WO2024053684A1 - フィーダー細胞、細胞シートおよびそれらの製造方法、ならびにフィーダー細胞を用いた細胞の維持または増殖方法 - Google Patents

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WO2024053684A1
WO2024053684A1 PCT/JP2023/032577 JP2023032577W WO2024053684A1 WO 2024053684 A1 WO2024053684 A1 WO 2024053684A1 JP 2023032577 W JP2023032577 W JP 2023032577W WO 2024053684 A1 WO2024053684 A1 WO 2024053684A1
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cells
cell
intestinal
feeder
culture
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Application number
PCT/JP2023/032577
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English (en)
French (fr)
Inventor
健一 守永
明弘 梅澤
Original Assignee
大日本印刷株式会社
国立研究開発法人国立成育医療研究センター
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present disclosure relates to feeder cells for maintaining or proliferating cells, cell sheets containing the feeder cells, and methods for producing them, and methods for maintaining or proliferating cells using the feeder cells.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells), and cells induced to differentiate from pluripotent stem cells have been studied in basic research. It is widely used in fields such as , regenerative medicine, and drug discovery.
  • the present disclosure provides feeder cells for two-dimensionally culturing and maintaining or proliferating cells such as intestinal epithelial cells, which are difficult to maintain and proliferate in two-dimensional culture, and feeder cells for maintaining or proliferating cells in two-dimensional culture.
  • the present invention provides a method for producing feeder cells.
  • the present disclosure also provides a cell sheet containing feeder cells as described above.
  • Embodiments of the present disclosure relate to the following [1] to [28].
  • a method for producing feeder cells for maintaining or proliferating cells comprising: (A) preparing an intestinal structure made from pluripotent stem cells and comprising endoderm-derived cells and mesoderm-derived cells; (B) culturing the intestinal structure to proliferate fibroblast-like cells derived from the intestinal structure; and (C) isolating the fibroblast-like cells to obtain feeder cells. ,Method.
  • the intestinal structure comprises: (a) preparing a cell culture substrate comprising a substrate, a plurality of isolated cell adhesion regions formed on the substrate and a cell non-adhesion region surrounding each of the cell adhesion regions; (b) seeding the pluripotent stem cells on the cell culture substrate; and (c) culturing the seeded pluripotent stem cells in a medium.
  • [4] The method according to [1] or [2], wherein in the step (B), the intestinal structure is cultured in a culture container, and at least a part of the intestinal structure is in contact with the culture container. .
  • [5] The method according to [2], wherein the culture period in step (c) is 60 days or more.
  • [6] A feeder cell produced by the method described in [1] or [2].
  • [7] Fibroblast-like cells that are positive for PDGFRA and CD81 and express Foxl1 and GREM1.
  • the fibroblast-like cell according to [7] which is positive for PDGFRA and CD81, negative for CD34, and expresses Foxl1 and GREM1.
  • the intestinal structure comprises: (a) preparing a cell culture substrate comprising a substrate, a plurality of isolated cell adhesion regions formed on the substrate and a cell non-adhesion region surrounding each of the cell adhesion regions; (b) seeding the pluripotent stem cells on the cell culture substrate; and (c) culturing the seeded pluripotent stem cells in a medium. Fibroblast-like cells according to [9].
  • the feeder cell according to [6] which is a feeder cell for maintaining or proliferating at least one type of cell selected from the group consisting of small intestinal intestinal epithelial cells, large intestinal intestinal epithelial cells, hepatocytes, and chondrocytes. Or the fibroblast-like cells described in [7].
  • a cell sheet comprising the feeder cell according to [6] or the fibroblast-like cell according to [7].
  • Co-culture comprising at least one type of cell selected from the group consisting of small intestine intestinal epithelial cells and hepatocytes and the feeder cell described in [6] or the fibroblast-like cell described in [7] thing.
  • the co-culture according to [16] wherein the cells are passaged three times or more.
  • a cell sheet comprising the co-culture according to [16].
  • the cell sheet according to [18] which has a circular or substantially circular shape with a diameter of 1 cm or more.
  • the cell sheet according to [18] comprising a layer of at least one type of cell selected from the group consisting of small intestine intestinal epithelial cells and hepatocytes.
  • the cell sheet according to [20] further comprising a layer of the feeder cells.
  • a transplant material comprising the cell sheet according to [15] or [18].
  • a method for maintaining or proliferating cells the method comprising the step of culturing the cells in the presence of the feeder cells according to [6] or the fibroblast-like cells according to [7]. .
  • [28] Expresses at least one gene selected from the group consisting of DCN, ACTA2 and NOG, and ADAMTS19, ANO1, BLID, LOC100507053, LHX8, SFRP4, AHRR, SLC14A1, FMO3, PZP, ABCG4, EYA2, Cells expressing the genes TMEM92-AS1, ANO10, EGFL6, SNCAIP, LGSN, PCDHB15 and KRTAP1-5.
  • feeder cells for two-dimensionally culturing and maintaining or proliferating cells such as intestinal epithelial cells, which are difficult to maintain and proliferate by two-dimensional culturing, and feeder cells for maintaining or proliferating cells in two-dimensional culture
  • a method for producing feeder cells can be provided.
  • a cell sheet containing feeder cells as described above can be provided.
  • the feeder cells described above have good feeder ability even after being passaged 10 times or more, they can be widely disseminated without being immortalized, and the culture system using the feeder cells is commonly used.
  • feeder cells can also be expected to play a role as a standard model of a culture system that is closer to the human organism than mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or immortalized feeder cells, which are used as feeder cells.
  • the feeder cells have adhesiveness to general culture surfaces, express CD90, and exist in the positional relationship where mesenchymal stem cells normally exist within the organoid, so they are a type of mesenchymal stem cell. It can be easily inferred that this is the case, and a therapeutic effect can be expected by transplanting the feeder cells.
  • FIG. 1 is a photograph of an intestinal structure produced by inducing differentiation of multifunctional stem cells, immunostained with antibodies (anti-Villin antibody and anti-5TH antibody) that serve as intestinal differentiation markers.
  • FIG. 2 is a photograph of a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells, immunostained with antibodies against markers of intestinal epithelial cells (CDX2 and Villin).
  • FIG. 3 is a photograph of a culture of intestinal epithelial cell-like cells derived from intestinal structures, immunostained with an antibody against an intestinal epithelial cell marker (CDX2).
  • CDX2 markers of intestinal epithelial cells
  • FIG. 4 is a photograph of a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells, immunostained with an antibody against an intestinal epithelial cell marker (CDX2).
  • FIG. 5 is a photograph of a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells, immunostained with an antibody against an intestinal epithelial cell marker (Villin).
  • FIG. 6 is a micrograph of a co-culture containing intestinal structure-derived fibroblast-like cells and primary human intestinal epithelial cells at passage number 2 and on day 5 of culture.
  • FIG. 7 is a micrograph of a co-culture containing intestinal structure-derived fibroblast-like cells and primary human intestinal epithelial cells at passage number 4 and on day 4 of culture.
  • FIG. 8 is a micrograph of a co-culture containing mouse embryonic fibroblasts (MEF) and human primary intestinal epithelial cells at passage number 2 and on day 5 of culture.
  • FIG. 9 is a micrograph of a co-culture containing mouse embryonic fibroblasts (MEF) and human primary intestinal epithelial cells at passage number 4 and on day 4 of culture.
  • FIG. 10 is a micrograph of a co-culture containing intestinal structure-derived fibroblast-like cells and hepatocytes on the 8th day after the start of culture.
  • FIG. 10 is a micrograph of a co-culture containing intestinal structure-derived fibroblast-like cells and hepatocytes on the 8th day after the start of culture.
  • FIG. 11 shows the results of analyzing gene expression in the intestinal tract and site-specific cells that constitute the intestinal tract in a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells.
  • FIG. 12-1 shows the results of analyzing gene expression in the intestinal tract and site-specific cells that constitute the intestinal tract in a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells.
  • Figure 12-2 shows the results of analyzing the gene expression of the WNT family, which is a variety of signal transduction proteins, in fibroblast-like cells derived from intestinal structures.
  • FIG. 13 shows the results of hierarchical clustering by comprehensive genetic analysis of co-cultures of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells.
  • FIG. 12-1 shows the results of analyzing gene expression in the intestinal tract and site-specific cells that constitute the intestinal tract in a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells.
  • FIG. 14 shows the measurement results of the barrier property (endothelial cell resistance value) of a cell sheet that is a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells.
  • FIG. 15 is a photograph of the expression of intestinal epithelial cell transporters in a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells.
  • FIG. 16 shows the results of analyzing gene expression of intestinal epithelial cell transporters and metabolic enzymes in a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells.
  • FIG. 17 is a photograph of a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells, immunostained with an antibody against a cell proliferation marker (Ki-67).
  • FIG. 18 is a photograph of a co-culture of intestinal structure-derived fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells stained with Alcian blue.
  • FIG. 19 is a graph showing the feeder ability of fibroblast-like cells derived from intestinal structures at each passage number.
  • FIG. 20 is a photograph of a co-culture of conventional feeder cells and intestinal epithelial cell-like cells, immunostained with antibodies against markers of intestinal epithelial cells (CDX2 and Villin).
  • FIG. 21 is a graph showing the expression of lubricin and COL2A1 in fibroblast-like cells derived from intestinal structures and chondrocytes collected from human children, respectively.
  • FIG. 22 is a photograph of fibroblast-like cells derived from intestinal structures being immunostained using antibodies against PDGFRA and CD81.
  • FIG. 23 shows the results of analyzing the expression of Foxl1, CD34, and GREM1 genes in fibroblast-like cells derived from intestinal structures.
  • FIG. 24 is a photograph of a cell sheet prepared using fibroblast-like cells derived from intestinal structures.
  • feeder cells refers to cells that are cultured (co-cultured) with cells of interest or cells prior to their differentiation in order to establish culture conditions that promote the maintenance and/or proliferation of the cells of interest. refers to a cell that is different from the target cell.
  • feeder cells may be seeded simultaneously with cells of interest or may be seeded before seeding of cells of interest. In one embodiment, feeder cells are seeded prior to seeding the cells of interest to form a layer of feeder cells (ie, a feeder layer).
  • the target cells and feeder cells may be cultured so that they are in contact with each other, or may be cultured so that they are not in contact with each other.
  • cells of interest and feeder cells are cultured such that at least a portion of the cells of interest and the feeder cells are in contact.
  • the growth of the feeder cells may be suppressed by known methods such as irradiation with radiation (eg, ⁇ rays) or treatment with antibiotics (eg, mitomycin C).
  • pluripotent stem cell refers to cells that have so-called pluripotency.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), somatic cell-derived ES cells (ntES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), adult tissues, umbilical cord blood, or stem cells derived from the umbilical cord. Can be mentioned.
  • fibroblast-like cells refers not only to so-called fibroblasts but also to cells with a flat or spindle-shaped shape that are differentiated fibroblasts, such as myofibroblasts. .
  • the origin of the fibroblast-like cells is not particularly limited, and for example, the fibroblast-like cells may be cells derived from the above-mentioned pluripotent stem cells or the intestinal structures described below.
  • fibroblast-like cells may be cells that exhibit a specific gene expression profile described below.
  • the term "fibroblast-like cells" in the present disclosure does not include the above-mentioned naturally occurring cells, but refers to naturally occurring cells or artificially obtained cells that have been artificially manipulated. These are cells obtained by adding the above, that is, artificially obtained cells (artificial cells).
  • feeder cells for maintaining cells such as intestinal epithelial cells that are difficult to maintain and proliferate by two-dimensional culture are provided. Also provided is a method for making a.
  • the feeder cells of the present disclosure can be produced by a method including the following steps (A) to (C) (hereinafter also referred to as "the production method of the present disclosure"): (A) preparing an intestinal structure made from pluripotent stem cells and comprising endoderm-derived cells and mesoderm-derived cells; (B) a step of culturing the intestinal structure to proliferate fibroblast-like cells derived from the intestinal structure; and (C) a step of isolating the fibroblast-like cells to obtain feeder cells.
  • steps (A) to (C) will be explained in detail below.
  • an intestinal structure containing endoderm-derived cells and mesoderm-derived cells is prepared from pluripotent stem cells.
  • the intestinal structure is a structure that includes endoderm-derived cells and mesoderm-derived cells and has at least one function equivalent to or similar to that of the intestine.
  • the intestinal structure is not particularly limited as long as it has the cell composition and function described above, and can be obtained, for example, by inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • the intestinal structure used in the production method of the present disclosure can be produced by a method including each of the following steps (a) to (c).
  • Step (a) includes a base material, a plurality of isolated cell adhesion regions (cell adhesive regions) formed on the base material, and a cell non-adhesion region (cell non-adhesion region) surrounding each of the cell adhesion regions. This is a step of preparing a cell culture substrate comprising a region).
  • cell adhesiveness refers to the strength of adhering cells, that is, the ease with which cells adhere. Therefore, “cell adhesion region” means a region where cell adhesion is relatively high, and “cell non-adhesion region” means a region where cell adhesion is relatively low. Specifically, cell adhesion refers to the extent to which cells adhere or spread due to the chemical and physical properties of the substrate (substrate surface), and cell adhesion areas with relatively high cell adhesion. Cell adhesion is likely to occur in the cell adhesion region where cell adhesion is relatively low.
  • cells when cells are seeded on a substrate patterned with cell adhesion areas and cell non-adhesion areas as described above, cells tend to adhere to the cell adhesion areas, while cells tend to adhere to the cell non-adhesion areas. Since the cells are difficult to coat, the seeded cells are arranged in a pattern on the substrate.
  • Cell adhesion can be determined using the cell adhesion extension rate when cells seeded on a substrate and arranged in a pattern are cultured. The higher the cell adhesion extension rate, the more efficiently cells can be cultured.
  • the cell adhesion extension rates of the cell adhesion region and the cell non-adhesion region are not particularly limited as long as the effects of the present disclosure can be achieved, but may be, for example, 60% or more and less than 60%, respectively.
  • the cell adhesion extension rate of the cell adhesion region is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more.
  • the cell adhesion extension rate in the cell non-adhesion region is preferably less than 40%, more preferably 5% or less, even more preferably 2% or less.
  • Cell adhesion extension rate is determined by seeding cells to be cultured on the surface to be measured at a seeding density of 4,000cm2 or more and less than 30,000 cells/ cm2 at a temperature of 37°C and a CO2 concentration of 5%. Percentage of cells that have adhered and spread after being stored in an incubator and cultured for 14.5 hours ( ⁇ (number of cells adhering to the surface to be measured)/(number of cells seeded to the surface to be measured) ⁇ 100(%)).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS FBS
  • the cell suspension is added onto the measurement target. This is done by slowly shaking the measurement object to which cells have been added to distribute the cells as uniformly as possible.
  • the cell adhesion extension rate is measured after removing cells that have not adhered to the measurement target by replacing the medium immediately before the measurement. In measuring the cell adhesion extension rate, areas where the density of cells tends to be specific (for example, the center of a given area where the density tends to be high, the periphery of a given area where the density tends to be low) are excluded. It is considered as a measurement point.
  • the base material used for producing the intestinal structure is not particularly limited as long as the effects of the present disclosure can be achieved.
  • the cell adhesion region is a base material in which at least a portion of polyethylene glycol immobilized on the base material is oxidized and/or decomposed.
  • a base material can be prepared by, for example, forming a thin film of polyethylene glycol (PEG) on the entire surface of the base material, and then subjecting the area where cell adhesion is desired to oxidation treatment and/or decomposition treatment to induce cell adhesion. It can be produced by forming a cell adhesion region by imparting properties. A portion that is not subjected to either oxidation treatment or decomposition treatment becomes a cell non-adhesion region in which PEG is immobilized.
  • PEG polyethylene glycol
  • the base material is not particularly limited as long as it is made of a material on which a PEG thin film can be formed.
  • Base materials include metals, glass, ceramics, inorganic materials such as silicone, elastomers, and plastics (e.g., polystyrene resin, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin). , polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin, etc.).
  • the shape of the base material is also not particularly limited, and examples include flat shapes such as a flat plate, flat membrane, film, and porous membrane, and three-dimensional shapes such as a cylinder, stamp, multiwell plate, and microchannel.
  • a film-like substrate is used.
  • the thickness of the film-like base material is not particularly limited, but is usually 0.1 to 1,000 ⁇ m, preferably 1 to 500 ⁇ m, and more preferably 10 to 200 ⁇ m.
  • Polyethylene glycol (PEG) contains at least an ethylene glycol chain (EG chain) consisting of one or more ethylene glycol units (-(CH 2 ) 2 -O-).
  • the polyethylene glycol chain may be linear or branched.
  • the ethylene glycol chain for example, has the following formula: -((CH 2 ) 2 -O) m - (m is an integer indicating the degree of polymerization) Refers to the structure represented by . m is not particularly limited as long as the effects of the present disclosure are achieved, but is preferably from 1 to 13, more preferably from 1 to 10.
  • PEG also includes ethylene glycol oligomers. Furthermore, PEG includes those into which a functional group has been introduced. Examples of the functional group include an epoxy group, a carboxyl group, an N-hydroxysuccinimide group, a carbodiimide group, an amino group, a glutaraldehyde group, and a (meth)acryloyl group. The functional group is preferably introduced at the end of the PEG chain, optionally via a linker. Examples of PEG into which a functional group is introduced include PEG (meth)acrylate, PEG di(meth)acrylate, and the like.
  • the average thickness of the PEG thin film formed on the substrate is not particularly limited, but is preferably 0.8 nm to 500 ⁇ m, more preferably 0.8 nm to 100 ⁇ m, even more preferably 1 nm to 10 ⁇ m, particularly preferably 1.5 nm. ⁇ 1 ⁇ m. Since the average thickness of the PEG thin film is 0.8 nm or more, protein adsorption and cell adhesion are less likely to be affected by areas on the surface of the base material that are not covered with the PEG thin film. On the other hand, since the average thickness is 500 ⁇ m or less, coating can be performed relatively easily.
  • the thickness of the PEG thin film is reduced, and it is possible to suppress the adhesion and extension of cells to areas other than the cell adhesion area. Furthermore, by setting the thickness of the PEG thin film to a certain level or less, factors necessary for cell survival contained in the culture solution can be distributed to cells close to the base material in the cell adhesion region.
  • Methods for forming a PEG thin film on a substrate include a method in which PEG is directly adsorbed onto the surface of the substrate, a method in which PEG is directly coated on the surface of the substrate, and a method in which PEG is coated on the surface of the substrate and then cross-linking treatment is performed.
  • the formation of the PEG thin film on the substrate is performed by forming an underlayer on the substrate and then coating the PEG.
  • the base layer on the surface of the base material can be formed, for example, by the method described in JP-A-2012-175983.
  • the underlayer on the surface of the substrate is a functional group that is capable of reacting with the PEG-terminated hydroxyl group or the introduced functional group to form a covalent bond, or is convertible to such a functional group. It can be formed by immobilizing a silane coupling agent having a functional group on the surface of a base material.
  • Examples of such functional groups include (meth)acryloyl group, (1H-imidazol-1-yl)carbonyl group, succinimidyloxycarbonyl group, glycidyl group, epoxy group, aldehyde group, amino group, and thiol group. , carboxyl group, azide group, cyano group, active ester group (1H-benzotriazol-1-yloxycarbonyl group, pentafluorophenyloxycarbonyl group, p-nitrophenyloxycarbonyl group, etc.), halogenated carbonyl group, isocyanate group, Examples include maleimide groups. Among these functional groups, preferred functional groups are (meth)acryloyl group, glycidyl group, and epoxy group.
  • the water contact angle on the surface of the base material to which the methacryloylsilane is added is typically 45° or more, preferably 47° or more, More preferably it is 48° or more, even more preferably 50° or more.
  • the water contact angle refers to the water contact angle measured at 23°C.
  • the density and cell adhesion of PEG immobilized on the substrate can be easily evaluated using the water contact angle on the surface of the substrate as an index. Specifically, the lower the water contact angle on the surface of the substrate, the higher the density of PEG present on the surface of the substrate, resulting in the formation of regions with low cell adhesion (i.e., cell non-adhesion regions). . That is, for example, when the water contact angle of the surface of the substrate after immobilizing PEG on the surface of the substrate is, for example, 48° or less, preferably 40° or less, more preferably 30° or less, the base material It is considered that PEG exists at a sufficient density on the surface of the material, and cell adhesion is sufficiently low.
  • the oxidation treatment of polyethylene glycol to form a cell adhesion region refers to a reaction in which an organic compound, that is, PEG, reacts with oxygen and the oxygen content becomes higher than before the reaction.
  • the decomposition treatment of polyethylene glycol for forming a cell adhesion region refers to a reaction in which bonds of an organic compound, that is, PEG are cleaved.
  • “Decomposition treatment” typically includes, but is not limited to, decomposition by oxidation, decomposition by ultraviolet irradiation, and the like. Note that when the "decomposition treatment” is decomposition accompanied by oxidation (that is, oxidative decomposition), the "decomposition treatment” and the “oxidation treatment” refer to the same treatment.
  • Decomposition due to ultraviolet irradiation refers to PEG absorbing ultraviolet rays and decomposing through an excited state. Note that when UV rays are irradiated into a system in which PEG and molecular species containing oxygen (e.g., oxygen, water, etc.) coexist, in addition to being absorbed by PEG and causing decomposition, molecular species containing oxygen are It may be activated and react with PEG. In this case, the latter reaction is classified as "oxidation”.
  • oxygen e.g., oxygen, water, etc.
  • oxidation and/or decomposition methods include a method of treating the PEG thin film with ultraviolet rays, a method of photocatalyst treatment, a method of treating it with an oxidizing agent, and the like. Partial oxidation and/or decomposition of the PEG thin film can be carried out using a mask or stamp such as a photomask or a stencil mask. Further, oxidation and/or decomposition can also be carried out by a direct writing method such as a method using a laser such as an ultraviolet laser.
  • a lamp that emits ultraviolet rays in the VUV to UV-C range as a light source, such as a mercury lamp that emits ultraviolet rays with a wavelength of 185 nm or 254 nm or an excimer lamp that emits ultraviolet rays with a wavelength of 172 nm.
  • a light source that emits ultraviolet rays with a wavelength of 365 nm or less, and it is more preferable to use a light source that emits ultraviolet rays with a wavelength of 254 nm or less.
  • the photocatalyst preferably used is a titanium oxide photocatalyst, a titanium oxide photocatalyst activated with metal ions or metal colloids, or the like.
  • an organic acid or an inorganic acid can be used without particular limitation, but since it is difficult to handle a highly concentrated acid, it is preferably used after diluting it to a concentration of 10% or less.
  • the optimal ultraviolet ray treatment time, photocatalyst treatment time, and oxidizing agent treatment time can be appropriately determined depending on various conditions such as the ultraviolet intensity of the light source used, the activity of the photocatalyst, and the oxidizing power and concentration of the oxidizing agent.
  • the amount of carbon in the cell adhesion region is equal to the amount of carbon in the cell non-adhesion region (including the underlayer, if present). It is preferable that it is relatively low. Specifically, the carbon content in the cell adhesion region is preferably 20 to 99% of the carbon content in the cell non-adhesion region. In addition, the value of the proportion (%) of carbon bonded to oxygen among the carbon in the cell adhesion region (including the base layer if it exists) is It is preferable that the value is smaller than the ratio (%) of carbon bonded to oxygen among the carbon in the carbon layer (including the underlayer in some cases).
  • the value of the proportion (%) of carbon bonded to oxygen among the carbon in the cell adhesion region is the same as the proportion (%) of carbon bonded to oxygen among the carbon in the cell non-adhesion region. It is preferably 35 to 99% of the value of .
  • the "carbon content” in the cell adhesion region is defined as “the carbon content determined from the analytical value of the C1s peak obtained using an
  • the "ratio” is defined as "the ratio of carbon bonded to oxygen determined from the analytical value of the C1s peak obtained using an X-ray photoelectron spectrometer.”
  • the area of each cell adhesion region is greater than 0.785 mm 2 , preferably 1.0 mm 2 or more, more preferably 1.2 mm 2 or more, even more preferably 1.5 mm 2 or more, and most preferably
  • the pattern is preferably formed in a range of 1.7 mm 2 or more, preferably 25 mm 2 or less, more preferably 15 mm 2 or less, still more preferably 10 mm 2 or less, and most preferably 5 mm 2 or less.
