置された細胞培養用ディッシュに、１×１０^７個播種し、実施例１に記載の条件で培養を行った。

培養６０日目における袋状構造物の組織回収率は、細胞として上記のどちらの細胞を用いた場合でも、比較例の細胞培養基材上での培養では０．１％であったのに対して、４種の実施例の細胞培養基材上での培養では１．０％以上であり、後者で収率の向上が確認された。

図２０の「実施例」の写真は、ヒト線維芽細胞より樹立されたｉＰＳ細胞（日本ジェネティックス社）を、内径６００μｍ、幅１００μｍの寸法の環状細胞接着部を複数備えた細胞培養基材上で培養して形成された袋状の細胞構造物の代表的な写真である。図２０の「比較例」の写真は、同細胞を、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を複数備えた比較例１の細胞培養基材上で培養して形成された袋状の細胞構造物の代表的な写真である。なお図２０に示す各写真は共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）により撮影した。

以上の結果より異なる細胞種を培養する場合でも、既存の円形の細胞接着部を有する細胞培養基材上での培養と比較して、本開示の環状の細胞接着部を有する細胞培養基材上での培養では、袋状の細胞構造物を高い組織回収率で得ることができた。なお実施例１等と比較して本実施例での組織回収率は低い傾向であるが、比較例での組織回収率も低いことから、本実施例での組織回収率の低さは、細胞の分化誘導の性質に起因すると考えられる。

＜実施例１０＞
細胞接着部の形状が異なる細胞培養基材上で癌細胞を培養し、袋状の細胞構造物（嚢胞組織）を誘導した実験結果を以下に示す。
細胞培養基材として、細胞接着部が以下の形状を有する細胞培養基材を用いた。
（形状１）内径２８０μｍ、幅６０μｍの環状の細胞接着部（図１参照）
（形状２）内径２８０μｍ、幅６０μｍの環の周方向の１／２が欠落している半円弧形の細胞接着部（図２２参照）
（形状３）内寸が一辺２８０μｍの正方形で、幅６０μｍの細胞接着部（図１５Ａ参照）
（形状４）内径２８０μｍ、幅６０μｍの環の周方向の１／８が欠落しているＣ字形の細胞接着部（図１５Ｂ参照）

細胞培養基材の製造方法は実施例１に記載の通りである。

癌細胞として大腸上皮癌由来Ｃａｃｏ−２細胞を用いた。細胞培養は次の手順で行った。

Ｃａｃｏ−２細胞は１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）により直径１０ｃｍの細胞培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で増殖させた。８０％ほどコンフルエントに達した段階で０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（富士フイルム和光純薬工業社）で２分処理する事で細胞を剥離した。続いて、ガラス基材上に形状１〜４の細胞接着部を複数有する５ｃｍ四方の正方形の細胞培養基材を内底面上に設置した直径１０ｃｍの円形の細胞培養ディッシュに、剥離した細胞を実施例９と同じ細胞濃度で播種し、培養を行った。なお使用培地はＣａｃｏ−２細胞の増殖時に使用した培地と同じであり、前記細胞培養基材への細胞接着用のプレコートは実施していない。培地は２〜３日に１回全量交換し、１８日間細胞を維持して、袋状の細胞構造物の形成の有無を見た。

図２３に、上記の形状１の細胞接着部を有する細胞培養基材上でＣａｃｏ−２細胞を培養した培養１８日目の培養物の観察像を示す。

図２４に、上記の形状２の細胞接着部を有する細胞培養基材上でＣａｃｏ−２細胞を培養した培養１８日目の培養物の観察像を示す。

図２５に、上記の形状３の細胞接着部を有する細胞培養基材上でＣａｃｏ−２細胞を培養した培養１８日目の培養物の観察像を示す。

図２６に、上記の形状４の細胞接着部を有する細胞培養基材上でＣａｃｏ−２細胞を培養した培養１８日目の培養物の観察像を示す。

いずれの形状の細胞接着部を有する細胞培養基材を用いた場合も、Ｃａｃｏ−２細胞から袋状の細胞構造物を誘導することができた。

なお図示しないが、比較例１で記載した直径１５００μｍの円形の細胞接着部を複数備えた細胞培養基材を用いた以外は同様の条件で大腸上皮癌由来Ｃａｃｏ−２細胞を培養した場合は袋状の細胞構造物を得ることはできなかった。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (10)

1. 第１の細胞非接着部と、
   前記第１の細胞非接着部中に配置された細胞培養部と
   を含む表面を有する細胞培養基材であって、
   前記細胞培養部が、第２の細胞非接着部と、前記第２の細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は、１以上の中断部分を介して断続的に延在し、前記第２の細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
   前記第２の細胞非接着部中に細胞接着部が存在せず、
   前記１以上の中断部分の各々の長さが前記第２の細胞非接着部の全周の６分の１以下であり、且つ、前記１以上の中断部分の合計の長さが前記第２の細胞非接着部の全周の６分の１以下である、
   細胞培養基材。
2. 前記細胞接着部の内周上の前記第２の細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、請求項１に記載の細胞培養基材。
3. 前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記第２の細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
4. 前記第２の細胞非接着部が、親水性ポリマーを含む層により被覆された表面である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
5. 前記親水性ポリマーが、ポリアルキレングリコール及びリン脂質極性基を有する両性イオンポリマーから選択される１種以上の親水性ポリマーである、請求項４に記載の細胞培養基材。
6. 前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項５に記載の細胞培養基材。
7. 前記細胞培養基材が、支持基材として、ガラス基材を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養基材を含む、細胞を培養して袋状の細胞構造物を誘導するための、細胞培養用キット。
9. 培地及びプレコート処理剤から選択される１種以上を更に含む、請求項８に記載のキット。
10. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養基材上に多能性幹細胞又は癌細胞を播種すること、並びに
    播種された前記多能性幹細胞又は前記癌細胞を培養して、袋状の細胞構造物を誘導することを含む、
    袋状の細胞構造物の製造方法。

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