  • pluripotent stem cells By culturing pluripotent stem cells by adhering them to a cell adhesion area with an area larger than 0.785 mm2 , it is possible to culture the cells while adhering to them without detaching the cells, and it is possible to culture them while adhering them to the intestinal structure. Differentiation induction is promoted. Furthermore, by culturing pluripotent stem cells by adhering them to a cell adhesion region having an area of 25 mm 2 or less, differentiation into intestinal structures can be effectively induced.
  • each cell adhesion region is not particularly limited, but may be, for example, a polygon including a quadrangle, a circle, an ellipse, etc. Among these, a circular shape is preferred, and the diameter is larger than 1.0 mm, preferably 1.2 mm or more, more preferably 1.5 mm or more, preferably 6 mm or less, more preferably 4 mm or less, even more preferably 3 mm or less, and particularly preferably is preferably circular with a diameter of 2 mm or less.
  • a plurality of cell adhesion regions may have the same or different areas and/or shapes, but preferably have the same area and shape.
  • each cell adhesion region is surrounded by a cell non-adhesion region, that is, they are isolated from each other, and are preferably spaced apart from each other by 0.75 mm or more, more preferably 1.5 mm or more. . That is, the shortest distance between cell adhesion regions (in the case of circles, the distance between the centers of two circles is the sum of the respective radii plus the above value) is preferably 0.75 mm or more, more preferably 1 .5 mm or more.
  • the proportion of the cell adhesion area in the base material is usually 5 to 80%, preferably 20 to 70%, and more preferably 40 to 60%. Note that this ratio is the ratio of the cell adhesion area to the entire base material, excluding the bottom surface of the dish, even when the base material is placed in a dish (Petri dish) or the like.
  • each cell adhesion region is arranged regularly at a constant interval, for example, in a lattice shape, with the same pitch vertically and horizontally.
  • a photomask with multiple circular openings place the glass substrate on which a PEG thin film is formed and the photomask to face each other, and It can be formed by irradiating ultraviolet rays and oxidizing a region of the PEG thin film corresponding to the opening of the photomask.
  • the substrate used in the present disclosure is preferably precoated for the purpose of promoting adhesion of pluripotent stem cells to the cell adhesion region.
  • the precoating treatment can be performed by coating the substrate with an extracellular matrix (for example, collagen, fibronectin, proteoglycan, laminin, vitronectin, etc.), gelatin, lysine, peptide, a gel matrix containing these, serum, etc.
  • an extracellular matrix for example, collagen, fibronectin, proteoglycan, laminin, vitronectin, etc.
  • gelatin lysine, peptide
  • feeder cells are seeded and cultured for about 24 hours before seeding pluripotent stem cells, and pluripotent stem cells are cultured on the feeder cells. It is preferable to do so.
  • the feeder cells any feeder cells that are commonly used in the art can be used without particular limitation, and examples thereof include fibroblasts and the like.
  • the feeder cells have a density of less than 1.26 x 10 5 cells/cm 2 relative to the cell culture substrate, preferably a density of 6.3 x 10 4 cells/cm 2 or less, preferably 3.15 x 10 4 cells. Seed at a density of / cm2 or higher.
  • precoat treatment and feeder cell seeding may be performed individually or in combination.
  • pre-coating treatment or seeding of feeder cells is performed.
  • Step (b) is a step of seeding pluripotent stem cells onto the cell culture substrate prepared in step (a) above, which includes a cell adhesion region and a cell non-adhesion region.
  • pluripotent stem cells seeded on the cell culture substrate examples include embryonic stem cells (ES cells), somatic cell-derived ES cells (ntES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), adult tissue, or umbilical cord. Examples include stem cells derived from blood or umbilical cord. One type of these pluripotent stem cells may be used alone, or two or more types may be used in combination. In a preferred embodiment, ES cells and iPS cells are each used alone as the pluripotent stem cells.
  • the ES cells used in the present disclosure are preferably mammalian-derived ES cells, and for example, ES cells derived from rodents such as mice or primates such as humans may be used.
  • mouse or human-derived ES cells are used as the ES cells.
  • ES cells are stem cell lines produced from the inner cell mass of a part of an embryo at the blastocyst stage, which is an early stage of animal development, and are pluripotent and can theoretically differentiate into all tissues in vitro. can be multiplied almost indefinitely while maintaining As the ES cells, for example, cells into which a reporter gene has been introduced near the Pdx1 gene can be used to facilitate confirmation of the degree of differentiation.
  • the 129/Sv-derived ES cell line in which the LacZ gene has been integrated into the Pdx1 locus or the ES cell line SK7 having a GFP reporter transgene under the control of the Pdx1 promoter can be used.
  • the ES cell line PH3 having an mRFP1 reporter transgene under the control of the Hnf3 ⁇ endoderm-specific enhancer fragment and a GFP reporter transgene under the control of the Pdx1 promoter can be used.
  • the iPS cells used in the present disclosure are cells with pluripotency obtained by reprogramming somatic cells.
  • induced pluripotent stem cells there is a group led by Professor Shinya Yamanaka of Kyoto University, a group led by Rudolf Jaenisch of the Massachusetts Institute of Technology, a group led by James Thomson of the University of Wisconsin, and a group led by Harvard University.
  • Several groups have been successful, including Konrad Hochedlinger's group at the university.
  • International Publication No. WO 2007/069666 describes somatic cell nuclear reprogramming factors including gene products of Oct family genes, Klf family genes, and Myc family genes, as well as Oct family genes, Klf family genes, Sox family genes, and Myc family genes.
  • Nuclear reprogramming factors for somatic cells containing gene products of family genes have been described, and induced pluripotent stem cells are produced by nuclear reprogramming of somatic cells, which further includes a step of contacting the somatic cells with the above nuclear reprogramming factors. It describes how to do this.
  • somatic cells include all cells constituting a living body other than endogenous germ cells, and may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells.
  • the origin of somatic cells is not particularly limited and may be mammals, birds, fish, reptiles, or amphibians, but mammals (e.g., rodents such as mice, primates such as humans) are preferred, and particularly preferred. is mouse or human.
  • human somatic cells fetal, newborn or adult somatic cells can be used.
  • somatic cells include fibroblasts (e.g., skin fibroblasts), epithelial cells (e.g., gastric epithelial cells, liver epithelial cells, alveolar epithelial cells), endothelial cells (e.g., blood vessels, lymph vessels), nerve cells. (e.g. neurons, glial cells), pancreatic cells, blood cells, bone marrow cells, muscle cells (e.g. skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes), hepatocytes, non-hepatocytes, adipocytes, osteoblasts. , cells constituting periodontal tissues (for example, periodontal ligament cells, cementoblasts, gingival fibroblasts, osteoblasts), cells constituting kidneys, eyes, ears, etc.
  • epithelial cells e.g., gastric epithelial cells, liver epithelial cells, alveolar epithelial cells
  • endothelial cells e.g., blood vessels, lymph vessels
  • nerve cells
  • iPS cells have the ability to self-renew over a long period of time under predetermined culture conditions (for example, conditions for culturing ES cells), and can multidifferentiate into ectoderm, mesoderm, and endoderm under predetermined differentiation-inducing conditions.
  • predetermined culture conditions for example, conditions for culturing ES cells
  • stem cells that have the ability to
  • the iPS cells in the present disclosure may be stem cells that have the ability to form teratomas when transplanted into a test animal such as a mouse.
  • a reprogramming gene is a gene that encodes a reprogramming factor that has the effect of reprogramming somatic cells to become iPS cells.
  • Specific examples of combinations of reprogramming genes include, but are not limited to, the following combinations. (i) Oct gene, Klf gene, Sox gene, Myc gene (ii) Oct gene, Sox gene, NANOG gene, LIN28 gene (iii) Oct gene, Klf gene, Sox gene, Myc gene, hTERT gene, SV40 largeT gene ( iv) Oct gene, Klf gene, Sox gene
  • Pluripotent stem cells shall be maintained in undifferentiated state using a non-differentiation inducing medium before being seeded onto the cell culture substrate.
  • the medium Before and after seeding onto the surface of the cell culture substrate, the medium is switched to a differentiation-inducing medium, seeded onto the surface of the cell culture substrate, and the cells are allowed to proliferate within the cell adhesion region until they become confluent.
  • the desired differentiation-induced cells can be obtained by subjecting the obtained cell aggregate to enzyme treatment.
  • the non-differentiation-inducing medium used in the present disclosure is not particularly limited as long as it does not induce differentiation of pluripotent stem cells, but, for example, it may have the property of maintaining the undifferentiated nature of mouse ES cells and mouse iPS cells.
  • Examples include a medium containing the known leukemia inhibitory factor and a medium containing basic FGF, which is known to have the property of maintaining the undifferentiated state of human iPS cells.
  • the differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it is a medium that induces differentiation of pluripotent stem cells, but examples include a serum-containing medium, a serum-free medium containing known components that have the property of replacing serum, etc. can be mentioned.
  • MEM medium Depending on the type of cells used, MEM medium, BME medium, DMEM medium, DMEM-F12 medium, ⁇ MEM medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI1640 medium, etc. Can be used.
  • Various growth factors, antibiotics, amino acids, etc. may be added to the various media mentioned above.
  • 0.1-2% pyruvate, 0.1-2% non-essential amino acids, 0.1-2% penicillin/streptomycin, 0.1-1% glutamine, 0.1-2% ⁇ -mercaptoethanol, 1-20 mM of a ROCK inhibitor (eg, Y27632) may be added.
  • humoral factors may be added to the differentiation-inducing medium, according to the method for inducing differentiation of intestinal structures in the present disclosure, differentiation of intestinal structures can be induced without adding humoral factors. . Therefore, in one embodiment, cells are cultured using a differentiation-inducing medium that does not contain humoral factors.
  • the method of seeding pluripotent stem cells onto the cell culture substrate is not particularly limited, and can be seeded by a method commonly used for seeding cells.
  • the pluripotent stem cells are, for example, less than 1.2 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , preferably 3 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, preferably 1.5 ⁇ It is sown at a density of 10 4 pieces/cm 2 or more.
  • Step (c) is a step in which the pluripotent stem cells seeded on the cell culture substrate in step (b) described above are cultured in a medium to obtain an intestinal structure.
  • Pluripotent stem cells are usually cultured at 37°C.
  • the culture is performed in an atmosphere with a CO 2 concentration of about 5% using a CO 2 cell culture device or the like.
  • the medium used in this step (c) is not particularly limited as long as it is a medium that induces differentiation of pluripotent stem cells, and can be appropriately selected depending on the type of pluripotent stem cells.
  • Examples of the medium include MEM medium, BME medium, DMEM medium, DMEM-F12 medium, ⁇ MEM medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI1640 medium, and the like. Further, serum or a serum substitute may be added to these media as necessary.
  • the culture period after seeding the pluripotent stem cells onto the cell culture substrate is preferably 60 days or more, more preferably 80 days or more, even more preferably 100 days or more, and preferably 210 days or less, more preferably 140 days. It is as follows. 60 days after seeding pluripotent stem cells onto the cell culture substrate, intestinal differentiation markers Villin and 5TH were detected, a bag-like structure was observed, and peristaltic-like movements were observed. It has been found that The intestinal structure obtained by steps (a) to (c) contains at least endoderm-derived cells and mesoderm-derived cells, but may contain other cells.
  • an intestinal structure produced from pluripotent stem cells and containing endoderm-derived cells and mesoderm-derived cells can be obtained.
  • the obtained intestinal structure is subjected to step (B) described below.
  • step (B) the intestinal structure prepared in step (A) described above is cultured, and fibroblast-like cells derived from the intestinal structure are proliferated.
  • the culture form of the intestinal structure is not particularly limited as long as the effects of the present disclosure are achieved, but it may be a form in which cells are cultured by adhering to a culture vessel (so-called adhesive culture), or a form in which cells are cultured without adhering to a culture vessel. It may also be in the form of culturing cells (so-called suspension culture).
  • the intestinal structure is cultured with at least a portion of the intestinal structure in contact with the culture vessel.
  • the culture container and the intestinal structure may be in constant contact or may be intermittently in contact.
  • the intestinal structure is cultured in suspension in a culture container, and the relationship between the culture container (e.g., bottom surface, inner wall, etc.) and the intestinal structure is adjusted appropriately by adjusting the amount of medium added to the culture container. contact with at least a portion of the For example, when using a dish as a culture container, a culture medium is added to the dish shallowly, and the intestinal structure is cultured in suspension so that at least a portion of the intestinal structure comes into contact with the containment of the dish.
  • the culture container e.g., bottom surface, inner wall, etc.
  • the medium used in this step (B) is not particularly limited as long as it induces differentiation and proliferation of fibroblasts, and examples include MEM medium, BME medium, DMEM medium, DMEM-F12 medium, ⁇ MEM. Examples include medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI1640 medium, and the like. Furthermore, serum or a serum substitute may be added to these media as necessary.
  • Culturing of intestinal structures is usually carried out at 37°C.
  • the culture is performed in an atmosphere with a CO 2 concentration of about 5% using a CO 2 cell culture device or the like.
  • the intestinal structure is preferably cultured until the fibroblast-like cells derived from the intestinal structure become confluent or nearly confluent.
  • the culture period can be appropriately set depending on the growth rate of the fibroblast-like cells, the shape and size of the culture container used, etc.
  • the culture period of the intestinal structure can be, for example, 1 to 6 days, 6 to 12 days, 12 to 72 days, etc.
  • intestinal epithelial cell-like cells cells having intestinal epithelial cell-like properties
  • the intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structure obtained by this step (B) have different properties from the intestinal epithelial cells obtained by conventional organoid culture starting from stem cells.
  • the present inventors have shown that cell division-related protein Ki-67, which is a proliferative cell marker, is locally present in intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structure obtained by this step (B). ing.
  • intestinal epithelial cells are only generated by differentiation from stem cells positive for Lgr5 (Leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5), which are known as intestinal epithelial stem cells. It is generally known that epithelial cells do not proliferate. Therefore, the local presence of Ki-67, a proliferative cell marker, in the intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structure obtained by this step (B) as described above means that the intestinal epithelial cell-like cells This can be said to suggest that the cells divide to generate new intestinal epithelial cell-like cells.
  • Lgr5 Leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5
  • the intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structure obtained by this step (B) are considered to have unique properties in that they may proliferate independently of conventional Lgr5-positive stem cells.
  • the intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structure obtained in this step (B) include secretory cells confirmed by the expression of specific mucin substances and absorption cells confirmed by the expression of specific transporters.
  • Various types of cells responsible for the functions of the small intestine, such as epithelial cells can be obtained.
  • Fibroblast-like cells i.e., feeder cells of the present disclosure
  • intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structure obtained by this step (B) may be used in combination with each other, or each may be used alone. Good too.
  • step (C) fibroblast-like cells derived from the intestinal structures grown in step (B) described above, ie, feeder cells of the present disclosure, are isolated.
  • Fibroblast-like cells can be isolated by methods commonly used to isolate fibroblasts. That is, it can be carried out by known processes such as enzyme treatment and scraping with a scraper. These steps may be performed alone or in combination of two or more.
  • the fibroblast-like cells obtained by this step (C) express at least one fibroblast marker selected from the group consisting of vimentin and CD90. In a preferred embodiment, the fibroblast-like cells obtained by this step (C) express at least one gene selected from the group consisting of ACTA2, SOX9, and DCN.
  • intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structures are isolated.
  • intestinal epithelial cell-like cells derived from intestinal structures can be isolated according to the following procedure. First, a medium containing intestinal structures after fibroblast-like cells have been isolated as described above is made into an environment in which only intestinal epithelial cell-like cells can survive. For example, by adding antibiotics such as puromycin and penicillin to the culture medium at a concentration of 100 ⁇ g/ml, only intestinal epithelial cell-like cells that have the activity to metabolize those antibiotics (drug-metabolizing enzymes: CYP) survive. Create an environment where this is possible.
  • antibiotics such as puromycin and penicillin
  • Intestinal epithelial cell-like cells are then isolated by removing dead cells from the culture medium. Note that if hepatocytes are present in the culture medium, they may survive by adding antibiotics as described above, but hepatocytes can be easily identified under a microscope as a group of multinucleated cells. Intestinal epithelial cell-like cells can be isolated by removing hepatocytes under a microscope. Furthermore, since hepatocytes are not stained by immunostaining using antibodies against CDX2, intestinal epithelial cell-like cells can also be isolated by identifying and removing hepatocytes using such antibodies.
  • intestinal epithelial cell-like cells adhere to each other through strong cell-to-cell adhesion, if intestinal epithelial cell-like cells form a layered structure with other cells, use tweezers etc. to separate the intestinal epithelial cells. Similar cells can be detached and isolated from other cells.
  • the method for producing feeder cells of the present disclosure further includes a step (step (D)) of proliferating the fibroblast-like cells isolated in step (C). May include.
  • the fibroblast-like cells isolated in step (C) can be cultured by a method commonly used for culturing fibroblasts.
  • the medium used in this step (D) is not particularly limited as long as it is a medium for growing fibroblasts, and examples thereof include MEM medium, BME medium, DMEM medium, DMEM-F12 medium, ⁇ MEM medium, and IMDM medium. , ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI1640 medium and the like. Furthermore, serum or a serum substitute may be added to these media as necessary.
  • Fibroblast-like cells are usually cultured at 37°C.
  • the culture is performed in an atmosphere with a CO 2 concentration of about 5% using a CO 2 cell culture device or the like.
  • the fibroblast-like cells are preferably cultured until the fibroblast-like cells become confluent or nearly confluent.
  • the culture period can be appropriately set depending on the growth rate of the fibroblast-like cells, the shape and size of the culture container used, etc.
  • the culture period for fibroblast-like cells can be, for example, 3 to 7 days, 7 to 12 days, etc.
  • fibroblast-like cells are used to maintain cells such as intestinal epithelial cells that are difficult to maintain and proliferate by two-dimensional culture. cells
  • the feeder cells of the present disclosure exhibit a particular gene expression profile.
  • the feeder cells of the present disclosure are characterized in that they express platelet-derived growth factor receptor (PDGFRA), CD81, forkhead box L1 (Foxl1), and gremlin-1 (GREM1) genes. shall be.
  • the feeder cells of the present disclosure are characterized in that they express the PDGFRA, CD81, and GREM1 genes, but do not express the CD34 gene.
  • the feeder cells of the present disclosure are characterized in that they express the PDGFRA, CD81, Foxl1, and GREM1 genes, but do not express the CD34 gene.
  • cells such as intestinal epithelial cells, which are difficult to maintain and proliferate by two-dimensional culture, can be maintained or proliferated by two-dimensional culture. .
  • feeder cells for maintaining cells such as intestinal epithelial cells, which have traditionally been difficult to maintain and proliferate through two-dimensional culture, are progressing in mice.
  • feeder cells that can maintain cells such as intestinal epithelial cells alone (i.e., have complete feeder ability) have not been found so far.
  • maintenance of cells such as intestinal epithelial cells has been achieved.
  • typical feeder cells that have been discovered include mouse trophocytes and telocytes, but it is known that trophocytes express the PDGFRA, CD81, and CD34 genes, but do not express the Foxl1 gene. It is being Furthermore, it is known that Telocyte expresses the PDGFRA and Foxl1 genes, but does not express the CD81 and CD34 genes.
  • cells that express the PDGFRA, CD81, Foxl1, and GREM1 genes, and cells that express the PDGFRA, CD81, and GREM1 genes but do not express the CD34 gene have never been found in the first place.
  • the fact that such cells have excellent feeder ability for cells such as intestinal epithelial cells is a surprising discovery that was previously unknown.
  • the feeder cells of the present disclosure can be obtained by passing through steps (A) to (C) and optionally step (D) described above.
  • the feeder cells of the present disclosure can maintain or proliferate cells that have conventionally been difficult to maintain and proliferate by two-dimensionally culturing.
  • the feeder cells of the present disclosure exhibit feeder ability for target cells over a longer period of culture (for example, 10 or more passages) than conventional feeder cells.
  • target cells for which the feeder cells of the present disclosure are used (hereinafter also referred to as "target cells") are not particularly limited, but are said to be difficult to maintain and proliferate by two-dimensional culture as described above.
  • it is a cell. More specifically, it is preferable that the cells are likely to undergo rapid dedifferentiation due to stress caused by passage or culture period during two-dimensional culture.
  • target cells include small intestine intestinal epithelial cells, large intestine intestinal epithelial cells, hepatocytes, and chondrocytes.
  • the target cells are small intestine intestinal epithelial cells, hepatocytes.
  • the feeder cells of the present disclosure are feeder cells for maintaining or proliferating each cell as described above by two-dimensional culture (plane culture).
  • the feeder cells of the present disclosure maintain their properties as long as the target cells maintain their original properties even when the target cells are passaged many times (for example, three or more times) by two-dimensional culture. can be prevented from being lost and can be allowed to proliferate.
  • feeder cells and target cells are derived from the same individual (feeder cells are derived from pluripotent stem cells derived from a specific individual, and target cells are pluripotent stem cells derived from the same individual).
  • natural cells refer to cells that exist in an individual and have not been subjected to any artificial manipulation (i.e., "natural” cells), and specifically refer to cells in the small intestine collected from humans. Examples include epithelial cells, large intestine epithelial cells, hepatocytes, and chondrocytes.
  • the target cells are cells derived from pluripotent stem cells, preferably small intestinal intestinal epithelial cells, large intestinal intestinal epithelial cells, hepatocytes, and chondrocytes derived from pluripotent stem cells, and more preferably pluripotent stem cell-derived cells. These are small intestine intestinal epithelial cells and hepatocytes derived from sexual stem cells.
  • the target cells are intestinal epithelial cell-like cells harvested from the above-mentioned intestinal structures, particularly preferably the same as those prepared in step (A) to obtain the feeder cells of the present disclosure.
  • These are intestinal epithelial cell-like cells collected from the intestinal structures of.
  • the feeder cells and intestinal epithelial cell-like cells of the present disclosure are both derived from the same intestinal structure produced from the same multifunctional stem cells, which provides the following advantages.
  • the first advantage is that the feeder cells and the intestinal epithelial cell-like cells are derived from the same multifunctional stem cells, so the safety of each can be easily confirmed.
  • feeder cells and intestinal epithelial cell-like cells Before differentiating and inducing feeder cells and intestinal epithelial cell-like cells, the safety of the multifunctional stem cells from which they are derived is simply confirmed. The safety of epithelial cell-like cells can be confirmed. Furthermore, since the feeder cells and the intestinal epithelial cell-like cells are derived from the same multifunctional stem cells, components derived from a different species will not be introduced after differentiation and induction. Therefore, when using one or both of these cells after differentiation and induction, there is no problem of contamination with components derived from a different species, and the cells can be used as they are as so-called "xeno-free" cells, especially in medical applications.
  • the intestinal epithelial cell-like cells collected from the intestinal structure described above contain at least one marker of intestinal epithelial cells selected from the group consisting of CDX2, ECAD, ZO-1, and cytokeratin AE1/AE3. Express seeds.
  • the intestinal epithelial cell-like cells collected from the intestinal structure described above express at least one marker for intestinal epithelial cells selected from the group consisting of CDX2 and Villin.
  • the number of passages of the feeder cells used is not particularly limited, but for example, 2 or more times, 3 or more times, 5 or more times, 7 or more times, 10 or more times, The number of times may be 12 or more, 15 or more, etc.
  • the number of passages of the feeder cells used can be, for example, 20 times or less, 15 times or less, 12 times or less, etc.
  • the feeder cells of the present disclosure can also be cultured alone to proliferate only the feeder cells. Furthermore, by co-cultivating the feeder cells of the present disclosure and specific target cells, the feeder cells and target cells can be grown together.
  • a culture (cell population) containing the feeder cells of the present disclosure or a culture consisting of the feeder cells of the present disclosure can be obtained.
  • a culture having a two-dimensional shape e.g., sheet-like
  • a culture having a two-dimensional shape for example, sheet shape
  • the feeder cells of the present disclosure can maintain or proliferate target cells, particularly cells that are difficult to maintain and proliferate by two-dimensional culture, by two-dimensional culture. Therefore, by culturing target cells using the feeder cells of the present invention (that is, co-cultivating the feeder cells of the present disclosure and target cells), a two-dimensional culture containing the feeder cells of the present invention and target cells can be grown.
  • a co-culture having a shape (for example, sheet-like) or a co-culture having a two-dimensional shape (for example, sheet-like) consisting of the feeder cells of the present disclosure and target cells can be obtained.
  • the feeder cells of the present disclosure it is possible to two-dimensionally maintain or proliferate cells that are conventionally difficult to maintain and proliferate by two-dimensional culture.
  • it can be obtained as a co-culture having a two-dimensional shape (for example, sheet-like).
  • it can be obtained as a co-culture comprising a layer of feeder cells and a layer of target cells.
  • a culture containing or consisting of target cells can be obtained.
  • the feeder cells of the present disclosure are formed into a sheet, and target cells, which are difficult to maintain and proliferate through two-dimensional culture, are co-cultured and maintained or proliferated on the sheet. , by obtaining a two-dimensional (e.g., sheet-like) co-culture of target cells, and then separating and removing part or all of the feeder cells of the present disclosure from the obtained co-culture. It is possible to obtain a culture having a two-dimensional shape containing the target cells, or a culture having a two-dimensional shape comprising the target cells.
  • a culture having a two-dimensional shape containing the feeder cells of the present disclosure or a culture of the present disclosure It is also possible to obtain a two-dimensionally shaped culture consisting of feeder cells.
  • the target cells are intestinal epithelial cells that are difficult to maintain and proliferate in two-dimensional culture (e.g., small intestinal intestinal epithelial cells, large intestinal intestinal epithelial cells, etc.), hepatocytes, and chondrocytes. These cells are preferably intestinal epithelial cells.
  • Separation of the feeder cells of the present disclosure and target cells contained in the co-culture can be normally performed using a known method used in the field of cell culture.
  • intestinal epithelial cells are extracted from the co-culture using the method disclosed in WO 2019/131938. -like cells are isolated.
  • a co-culture of feeder cells and target cells of the present disclosure a co-culture containing target cells, and a co-culture containing feeder cells can all be used as a so-called cell sheet.
  • a cell sheet is a thin membrane made by culturing cells into a sheet, and has the advantages of being able to be transplanted into living tissue without using sutures and in a short time. Taking advantage of these properties, it is used in the treatment of various diseases and tissue regeneration. Therefore, in one embodiment, the cell sheet is used as a transplant material for disease treatment and tissue regeneration.
  • the feeder cells of the present disclosure can maintain or proliferate target cells by two-dimensional culture, it is possible to easily create a co-culture having a two-dimensional shape such as a cell sheet. . Furthermore, by appropriately setting the size, shape, culture time, etc. of the culture vessel in which the feeder cells and target cells of the present disclosure are co-cultured, a cell sheet having a desired size and two-dimensional shape can be produced. Conventionally, it has been difficult to maintain and proliferate cells such as intestinal epithelial cells by two-dimensional culture, so it is necessary to create co-cultures with two-dimensional shapes such as cell sheets that mainly contain these cells. It wasn't easy either.
  • a large cell sheet can be created without combining two cell sheets.
  • large shapes such as circular or oval shapes with a diameter of 1 cm or more, 2 cm or more, 3 cm or more, 5 cm or more, or 10 cm or more, or polygons (for example, squares, etc.) of similar size can be formed.
  • a single cell sheet can be produced without combining multiple cell sheets.
  • the ability to create large cell sheets without combining multiple cell sheets for cells that have conventionally been difficult to maintain and proliferate through two-dimensional culture is an excellent example of the excellent effects brought about by the feeder cells of the present disclosure. It can be said that it is one.
  • the disease state is determined based on the size (diameter) of the ulcer, and if the diameter is 2 cm or more, it is determined that healing is difficult. Therefore, it can be said that by efficiently producing such a huge cell sheet as a single cell sheet, it can greatly contribute to the treatment of Crohn's disease, etc., for which treatment using cell sheets is effective.
  • progenitor cells at a stage before differentiation into specific cells are created from pluripotent stem cells, etc., and after being grown in a two-dimensional culture using a growth medium, differentiation is promoted using a differentiation medium to produce functional cells.
  • methods for obtaining structures are known.
  • the target cells are cells that tend to undergo rapid dedifferentiation due to stress caused by passage or culture period during two-dimensional culture, dedifferentiation may occur during the differentiation promotion stage using the differentiation medium. , it is usually not possible to maintain the desired cell properties for a long period of time. That is, it is not possible to obtain a structure in which the desired cell properties are maintained over a long period of time.
  • the feeder cells of the present disclosure can also be suitably used in applications such as structures (eg, transplant materials, drug discovery tools, etc.) that require the maintenance of target cell properties over a long period of time.
  • the feeder cells of the present disclosure can be produced so as not to contain xenogeneic components (under so-called xeno-free conditions). Therefore, when used as a transplant material such as a cell sheet as described above, it is possible to eliminate the risk of xenogeneic components during transplantation. Furthermore, as shown in the Examples, primary intestinal epithelial cells collected from humans could be grown using the feeder cells of the present disclosure as a scaffold. It is speculated that it may contribute to autologous tissue regeneration.
  • the feeder cells of the present disclosure are thought to have various functions in addition to the functions as feeder cells as described above. Therefore, the uses of the feeder cells of the present disclosure are not limited to such uses as feeder cells, but can also be used for uses where a function different from that of a feeder cell is expected.
  • the feeder cells (fibroblast-like cells) of the present disclosure the feeder cells (fibroblast-like cells) and various cells such as small intestine intestinal epithelial cells, hepatocytes, etc.
  • Pharmaceutical compositions containing the culture are provided.
  • the pharmaceutical composition is one prepared from the feeder cells (fibroblast-like cells) and co-culture of the present disclosure as an oral or parenteral preparation according to a conventional method.
  • acceptable additives may be used in combination.
  • Acceptable additives for formulation include, for example, excipients, stabilizers, preservatives, wetting agents, emulsifiers, lubricants, sweeteners, colorants, flavors, buffers, antioxidants, pH Conditioners and the like can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition is an oral preparation
  • solid preparations such as tablets, powders, fine granules, granules, capsules, pills, sustained-release preparations, and liquid preparations such as solutions, suspensions, and emulsions
  • liquid preparations such as solutions, suspensions, and emulsions
  • the pharmaceutical composition is a parenteral preparation, it can take the form of an injection, a suppository, a sheet-like patch, a suspension for application, a spray, and the like.
  • the amount of the pharmaceutical composition to be administered (applied) is not particularly limited as long as the effects of the present disclosure are achieved, and can be adjusted as appropriate depending on the age, health condition, body weight, etc. of the subject to be administered (applied).
  • the feeder cells of the present disclosure are used in the form of a sheet-like patch to treat a mucosal ulcer in a subject, the patch is applied so as to completely cover the ulcer and surrounding areas. If the ulcer is large, a combination of patches may be applied so that the patch completely covers the ulcer and surrounding area.
  • feeder cells fibroblast-like cells
  • co-cultures are preferably ingested (administered) continuously over a long period of time, and the ingestion (administration) period is, for example, 1 ⁇ 6 weeks, 1 to 12 weeks, 2 to 10 weeks, 4 to 10 weeks, 4 to 12 weeks, etc.
  • ingestion administration
  • continuous means that the pharmaceutical composition is continuously ingested (administered) in a determined amount every day.
  • a method of treating a disease in a subject comprising ingesting (administering) to the subject an effective amount of feeder cells (fibroblast-like cells) or a co-culture.
  • the above methods may be non-therapeutic or therapeutic.
  • the dosage and intake (administration) period of feeder cells (fibroblast-like cells) or co-cultures are not particularly limited as long as the effects of the present disclosure are achieved, and are dependent on the type of disease and intake. (Administration) Can be adjusted as appropriate depending on the age, health condition, weight, etc. of the subject.
  • a method for treating a disease in a subject which includes applying the above-described cell sheet to the subject.
  • the above methods may be non-therapeutic or therapeutic.
  • the shape and size of the cell sheet are not particularly limited as long as the effects of the present disclosure are achieved, and the shape and size of the cell sheet are determined depending on the type of disease, the type of organ or tissue to which it is applied, and the part to which it is applied. It can be adjusted as appropriate depending on the shape, size, etc.
  • feeder cells fibroblast-like cells
  • co-cultures of the present disclosure for the manufacture of compositions for treating diseases.
  • diseases that can be treated using the feeder cells (fibroblast-like cells), co-cultures, and cell sheets of the present disclosure include, for example, gastrointestinal ulcers such as Crohn's disease and ulcerative colitis.
  • Diseases associated with gastrointestinal tract cancer complications associated with gastrointestinal surgery such as colon cancer surgery, etc.
  • a cell sheet containing feeder cells fibroblast-like cells
  • a cell sheet containing feeder cells fibroblast-like cells
  • a co-culture a cell sheet containing a co-culture of the present disclosure
  • the cell sheet containing the feeder cells (fibroblast-like cells) of the present disclosure i.e., the cell sheet of the present disclosure
  • the cell sheet of the present disclosure has mucus secretion ability, specifically mucin secretion ability
  • the cell sheet of the present disclosure It is preferable because it has a high effect of protecting the applied area (for example, a healing part of an ulcer, etc.).
  • the cell sheet of the present disclosure can protect the applied area by preferably applying it to an inflamed area, wound area, lesion area, post-operative suture area, abdominal cavity, etc. and allowing it to heal.
  • the cell sheet of the present disclosure is preferably fused to an inflamed area, a wound area, a lesion area, a suture area after surgery, or the abdominal cavity, thereby preventing leakage from the fusion area, leakage into the fusion area, or invasion into the fusion area. Can be suppressed.
  • the cell sheet of the present disclosure can provide cells or cell scaffolds necessary for healing of the fusion site, preferably by being fused to an inflamed area, wound area, lesion area, post-surgical suture area, or abdominal cavity.
  • the cell sheet of the present disclosure can be preferably fused to an inflamed area, wound area, lesion area, sutured area after surgery, or abdominal cavity, thereby preventing the fused area from adhering to a foreign location.
  • the cell sheet of the present disclosure is preferably applied to an inflamed area, a wound area, a lesion area, a suture area after surgery, or the abdominal cavity, thereby suppressing infiltration of blood cells into the gastrointestinal tissue due to an autoimmune reaction, etc. can suppress the immune response.
  • the cell sheet of the present disclosure can alleviate hyperinflammation in the fused area, preferably by being fused to an inflamed area, wound area, lesion area, post-surgical suture area, or abdominal cavity.
  • the cell sheet of the present disclosure can prevent postoperative complications by preferably being fused to a sutured portion after surgery.
  • the cell sheet of the present disclosure can replace intestinal function, preferably by transplanting into defective intestinal tissue.
  • the cell sheet of the present disclosure can be held with tweezers or the like and affixed to a desired transplant site in any endoscopic surgery, open surgery, laparoscopic surgery, etc.
  • the cell sheet of the present disclosure may be transplanted in a state integrated with a support, or may be held and transplanted with a carrier such as a wire. good.
  • the cell sheet of the present disclosure can be fixed to a biocompatible support and transplanted together with the support.
  • a biocompatible adhesion auxiliary substance such as fibrin may be applied to the cell sheet of the present disclosure and/or the transplant site. Furthermore, the cell sheet of the present disclosure and the transplant site may be sutured together.
  • the cell sheet of the present disclosure When pasting the cell sheet of the present disclosure on a transplant site, for example, the cell sheet of the present disclosure may be spread out with tweezers and placed on the transplant site and pasted, or the cell sheet of the present disclosure may be placed on the transplant site. You can spread it out later. Furthermore, the cell sheet of the present disclosure can be applied to the transplant site by pressing it with a jig having a balloon structure.
  • a method for producing feeder cells for maintaining or proliferating cells comprising: (A) preparing an intestinal structure made from pluripotent stem cells and comprising endoderm-derived cells and mesoderm-derived cells; (B) culturing the intestinal structure to proliferate fibroblast-like cells derived from the intestinal structure; and (C) isolating the fibroblast-like cells to obtain feeder cells. ,Method.
  • the intestinal structure comprises: (a) preparing a cell culture substrate comprising a substrate, a plurality of isolated cell adhesion regions formed on the substrate and a cell non-adhesion region surrounding each of the cell adhesion regions; (b) seeding the pluripotent stem cells on the cell culture substrate; and (c) culturing the seeded pluripotent stem cells in a medium.
  • the fibroblast-like cell according to [7] which is positive for PDGFRA and CD81, negative for CD34, and expresses Foxl1 and GREM1.
  • the intestinal structure comprises: (a) preparing a cell culture substrate comprising a substrate, a plurality of isolated cell adhesion regions formed on the substrate and a cell non-adhesion region surrounding each of the cell adhesion regions; (b) seeding the pluripotent stem cells on the cell culture substrate; and (c) culturing the seeded pluripotent stem cells in a medium. Fibroblast-like cells according to [9].
  • the feeder cell according to [6] which is a feeder cell for maintaining or proliferating at least one type of cell selected from the group consisting of small intestinal intestinal epithelial cells, large intestinal intestinal epithelial cells, hepatocytes, and chondrocytes. or the fibroblast-like cell according to any one of [7] to [11].
  • the feeder cell according to [6] or the fibroblast-like cell according to any one of [7] to [12] which is a feeder cell for maintaining or proliferating the cell by planar culture.
  • [14] The feeder cell according to [6] or the fibroblast-like cell according to any one of [7] to [13], which is a feeder cell that can be passaged three times or more.
  • a cell sheet comprising the feeder cell according to [6] or the fibroblast-like cell according to any one of [7] to [14].
  • the co-culture according to [16] wherein the cells are passaged three times or more.
  • a cell sheet comprising the co-culture according to [16] or [17].
  • the cell sheet according to [18] which has a circular or substantially circular shape with a diameter of 1 cm or more.
  • the cell sheet according to [18] or [19], comprising a layer of at least one type of cell selected from the group consisting of small intestine intestinal epithelial cells and hepatocytes.
  • the cell sheet according to any one of [18] to [20] further comprising a layer of the feeder cells.
  • a transplant material comprising the cell sheet according to any one of [15] and [18] to [21].
  • a method for maintaining or proliferating cells which comprises maintaining or proliferating the cells in the presence of the feeder cells according to [6] or the fibroblast-like cells according to any one of [7] to [14].
  • a method comprising the step of culturing.
  • the cell is at least one type of cell selected from the group consisting of small intestinal epithelial cells, large intestinal intestinal epithelial cells, hepatocytes, and chondrocytes.
  • Example 1 Preparation of cell culture substrate 39.0 g of toluene and 13.5 g of methacryloylsilane TSL8370 (manufactured by GE Toshiba Silicone) were mixed, and 450 ⁇ l of triethylamine was added while stirring. After stirring at room temperature for several minutes, the entire amount was transferred to a glass plate. A 5 cm square glass substrate that had been UV cleaned was immersed in the solution and left at room temperature for 16 hours. Thereafter, the glass substrate was washed with ethanol and water and dried with nitrogen blow. As a result, a thin film containing methacryloyl groups was formed on the surface of the glass substrate.
  • DMPA polymerization initiator 2,2'-dimethoxy-2-phenyl-acetophenone
  • PEGdA polyethylene glycol diacrylate
  • This PEGdA substrate was immersed in water overnight, washed with water, and then dried. Note that the average dry film thickness was 0.33 ⁇ m.
  • a 5-inch photomask was used that had a pattern in which a plurality of circular openings with a diameter of 1.5 mm were formed.
  • a mask was gently placed on the PEGdA surface of the PEGdA substrate, and vacuum ultraviolet rays using a xenon excimer lamp (172 nm, 10 mW/cm 2 ) as a light source were irradiated from the back side of the mask for 1 minute. As a result, a region on the surface of the PEGdA film corresponding to the opening of the photomask was oxidized. Next, the substrate was cut into 2.5 cm square pieces and used as a cell culture substrate.
  • the cell adhesion regions in the obtained cell culture substrate had a circular shape and a diameter of 1.5 mm, and the spaces between the cell adhesion regions, that is, the shortest distances between the cell adhesion regions were all 0.35 mm.
  • Example 2 Preparation of intestinal structure Pluripotent stem cells (SEES-, an ES cell line established by the National Center for Child Health and Development, Japan) were placed on the surface of the cell culture substrate prepared in Example 1. 2 cells) were seeded at about 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2 and cultured in an incubator at 37° C. and a CO 2 concentration of 5% for 60 days to induce differentiation. XF32 medium was used for culturing pluripotent stem cells. After 60 days of differentiation induction, the culture was gel-embedded using a cell suspension jelly reagent (iPGell, manufactured by Geno Staff Co., Ltd.), and the gel-embedded culture was cut to obtain sections of the culture. was created. The composition of the XF32 medium used for culturing pluripotent stem cells is shown in Table 1 below.
  • Villin and 5TH As a result of immunostaining the sections of the obtained culture using antibodies against each of intestinal differentiation markers, Villin and 5TH, Villin and 5TH were detected in the cell adhesion region, and pouch-like structures (i.e., intestinal structures) were detected. It was confirmed that a body) was formed (Fig. 1). Furthermore, since it was confirmed that the sac-like structure performed peristalsis, it was confirmed that cells derived from endoderm, mesoderm, and ectoderm necessary for peristalsis were present.
  • Example 3 Maintenance and proliferation of fibroblast-like cells and intestinal epithelial cells derived from intestinal structures 1
  • the intestinal structure prepared in Example 2 was transferred to another adhesive culture dish and cultured for 17 days in an incubator at 37°C and a CO2 concentration of 5% to collect fibers derived from the intestinal structure.
  • Blast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells were grown.
  • XF32 medium was used for culturing the intestinal structures. In culturing the intestinal structure, the amount of the medium was adjusted so that at least a portion of the intestinal structure was always in contact with the bottom surface of the culture container.
  • the obtained fibroblast-like cells were expanded and cultured using D-MEM supplemented with 10% FBS by changing the medium twice a week and subculturing them every week to obtain a stock at passage number 7. I got a lot.
  • the obtained stock is divided into two parts and each is stored in a -80°C freezer or in the gas phase of a tank containing liquid nitrogen.
  • the stock stored in a tank containing liquid nitrogen is stored in a -80°C freezer. It was used after being transferred to.
  • the fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells were cultured together for 5 days.
  • Cultivation was performed by culturing fibroblast-like cells in advance for about one week in D-MEM supplemented with 10% FBS, and then seeding intestinal epithelial cell-like cells onto the fibroblast-like cells.
  • Ta For culturing after seeding intestinal epithelial cell-like cells, ESTEM-HE medium (GlycoTechnica) containing R-spondin 1 and Wnt3a was used.
  • FIG. 2 shows an immunostained photograph of CDX2
  • the upper right photograph shows a photograph stained with DAPI
  • the lower right photograph shows an immunostained photograph using an antibody against Vimentin
  • the upper left photograph shows a merge of the above three photographs. It's a photo.
  • each scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • the photograph in FIG. 2 showed that when fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells were co-cultured, intestinal epithelial cell-like cells could be maintained and proliferated.
  • Vimentin is a marker for mesoderm, and intestinal epithelial cells expressing CDX2 and Villin are recognized to be derived from endoderm. This can be said to support the existence of each cell derived from.
  • the obtained intestinal epithelial cell-like cells were cultured for 2 passages alone for 14 days.
  • the above ESTEM-HE medium was used for culture.
  • the culture was immunostained using an antibody against CDX2, which is a marker of intestinal epithelial cells, and as a result, CDX2 was detected only in extremely limited cells (FIG. 3).
  • the lower left photograph shows a CDX2 immunostaining photograph
  • the upper right photograph is a DAPI staining photograph
  • the upper left photograph is a merged photograph of the above two photographs.
  • each scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • the photograph in FIG. 3 shows that when intestinal epithelial cell-like cells were cultured alone, intestinal epithelial cell-like cells were not maintained, and cells having this property could not proliferate.
  • Example 4 Maintenance and proliferation of fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells derived from intestinal structures 2 Fibroblast-like cells derived from intestinal structures and intestinal epithelial cell-like cells, which were prepared by the same method as in Example 3, were co-cultured. Specifically, intestinal epithelial cell-like cells of passage number 12 and fibroblast-like cells of passage number 7 were two-dimensionally co-cultured for 7 days. ESTEM-HE medium was used for culture. Co-cultures were embedded in IP gels. The co-culture embedded and fixed in IP gel was sliced to obtain a section of the co-culture, and the obtained section was immunostained using an antibody against CDX2, a marker of intestinal epithelial cells, and CDX2 was detected. ( Figure 4). In addition, in the photograph of FIG. 4, the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • Example 5 Cell polarity of fibroblast-like cells and intestinal epithelial cells derived from intestinal structures Fibroblast-like cells and intestinal epithelial cells derived from intestinal structures produced by the same method as in Example 3 Cells were co-cultured. Specifically, intestinal epithelial cell-like cells of passage number 12 and fibroblast-like cells of passage number 7 were two-dimensionally co-cultured for 7 days. ESTEM-HE medium was used for culture. Co-cultures were embedded in IP gels. The co-culture embedded and fixed in IP gel was sliced to obtain a section of the co-culture, and the obtained section was immunostained using an antibody against Villin, a marker of intestinal epithelial cells, and as a result, Villin was detected.
  • FIG. 5 the upper left photograph shows an immunostained photograph of Villin
  • the upper right photograph shows a photograph stained with DAPI
  • the lower left photograph shows a merged photograph of the above two photographs.
  • each scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • Example 6 Maintenance of intestinal epithelial cells by fibroblast-like cells derived from intestinal structures Fibroblast-like cells at passage number 7 derived from intestinal structures prepared by the same method as in Example 3 and human The cells were co-cultured with primary intestinal epithelial cells collected from. Cultivation was carried out by culturing fibroblast-like cells for about one week in advance in D-MEM supplemented with 10% FBS, and then seeding intestinal epithelial cells onto the fibroblast-like cells. ESTEM-HE medium was used for culture after seeding the intestinal epithelial cells. Microscopic photographs of cells at each time point of passage number 2 (fifth day of culture) and passage number four (fourth day of culture) are shown in Figures 6 and 7, respectively.
  • mice embryonic fibroblasts which are commonly used feeder cells, were used instead of fibroblast-like cells derived from intestinal structures as feeder cells.
  • MEFs mouse embryonic fibroblasts
  • FIGS. 8 and 9 Microscopic photographs of cells at each time point of passage number 2 (fifth day of culture) and passage number four (fourth day of culture) are shown in FIGS. 8 and 9, respectively. Note that in each of the photographs in FIGS. 6 to 9, the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 A comparison of Figures 6 and 7 shows that primary intestinal epithelial cells collected from humans can be maintained and expanded by fibroblast-like cells derived from intestinal structures.
  • primary intestinal epithelial cells which are not intestinal epithelial cells derived from intestinal structures, can be maintained and expanded.
  • FIGS. 8 and 9 showed that primary intestinal epithelial cells collected from humans could not be maintained and proliferated by feeder cells that are not fibroblast-like cells derived from intestinal structures.
  • the cells clearly change into a flat shape, which is a typical change when dedifferentiated.
  • Example 7 Maintenance of hepatocytes by fibroblast-like cells derived from intestinal structures Fibroblast-like cells at passage number 7 derived from intestinal structures produced by the same method as in Example 3, and hepatocytes were co-cultured. The culture was carried out by culturing fibroblast-like cells for about one week in advance in D-MEM supplemented with FBS at a concentration of 10%, and then seeding hepatocytes onto the fibroblast-like cells. ESTEM-HE medium was used for culture after hepatocytes were seeded. FIG. 10 shows a micrograph of the cells on the 8th day after the start of culture.
  • hepatocytes normally requires an appropriate coating for the culture vessel and feeder cells such as mouse embryonic fibroblasts (MEF), these can be eliminated by using the feeder cells of the present disclosure. It was shown that hepatocytes can be cultured without This result suggests that the feeder cells of the present disclosure are excellent as a scaffold for culture, and that only the extracellular matrix (ECM) produced by the feeder cells of the present disclosure can be isolated using techniques such as decellularization. It also suggests that it can be used separately.
  • ECM extracellular matrix
  • Example 8 Genetic analysis of fibroblast-like cells derived from intestinal structures 1 Regarding fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structure produced by the same method as in Example 3, gene expression in the intestinal tract and site-specific cells constituting the intestinal tract was analyzed. Furthermore, we analyzed gene expression in various types of fibroblasts in vivo. The results are shown in FIG. In FIG. 11, “RYU” and “LONG” represent gene expression of intestinal epithelial cell-like cells and fibroblast-like cells, respectively, derived from the intestinal structure produced by the same method as in Example 3.
  • human_SI represents gene expression based on total RNA of human small intestine
  • DuSMFs, DuSPFs, ILSMFs, and ILSPFs are fibroblasts near the mucosa and Represents gene expression of fibroblasts near the serosa.
  • fibroblast-like cells derived from intestinal structures expressed all of the genes expressed by the intestinal tract and site-specific cells that make up the intestinal tract shown in the figure.
  • fibroblast-like cells derived from intestinal structures have a gene expression pattern that is significantly different from that of various types of fibroblasts in the living body, regarding genes expressed by the intestinal tract and site-specific cells that make up the intestinal tract. It was shown that it has.
  • fibroblast-like cells derived from intestinal structures unlike various types of fibroblasts in living organisms, can help maintain and/or proliferate cells such as intestinal epithelial cells that make up the intestinal tract. It has been suggested.
  • Example 9 Genetic analysis of fibroblast-like cells derived from intestinal structures 2 Regarding fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structure produced by the same method as in Example 3, gene expression in the intestinal tract and site-specific cells constituting the intestinal tract was analyzed. Furthermore, gene expression based on total RNA of human small intestine was analyzed. The results are shown in Figure 12-1. In FIG. 12-1, “RYU01”, “RYU02” and “RYU03” all represent gene expression of intestinal epithelial cell-like cells derived from the intestinal structure prepared by the same method as in Example 3. Moreover, “LONG01” represents gene expression of fibroblast-like cells derived from the intestinal structure produced by the same method as in Example 3. Furthermore, "human_SI” represents gene expression based on total RNA of human small intestine.
  • fibroblast-like cells derived from intestinal structures express genes such as NOG, HGF, WNT5A, and GREM1, which are expressed by the intestinal tract shown in the figure and site-specific cells that make up the intestinal tract. It was shown that each gene was expressed.
  • NOG, WNT5A, and GREM1 are known to act as factors that maintain intestinal epithelial cells (Hans Clevers et al., Gastroenterology, 2012;143:1518-1529, “Redundant Sources of Wnt Regulate Intestinal Stem (See “Cells and Promote Formation of Paneth”).
  • HGF is known to contribute to the homeostasis of colonic epithelial cells. Therefore, these results suggested that fibroblast-like cells derived from intestinal structures can help maintain and/or proliferate cells such as intestinal epithelial cell-like cells that constitute the intestinal tract.
  • Example 10 Hierarchical clustering by comprehensive genetic analysis of fibroblast-like cells derived from intestinal structures Fibroblast-like cells and intestinal epithelial cells derived from intestinal structures produced by the same method as Example 3 Hierarchical clustering was performed on similar cells using comprehensive gene expression analysis. Furthermore, we performed hierarchical clustering using comprehensive gene expression analysis of primary intestinal epithelial cells collected from humans. The results are shown in FIG. In addition, in FIG. 13, "Ryu cells” and “Long cells” respectively mean intestinal epithelial cell-like cells and fibroblast-like cells derived from intestinal structures.
  • Example 11 Barrier properties of cell sheets of intestinal epithelial cell-like cells derived from intestinal structures Fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells derived from intestinal structures produced by the same method as in Example 3 were After culturing fibroblast-like cells on Transwell for 5 days to reach a confluent state, intestinal epithelial cell-like cells were further seeded at 6.0 ⁇ 10 4 /well, and two-dimensionally cultured for 7 days. were co-cultured. For culture, D-MEM medium supplemented with 15% FBS was used.
  • Caco2 is a cell sheet of Caco-2 cells, which is generally used as a drug discovery tool, and was seeded on Transwell at 6.0 ⁇ 10 4 /well and cultured for 11 days.
  • Long05 represents a cell sheet of fibroblast-like cells derived from intestinal structures.
  • RYU01”, “RYU04”, “RYU05”, and “RYU07” refer to different intestinal epithelial cell-like cells produced using different ES cells, and “RYU05 only” indicates barrier property (endothelial cell resistance value). This is a sample in which puromycin was used two days before the measurement of ) to cause cell death only in the fibroblast-like cell layer to the extent that the sheet did not peel off.
  • Example 12 Shape and transporter expression of co-culture of fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells derived from intestinal structures 1 Fibroblast-like cells derived from intestinal structures and intestinal epithelial cell-like cells, which were prepared by the same method as in Example 3, were co-cultured. Specifically, intestinal epithelial cell-like cells of passage number 12 and fibroblast-like cells of passage number 7 were two-dimensionally co-cultured for 7 days. ESTEM-HE medium was used for culture. After the culture was completed, the shape of the obtained co-culture was observed under a microscope, and the co-culture was further embedded in IP gel.
  • the photograph shown in FIG. 15 shows that the co-culture of fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells derived from the construct has a shape similar to that of the intestinal epithelium, and that it is similar to that of the intestinal epithelium of the living body. It was confirmed that the transporter was localized on the luminal side (ie, the apical side) of the intestinal epithelium.
  • Example 13 Expression of transporters and metabolic enzymes in fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells derived from intestinal structures Fibroblasts derived from intestinal structures produced by the same method as Example 3 -like cells and intestinal epithelial cell-like cells were co-cultured. Specifically, intestinal epithelial cell-like cells of passage number 12 and fibroblast-like cells of passage number 7 were two-dimensionally co-cultured for 7 days. ESTEM-HE medium was used for culture. The expression of ABCB1, a transporter of intestinal epithelial cells, and metabolic enzymes CES2, CYP3A4, UGT1A8, and UGT1A6 was confirmed for fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells of each passage number.
  • Example 14 Confirmation of division of intestinal epithelial cell-like cells in a co-culture of fibroblast-like cells and intestinal epithelial cell-like cells
  • Fibroblast-like cells derived from intestinal structures prepared by the same method as Example 3 cells and intestinal epithelial cell-like cells were co-cultured.
  • intestinal epithelial cell-like cells of passage number 5 and fibroblast-like cells of passage number 12 were two-dimensionally co-cultured for 7 days.
  • ESTEM-HE medium was used for culture. After completion of the culture, the co-culture was immunostained using an antibody against Ki-67, a marker of cell proliferation. The results are shown in FIG. In addition, in each photograph of FIG. 17, the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the photograph in FIG. 17 showed that Ki-67, a cell proliferation marker, was present non-locally. This result suggests that cell division occurs non-locally rather than locally from a single cell. This result suggests at least two possibilities.
  • the first possibility is that the results in FIG. 17 suggest characteristics when target cells are expanded by fibroblast-like cells derived from intestinal structures (i.e., feeder cells of the present disclosure). .
  • a second possibility is that Figure 17 suggests that intestinal epithelial cell-like cells derived from intestinal structures divide and proliferate.
  • intestinal epithelial cells which are normally generated only by differentiation from intestinal epithelial stem cells (Lgr5-positive stem cells) and are not generated by division and proliferation of intestinal epithelial cells after differentiation, are different from intestinal epithelial cells. This suggests that they proliferate by dividing.
  • Example 15 Confirmation of mucosal forming ability of fibroblast-like cells and intestinal epithelial cells derived from intestinal structures
  • Cell-like cells were co-cultured. Specifically, intestinal epithelial cell-like cells of passage number 7 and fibroblast-like cells of passage number 12 were two-dimensionally co-cultured for 3 days.
  • ESTEM-HE medium was used for culture. After completion of the culture, the co-culture was embedded in IP gel and stained with Alcian blue. The results are shown in FIG. In addition, in each photograph of FIG. 18A and B, the scale bar indicates 50 ⁇ m and 200 ⁇ m, respectively.
  • the blue coloration shown in each photograph in FIG. 18 indicates the presence of mucin and suggests the presence of goblet cells that are classified as intestinal epithelial cells.
  • the feeder cells of the present disclosure have a feeder ability that contributes to the stable proliferation of intestinal epithelial cells over a long period of time (multiple passages), and that the intestinal epithelium that has been grown and maintained in culture using the feeder cells of the present disclosure This shows that the cells maintain intestinal secretion ability. From this result, by using the feeder cells of the present disclosure, it is possible to produce a large amount of mucin itself or cells that produce mucin, and by extension, it is also possible to produce a cell sheet containing a large amount of such mucin. This suggests that it is possible.
  • the feeder cells of the present disclosure are particularly useful in the medical field. Applications in medical fields related to mucus and mucous membranes are expected.
  • Caco-2 cells have conventionally been generally used as a drug discovery tool, since Caco-2 cells are generally not said to have the ability to secrete mucin, the feeder cells of the present disclosure It is also suggested that by using Caco-2 cells, it is possible to provide an assay system that is more similar to living organisms than Caco-2 cells.
  • Example 16 Confirmation of feeder ability of fibroblast-like cells derived from intestinal structures 1
  • the feeder ability of fibroblast-like cells derived from intestinal structures produced by the same method as in Example 3 was confirmed in comparison with conventional feeder cells derived from human embryonic stem cells.
  • conventional feeder cells were produced according to the following procedure.
  • hES cells Human embryonic stem cells (hES cells), EES2, were exposed to ROC inhibitor (Y-27632; 10 ⁇ M) and then dissociated into single cells using 0.5 mM EDTA and distributed per well in a 96-well plate. They were seeded at a concentration of 5 x 103 cells.
  • the seeded cells were grown in EB medium (76% KnockOut DMEM, 20% 35kGy irradiated Xeno-free KnockOut Serum Replacement (XF-KSR, Life Technologies), 2mM GlutaMAX-I, 0.1mM non-essential amino acids (NEA).
  • EB medium 76% KnockOut DMEM, 20% 35kGy irradiated Xeno-free KnockOut Serum Replacement (XF-KSR, Life Technologies), 2mM GlutaMAX-I, 0.1mM non-essential amino acids (NEA).
  • A 50U/ml penicillin - 50 ⁇ g/ml streptomycin (Pen-Strep), 50 ⁇ g/ml L-ascorbic acid 2-phosphate (Sigma-Aldrich)) for 4 days to form embryoid bodies.
  • the obtained embryoid bodies were transferred to a T25 flask coated with NMP collagen PS (Nippon Ham Co., Ltd.) and incubated with XF32 medium (85% KnockOut DMEM, 15% 35kGy irradiated XF-KSR, 2mM GlutaMAX-I, 0.1mM NEAA).
  • XF32 medium 85% KnockOut DMEM, 15% 35kGy irradiated XF-KSR, 2mM GlutaMAX-I, 0.1mM NEAA.
  • Pen-Strep 50 ⁇ g/ml L-ascorbic acid 2-phosphate, 10 ng/ml heregulin-1 ⁇ (Recombinant human NRG-beta 1/HRG-beta 1 EGF domain; Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 200 ng/ml group
  • the cells were cultured for 60 to 70 days in recombinant human IGF-1 (LONGR3-IGF-1; Sigma-Aldrich) and 20 ng/ml human bFGF (Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) to obtain hES cell-derived cells. Since these cells had mesenchymal cell-like properties, they are also called ES cell-derived mesenchymal cells.
  • hES cell-derived mesenchymal cells were maintained in ⁇ -MEM medium supplemented with 10% FBS (Gibco or HyClone) and 1% Pen-Strep to form feeder cells (hereinafter referred to as "conventional feeder cells”). ) was obtained.
  • the feeder ability of the fibroblast-like cells i.e., the feeder cells of the present disclosure
  • the feeder cells of the present disclosure were mass-cultured to obtain feeder cells with a passage number of 7, and in the same manner as in Example 3, the intestinal epithelial cells were seeded on the feeder cells obtained, cultured, and passages were repeated.
  • the PDL (population doubling level: vertical axis) at each passage number of intestinal epithelial cells that were repeatedly passaged is shown in FIG. 19.
  • the feeder cells of the present disclosure exhibit stable target cell (intestinal epithelial cell) proliferation ability at any time point from passage number 1 to 16 (P1 to 16). confirmed. That is, the feeder cells of the present disclosure were shown to exhibit feeder ability that contributes to stable proliferation of target cells over a long period of time (multiple passages).
  • Example 17 Confirmation of feeder ability of fibroblast-like cells derived from intestinal structures 2
  • the feeder ability of fibroblast-like cells i.e., feeder cells of the present disclosure
  • conventional feeder cells derived from human embryonic stem cells. confirmed.
  • conventional feeder cells produced by the same method as in Example 16 were prepared.
  • the feeder cells of the present disclosure and conventional feeder cells were then seeded in 24-well plates at a concentration of 5 x 104 cells per well, respectively, and FBS was added at 10% and penicillin-streptomycin at 1%.
  • FIG. 20 shows the results of culturing intestinal epithelial cell-like cells using conventional feeder cells.
  • FIG. 20 shows the results of culturing intestinal epithelial cell-like cells using conventional feeder cells.
  • the upper left photograph shows an immunostaining photograph of CDX2
  • the upper right shows an immunostaining photograph with Villin
  • the lower left shows an immunostaining photograph with DAPI
  • the lower right shows a microscopic photograph of intestinal epithelial cell-like cells after culture. shows.
  • Example 18 Maintenance of chondrocytes by fibroblast-like cells derived from intestinal structures
  • the feeder ability (maintenance of chondrocytes) of ie, the feeder cells of the present disclosure
  • the feeder ability (maintenance of chondrocytes) of was confirmed.
  • the expression of lubricin and COL2A1 was confirmed by qRT-PCR in chondrocytes (YUB) collected from human children and chondrocytes cultured with each of the above four types of fibroblast-like cells. The results are shown in FIG.
  • YUB indicates chondrocytes collected from pediatric specimens
  • “4R” to “7R” respectively mean chondrocytes cultured with each fibroblast-like cell (in addition, “6R” in FIG. 21A ' data were not obtained).
  • lubricin and COL2A1 were highly expressed in chondrocytes 4R to 7R cultured with the feeder cells of the present disclosure compared to YUB, which is a chondrocyte collected from a human child. It was done.
  • lubricin is a lubricant substance that is highly expressed in synovial cells, which are known as feeder cells for chondrocytes
  • COL2A1 is a lubricant substance that is highly expressed in chondrocytes.
  • chondrocytes are known to be cells that easily dedifferentiate.
  • Example 19 Gene expression profile of feeder cells of the present disclosure and marker confirmation by immunostaining Fibroblast-like cells derived from intestinal structures produced by the same method as Example 3 (i.e., feeder cells of the present disclosure) Cell markers were confirmed by immunostaining. Specifically, a specimen was prepared by embedding cultured fibroblast-like cells in IP gel, and the protein expression on the cell surface of PDGFRA and CD81 was detected using Cell Signaling Technology, Inc. as primary antibodies. The cells were stained using PDGF Receptor ⁇ (D1E1E) The results are shown in FIG. 22.
  • Example 20 Production of cell sheet A cell sheet was produced using the feeder cells of the present disclosure. Specifically, feeder cells of the present disclosure were seeded and cultured until a confluent state was reached. Next, the intestinal epithelial cells were seeded in a layered manner on top of the confluent feeder cells, and cultured until the intestinal epithelial cells became confluent and formed a sheet structure due to the bonds between the cells. Next, the laminate of the feeder cell layer of the present disclosure and the intestinal epithelial cell layer was peeled off from the culture plane to obtain a cell sheet containing the feeder cell layer and the intestinal epithelial cell layer.
  • FIG. 24 A photograph of the obtained cell sheet is shown in FIG. 24. From the results shown in FIG. 24, it was confirmed that the cell sheet of the present disclosure had a diameter of 1 cm or more.
  • feeder cells for two-dimensionally culturing and maintaining or proliferating cells that have conventionally been difficult to maintain and proliferate by two-dimensionally culturing, and a method for producing the feeder cells.

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Abstract

［課題］二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている細胞について、二次元的に培養して維持または増殖させるためのフィーダー細胞およびその作製方法の提供。 ［解決手段］多能性幹細胞から作製され、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞を増殖させ、単離してフィーダー細胞とする。

Description

フィーダー細胞、細胞シートおよびそれらの製造方法、ならびにフィーダー細胞を用いた細胞の維持または増殖方法
　本開示は、細胞を維持または増殖させるためのフィーダー細胞、該フィーダー細胞を含む細胞シートおよびそれらの製造方法、ならびに該フィーダー細胞を用いて細胞を維持または増殖させる方法に関する。
　近年、生体から得られる初代培養細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞、ならびに多能性幹細胞から分化誘導された細胞等が、基礎研究、再生医療、創薬等の分野において広く用いられている。
　これらの分野において、多能性幹細胞を分化誘導させて特定の性質を有する細胞を増殖させたり、そのような特定の性質を有する複数の細胞を組織化させて組織や器官を形成させたりする技術が求められている。従来、そのような技術が盛んに研究されており、例えば、多官能性幹細胞から腸管上皮細胞を分化誘導させて、さらに分化後の腸管上皮細胞を三次元的に培養することにより維持および増殖させて腸構造体を形成する技術が提案されている（例えば、特許文献１）。
　一方、腸管上皮細胞の二次元的な培養についても様々な試みがなされているが、腸管上皮細胞を維持および増殖させる二次元培養の方法は未だに見出されていない。
　ところで、多能性幹細胞から特定の性質を有する細胞を分化誘導したり、分化誘導後の細胞を維持および増殖を促進したりするために、特定の因子（例えば、分化誘導因子等）を産生・供給する細胞、すなわちフィーダー細胞が用いられることがある（例えば、特許文献２）。
　しかしながら、フィーダー細胞を用いることにより、腸管上皮細胞を二次元的に培養した場合であってもその維持または増殖をさせる技術は知られていなかった。したがって、これまで二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている腸管上皮細胞等の細胞について、二次元的に培養して維持または増殖させるための実用的な方法を見出すことが要望されている。
特開２０１７－１８４７４９号公報 特開２０２２－７６１０号公報
　このような状況下、これまで二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている腸管上皮細胞等の細胞について、二次元的に培養して維持または増殖させるための実用的な方法を見出すことが要望されている。
　したがって、本開示では、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている腸管上皮細胞等の細胞について、二次元的に培養して維持または増殖させるためのフィーダー細胞、およびそのようなフィーダー細胞を作製する方法を提供する。また、本開示では、上述したようなフィーダー細胞を含む細胞シートを提供する。
　本開示の実施形態は以下の［１］～［２８］に関する。
［１］細胞を維持または増殖させるためのフィーダー細胞を作製する方法であって、
　（Ａ）多能性幹細胞から作製され、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体を準備する工程、
　（Ｂ）前記腸構造体を培養して、前記腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞を増殖させる工程、および
　（Ｃ）前記線維芽細胞様細胞を単離してフィーダー細胞を得る工程
を含む、方法。
［２］前記腸構造体が、
　（ａ）基材と、前記基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域および各前記細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材を準備する工程、
　（ｂ）多能性幹細胞を、前記細胞培養基材に播種する工程、および
　（ｃ）前記播種した多能性幹細胞を培地中で培養する工程
を含む方法により作製されたものである、
［１］に記載の方法。
［３］（Ｄ）前記単離された線維芽細胞様細胞を増殖させる工程をさらに含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記工程（Ｂ）において、前記腸構造体が培養容器中で培養され、前記腸構造体の少なくとも一部が前記培養容器に接している、［１］または［２］に記載の方法。
［５］前記工程（ｃ）における培養の期間が６０日間以上である、［２］に記載の方法。
［６］［１］または［２］に記載の方法により作製される、フィーダー細胞。
［７］ＰＤＧＦＲＡおよびＣＤ８１が陽性であり、かつＦｏｘｌ１およびＧＲＥＭ１を発現する、線維芽細胞様細胞。
［８］ＰＤＧＦＲＡおよびＣＤ８１が陽性であり、ＣＤ３４が陰性であり、かつＦｏｘｌ１およびＧＲＥＭ１を発現する、［７］に記載の線維芽細胞様細胞。
［９］多能性幹細胞に由来するか、または多能性幹細胞から作製される腸構造体であって、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体の培養物に由来する、［７］に記載の線維芽細胞様細胞。
［１０］前記腸構造体が、
　（ａ）基材と、前記基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域および各前記細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材を準備する工程、
　（ｂ）多能性幹細胞を、前記細胞培養基材に播種する工程、および
　（ｃ）前記播種した多能性幹細胞を培地中で培養する工程
を含む方法により作製されたものである、
［９］に記載の線維芽細胞様細胞。
［１１］前記多能性幹細胞がヒト由来である、［９］に記載の線維芽細胞様細胞。
［１２］小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞、肝細胞、軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞を維持または増殖させるためのフィーダー細胞である、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］に記載の線維芽細胞様細胞。
［１３］前記細胞を平面培養により維持または増殖させるためのフィーダー細胞である、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］に記載の線維芽細胞様細胞。
［１４］前記細胞を３回以上継代させることができるフィーダー細胞である、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］に記載の線維芽細胞様細胞。
［１５］［６］に記載のフィーダー細胞または［７］に記載の線維芽細胞様細胞を含む、細胞シート。
［１６］小腸腸管上皮細胞、肝細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞と、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］に記載の線維芽細胞様細胞とを含む、共培養物。
［１７］前記細胞の継代回数が３回以上である、［１６］に記載の共培養物。
［１８］［１６］に記載の共培養物を含む、細胞シート。
［１９］直径が１ｃｍ以上の円形または略円形である、［１８］に記載の細胞シート。
［２０］小腸腸管上皮細胞、肝細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞の層を含む、［１８］に記載の細胞シート。
［２１］前記フィーダー細胞の層をさらに含む、［２０］に記載の細胞シート。
［２２］［１５］または［１８］に記載の細胞シートを含む、移植材料。
［２３］細胞を維持または増殖させるための方法であって、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］に記載の線維芽細胞様細胞の存在下で前記細胞を培養する工程を含む、方法。
［２４］前記細胞の培養が平面培養である、［２３］に記載の方法。
［２５］前記細胞が、小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞、肝細胞、軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞である、［２３］または［２４］に記載の方法。
［２６］前記細胞と前記フィーダー細胞とが同一の個体に由来する、［２３］または［２４］に記載の方法。
［２７］前記細胞と前記フィーダー細胞とが異なる個体に由来する、［２３］または［２４］に記載の方法。
［２８］ＤＣＮ、ＡＣＴＡ２およびＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を発現し、かつ、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＮＯ１、ＢＬＩＤ、ＬＯＣ１００５０７０５３、ＬＨＸ８、ＳＦＲＰ４、ＡＨＲＲ、ＳＬＣ１４Ａ１、ＦＭＯ３、ＰＺＰ、ＡＢＣＧ４、ＥＹＡ２、ＴＭＥＭ９２－ＡＳ１、ＡＮＯ１０、ＥＧＦＬ６、ＳＮＣＡＩＰ、ＬＧＳＮ、ＰＣＤＨＢ１５およびＫＲＴＡＰ１－５の遺伝子を発現する細胞。
　本開示によれば、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている腸管上皮細胞等の細胞について、二次元的に培養して維持または増殖させるためのフィーダー細胞、およびそのようなフィーダー細胞を作製する方法を提供することができる。さらに、本開示によれば、上述したようなフィーダー細胞を含む細胞シートを提供することができる。さらに、上述したフィーダー細胞は継代数を１０以上重ねても良好なフィーダー能を有することから、不死化せずとも広く普及させることが可能であり、該フィーダー細胞を用いた培養系は、一般的に用いられるフィーダー細胞であるマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）や不死化させたフィーダー細胞よりもヒト生体に近い培養系の標準モデルとしての役割も期待できる。また、該フィーダー細胞は一般的な培養表面への接着性を有し、ＣＤ９０の発現を見せ、オルガノイド内で本来間葉系幹細胞が存在する位置関係に存在することから、間葉系幹細胞の一種であることは容易に推察でき、該フィーダー細胞の移植による治療効果も期待できる。
図１は、多官能性幹細胞を分化誘導して作製された腸構造体を、腸の分化マーカーとなる抗体（抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体および抗５ＴＨ抗体）を用いて免疫染色した写真である。 図２は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物を、腸管上皮細胞のマーカー（ＣＤＸ２およびＶｉｌｌｉｎ）に対する抗体を用いて免疫染色した写真である。 図３は、腸構造体由来の腸管上皮細胞様細胞の培養物を、腸管上皮細胞のマーカー（ＣＤＸ２）に対する抗体を用いて免疫染色した写真である。 図４は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物を、腸管上皮細胞のマーカーで（ＣＤＸ２）に対する抗体を用いて免疫染色した写真である。 図５は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物を、腸管上皮細胞のマーカー（Ｖｉｌｌｉｎ）に対する抗体を用いて免疫染色した写真である。 図６は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞とヒト初代腸管上皮細胞とを含む共培養物の、継代数２、培養５日目の時点における顕微鏡写真である。 図７は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞とヒト初代腸管上皮細胞とを含む共培養物の、継代数４、培養４日目の時点における顕微鏡写真である。 図８は、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）とヒト初代腸管上皮細胞とを含む共培養物の、継代数２、培養５日目の時点における顕微鏡写真である。 図９は、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）とヒト初代腸管上皮細胞とを含む共培養物の、継代数４、培養４日目の時点における顕微鏡写真である。 図１０は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞と肝細胞とを含む共培養物の、培養開始後８日目における顕微鏡写真である。 図１１は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物における、腸管および腸管を構成する部位特異的な細胞の遺伝子発現を解析した結果である。 図１２－１は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物における、腸管および腸管を構成する部位特異的な細胞の遺伝子発現を解析した結果である。 図１２－２は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞における、各種のシグナル伝達タンパク質であるＷＮＴファミリーの遺伝子発現を解析した結果である。 図１３は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物の網羅的遺伝子解析による階層的クラスタリングの結果である。 図１４は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物である細胞シートのバリア性（内皮細胞抵抗値）の測定結果である。 図１５は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物における、腸管上皮細胞のトランスポーターの発現に関する写真である。 図１６は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物における、腸管上皮細胞のトランスポーターおよび代謝酵素の遺伝子発現を解析した結果である。 図１７は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物を、細胞増殖のマーカー（Ｋｉ－６７）に対する抗体を用いて免疫染色した写真である。 図１８は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物を、アルシアンブルーにより染色した写真である。 図１９は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞の各継代回数時のフィーダー能を示すグラフである。 図２０は、従来のフィーダー細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物を、腸管上皮細胞のマーカー（ＣＤＸ２およびＶｉｌｌｉｎ）に対する抗体を用いて免疫染色した写真である。 図２１は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞およびヒト小児から採取された軟骨細胞のそれぞれにおける、ラブリシンおよびＣＯＬ２Ａ１の発現を示すグラフである。 図２２は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞をＰＤＧＦＲＡおよびＣＤ８１に対する各抗体を用いて免疫染色した写真である。 図２３は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞におけるＦｏｘｌ１、ＣＤ３４およびＧＲＥＭ１の各遺伝子発現を解析した結果である。 図２４は、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞を用いて作製した細胞シートの写真である。
　本明細書において用いられる「フィーダー細胞」という用語は、目的の細胞の維持および／または増殖を促進する培養条件を整えるために該目的の細胞またはその分化前の細胞等と共に培養（共培養）される細胞であって、該目的の細胞とは異なる細胞を指す。本開示において、フィーダー細胞は目的の細胞と同時に播種されてもよく、目的の細胞の播種の前に播種されてもよい。一つの実施形態において、フィーダー細胞は、目的の細胞の播種の前に播種されて、フィーダー細胞の層（すなわち、フィーダー層）を形成する。目的の細胞とフィーダー細胞とは互いに接触するように培養されてもよく、互いに接触しないように培養されてもよい。一つの実施形態において、目的の細胞とフィーダー細胞とは、目的の細胞の少なくとも一部とフィーダー細胞とが接触するように培養される。なお、フィーダー細胞は、放射線（例えば、γ線）の照射、抗生物質（例えば、マイトマイシンＣ）による処理等の公知の方法によって、その増殖が抑制されていてもよい。
　本明細書において用いられる「多能性幹細胞」という用語は、いわゆる分化多能性を有する細胞を指す。本明細書において用いられる「多能性」や「分化多能性」という用語は、生体を構成するすべての胚葉（すなわち、外胚葉、中胚葉および内胚葉）に分化することができる細胞の能力を指す。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、成体組織または臍帯血もしくは臍帯に由来する幹細胞等が挙げられる。
　本明細書において用いられる「線維芽細胞様細胞」という用語は、いわゆる線維芽細胞だけでなく、筋線維芽細胞等のような、線維芽細胞が分化した扁平または紡錘形の形状を有する細胞を指す。また、線維芽細胞様細胞の由来は特に限定されず、例えば、線維芽細胞様細胞は上述した多能性幹細胞や後述する腸構造体に由来する細胞であり得る。また、線維芽細胞様細胞は、後述する特定の遺伝子発現プロファイルを示す細胞であり得る。なお、本開示における「線維芽細胞様細胞」は、天然に存在する上述の各種細胞を包含するものではなく、天然に存在する細胞または人工的に得られた細胞に対して人為的な操作を加えることにより得られた細胞、すなわち人工的に得られた細胞（人工細胞）である。
［フィーダー細胞の作製方法］
　本開示の一つの態様によれば、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている腸管上皮細胞等の細胞を維持するためのフィーダー細胞（以下、「本開示のフィーダー細胞」とも言う。）を作製する方法が提供される。本開示のフィーダー細胞は、以下の（Ａ）～（Ｃ）の各工程を含む方法（以下、「本開示の作製方法」ともいう。）により作製することができる：
　（Ａ）多能性幹細胞から作製され、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体を準備する工程、
　（Ｂ）腸構造体を培養して、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞を増殖させる工程、および
　（Ｃ）線維芽細胞様細胞を単離してフィーダー細胞を得る工程。
　以下、（Ａ）～（Ｃ）の各工程について詳細に説明する。
＜工程（Ａ）＞
　工程（Ａ）では、多能性幹細胞から作製される、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体が準備される。腸構造体とは、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含み、腸と同等または類似する機能を少なくとも１つ有する構造体である。
　腸構造体は、上述した細胞構成および機能を有するものであれば特に制限されないが、例えば、多能性幹細胞を分化誘導することにより得ることができる。一つの実施形態において、本開示の作製方法において用いられる腸構造体は、以下の（ａ）～（ｃ）の各工程を含む方法により作製することができる。
（工程（ａ））
　工程（ａ）は、基材と、前記基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域（細胞接着性の領域）および各前記細胞接着領域を囲む細胞非接着領域（細胞非接着性の領域）とを備える細胞培養基材を準備する工程である。
　本明細書において「細胞接着性」とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。したがって、「細胞接着領域」とは細胞接着性が比較的高い領域を意味し、「細胞非接着領域」とは細胞接着性が比較的低い領域を意味する。具体的には、細胞接着性とは、基材上（基材表面）の化学的性質や物理性質等によって細胞の接着や伸展が起こる程度を意味し、細胞接着性が比較的高い細胞接着領域では細胞の接着が起こりやすく、細胞接着性が比較的低い細胞接着領域では細胞の接着が起こりにくい。したがって、上述したように細胞接着領域と細胞非接着領域とがパターン化された基材上に細胞を播種すると、細胞接着領域には細胞が接着しやすく、細胞非接着領域には細胞が接着しにくいため、播種された細胞が基材上にパターン状に配列されることになる。
　細胞接着性は、基材上に播種されてパターン状に配列された細胞を培養した場合の細胞接着伸展率を指標として判断することができる。細胞接着伸展率が高いほど、効率的に細胞を培養することができる。細胞接着領域および細胞非接着領域の細胞接着伸展率は、本開示の効果が奏される限り特に制限されないが、例えば、それぞれ６０％以上および６０％未満とすることができる。細胞接着領域の細胞接着伸展率は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より一層好ましくは９０％以上である。一方、細胞非接着領域の細胞接着伸展率は、好ましくは４０％未満、より好ましくは５％以下、より一層好ましくは２％以下である。細胞接着伸展率は、播種密度が４，０００ｃｍ２個以上３０，０００個／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベータ内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（測定対象表面に接着している細胞数）／（測定対象表面に播種された細胞数）｝×１００（％））と定義される。
　測定対象物上への細胞の播種は、ＦＢＳを１０％となるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に細胞を懸濁させて、細胞懸濁液を測定対象物上に添加し、次いで、細胞が添加された測定対象物をゆっくりと振とうして細胞ができるだけ均一に分布させることにより行われる。さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行うことによって、測定対象物上に接着していない細胞を除去した後に行う。細胞接着伸展率の測定においては、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所（例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁）を除いた箇所が測定箇所とされる。
　本開示において、腸構造体を作製するために用いられる基材は、本開示の効果が奏される限り特に制限されないが、例えば、細胞非接着領域が、ポリエチレングリコールが基材上に固定化されて形成され、細胞接着領域が、基材上に固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部が酸化処理および／または分解処理されて形成された基材である。このような基材は、例えば、基材の表面全体にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の薄膜を形成し、次いで、細胞の接着が望まれる領域に対して酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性を付与すことで細胞接着領域を形成することにより作製することができる。酸化処理および分解処理のいずれも施さない部分は、ＰＥＧが固定化された細胞非接着領域となる。
　基材としては、その表面にＰＥＧ薄膜を形成することが可能な材料で形成されたものであれば特に制限されるものではない。基材の材料としては、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等）に代表される有機材料を挙げることができる。基材の形状も特に制限されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。一つの実施形態において、フィルム状の基材が用いられる。フィルム状の基材の厚さは特に制限されないが、通常０．１～１，０００μｍであり、好ましくは１～５００μｍ、より好ましくは１０～２００μｍである。
　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、１つ以上のエチレングリコール単位（－（ＣＨ２）２－Ｏ－）からなるエチレングリコール鎖（ＥＧ鎖）を少なくとも含む。ポリエチレングリコール鎖は、直鎖状であってもよく分岐鎖状であってもよい。エチレングリコール鎖は、例えば、次式：
　　　　　　　－（（ＣＨ２）２－Ｏ）ｍ－
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。ｍは、本開示の効果が奏される限り特に制限されないが、好ましくは１～１３であり、より好ましくは１～１０である。
　ＰＥＧにはエチレングリコールオリゴマーも包含される。また、ＰＥＧには、官能基が導入されたものも包含される。官能基としては、例えば、エポキシ基、カルボキシル基、Ｎ－ハイドロキシスクシイミド基、カルボジイミド基、アミノ基、グルタルアルデヒド基、（メタ）アクリロイル基等が挙げられる。官能基は、必要に応じてリンカーを介して、好ましくはＰＥＧ鎖の末端に導入される。官能基が導入されたＰＥＧとしては、例えば、ＰＥＧ（メタ）アクリレート、ＰＥＧジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
　基材上に形成されるＰＥＧ薄膜の平均厚さは特に制限されないが、好ましくは０．８ｎｍ～５００μｍ、より好ましくは０．８ｎｍ～１００μｍ、より一層好ましくは１ｎｍ～１０μｍ、特に好ましくは１．５ｎｍ～１μｍである。ＰＥＧ薄膜の平均厚さが０．８ｎｍ以上であることにより、タンパク質の吸着や細胞の接着において、基材表面のＰＥＧ薄膜で覆われていない領域の影響を受けにくい。一方、平均厚さが５００μｍ以下であることにより、コーティングを比較的容易に行うことができる。さらに、ＰＥＧ薄膜の厚みを一定以上とすることで、細胞非接着性が低下して、細胞が細胞接着領域以外の領域まで接着伸展するのを抑制できる。またＰＥＧ薄膜の厚みを一定以下とすることで、培養液中に含まれる細胞生存に必要な因子を、細胞接着領域内の基材に近い細胞にもゆきわたらせることができる。
　基材上におけるＰＥＧ薄膜の形成方法としては、基材の表面にＰＥＧを直接吸着させる方法、基材の表面にＰＥＧを直接コーティングする方法、基材の表面にＰＥＧをコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材とＰＥＧ薄膜との密着性を高めるために基材の表面に下地層を形成し、次いでＰＥＧをコーティングする方法、基材の表面に重合開始点を形成し、次いでＰＥＧを重合する方法等を挙げることができる。好ましい実施形態において、基材上におけるＰＥＧ薄膜の形成は、基材上に下地層を形成し、次いでＰＥＧをコーティングすることにより行われる。
　基材の表面における下地層は、例えば、特開２０１２－１７５９８３に記載の方法等により形成することができる。好ましい実施形態において、基材の表面における下地層は、ＰＥＧ末端のヒドロキシル基または導入された官能基と反応して共有結合を形成することができる官能基、あるいは、そのような官能基に変換可能な官能基を有するシランカップリング剤を基材表面に固定化することによって形成することができる。そのような官能基としては、例えば、（メタ）アクリロイル基、(１Ｈ－イミダゾール－１－イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、グリシジル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基、イソシアネート基、マレイミド基等が挙げられる。これら官能基のうち、好ましい官能基は（メタ）アクリロイル基、グリシジル基、エポキシ基である。
　例えば、末端にメタクリロイル基を有するシランカップリング剤（メタクリロイルシラン）が用いられる場合、メタクリロイルシランを付加した基材の表面の水接触角は、典型的には４５°以上、好ましくは４７°以上、より好ましくは４８°以上、より一層好ましくは５０°以上である。なお、本開示において水接触角とは、２３℃において測定される水接触角を指す。基材の表面が上述したような水接触角を有する場合、十分な密度でＰＥＧを固定化することができる。
　基材上に固定化されるＰＥＧの密度および細胞接着性は、基材の表面における水接触角を指標として簡便に評価することができる。具体的には、基材の表面における水接触角が低いほど、基材の表面に存在するＰＥＧの密度が高く、結果として細胞接着性が低い領域（すなわち、細胞非接着領域）が形成される。すなわち、例えば、基材の表面にＰＥＧを固定化した後の基材の表面の水接触角が、例えば４８°以下、好ましくは４０°以下、より好ましくは３０°以下である場合には、基材の表面にＰＥＧが十分な密度で存在し、細胞接着性が十分に低いと考えられる。
　本開示において、細胞接着領域を形成するための、ポリエチレングリコールの酸化処理とは、有機化合物、すなわちＰＥＧが酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を指す。また、本開示において、細胞接着領域を形成するための、ポリエチレングリコールの分解処理とは、有機化合物、すなわちＰＥＧの結合が切断される反応を指す。「分解処理」としては、典型的には酸化による分解、紫外線照射による分解等が挙げられるがこれらには限定されない。なお、「分解処理」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解処理」と「酸化処理」とは同一の処理を指す。
　紫外線照射による分解は、ＰＥＧが紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、ＰＥＧと酸素を含む分子種（例えば、酸素、水等）とが共存している系中に紫外線を照射すると、紫外線がＰＥＧに吸収されて分解が起こる以外に、酸素を含む分子種が活性化してＰＥＧと反応する場合がある。この場合、後者の反応は「酸化」に分類される。そして、活性化された分子種による酸化によりＰＥＧが分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類される。このように、「酸化」と「分解」とが操作として重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない場合がある。本明細書では、このような場合が「酸化および／または分解」とも表現される。
　酸化および／または分解の方法としては、ＰＥＧ薄膜を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法等が挙げられる。ＰＥＧ薄膜を部分的に酸化および／または分解する場合は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクやスタンプを用いて行うことができる。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化および／または分解をすることもできる。
　紫外線照射処理する場合、波長１８５ｎｍや２５４ｎｍの紫外線を放射する水銀ランプや波長１７２ｎｍの紫外線を放射するエキシマランプ等のＶＵＶ領域からＵＶ－Ｃ領域の紫外線を放射するランプを光源として用いることが好ましい。光触媒処理する場合、波長３６５ｎｍ以下の紫外線を放射する光源を用いることが好ましく、波長２５４ｎｍ以下の紫外線を放射する光源を用いることがより好ましい。光触媒としては、好ましくは酸化チタン光触媒、金属イオンや金属コロイドで活性化された酸化チタン光触媒等が用いられる。また、酸化剤としては、有機酸や無機酸を特に制限なく用いることができるが、高濃度の酸は取り扱いが難しいので、好ましくは１０％以下の濃度に希釈して用いられる。最適な紫外線処理時間、光触媒処理時間、酸化剤処理時間は、用いる光源の紫外線強度、光触媒の活性、酸化剤の酸化力や濃度等の諸条件に応じて適宜決定することができる。
　一つの実施形態において、細胞接着領域（下地層が存在する場合には下地層も含む）の炭素量は、細胞非接着領域（下地層が存在する場合には下地層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着領域の炭素量は、細胞非接着領域の炭素量に対して２０～９９％であることが好ましい。また、細胞接着領域（下地層が存在する場合には下地層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞非接着領域（下地層が存在する場合には下地層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞非接着領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５～９９％であることが好ましい。播種された細胞が基材上にパターン状に配列される場合に、紫外線露光量の増大に伴い細胞接着性が増大するが、細胞回収時に接着性が高いと細胞が剥がれにくくなり、回収が困難になるからである。
　本明細書において、細胞接着領域の「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義され、「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。
　本開示で用いる基材においては、各細胞接着領域の面積は０．７８５ｍｍ２より大きく、好ましくは１．０ｍｍ２以上、より好ましくは１．２ｍｍ２以上、さらに好ましくは１．５ｍｍ２以上、最も好ましくは１．７ｍｍ２以上であり、好ましくは２５ｍｍ２以下、より好ましくは１５ｍｍ２以下、さらに好ましくは１０ｍｍ２以下、最も好ましくは５ｍｍ２以下の範囲となるようパターン形成される。多能性幹細胞を０．７８５ｍｍ２より大きい面積を有する細胞接着領域に接着させて培養することにより、細胞が剥離することなく、細胞を接着させたまま培養することができ、腸構造体への分化誘導が促進される。また、多能性幹細胞を２５ｍｍ２以下の面積を有する細胞接着領域に接着させて培養することにより、腸構造体への分化が効果的に誘導され得る。
　各細胞接着領域の形状は特に制限されないが、例えば、四角形を初めとする多角形、円形、楕円形等とすることができる。中でも円形が好ましく、直径が１．０ｍｍより大きく、好ましくは１．２ｍｍ以上、より好ましくは１．５ｍｍ以上であり、好ましくは６ｍｍ以下、より好ましくは４ｍｍ以下、より一層好ましくは３ｍｍ以下、特に好ましくは２ｍｍ以下の円形が好ましい。１つの基材において、複数存在する細胞接着領域は、互いに面積および／または形状が同じであってもよく、異なっていてもよいが、面積および形状とも同じであることが好ましい。
　また、基材において、各細胞接着領域は、細胞非接着領域に囲まれており、すなわち互いに隔離されており、好ましくは０．７５ｍｍ以上、より好ましくは１．５ｍｍ以上互いに離れて配置されている。すなわち、細胞接着領域間の最短距離（円の場合、二つの円の中心間の距離が、各半径の合計に上記値を加えた値となる）が好ましくは０．７５ｍｍ以上、より好ましくは１．５ｍｍ以上となるように配置される。各細胞接着領域を一定距離以上隔離することにより、各細胞接着領域内の細胞が他の細胞接着領域の細胞と細胞間結合を形成することなく均一に一定間隔で培養され、再現性の高い実験系を構築できる。
　基材における細胞接着領域の割合は、通常５～８０％であり、好ましくは２０～７０％、より好ましくは４０～６０％である。なお、この割合は、基材をディッシュ（シャーレ）等に配置する場合でも、ディッシュの底面は含めずに基材全体に対する細胞接着領域の割合とする。培養液に対する細胞の量を一定以上とすることで細胞の死滅を防止でき、一定以下とすることで生存に必要な因子の枯渇とそれによる細胞へのダメージを防止できる。
　また、各細胞接着領域は、規則的に一定の間隔で、例えば格子状に、縦横同じピッチで配置されていることが好ましい。各細胞接着領域の細胞からの産生物質によるパラクライン効果を一定にすることで、分化に与える影響を一定にすることができる。
　例えば、円形の細胞接着領域を複数有するパターンは、複数の円形の開口部を有するフォトマスクを用い、ＰＥＧ薄膜が形成されたガラス基板とフォトマスクを対向するように配置し、フォトマスクの側から紫外線を照射し、ＰＥＧ薄膜においてフォトマスクの開口部に相当する領域を酸化処理することにより形成することができる。
　本開示で用いられる基材は、多能性幹細胞の細胞接着領域への接着を促進する目的で、プレコート処理されていることが好ましい。プレコート処理は、細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、ビトロネクチン等）、ゼラチン、リジン、ペプチド、それらを含むゲル状マトリックス、血清等で基材をコーティングすることにより行うことができる。基材をプレコート処理することにより、接着性の低い多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）の細胞接着領域への接着を促進でき、細胞の接着培養および分化誘導を効果的に行うことができる。
　同様に、多能性幹細胞の細胞接着領域への接着を促進する目的で、多能性幹細胞の播種前にフィーダー細胞を播種して２４時間程度培養し、フィーダー細胞上で多能性幹細胞を培養することが好ましい。フィーダー細胞としては、当技術分野で通常用いられるものであれば特に制限されることなく用いることができ、例えば、線維芽細胞等が挙げられる。フィーダー細胞は、細胞培養基材に対し１．２６×１０５個／ｃｍ２未満の密度、好ましくは６．３×１０４個／ｃｍ２以下の密度で、好ましくは３．１５×１０４個／ｃｍ２以上の密度で播種される。
　上述したプレコート処理およびフィーダー細胞の播種は、それぞれを単独で行ってもよく、両方を組み合わせて行ってもよい。好ましくはプレコート処理およびフィーダー細胞の播種のいずれかが行われる。
（工程（ｂ））
　工程（ｂ）は、上述した工程（ａ）で準備された、細胞接着領域および細胞非接着領域を備える細胞培養基材上に多能性幹細胞を播種する工程である。
　細胞培養基材上に播種される多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、成体組織または臍帯血もしくは臍帯に由来する幹細胞等が挙げられる。これらの多能性幹細胞は１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。好ましい実施形態において、多能性幹細胞としてはＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞がそれぞれ単独で用いられる。
　本開示において用いられるＥＳ細胞は、好ましくは哺乳動物由来のＥＳ細胞であり、例えば、マウス等のげっ歯類またはヒト等の霊長類由来のＥＳ細胞が用いられ得る。好ましい実施形態において、ＥＳ細胞としてはマウスまたはヒト由来のＥＳ細胞が用いられる。ＥＳ細胞は、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞株を指し、生体外にて、理論上すべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させることができる。ＥＳ細胞としては、例えば、その分化の程度の確認を容易とするために、Ｐｄｘ１遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。例えば、Ｐｄｘ１座にＬａｃＺ遺伝子を組み込んだ１２９／Ｓｖ由来ＥＳ細胞株又は、Ｐｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンをもつＥＳ細胞ＳＫ７株等を用いることができる。あるいは、Ｈｎｆ３β内胚葉特異的エンハンサー断片制御下のｍＲＦＰ１レポータートランスジーンおよびＰｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンを有するＥＳ細胞ＰＨ３株を使用することもできる。
　本開示において用いられるｉＰＳ細胞は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。人工多能性幹細胞の作製については、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Rudolf Jaenisch)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（James Thomson）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Konrad Hochedlinger）らのグループ等を含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、ならびにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子およびＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
　ここで用いられる体細胞の種類は特に制限されず、任意の体細胞を用いることができる。すなわち、本明細書において体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞であってもよく、未分化の幹細胞であってもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に制限されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウス等のげっ歯類、ヒト等の霊長類）であり、特に好ましくはマウスまたはヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児または成人のいずれの体細胞を用いることもできる。体細胞としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、すい臓細胞、血球細胞、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓、眼、耳を構成する細胞等が挙げられる。
　ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉および内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本開示におけるｉＰＳ細胞はマウス等の試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
　体細胞からｉＰＳ細胞を作製するためには、まず、少なくとも１種類の初期化遺伝子が体細胞に導入される。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
　（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
　（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０　ｌａｒｇｅＴ遺伝子
　（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
　細胞培養基材に播種する前の多能性幹細胞は、非分化誘導化培地を用いて未分化性を維持したものとする。細胞培養基材の表面へ播種する前後において分化誘導化培地に切り換え、細胞培養基材の表面へ播種し、そのまま細胞を細胞接着領域内でコンフルエントになるまで増殖させる。得られた細胞集合体に対し酵素処理を行うことで目的とする分化誘導細胞を得ることができる。
　本開示で用いられる非分化誘導化培地は、多能性幹細胞を分化誘導させない培地であれば特に制限されないが、例えば、マウスＥＳ細胞およびマウスｉＰＳ細胞の未分化性を維持する性質を有することが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳ細胞の未分化性を維持する性質を有することが知られているｂａｓｉｃ　ＦＧＦを含む培地等が挙げられる。分化誘導化培地は、多能性幹細胞を分化誘導させる培地であれば特に制限されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清に代替する性質を有する既知成分を含有した無血清培地等が挙げられる。用いられる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。
　上述した各種培地には、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等が添加されていてもよい。例えば、０．１～２％のピルビン酸、０．１～２％の非必須アミノ酸、０．１～２％のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１～１％のグルタミン、０．１～２％のβメルカプトエタノール、１～２０ｍＭのＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）が添加されていてもよい。分化誘導培地には、液性因子を添加してもよいが、本開示における腸構造体の分化誘導方法によれば、液性因子を添加しなくても腸構造体を分化誘導することができる。したがって、一つの実施形態において、液性因子を含まない分化誘導培地を用いて細胞が培養される。
　細胞培養基材への多能性幹細胞の播種の方法は特に制限されるものではなく、細胞を播種する場合に通常用いられる方法によって播種することができる。本開示においては、多能性幹細胞は、細胞培養基材に対して、例えば１．２×１０５個／ｃｍ２未満、好ましくは３×１０４個／ｃｍ２以下、好ましくは１．５×１０４個／ｃｍ２以上の密度で播種される。
（工程（ｃ））
　工程（ｃ）は、上述した工程（ｂ）で細胞培養基材上に播種された多能性幹細胞を培地中で培養し、腸構造体を得る工程である。
　多能性幹細胞の培養は、通常３７℃で行われる。好ましくは、ＣＯ２細胞培養装置等を用いて、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養が行われる。
　本工程（ｃ）において用いられる培地は、多能性幹細胞を分化誘導させる培地であれば特に制限されるものではなく、多能性幹細胞の種類に応じて適宜選択することができる。培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられる。また、これらの培地には、必要に応じて血清、血清に代替する性質を添加されてもよい。
　多能性幹細胞を細胞培養基材へ播種後の培養期間は、好ましくは６０日以上、より好ましくは８０日以上、さらに好ましくは１００日以上であり、好ましくは２１０日以下、より好ましくは１４０日以下である。多能性幹細胞を細胞培養基材へ播種後６０日目において、腸の分化マーカーであるＶｉｌｌｉｎおよび５ＴＨが検出されること、さらには袋状の構造体が確認され、蠕動運動様の動きが観察されることが見出されている。工程（ａ）～（ｃ）により得られる腸構造体は、少なくとも内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含むが、その他の細胞を含んでいてもよい。
　上述したように、（ａ）～（ｃ）の各工程によって、多能性幹細胞から作製され、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体を得ることができる。得られた腸構造体は、後述する工程（Ｂ）に供される。
＜工程（Ｂ）＞
　工程（Ｂ）では、上述した工程（Ａ）で準備された腸構造体を培養して、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞の増殖が行われる。
　腸構造体の培養形態は、本開示の効果が奏される限り特に制限されないが、培養容器に接着させて細胞を培養する形態（いわゆる接着培養）であってもよく、培養容器に接着させずに細胞を培養する形態（いわゆる浮遊培養）であってもよい。好ましい実施形態において、腸構造体の培養は、腸構造体の少なくとも一部が培養容器に接触している状態で培養される。培養容器と腸構造体とは常時接触していてもよく、断続的に接触していてもよい。
　一つの実施形態において、腸構造体は培養容器中で浮遊培養され、培養容器中に添加された培地の量を適宜調節することにより、培養容器（例えば、底面、内壁等）と腸構造体の少なくとも一部とを接触させる。例えば、培養容器としてディッシュを用いる場合、ディッシュに浅く培地を添加して、腸構造体の少なくとも一部がディッシュのテイメント接触するように浮遊培養する。
　本工程（Ｂ）において用いられる培地は、線維芽細胞を分化誘導させ、増殖させる培地であれば特に制限されるものではなく、例えば、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられる。また、これらの培地には、必要に応じて血清、血清に代替する性質を添加されてもよい。
　腸構造体の培養は、通常３７℃で行われる。好ましくは、ＣＯ２細胞培養装置等を用いて、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養が行われる。
　腸構造体の培養は、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞がコンフルエントまたはほぼコンフルエントになるまで行うことが好ましい。培養期間は、線維芽細胞様細胞の増殖の速さ、用いられる培養容器の形状、大きさ等によって適宜設定することができる。腸構造体の培養期間は、例えば、１～６日、６～１２日、１２～７２日等とすることができる。
　本工程（Ｂ）では、上述した線維芽細胞様細胞に加えて、腸管上皮細胞様の性質を有する細胞（以下、「腸管上皮細胞様細胞」ともいう。）が増殖する場合がある。このように、本工程（Ｂ）により得られる腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞は、従来の幹細胞を起点としたオルガノイド培養により得られる腸管上皮細胞とは異なる性質を有する。例えば、本工程（Ｂ）により得られる腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞では、増殖細胞マーカーである細胞分裂関連タンパク質Ｋｉ－６７が局所的に存在することが本発明者らによって示されている。ここで、一般的に、腸管上皮細胞は、腸管上皮幹細胞として知られるＬｇｒ５（Leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5）について陽性の幹細胞から分化して生じるのみで、分化後の腸管上皮細胞が増殖して生じることはないことが一般的に知られている。したがって、上記のように本工程（Ｂ）により得られる腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞において、増殖細胞マーカーであるＫｉ－６７が局所的に存在するということは、腸管上皮細胞様細胞が分裂して新たな腸管上皮細胞様細胞が生じることを示唆するものと言える。すなわち、本工程（Ｂ）により得られる腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞は、従来のＬｇｒ５陽性の幹細胞に依存しない増殖をする可能性がある点で、特異な性質を有すると考えられる。また、本工程（Ｂ）により得られる腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞としては、特定のムチン質の発現によって確認される分泌系細胞や、特定のトランスポーターの発現によって確認される吸収上皮細胞等の、小腸の機能を担う様々な種類の細胞が得られる。
　本工程（Ｂ）により得られる腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞（すなわち、本開示のフィーダー細胞）および腸管上皮細胞様細胞は、互いに組み合わせて用いてもよく、それぞれを単独で用いてもよい。
＜工程（Ｃ）＞
　工程（Ｃ）では、上述した工程（Ｂ）で増殖した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞、すなわち本開示のフィーダー細胞が単離される。
　線維芽細胞様細胞の単離は、線維芽細胞を単離する場合に通常用いられる方法によって行うことができる。すなわち、公知の酵素処理、スクレーパーによるかき取り等の工程によって行うことができる。これらの工程は１種を単独で行ってもよく、２種以上を組み合わせて行ってもよい。
　一つの実施形態において、本工程（Ｃ）により得られる線維芽細胞様細胞は、ビメンチン、ＣＤ９０からなる群から選択される線維芽細胞のマーカーの少なくとも１種を発現する。好ましい実施形態において、本工程（Ｃ）により得られる線維芽細胞様細胞は、ＡＣＴＡ２、ＳＯＸ９、ＤＣＮからなる群から選択される遺伝子の少なくとも１種を発現する。
　一つの実施形態において、工程（Ｃ）では、上述した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞の単離に加えて、腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞の単離が行われる。具体的には、腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞の単離は以下の手順に従って行うことができる。まず、上述したように線維芽細胞様細胞を単離した後の腸構造体を含む培地を、腸管上皮細胞様細胞のみが生存可能な環境にする。例えば、培地にピューロマイシン、ペニシリン等の抗生物質を１００μｇ／ｍｌとなるように添加することにより、それらの抗生物質を代謝する活性（薬物代謝酵素：ＣＹＰ）を有する腸管上皮細胞様細胞のみが生存可能な環境とする。次いで、培地から死細胞を除去して、腸管上皮細胞様細胞を単離する。なお、培地に肝細胞が存在する場合、上述したような抗生物質の添加により肝細胞が生存し得るが、肝細胞は多核細胞の集団として顕微鏡下で容易に判別することが可能であるため、顕微鏡下で肝細胞を除去することにより腸管上皮細胞様細胞を単離することができる。また、肝細胞はＣＤＸ２に対する抗体を用いた免疫染色で染色されないため、そのような抗体を用いて肝細胞を判別および除去することにより腸管上皮細胞様細胞を単離することもできる。なお、腸管上皮細胞様細胞は互いに強い細胞間接着で接着していることから、腸管上皮細胞様細胞が他の細胞と層構造を形成している場合には、ピンセット等を用いて腸管上皮細胞様細胞を他の細胞から剥離して単離することができる。
＜工程（Ｄ）＞
　本開示のフィーダー細胞の作製方法は、上述した工程（Ａ）～（Ｃ）に加えて、工程（Ｃ）で単離された線維芽細胞様細胞を増殖させる工程（工程（Ｄ））をさらに含んでもよい。
　工程（Ｃ）で単離された線維芽細胞様細胞の培養は、線維芽細胞を培養する場合に通常用いられる方法によって行うことができる。
　本工程（Ｄ）において用いられる培地は、線維芽細胞を増殖させる培地であれば特に制限されるものではなく、例えば、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられる。また、これらの培地には、必要に応じて血清、血清に代替する性質を添加されてもよい。
　線維芽細胞様細胞の培養は、通常３７℃で行われる。好ましくは、ＣＯ２細胞培養装置等を用いて、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養が行われる。
　線維芽細胞様細胞の培養は、線維芽細胞様細胞がコンフルエントまたはほぼコンフルエントになるまで行うことが好ましい。培養期間は、線維芽細胞様細胞の増殖の速さ、用いられる培養容器の形状、大きさ等によって適宜設定することができる。線維芽細胞様細胞の培養期間は、例えば、３～７日、７～１２日等とすることができる。
［フィーダー細胞］
　本開示の一つの態様によれば、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている腸管上皮細胞等の細胞を維持するための線維芽細胞様細胞（すなわち、本開示のフィーダー細胞）が提供される。一つの実施形態において、本開示のフィーダー細胞は、特定の遺伝子発現プロファイルを示す。一つの実施形態において、本開示のフィーダー細胞は、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲＡ）、ＣＤ８１、フォークヘッド・ボックス・Ｌ１（Ｆｏｘｌ１）およびグレムリン－１（ＧＲＥＭ１）の各遺伝子を発現することを特徴とする。また、別の実施形態において、本開示のフィーダー細胞は、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ８１およびＧＲＥＭ１の各遺伝子を発現し、ＣＤ３４遺伝子を発現しないことを特徴とする。一つの好ましい実施形態において、本開示のフィーダー細胞は、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ８１、Ｆｏｘｌ１およびＧＲＥＭ１の各遺伝子を発現し、ＣＤ３４遺伝子を発現しないことを特徴とする。これらの本開示のフィーダー細胞によれば、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている腸管上皮細胞等の細胞について、二次元的に培養して維持または増殖させることができる。
　従来、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている腸管上皮細胞等の細胞を維持するためのフィーダー細胞はマウスにおいて研究が進んでいる。しかしながら、腸管上皮細胞等の細胞を単独で維持することができる（すなわち、完全なフィーダー能を有する）フィーダー細胞はこれまでに見出されておらず、複数種のフィーダー細胞を組み合わせて用いることにより腸管上皮細胞等の細胞の維持を達成しているのが現状である。また、従来見出されている代表的なフィーダー細胞としては、マウスのＴｒｏｐｈｏｃｙｔｅ、Ｔｅｌｏｃｙｔｅ等が挙げられるが、ＴｒｏｐｈｏｃｙｔｅはＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ８１およびＣＤ３４の各遺伝子を発現する一方、Ｆｏｘｌ１遺伝子を発現しないことが知られている。また、ＴｅｌｏｃｙｔｅはＰＤＧＦＲＡおよびＦｏｘｌ１の各遺伝子を発現する一方、ＣＤ８１およびＣＤ３４の各遺伝子を発現しないことが知られている。したがって、本開示のフィーダー細胞のように、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ８１、Ｆｏｘｌ１およびＧＲＥＭ１の各遺伝子を発現する細胞や、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ８１およびＧＲＥＭ１の各遺伝子を発現し、ＣＤ３４遺伝子を発現しない細胞はそもそも見出されておらず、そのような細胞が腸管上皮細胞等の細胞に対して優れたフィーダー能を有することは、従来まったく知られていなかった驚くべき発見と言える。
　一つの実施形態において、本開示のフィーダー細胞は、上述した工程（Ａ）～（Ｃ）および任意に工程（Ｄ）を経ることによって得ることができる。本開示のフィーダー細胞は、従来、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている細胞を二次元的に培養して維持または増殖させることができる。特に、本開示のフィーダー細胞は、従来のフィーダー細胞と比較して長期の培養（例えば、１０回以上の継代）にわたり、対象となる細胞に対するフィーダー能を発揮する。
　本開示のフィーダー細胞が用いられる対象となる細胞（以下、「対象細胞」ともいう。）は特に制限されないが、上述したような二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている細胞であることが好ましい。より具体的には、二次元的な培養時に継代や培養期間を経ることによるストレスによって急激な脱分化を生じやすい細胞であることが好ましい。そのような対象細胞としては、例えば、小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞、肝細胞、軟骨細胞等が挙げられる。一つの好ましい実施形態において、対象細胞は、小腸腸管上皮細胞、肝細胞である。したがって、一つの実施形態において、本開示のフィーダー細胞は、上述したような各細胞を二次元的な培養（平面培養）により維持または増殖させるためのフィーダー細胞である。すなわち、本開示のフィーダー細胞は、対象細胞を二次元培養により多数回（例えば、３回以上）継代した場合であっても、対象細胞が本来の性質を維持している限りにおいて、その性質が喪失されるのを抑制し、増殖させることができる。なお、本開示において、フィーダー細胞と対象細胞とは同一の個体に由来する（フィーダー細胞が特定の個体に由来する多能性幹細胞に由来し、対象細胞が同一の個体に由来する多能性幹細胞または天然細胞に由来する）ものであってもよく、異なる個体に由来する（フィーダー細胞が特定の個体に由来する多能性幹細胞に由来し、対象細胞が同種の別の個体に由来する多能性幹細胞または天然細胞に由来する）ものであってもよい。なお、「天然細胞」とは、個体中に存在し、人為的な操作が加えられていない状態（すなわち、「天然」）の細胞を意味し、具体的には、ヒトから採取された小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞、肝細胞、軟骨細胞等が挙げられる。
　一つの実施形態において、対象細胞は多能性幹細胞由来の細胞であり、好ましくは多能性幹細胞由来の小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞、肝細胞、軟骨細胞であり、より好ましくは多能性幹細胞由来の小腸腸管上皮細胞、肝細胞である。
　好ましい実施形態において、対象細胞は、上述した腸構造体から採取される腸管上皮細胞様細胞であり、特に好ましくは、本開示のフィーダー細胞を得るために工程（Ａ）で準備されたのと同一の腸構造体から採取される腸管上皮細胞様細胞である。このように、本開示のフィーダー細胞および腸管上皮細胞様細胞がいずれも同一の多官能性幹細胞から作製される同一の腸構造体に由来することにより、以下に述べるような利点がある。第１の利点として、フィーダー細胞および腸管上皮細胞様細胞の由来が同一の多官能性幹細胞であるため、それぞれの安全性を容易に確認することができる。具体的には、フィーダー細胞および腸管上皮細胞様細胞のそれぞれを分化・誘導させる前に、それらの由来となる多官能性幹細胞の安全性を確認するだけで、分化・誘導後のフィーダー細胞および腸管上皮細胞様細胞の安全性を確認することができる。また、フィーダー細胞および腸管上皮細胞様細胞の由来が同一の多官能性幹細胞であることから、分化・誘導後に異種由来の成分が入ることがない。したがって、分化・誘導後のこれらの細胞の一方または両方を用いる場合には異種由来の成分の混入の問題がなく、特に医療用途において、いわゆる「ゼノフリー」の細胞としてそのまま用いることができる。
　一つの実施形態において、上述した腸構造体から採取される腸管上皮細胞様細胞は、ＣＤＸ２、ＥＣＡＤ、ＺＯ－１、サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３からなる群から選択される腸管上皮細胞のマーカーの少なくとも１種を発現する。好ましい実施形態において、上述した腸構造体から採取される腸管上皮細胞様細胞は、ＣＤＸ２、Ｖｉｌｌｉｎからなる群から選択される腸管上皮細胞のマーカーの少なくとも１種を発現する。
　本開示のフィーダー細胞を用いて対象細胞を培養する場合、用いられるフィーダー細胞の継代数は特に制限されないが、例えば、２回以上、３回以上、５回以上、７回以上、１０回以上、１２回以上、１５回以上等とすることができる。一方で、用いられるフィーダー細胞の継代数は、例えば、２０回以下、１５回以下、１２回以下等とすることができる。
　本開示のフィーダー細胞は、単独で培養することにより、フィーダー細胞のみを増殖させることもできる。さらに、本開示のフィーダー細胞と特定の対象細胞とを共培養することにより、フィーダー細胞および対象細胞を共に増殖させることもできる。
　本開示のフィーダー細胞を単独で培養することにより、本開示のフィーダー細胞を含む培養物（細胞集団）、または本開示のフィーダー細胞からなる培養物を得ることができる。具体的には、本開示のフィーダー細胞を単独で二次元培養することにより、本開示のフィーダー細胞を含む二次元的な形状（例えば、シート状）を有する培養物、または本開示のフィーダー細胞からなる二次元的な形状（例えば、シート状）を有する培養物を得ることができる。なお、本明細書において、「培養物」および「共培養物」に関して、特定の細胞を「含む」とは、培養物中に特定の細胞以外の細胞が含まれ得ることを意味し、特定の細胞「からなる」とは、培養物中に特定の細胞以外の細胞が意図的に含まれないことを意味する。
　また、上述したように、本開示のフィーダー細胞は、対象細胞、特に二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている細胞を二次元培養により維持または増殖させることができる。したがって、本願発明のフィーダー細胞を用いて対象細胞を培養する（すなわち、本開示のフィーダー細胞と対象細胞とを共培養する）ことにより、本願発明のフィーダー細胞と対象細胞とを含む二次元的な形状（例えば、シート状）を有する共培養物、または本開示のフィーダー細胞と対象細胞とからなる二次元的な形状（例えば、シート状）を有する共培養物を得ることができる。特に、本開示のフィーダー細胞を用いることにより、従来は二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている細胞を二次元的に維持または増殖させることができることから、そのような細胞であっても二次元的な形状（例えば、シート状）を有する共培養物として得ることができる。例えば、フィーダー細胞の層と対象細胞の層とを含む共培養物として得ることができる。また、そのような共培養物から本開示のフィーダー細胞の一部または全部を分離して除くことにより、対象細胞を含む培養物、または対象細胞からなる培養物を得ることができる。具体的には、本開示のフィーダー細胞をシート状とし、そのシート上で、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている対象細胞を共培養して維持または増殖させることにより、対象細胞の二次元的な形状（例えば、シート状）の共培養物を得、次いで得られた共培養物から本開示のフィーダー細胞の一部または全部を分離して除くことにより、対象細胞を含む二次元的な形状を有する培養物、または対象細胞からなる二次元的な形状を有する培養物を得ることができる。一方、上記のようにして得られた共培養物から対象細胞の一部または全部を分離して除くことにより、本開示のフィーダー細胞を含む二次元的な形状を有する培養物、または本開示のフィーダー細胞からなる二次元的な形状を有する培養物を得ることもできる。
　一つの実施形態において、対象細胞は、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている腸管上皮細胞（例えば、小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞等）、肝細胞、軟骨細胞等の細胞であり、好ましくは腸管上皮細胞である。
　共培養物に含まれる本開示のフィーダー細胞と対象細胞との分離は、通常、細胞培養の分野で用いられている公知の方法を用いて行うことができる。一つの実施形態において、共培養物に本開示のフィーダー細胞と腸管上皮細胞様細胞とが含まれる場合、国際公開第２０１９／１３１９３８パンフレットに開示されている方法を用いて共培養物から腸管上皮細胞様細胞が単離される。
　一つの実施形態において、そのような本開示のフィーダー細胞と対象細胞との共培養物、対象細胞を含む共培養物、およびフィーダー細胞を含む共培養物は、いずれもいわゆる細胞シートとして用いることができる。細胞シートとは、細胞をシート状に培養して作製される薄い膜であり、生体組織に対して縫合糸を使わずに移植することができる、短時間で移植することができる等の利点を有し、このような特性を活かして様々な疾患の治療や組織再生に用いられている。したがって、一つの実施形態において、細胞シートは、疾患の治療用、組織再生のための移植材料用として用いられる。
　上述したように、本開示のフィーダー細胞は、対象細胞を二次元培養により維持または増殖させることができることから、細胞シート等の二次元的な形状を有する共培養物を容易に作製することができる。また、本開示のフィーダー細胞および対象細胞を共培養する培養容器の大きさや形状、培養時間等を適宜設定することにより、所望の大きさや二次元形状を有する細胞シートを作製することができる。従来、腸管上皮細胞等の細胞については二次元的な培養による維持および増殖が困難であったため、これらの細胞を主に含む細胞シート等の二次元的な形状を有する共培養物を作製することも容易ではなかった。そのため、例えば大きな細胞シート等を作製する場合には、作製可能な比較的小さい二次元形状を有する細胞シートを複数組み合わせて用いるしかなかった。一方、本開示のフィーダー細胞を用いることにより、そのような細胞であっても二次元培養により維持または増殖させることができ、その大きさや形状を適宜設定することもできるので、上述したように複数の細胞シートを組み合わせることなく大きな細胞シートを作製することができる。例えば、本開示のフィーダー細胞を用いることにより、直径が１ｃｍ以上、２ｃｍ以上、３ｃｍ以上、５ｃｍ以上、１０ｃｍ以上の円形や楕円形、同程度の大きさの多角形（例えば、四角形等）といった巨大な細胞シートを、複数の細胞シートを組み合わせることなく１枚の細胞シートとして作製することができる。このように、従来、二次元的な培養による維持および増殖が困難であった細胞について、複数の細胞シートを組み合わせることなく大きな細胞シートを作製できることは、本開示のフィーダー細胞がもたらす優れた効果の一つであると言える。例えば、クローン病においては、潰瘍の大きさ（直径）を指標として病状が判断され、直径が２ｃｍ以上である場合には治癒が困難であると判断される。したがって、このような巨大な細胞シートを１枚の細胞シートとして効率的に作製することによって、細胞シートによる治療が有効なクローン病等の治療に大いに貢献し得ると言える。
　また、特定の細胞に分化する前段階の前駆細胞を多能性幹細胞等から作製し、二次元培養で増殖培地によって増殖させた後、分化培地によって分化促進させて、機能的な細胞で構成される構造物を得る方法が従来知られている。ここで、目的の細胞が、二次元的な培養時に継代や培養期間を経ることによるストレスによって急激な脱分化を生じやすい細胞である場合には、分化培地による分化促進段階で脱分化が生じ、通常、目的の細胞の性質を長期間にわたり維持することができない。すなわち、目的の細胞の性質が長期間にわたり維持された構造物を得ることができない。しかしながら、本開示のフィーダー細胞を用いることにより、このような分化促進段階での脱分化を抑制することができ、目的の細胞の性質を長期間にわたり維持することが可能となる。したがって、本開示のフィーダー細胞は、目的の細胞の性質を長期間にわたり維持する必要がある構造物（例えば、移植材料、創薬ツール等）といった用途においても好適に用いることができる。
　また、本開示のフィーダー細胞は、異種由来成分を含まないように（いわゆる、ゼノフリー条件下で）作製することが可能である。したがって、上述したような細胞シート等の移植材料として用いられる場合には、その移植に際しての異種由来成分による危険性を排除することができる。また、実施例で示すように、本開示のフィーダー細胞を足場として、ヒトから採取された初代腸管上皮細胞を増殖させることができたことから、本開示のフィーダー細胞の単独での移植によって迅速な自家組織再生に寄与し得ると推測される。
　また、本開示のフィーダー細胞は、上述したようなフィーダー細胞としての機能の他にも様々な機能を有していると考えられる。したがって、本開示のフィーダー細胞の用途は、そのようなフィーダー細胞としての用途に限定されるものではなく、フィーダー細胞としての機能とは異なる機能が期待される用途に用いることもできる。
　例えば、本開示の一つの態様によれば、本開示のフィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）や、フィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）と小腸腸管上皮細胞、肝細胞等の各種細胞等の共培養物を含む医薬組成物が提供される。ここで、医薬組成物とは、本開示のフィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）や共培養物を、常法に従って、経口製剤または非経口製剤として調製したものである。製剤化には、製剤化のために許容可能な添加剤を併用してもよい。製剤化のために許容可能な添加剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。医薬組成物が経口製剤の場合には、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等の固形製剤、溶液、懸濁液、乳濁液等の液状製剤の形態をとることができる。また、医薬組成物が非経口製剤の場合には、注射剤や座剤、シート状の貼付剤、塗布用の懸濁液、スプレー等の形態をとることができる。
　医薬組成物の投与（適用）量は、本開示の効果が奏される限り特に限定されず、投与（適用）対象の年齢、健康状態、体重等に応じて適宜調整することができる。例えば、本開示のフィーダー細胞をシート状の貼付剤として、対象における粘膜の潰瘍の治療に用いる場合、貼付剤により潰瘍部分およびその周辺部分を完全に覆うように適用する。潰瘍が大きい場合には、複数の貼付剤を組み合わせて、貼付剤により潰瘍部分およびその周辺部分を完全に覆うように適用する。
　フィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）や共培養物は、その効果をよりよく発揮させるために、長期間にわたって継続的に摂取（投与）することが好ましく、摂取（投与）期間は、例えば、１～６週間、１～１２週間、２～１０週間、４～１０週間、４～１２週間等とすることができる。本明細書において「継続的」とは、医薬組成物を毎日決められた量摂取（投与）し続けることを意味する。
　本開示の別の態様によれば、フィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）や共培養物の有効量を対象に摂取（投与）させることを含む、該対象の疾患を治療する方法が提供される。上記方法は、非治療的方法であってもよく、治療的方法であってもよい。
　疾患を治療する方法において、フィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）や共培養物の投与量および摂取（投与）期間は、本開示の効果が奏される限り特に限定されず、疾患の種類、摂取（投与）対象の年齢、健康状態、体重等に応じて適宜調整することができる。
　本開示の別の態様によれば、上述した細胞シートを対象に適用することを含む、該対象の疾患を治療する方法が提供される。上記方法は、非治療的方法であってもよく、治療的方法であってもよい。
　疾患を治療する方法において、細胞シートの形状、大きさは、本開示の効果が奏される限り特に限定されず、疾患の種類、適用対象となる臓器や組織の種類、適用対象となる部分の形状や大きさ等に応じて適宜調整することができる。
　本開示の別の態様によれば、疾患の治療用組成物の製造のための、本開示のフィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）や共培養物の使用が提供される。
　上述した各態様において、本開示のフィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）、共培養物、細胞シートを用いて治療され得る疾患としては、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎等の消化管の潰瘍を伴う疾患、結腸癌術後等の消化管手術に伴う合併症等が挙げられる。
　上述した各態様において、本開示のフィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）を含む細胞シート、フィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）及び共培養物を含む細胞シート、共培養物を含む細胞シートは、ヒトまたは非ヒト動物の体に移植する用途、特に、臓器等における炎症部、創傷部、病変部、手術後の縫合部、腹腔、欠損した腸組織等を被覆する用途、で用いることができる。
　特に、本開示のフィーダー細胞（線維芽細胞様細胞）を含む細胞シート（すなわち、本開示の細胞シート）が、粘液分泌能、具体的にはムチン分泌能を有する場合、本開示の細胞シートの適用部分（例えば、潰瘍等における癒合部等）を保護する効果が高いため好ましい。本開示の細胞シートは、好ましくは炎症部、創傷部、病変部、手術後の縫合部、腹腔等に適用して癒合させることにより、適用部分を保護することができる。
　本開示の細胞シートは、好ましくは炎症部、創傷部、病変部、手術後の縫合部または腹腔に癒合させることにより、癒合部からの漏出、癒合部への漏出、あるいは癒合部への侵入を抑制することができる。
　本開示の細胞シートは、好ましくは炎症部、創傷部、病変部、手術後の縫合部または腹腔に癒合させることにより、癒合部の治癒に必要な細胞や細胞の足場を提供することができる。
　本開示の細胞シートは、好ましくは炎症部、創傷部、病変部、手術後の縫合部または腹腔に癒合させることにより、癒合部の異所への癒着を防止することができる。
　本開示の細胞シートは、好ましくは炎症部、創傷部、病変部、手術後の縫合部または腹腔に癒合させることにより、自己の免疫反応に伴う血球系細胞の消化管組織への浸潤の抑制等のように、免疫反応を抑制することができる。
　本開示の細胞シートは、好ましくは炎症部、創傷部、病変部、手術後の縫合部または腹腔に癒合させることにより、癒合部の炎症亢進を緩和することができる。本開示の細胞シートは、好ましくは手術後の縫合部に癒合させることにより、術後合併症を予防することができる。本開示の細胞シートは、好ましくは欠損した腸組織に移植することにより、腸機能を代替することができる。
　本開示の細胞シートは、内視鏡手術、開腹手術、腹腔鏡手術等のいずれにおいても、ピンセット等により保持し、所望の移植部位に貼り付けることができる。腹腔鏡手術等で移植が困難な部位に移植する場合には、本開示の細胞シートを、支持体と一体化した状態で移植してもよく、ワイヤー等のキャリアにより保持して移植してもよい。本開示の細胞シートは、生体適合性の支持体に固定し、支持体と共に移植することができる。
　本開示の細胞シートを生体に移植する場合、本開示の細胞シートおよび／または移植部位に、フィブリン等の生体適合性を有する接着補助物質を適用してもよい。また、本開示の細胞シートと移植部位とを縫合してもよい。
　本開示の細胞シートを移植部位に貼り付ける場合、例えば、本開示の細胞シートをピンセットで広げた状態にして移植部位に載せて貼り付けてもよく、本開示の細胞シートを移植部位に載せた後に広げてもよい。また、バルーン構造の治具により本開示の細胞シートを移植部位に押し付けるように貼り付けることもできる。
　本開示の別の態様は、以下の［１］～［２８］に関連する。
［１］細胞を維持または増殖させるためのフィーダー細胞を作製する方法であって、
　（Ａ）多能性幹細胞から作製され、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体を準備する工程、
　（Ｂ）前記腸構造体を培養して、前記腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞を増殖させる工程、および
　（Ｃ）前記線維芽細胞様細胞を単離してフィーダー細胞を得る工程
を含む、方法。
［２］前記腸構造体が、
　（ａ）基材と、前記基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域および各前記細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材を準備する工程、
　（ｂ）多能性幹細胞を、前記細胞培養基材に播種する工程、および
　（ｃ）前記播種した多能性幹細胞を培地中で培養する工程
を含む方法により作製されたものである、
［１］に記載の方法。
［３］（Ｄ）前記単離された線維芽細胞様細胞を増殖させる工程をさらに含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記工程（Ｂ）において、前記腸構造体が培養容器中で培養され、前記腸構造体の少なくとも一部が前記培養容器に接している、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記工程（ｃ）における培養の期間が６０日間以上である、［２］に記載の方法。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載の方法により作製される、フィーダー細胞。
［７］ＰＤＧＦＲＡおよびＣＤ８１が陽性であり、かつＦｏｘｌ１およびＧＲＥＭ１を発現する、線維芽細胞様細胞。
［８］ＰＤＧＦＲＡおよびＣＤ８１が陽性であり、ＣＤ３４が陰性であり、かつＦｏｘｌ１およびＧＲＥＭ１を発現する、［７］に記載の線維芽細胞様細胞。
［９］多能性幹細胞に由来するか、または多能性幹細胞から作製される腸構造体であって、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体の培養物に由来する、［７］または［８］に記載の線維芽細胞様細胞。
［１０］前記腸構造体が、
　（ａ）基材と、前記基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域および各前記細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材を準備する工程、
　（ｂ）多能性幹細胞を、前記細胞培養基材に播種する工程、および
　（ｃ）前記播種した多能性幹細胞を培地中で培養する工程
を含む方法により作製されたものである、
［９］に記載の線維芽細胞様細胞。
［１１］前記多能性幹細胞がヒト由来である、［９］または［１０］に記載の線維芽細胞様細胞。
［１２］小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞、肝細胞、軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞を維持または増殖させるためのフィーダー細胞である、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］～［１１］のいずれかに記載の線維芽細胞様細胞。
［１３］前記細胞を平面培養により維持または増殖させるためのフィーダー細胞である、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］～［１２］のいずれかに記載の線維芽細胞様細胞。
［１４］前記細胞を３回以上継代させることができるフィーダー細胞である、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］～［１３］のいずれかに記載の線維芽細胞様細胞。
［１５］［６］に記載のフィーダー細胞または［７］～［１４］のいずれかに記載の線維芽細胞様細胞を含む、細胞シート。
［１６］小腸腸管上皮細胞、肝細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞と、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］～［１４］のいずれかに記載の線維芽細胞様細胞との、共培養物。
［１７］前記細胞の継代回数が３回以上である、［１６］に記載の共培養物。
［１８］［１６］または［１７］に記載の共培養物を含む、細胞シート。
［１９］直径が１ｃｍ以上の円形または略円形である、［１８］に記載の細胞シート。
［２０］小腸腸管上皮細胞、肝細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞の層を含む、［１８］または［１９］に記載の細胞シート。
［２１］前記フィーダー細胞の層をさらに含む、［１８］～［２０］のいずれかに記載の細胞シート。
［２２］［１５］および［１８］～［２１］のいずれかに記載の細胞シートを含む、移植材料。
［２３］細胞を維持または増殖させるための方法であって、［６］に記載のフィーダー細胞または［７］～［１４］のいずれかに記載の線維芽細胞様細胞の存在下で前記細胞を培養する工程を含む、方法。
［２４］前記細胞の培養が平面培養である、［２３］に記載の方法。
［２５］前記細胞が、小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞、肝細胞、軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞である、［２３］または［２４］に記載の方法。
［２６］前記細胞と前記フィーダー細胞とが同一の個体に由来する、［２３］～［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］前記細胞と前記フィーダー細胞とが異なる個体に由来する、［２３］～［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］ＤＣＮ、ＡＣＴＡ２およびＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を発現し、かつ、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＮＯ１、ＢＬＩＤ、ＬＯＣ１００５０７０５３、ＬＨＸ８、ＳＦＲＰ４、ＡＨＲＲ、ＳＬＣ１４Ａ１、ＦＭＯ３、ＰＺＰ、ＡＢＣＧ４、ＥＹＡ２、ＴＭＥＭ９２－ＡＳ１、ＡＮＯ１０、ＥＧＦＬ６、ＳＮＣＡＩＰ、ＬＧＳＮ、ＰＣＤＨＢ１５およびＫＲＴＡＰ１－５の遺伝子を発現する細胞。
　以下、実施例を挙げて、本開示をさらに詳細に説明するが、本開示は、これらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］細胞培養基材の作製
　トルエン３９．０ｇ、メタクリロイルシランＴＳＬ８３７０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、撹拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間撹拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの５ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にメタクリロイル基を含む薄膜が形成された。
　ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧｄＡ、アルドリッチ製）１０ｇに重合開始剤２，２’－ジメトキシ－２－フェニル－アセトフェノン（ＤＭＰＡ、アルドリッチ製）０．１ｇを室温で溶かした。これを上記メタクリロイル化基板に１５００ｒｐｍで５秒間スピンコートした。その後、速やかに窒素雰囲気下で３秒間紫外線を基板全面に照射した。次いで１６０℃で１０分間ポストベークした。このＰＥＧｄＡ化基板を一晩水に浸漬した後に水洗し、次いで乾燥させた。なお、平均乾燥膜厚は、０．３３μｍであった。
　フォトマスクは、直径１．５ｍｍの円形の開口部が複数形成されたパターンを有する５インチサイズのもの用いた。フォトマスクの開口部間のスペース、すなわち開口部間の最短距離は全て０．３５ｍｍであった。
　マスクをＰＥＧｄＡ化基板のＰＥＧｄＡ面に静かに載せ、マスクの裏面側からキセノンエキシマーランプ（１７２ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２）を光源とする真空紫外線を１分間照射した。これにより、ＰＥＧｄＡ膜表面のフォトマスクの開口部に相当する領域を酸化処理した。次いで、基板を２．５ｃｍ角に切断して、細胞培養基材として用いた。
　得られた細胞培養基材における細胞接着領域の形状は円形で、その直径は１．５ｍｍであり、細胞接着領域間のスペース、すなわち細胞接着領域間の最短距離は全て０．３５ｍｍであった。
［実施例２］腸構造体の作製
　実施例１で作製された細胞培養基材の表面に多能性幹細胞（日本国　国立研究開発法人　国立成育医療研究センターが樹立したＥＳ細胞株であるＳＥＥＳ－２細胞）を約１×１０７個／ｃｍ２播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件のインキュベータ内で６０日間培養して分化誘導した。多能性幹細胞の培養には、ＸＦ３２培地を用いた。６０日間の分化誘導の後、細胞浮遊液ゼリー化試薬（ｉＰＧｅｌｌ、ジェノスタッフ株式会社製）を用いて培養物のゲル包埋行い、ゲル包埋された培養物を切断して、培養物の切片を作製した。多能性幹細胞の培養に用いたＸＦ３２培地の組成を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた培養物の切片を、腸の分化マーカーであるＶｉｌｌｉｎおよび５ＴＨのそれぞれに対する抗体を用いて免疫染色した結果、細胞接着領域においてＶｉｌｌｉｎおよび５ＴＨが検出され、袋状の構造体（すなわち腸構造体）が形成されていることが確認された（図１）。さらに、袋状の構造体が蠕動運動をすることが確認されたことから、蠕動運動に必要な内胚葉、中胚葉および外胚葉に由来する細胞が存在することが確認された。また、実体顕微鏡による観察の結果、袋状の構造体における蠕動運動様の動きも観察され、外胚葉であるＣａｊａｌ細胞、内胚葉である腸管上皮細胞、中胚葉である平滑筋の存在が確認できた。
［実施例３］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞の維持および増殖１
　実施例２で作製された腸構造体を、接着性を有する別の培養皿に移し３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベータ内の条件下で１７日間培養して、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を増殖させた。腸構造体の培養には、ＸＦ３２培地を用いた。なお、腸構造体の培養にあたっては、その少なくとも一部が培養容器の底面に常に接触するように培地の量を調節した。
　得られた線維芽細胞様細胞のみを、ＦＢＳを１０％となるように添加したＤ－ＭＥＭを用いて、週２回の培地交換と毎週の継代で拡大培養し、継代数７のストックを大量に得た。なお、得られたストックを２つに分けて、それぞれ－８０℃のフリーザー内または液体窒素入りのタンクの気相中で保存し、液体窒素入りタンクに保存したストックは、－８０℃のフリーザー内に移したのちに使用した。この線維芽細胞様細胞と腸管上皮細胞様細胞を５日間共に培養した。培養は、ＦＢＳを１０％となるように添加したＤ－ＭＥＭによって線維芽細胞様細胞を予め１週間程度培養し、次いで腸管上皮細胞様細胞を線維芽細胞様細胞上に播種するという手順で行った。腸管上皮細胞様細胞を播種した後の培養には、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ　１およびＷｎｔ３ａを含有するＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地（GlycoTechnica社）を用いた。２１日間（３継代）培養した後の腸管上皮細胞様細胞と、継代のたびに入れ替え１週間培養された継代数７の線維芽細胞様細胞との共培養物を、腸管上皮細胞のマーカーであるＣＤＸ２および線維芽細胞のマーカーであるＶｉｍｅｎｔｉｎに対する抗体を用いて免疫染色した結果、ＣＤＸ２およびＶｉｍｅｎｔｉｎが検出された（図２）。なお、図２において、左下の写真がＣＤＸ２の免疫染色写真を示し、右上はＤＡＰＩによる染色写真、右下はＶｉｍｅｎｔｉｎに対する抗体を用いた免疫染色写真、左上は上記３つの写真を融合（Ｍｅｒｇｅ）した写真である。また、図２の各写真において、スケールバーはいずれも１００μｍを示す。図２の写真から、線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を共培養した場合には、腸管上皮細胞様細胞が維持および増殖し得ることが示された。なお、Ｖｉｍｅｎｔｉｎは中胚葉のマーカーであり、ＣＤＸ２およびＶｉｌｌｉｎの発現がある腸管上皮細胞は内胚葉に由来するものと認められることから、図１および図２は、腸構造体における内胚葉および中胚葉に由来する各細胞の存在を裏付けるものであると言える。
　一方、得られた腸管上皮細胞様細胞を１４日間単独で２継代培養した。培養には、前記ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。１４日間（２継代）培養した後の培養物を、腸管上皮細胞のマーカーであるＣＤＸ２に対する抗体を用いて免疫染色した結果、ＣＤＸ２が極めて限られた細胞においてのみ検出された（図３）。なお、図３において、左下の写真がＣＤＸ２の免疫染色写真を示し、右上はＤＡＰＩによる染色写真、左上は上記２つの写真を融合（Ｍｅｒｇｅ）した写真である。また、図３の各写真において、スケールバーはいずれも１００μｍを示す。図３の写真から、腸管上皮細胞様細胞を単独で培養した場合には、腸管上皮細胞様細胞が維持されず、その性質を有する細胞が増殖し得ないことが示された。
［実施例４］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の維持および増殖２
　実施例３と同様の方法により作製した、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を共培養した。具体的には、継代数１２の腸管上皮細胞様細胞と、継代数７の繊維芽様細胞とを、７日間二次元的に共培養した。培養には、ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。共培養物をＩＰゲルに包埋した。ＩＰゲルに包埋され固定された共培養物をスライスして共培養物の切片を得、得られた切片を腸管上皮細胞のマーカーであるＣＤＸ２に対する抗体を用いて免疫染色した結果、ＣＤＸ２が検出された（図４）。なお、図４の写真において、スケールバーは５０μｍを示す。
［実施例５］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞の細胞極性
　実施例３と同様の方法により作製した、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を共培養した。具体的には、継代数１２の腸管上皮細胞様細胞と継代数７の繊維芽細胞様細胞とを、７日間二次元的に共培養した。培養には、ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。共培養物をＩＰゲルに包埋した。ＩＰゲルに包埋され固定された共培養物をスライスして共培養物の切片を得、得られた切片を腸管上皮細胞のマーカーであるＶｉｌｌｉｎに対する抗体を用いて免疫染色した結果、Ｖｉｌｌｉｎが検出された（図５）。さらに、生体の腸管上皮における管腔側（すなわち、Ａｐｉｃａｌ側）にＶｉｌｌｉｎが局在していることが確認された（図５）。これは、生体の腸管上皮におけるＶｉｌｌｉｎの局在と同様である。なお、図５において、左上の写真がＶｉｌｌｉｎの免疫染色写真を示し、右上はＤＡＰＩによる染色写真、左下は上記２つの写真を融合（Ｍｅｒｇｅ）した写真である。また、図５の各写真において、スケールバーはいずれも５０μｍを示す。
［実施例６］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞による腸管上皮細胞の維持
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する継代数７の線維芽細胞様細胞と、ヒトから採取した初代腸管上皮細胞とを共培養した。培養は、ＦＢＳを１０％となるように添加したＤ－ＭＥＭによって線維芽細胞様細胞を予め１週間程度培養し、次いで腸管上皮細胞を線維芽細胞様細胞上に播種するという手順で行った。腸管上皮細胞を播種した後の培養には、ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。継代数２（培養５日目）および継代数４（培養４日目）の各時点における細胞の顕微鏡写真を、それぞれ図６および７に示す。一方で、フィーダー細胞として、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞に代えて一般的に用いられるフィーダー細胞であるマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いた以外は上述したのと同様の条件下で、ヒトから採取した初代腸管上皮細胞の共培養をした。継代数２（培養５日目）および継代数４（培養４日目）の各時点における細胞の顕微鏡写真を、それぞれ図８および９に示す。なお、図６～９の各写真において、スケールバーはいずれも１００μｍを示す。
　図６および７の比較から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞によって、ヒトから採取した初代腸管上皮細胞が維持および増殖され得ることが示された。特に、腸構造体に由来する腸管上皮細胞ではない初代腸管上皮細胞が維持および増殖され得ることは特筆すべき点である。
　一方、図８および９の比較から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞ではないフィーダー細胞によっては、ヒトから採取した初代腸管上皮細胞が維持および増殖され得ないことが示された。特に、図９においては細胞が明確に扁平な形状に変化しており、これは脱分化した場合の典型的な変化である。
［実施例７］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞による肝細胞の維持
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する継代数７の線維芽細胞様細胞と、肝細胞とを共培養した。培養は、ＦＢＳを１０となるように添加したＤ－ＭＥＭによって線維芽細胞様細胞を予め１週間程度培養し、次いで肝細胞を線維芽細胞様細胞上に播種するという手順で行った。肝細胞を播種した後の培養には、ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。培養開始後８日目における細胞の顕微鏡写真を図１０に示す。
　図１０の写真の中央に幹細胞特有の多角化した細胞（矢印）が観察されることから、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞によって、肝細胞が維持および増殖され得ることが示された。
　また、通常、肝細胞の培養には、培養容器の適切なコートやマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）等のフィーダー細胞が必要とされるが、本開示のフィーダー細胞を用いることによりこれらを必要とすることなく肝細胞を培養することができることが示された。この結果は、本開示のフィーダー細胞が培養の足場として優れていることを示唆するものであり、本開示のフィーダー細胞が産生した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のみを脱細胞化処理等の手法で単離し用いるという用途を示唆するものでもある。
［実施例８］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞の遺伝子解析１
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞について、腸管および腸管を構成する部位特異的な細胞の遺伝子発現を解析した。さらに、生体における様々な種類の線維芽細胞との遺伝子発現を解析した。結果を図１１に示す。図１１中、「ＲＹＵ」および「ＬＯＮＧ」はそれぞれ実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞および線維芽細胞様細胞の遺伝子発現を表す。また、「ｈｕｍａｎ＿ＳＩ」はヒト小腸の全ＲＮＡに基づく遺伝子発現を表し、ＤｕＳＭＦｓ、ＤｕＳＰＦｓ、ＩＬＳＭＦｓおよびＩＬＳＰＦｓはそれぞれ十二指腸粘膜下、十二指腸腹膜下、回腸粘膜下および回腸腹膜下における粘膜近傍の線維芽細胞および漿膜近傍の線維芽細胞の遺伝子発現を表す。
　図１１に示す結果から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞は、同図に示す腸管および腸管を構成する部位特異的な細胞が発現する遺伝子の全てを発現することが示された。また、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞は、腸管および腸管を構成する部位特異的な細胞が発現する遺伝子に関して、生体における様々な種類の線維芽細胞とは大きく異なる遺伝子の発現パターンを有することが示された。これらの結果から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞は、生体における様々な種類の線維芽細胞とは異なり、腸管を構成する腸管上皮細胞等の細胞の維持および／または増殖を助け得ることが示唆された。
［実施例９］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞の遺伝子解析２
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞について、腸管および腸管を構成する部位特異的な細胞の遺伝子発現を解析した。さらに、ヒト小腸の全ＲＮＡに基づく遺伝子発現を解析した。結果を図１２－１に示す。図１２－１中、「ＲＹＵ０１」、「ＲＹＵ０２」および「ＲＹＵ０３」はいずれも実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞の遺伝子発現を表す。また、「ＬＯＮＧ０１」は実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞の遺伝子発現を表す。また、「ｈｕｍａｎ＿ＳＩ」はヒト小腸の全ＲＮＡに基づく遺伝子発現を表す。
　図１２－１に示す結果から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞は、図に示す腸管および腸管を構成する部位特異的な細胞が発現する遺伝子であるＮＯＧ、ＨＧＦ、ＷＮＴ５Ａ、ＧＲＥＭ１の各遺伝子を発現することが示された。ここで、ＮＯＧ、ＷＮＴ５ＡおよびＧＲＥＭ１は腸管上皮細胞を維持する因子として作用することが知られている（Hans Clevers et al., Gastroenterology, 2012;143:1518-1529, “Redundant Sources of Wnt Regulate Intestinal Stem Cells and Promote Formation of Paneth”を参照されたい。）。また、ＨＧＦは、結腸上皮細胞の恒常性維持に寄与することが知られている。したがって、これらの結果から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞は、腸管を構成する腸管上皮細胞様細胞等の細胞の維持および／または増殖を助け得ることが示唆された。
　また、実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞腸管上皮細胞様細胞について、各種のシグナル伝達タンパク質であるＷＮＴファミリーの遺伝子発現を解析した。結果を図１２－２に示す。図１２－２中、「ＬＯＮＧ０１」は実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞の遺伝子発現を表す。また、「ｈｕｍａｎ＿ＳＩ」はヒト小腸の全ＲＮＡに基づく遺伝子発現を表す。
　図１２－２に示す結果から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞は、ヒト小腸と比較して、ＷＮＴファミリー遺伝子の発現パターンに差があることが示された。この結果から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞は、ヒト小腸、すなわち天然の線維芽細胞とは異なるものであることが示唆された。
［実施例１０］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞の網羅的遺伝子解析による階層的クラスタリング
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞について、網羅的遺伝子発現解析による階層的クラスタリングを行った。さらに、ヒトから採取した初代腸管上皮細胞についても、網羅的遺伝子発現解析による階層的クラスタリングを行った。結果を図１３に示す。なお、図１３中、「Ｒｙｕ細胞」および「Ｌｏｎｇ細胞」はそれぞれ腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞および線維芽細胞様細胞を意味する。
　図１３に示す結果から、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞であるＬｏｎｇ細胞と共培養した腸管上皮細胞であるＲｙｕ細胞では、ヒト初代腸管上皮細胞（ヒトプライマリー腸管上皮細胞）との比較において、継代数と遺伝子発現のパターンとの相関が見られなかった。この結果から、腸構造体由来の線維芽細胞様細胞であるＬｏｎｇ細胞と共培養した腸管上皮細胞様細胞であるＲｙｕ細胞では、継代数による脱分化が生じていない（すなわち、Ｒｙｕ細胞が維持されている）ことが強く示唆される。
［実施例１１］腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞の細胞シートのバリア性
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を、Transwellの上に線維芽細胞様細胞を５日間培養してコンフルエントの状態にした後、腸管上皮細胞様細胞を６．０×１０４／ウェルとなるようにさらに播種し、７日間二次元的に共培養した。培養には、ＦＢＳを１５％となるように添加したＤ－ＭＥＭ培地を用いた。培養終了後、得られた共培養物を細胞シートとして、そのバリア性（内皮細胞抵抗値）を、チョップスティック型電極を用いて、電極をカップ挿入後、２０秒経過した時点の抵抗値を読み取り確認した。結果を図１４に示す。なお、図１４中、「Ｃａｃｏ２」は、一般的に創薬ツールとして用いられるＣａｃｏ－２細胞の細胞シートでありTranswell上に６．０×１０４／ウェルとなるよう播種し、１１日間培養したものを用いた、「Ｌｏｎｇ０５」は、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞の細胞シートを表す。また、「ＲＹＵ０１」、「ＲＹＵ０４」、「ＲＹＵ０５」および「ＲＹＵ０７」は、それぞれ異なるＥＳ細胞を用いて作製された異なる腸管上皮細胞様細胞を指し、「ＲＹＵ０５　ｏｎｌｙ」はバリア性（内皮細胞抵抗値）の測定２日前にピューロマイシンを用い、シートが剥がれない程度に繊維芽様細胞層のみ細胞死を引き起こしたサンプルである。
　図１４に示す結果から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を共培養して得られた「ＲＹＵ０５　ｏｎｌｙ」、「ＲＹＵ０１」、「ＲＹＵ０４」、「ＲＹＵ０５」および「ＲＹＵ０７」の細胞シートでは、一般的に創薬ツールとして用いられるＣａｃｏ－２細胞の細胞シートと同程度またはそれを上回るバリア性（内皮細胞抵抗値）を有することが示された。
［実施例１２］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物の形状およびトランスポーターの発現１
　実施例３と同様の方法により作製した、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を共培養した。具体的には、継代数１２の腸管上皮細胞様細胞と継代数７の線維芽細胞様細胞とを７日間二次元的に共培養した。培養には、ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。培養終了後、得られた共培養物の形状を顕微鏡で観察し、さらに共培養物をＩＰゲルに包埋した。ＩＰゲルに包埋され固定された共培養物をスライスして共培養物の切片を得、得られた切片を腸管上皮細胞のトランスポーターであるＰＥＰＴ１、ＢＣＲＰおよびＳＬＣ１０Ａ２に対する抗体を用いて免疫染色して、それぞれの発現を確認した。結果を図１５示す。なお、図１５の各写真において、スケールバーはいずれも５０μｍを示す。
　図１５に示す写真から、構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物が、腸管上皮に類似する形状をとること、および生体の腸管上皮におけるのと同様に生体の腸管上皮における管腔側（すなわち、Ａｐｉｃａｌ側）にトランスポーターが局在することが確認された。これらの写真から、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物が、腸の粘膜構造との機能の類似性を有することを示唆される。
［実施例１３］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞のトランスポーターおよび代謝酵素の発現
　実施例３と同様の方法により作製した、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を共培養した。具体的には、継代数１２の腸管上皮細胞様細胞と継代数７の繊維芽細胞様細胞とを７日間二次元的に共培養した。培養には、ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。各継代数の線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞について、腸管上皮細胞のトランスポーターであるＡＢＣＢ１、および代謝酵素ＣＥＳ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ６の発現を確認した。結果を図１６に示す。なお、図１６中、「ＲＹＵ」は腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞の遺伝子発現、「ＬＯＮＧ」は腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞の遺伝子発現、「ｈｕｍａｎ＿ＳＩ」はヒト小腸の全ＲＮＡに基づく遺伝子発現を表す。また、「５６５３」は細胞にピューロマイシン処理が行われたことを表す。
　図１６に示す結果から、腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞である「ＲＹＵ」においては、トランスポーターＡＢＣＢ１、および代謝酵素ＣＥＳ２、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ６が発現していることが確認された。また、図１６において細胞毒性を有する抗生物質であるピューロマイシンによる処理を行ったＲＹＵ５６５３が何れも生存し、また高いＣＹＰ３Ａ４転写量を示したことから、ピューロマイシンへの高いＣＹＰ応答性が確認された。これらのことから、腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞である「ＲＹＵ」が、高い薬物代謝活性を有することが確認された。
［実施例１４］維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞の共培養物における腸管上皮細胞様細胞の分裂の確認
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を共培養した。具体的には、継代数５の腸管上皮細胞様細胞と継代数１２の繊維芽細胞様細胞とを７日間二次元的に共培養した。培養には、ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。培養終了後、共培養物を細胞増殖のマーカーであるＫｉ－６７に対する抗体を用いて免疫染色した。結果を図１７に示す。なお、図１７の各写真において、スケールバーは５０μｍを示す。
　図１７の写真から、細胞増殖のマーカーであるＫｉ－６７が非局所的に存在していることが示された。この結果は、細胞の分裂が単一の細胞から生じる局所的なものではなく、非局所的に生じていることを示唆するものである。この結果から、少なくとも２つの可能性が示唆される。１つ目の可能性は、図１７の結果が、腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞（すなわち、本開示のフィーダー細胞）により対象細胞を増殖させる場合の特徴を示唆するというものである。２つ目の可能性は、図１７が、腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞が分裂して増殖することを示唆するというものである。すなわち、通常は、腸管上皮幹細胞（Ｌｇｒ５陽性幹細胞）から分化して生じるのみで、分化後の腸管上皮細胞が分裂、増殖して生じることはないとされている腸管上皮細胞が、腸管上皮細胞が分裂することにより増殖していることを示唆するというものである。
［実施例１５］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞の粘膜形成能の確認
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞および腸管上皮細胞様細胞を共培養した。具体的には、継代数７の腸管上皮細胞様細胞と継代数１２の繊維芽細胞様細胞とを３日間二次元的に共培養した。培養には、ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。培養終了後、共培養物をＩＰゲルに包埋し、アルシアンブルーにより染色した。結果を図１８に示す。なお、図１８ＡおよびＢの各写真において、スケールバーはそれぞれ５０μｍおよび２００μｍを示す。
　図１８の各写真に示される青の呈色はムチン質の存在を示し、腸管上皮細胞に区分される杯細胞の存在を示唆するものである。これは、本開示のフィーダー細胞が腸管上皮細胞の長期（多回数の継代）にわたる安定的な増殖に寄与するフィーダー能を奏し、本開示のフィーダー細胞を用いて増殖および維持培養された腸管上皮様細胞が腸内分泌能を維持することを示すものである。この結果から、本開示のフィーダー細胞を用いることにより、ムチン質そのものやムチン質を産生する細胞を大量に作製することが可能であり、ひいてはそのようなムチン質を大量に有する細胞シートの作製も可能であることが示唆される。動物が分泌するほぼすべての粘液にムチンが含まれており、動物の体内のほとんどの粘膜はムチンに覆われていることが知られていることから、本開示のフィーダー細胞は、医療分野、特に粘液や粘膜に関連する医療分野における応用が期待される。また、従来、一般的に創薬ツールとしてＣａｃｏ－２細胞が用いられているが、Ｃａｃｏ－２細胞は一般的にムチン質の分泌能を有さないとされることから、本開示のフィーダー細胞を用いることにより、Ｃａｃｏ－２細胞と比較してより生体に近いアッセイ系の提供が可能であることも示唆される。
［実施例１６］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞のフィーダー能の確認１
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞のフィーダー能を、ヒト胚性幹細胞に由来する従来のフィーダー細胞との比較として確認した。まず、従来のフィーダー細胞を、以下の手順に従って作製した。
　ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）であるＥＥＳ２を、ＲＯＣ阻害剤（Ｙ－２７６３２；１０μＭ）に曝露した後、０．５ｍＭのＥＤＴＡを用いて単一細胞に解離させ、９６ウェルプレートに１ウェル当たり５×１０３細胞の濃度で播種した。
　播種した細胞をＥＢ培地（７６％ＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＤＭＥＭ、２０％３５ｋＧｙ照射Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ　ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＸＦ－ＫＳＲ、Life Technologies）、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン－５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）、５０μｇ／ｍｌ　Ｌ－アスコルビン酸２－ホスフェート（Sigma-Aldrich））中で４日間培養して胚様体を形成させた。
　得られた胚様体を、ＮＭＰ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＰＳ（日本ハム株式会社）でコートしたＴ２５フラスコに移し、ＸＦ３２培地（８５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＤＭＥＭ、１５％３５ｋＧｙ照射ＸＦ－ＫＳＲ、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ、０．１ｍＭ　ＮＥＡＡ、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、５０μｇ／ｍｌ　Ｌ－アスコルビン酸２－ホスフェート、１０ｎｇ／ｍｌヘレグリン－１β（Recombinant human NRG-beta 1/HRG-beta 1 EGF domain；富士フイルム和光純薬株式会社）、２００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＧＦ－１（LONGR3-IGF-1；Sigma-Aldrich）、および２０ｎｇ／ｍｌヒトｂＦＧＦ（科研製薬株式会社））中で６０～７０日培養して、ｈＥＳ細胞由来細胞を得た。この細胞は間葉系細胞様の性質を有していたことから、ＥＳ細胞由来間葉系細胞とも称する。
　得られたｈＥＳ細胞由来間葉系細胞を、１０％ＦＢＳ（GibcoまたはHyClone）および１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを補充したα－ＭＥＭ培地中で維持して、フィーダー細胞（以下、「従来のフィーダー細胞」ともいう。）を得た。
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞（すなわち、本開示のフィーダー細胞）ついて、以下の手順に従って、フィーダー能を確認した。本開示のフィーダー細胞を大量培養して継代数７のフィーダー細胞を得、実施例３と同様に、腸管上皮細胞を得られたフィーダー細胞上に播種し培養して継代を繰り返した。継代を繰り返した腸管上皮細胞の各継代回数時におけるＰＤＬ（Population doubling level：縦軸）を、それぞれ図１９に示す。
　図１９に示す結果から、本開示のフィーダー細胞では、継代回数１～１６（Ｐ１～１６）のいずれの時点においても安定的な対象細胞（腸管上皮細胞）の増殖能が奏されることが確認された。すなわち、本開示のフィーダー細胞は、長期（多回数の継代）にわたり対象細胞の安定的な増殖に寄与するフィーダー能を奏することが示された。
［実施例１７］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞のフィーダー能の確認２
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞のフィーダー能（すなわち、本開示のフィーダー細胞）を、ヒト胚性幹細胞に由来する従来のフィーダー細胞との比較として確認した。具体的には、まず、実施例１６と同様の方法により作製した従来のフィーダー細胞を準備した。次いで、本開示のフィーダー細胞および従来のフィーダー細胞をそれぞれ、２４ウェルプレートに１ウェル当たり５×１０４細胞の濃度で播種し、ＦＢＳを１０％およびペニシリン－ストレプトマイシンを１％となるように添加したα－ＭＥＭ培地中で培養し、１日後に、腸構造体に由来する腸管上皮細胞様細胞（継代数３）を１ウェル当たり１．０×１０５の濃度で播種した。培養には、ＥＳＴＥＭ－ＨＥ培地を用いた。７日間（１継代）培養した後の培養物を、腸管上皮細胞のマーカーであるＣＤＸ２およびＶｉｌｌｉｎに対する抗体を用いて免疫染色した。従来のフィーダー細胞を用いて腸管上皮細胞様細胞を培養した結果を図２０に示す。なお、図２０において、左上の写真はＣＤＸ２の免疫染色写真を示し、右上はＶｉｌｌｉｎによる免疫染色写真、左下がＤＡＰＩによる免疫染色写真を示し、右下は培養後の腸管上皮細胞様細胞の顕微鏡写真を示す。
　図２０に示す結果から、従来のフィーダー細胞を用いて腸管上皮細胞様細胞を培養した場合には、中央に非常に大きく扁平な細胞が見られた。また、Ｖｉｌｌｉｎの発現は確認されたものの、ＣＤＸ２の発現はほぼ確認されなかった。この結果から、従来のフィーダー細胞を用いた場合には、通常は腸管上皮細胞で発現するＣＤＸ２の発現が失われ、短期間（少ない継代回数）で腸管上皮細胞様細胞の形質が変化することが示唆された。なお、結果は示していないが、本開示のフィーダー細胞を用いて腸管上皮細胞様細胞培養した場合には、同一の継代回数であってもＣＤＸ２およびＶｉｌｌｉｎの発現が確認され、腸管上皮細胞としての形質が維持されていることが確認された。
［実施例１８］腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞による軟骨細胞の維持
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する継代数７の異なる４種の線維芽細胞様細胞（すなわち、本開示のフィーダー細胞）のフィーダー能（軟骨細胞の維持）を確認した。具体的には、ヒト小児から採取された軟骨細胞（ＹＵＢ）、および上記４種の各線維芽細胞様細胞と共に培養した軟骨細胞のそれぞれについて、ラブリシンおよびＣＯＬ２Ａ１の発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより確認した。結果を図２１に示す。また、表中「ＹＵＢ」は小児検体から採取された軟骨細胞を示し、「４Ｒ」～「７Ｒ」はそれぞれ各線維芽細胞様細胞と共に培養した軟骨細胞を意味する（なお、図２１Ａの「６Ｒ」はデータが取得されなかった）。
　図２１の結果から、本開示のフィーダー細胞と共に培養した軟骨細胞４Ｒ～７Ｒにおいては、ヒト小児から採取された軟骨細胞であるＹＵＢと比較して、ラブリシンおよびＣＯＬ２Ａ１が高発現していることが確認された。ここで、ラブリシンは軟骨細胞のフィーダー細胞として知られる滑膜細胞において高発現する潤滑物質であり、ＣＯＬ２Ａ１は軟骨細胞において高発現する潤滑物質である。また、軟骨細胞は脱分化しやすい細胞であることが知られている。したがって、上記の結果は、ＹＵＢにおいては軟骨細胞が脱分化をして本来の性質を喪失して、ラブリシンはもちろんのことＣＯＬ２Ａ１の発現がほとんど認められなくなったのに対して、４Ｒ～７Ｒにおいては本開示のフィーダー細胞が滑膜細胞様の機能を発揮してラブリシンが高発現し、さらに軟骨細胞の本来の性質が維持されてＣＯＬ２Ａ１が高発現したものと考えられる。これらの結果から、本開示のフィーダー細胞は、軟骨細胞に対してフィーダー能を有していることが示唆された。
［実施例１９］本開示のフィーダー細胞の遺伝子発現プロファイルおよび免疫染色によるマーカー確認
　実施例３と同様の方法により作製した腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞（すなわち、本開示のフィーダー細胞）の細胞マーカーを、免疫染色によって確認した。具体的には、培養した線維芽様細胞をＩＰゲルに包埋して標本を作製し、ＰＤＧＦＲＡおよびＣＤ８１の細胞表面のタンパク質発現をそれぞれ一次抗体としてＣｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｉｎｃ．製のＰＤＧＦ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　α（Ｄ１Ｅ１Ｅ）　ＸＰ（登録商標）　Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡｂ、およびＥＸＢＩＯ社製のＡｎｔｉ－ＣＤ８１，　Ｍｏｕｓｅ－Ｍｏｎｏ（Ｍ３８）を用いて染色した。結果を図２２に示す。
　また、網羅的遺伝子発現により得られ正規化（Normalization）されたＦｏｘｌ１、ＣＤ３４およびＧＲＥＭ１の各遺伝子の発現を確認した。結果を図２３に示す。
　図２２および２３に示す結果から、本開示のフィーダー細胞においては、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ８１、Ｆｏｘｌ１およびＧＲＥＭ１の各遺伝子が発現しており、一方でＣＤ３４が発現していないことが確認された。
［実施例２０］細胞シートの作製
　本開示のフィーダー細胞を用いて、細胞シートを作製した。具体的には、本開示のフィーダー細胞を播種し、コンフルエントの状態になるまで培養した。次いで、腸管上皮細胞を、コンフルエントの状態になったフィーダー細胞の上に積層させる形で播種して、腸管上皮細胞がコンフルエントになり細胞間の結合によりシート構造を形成するまで培養した。次いで、本開示のフィーダー細胞の層と腸管上皮細胞の層との積層物を培養平面から剥離し、フィーダー細胞の層と腸管上皮細胞の層とを含む細胞シートを得た。
　得られた細胞シートの写真を、図２４に示す。図２４に示す結果から、本開示の細胞シートは、直径が１ｃｍ以上であることが確認された。
　本開示によれば、従来、二次元的な培養による維持および増殖が困難であるとされている細胞について、二次元的に培養して維持または増殖させるためのフィーダー細胞およびその作製方法が提供される。

Claims (28)

  1. 　細胞を維持または増殖させるためのフィーダー細胞を作製する方法であって、
    　（Ａ）多能性幹細胞から作製され、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体を準備する工程、
    　（Ｂ）前記腸構造体を培養して、前記腸構造体に由来する線維芽細胞様細胞を増殖させる工程、および
    　（Ｃ）前記線維芽細胞様細胞を単離してフィーダー細胞を得る工程
    を含む、方法。
  2. 　前記腸構造体が、
    　（ａ）基材と、前記基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域および各前記細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材を準備する工程、
    　（ｂ）多能性幹細胞を、前記細胞培養基材に播種する工程、および
    　（ｃ）前記播種した多能性幹細胞を培地中で培養する工程
    を含む方法により作製されたものである、
    請求項１に記載の方法。
  3. 　（Ｄ）前記単離された線維芽細胞様細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記工程（Ｂ）において、前記腸構造体が培養容器中で培養され、前記腸構造体の少なくとも一部が前記培養容器に接している、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　前記工程（ｃ）における培養の期間が６０日間以上である、請求項２に記載の方法。
  6. 　請求項１または２に記載の方法により作製される、フィーダー細胞。
  7. 　ＰＤＧＦＲＡおよびＣＤ８１が陽性であり、かつＦｏｘｌ１およびＧＲＥＭ１を発現する、線維芽細胞様細胞。
  8. 　ＰＤＧＦＲＡおよびＣＤ８１が陽性であり、ＣＤ３４が陰性であり、かつＦｏｘｌ１およびＧＲＥＭ１を発現する、請求項７に記載の線維芽細胞様細胞。
  9. 　多能性幹細胞に由来するか、または多能性幹細胞から作製される腸構造体であって、内胚葉由来細胞および中胚葉由来細胞を含む腸構造体の培養物に由来する、請求項７に記載の線維芽細胞様細胞。
  10. 　前記腸構造体が、
    　（ａ）基材と、前記基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域および各前記細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材を準備する工程、
    　（ｂ）多能性幹細胞を、前記細胞培養基材に播種する工程、および
    　（ｃ）前記播種した多能性幹細胞を培地中で培養する工程
    を含む方法により作製されたものである、
    請求項９に記載の線維芽細胞様細胞。
  11. 　前記多能性幹細胞がヒト由来である、請求項９に記載の線維芽細胞様細胞。
  12. 　小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞、肝細胞、軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞を維持または増殖させるためのフィーダー細胞である、請求項６に記載のフィーダー細胞または請求項７に記載の線維芽細胞様細胞。
  13. 　前記細胞を平面培養により維持または増殖させるためのフィーダー細胞である、請求項６に記載のフィーダー細胞または請求項７に記載の線維芽細胞様細胞。
  14. 　前記細胞を３回以上継代させることができるフィーダー細胞である、請求項６に記載のフィーダー細胞または請求項７に記載の線維芽細胞様細胞。
  15. 　請求項６に記載のフィーダー細胞または請求項７に記載の線維芽細胞様細胞を含む、細胞シート。
  16. 　小腸腸管上皮細胞、肝細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞と、請求項６に記載のフィーダー細胞または請求項７に記載の線維芽細胞様細胞とを含む、共培養物。
  17. 　前記細胞の継代回数が３回以上である、請求項１６に記載の共培養物。
  18. 　請求項１６に記載の共培養物を含む、細胞シート。
  19. 　直径が１ｃｍ以上の円形または略円形である、請求項１８に記載の細胞シート。
  20. 　小腸腸管上皮細胞、肝細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞の層を含む、請求項１８に記載の細胞シート。
  21. 　前記フィーダー細胞の層をさらに含む、請求項２０に記載の細胞シート。
  22. 　請求項１５または１８に記載の細胞シートを含む、移植材料。
  23. 　細胞を維持または増殖させるための方法であって、請求項６に記載のフィーダー細胞または請求項７に記載の線維芽細胞様細胞の存在下で前記細胞を培養する工程を含む、方法。
  24. 　前記細胞の培養が平面培養である、請求項２３に記載の方法。
  25. 　前記細胞が、小腸腸管上皮細胞、大腸腸管上皮細胞、肝細胞、軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞である、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 　前記細胞と前記フィーダー細胞とが同一の個体に由来する、請求項２３または２４に記載の方法。
  27. 　前記細胞と前記フィーダー細胞とが異なる個体に由来する、請求項２３または２４に記載の方法。
  28. 　ＤＣＮ、ＡＣＴＡ２およびＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を発現し、かつ、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＮＯ１、ＢＬＩＤ、ＬＯＣ１００５０７０５３、ＬＨＸ８、ＳＦＲＰ４、ＡＨＲＲ、ＳＬＣ１４Ａ１、ＦＭＯ３、ＰＺＰ、ＡＢＣＧ４、ＥＹＡ２、ＴＭＥＭ９２－ＡＳ１、ＡＮＯ１０、ＥＧＦＬ６、ＳＮＣＡＩＰ、ＬＧＳＮ、ＰＣＤＨＢ１５およびＫＲＴＡＰ１－５の遺伝子を発現する細胞。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018230102A1 (ja) * 2017-06-13 2018-12-20 大日本印刷株式会社 腸オルガノイド及びその作製方法
JP2022007610A (ja) * 2020-06-26 2022-01-13 国立研究開発法人国立成育医療研究センター 多能性幹細胞由来フィーダー細胞

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018230102A1 (ja) * 2017-06-13 2018-12-20 大日本印刷株式会社 腸オルガノイド及びその作製方法
JP2022007610A (ja) * 2020-06-26 2022-01-13 国立研究開発法人国立成育医療研究センター 多能性幹細胞由来フィーダー細胞

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAJIME UCHIDA, MACHIDA MASAKAZU, MIURA TAKUMI, KAWASAKI TOMOYUKI, OKAZAKI TAKUYA, SASAKI KENGO, SAKAMOTO SEISUKE, OHUCHI NORIAKI, : "A xenogeneic-free system generating functional human gut organoids from pluripotent stem cells", JCI INSIGHT, vol. 2, no. 1, 1 January 2017 (2017-01-01), pages 1 - 13, XP055645928, DOI: 10.1172/jci.insight.86492 *
YOKOMIZO R, FUJIKI Y, KISHI H, SAGO H, OKAMOTO A: "P-801 - Endometrial regeneration with establishment of improved culture methods for endometrial epithelial cells: co-culture with feeder cells", ABSTRACTS OF THE 36TH ANNUAL MEETING OF THE ESHRE, 1 July 2020 (2020-07-01), pages i501, XP093148353, Retrieved from the Internet <URL:https://www.eshre.eu/-/media/sitecore-files/Annual-meeting/Virtual2020/HUMREP35suppl1--ESHRE-2020-cropped.pdf> *

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