JP7418754B2 - 腸オルガノイド及びその作製方法 - Google Patents
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Description
空洞を内包する構造を有し、
長軸方向の長さが5mm以上であることを特徴とする腸オルガノイド。
(2) 内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む、(1)に記載の腸オルガノイド。
(3) 外表面に腸上皮細胞を含む、(1)又は(2)に記載の腸オルガノイド。
(4) 基材と、該基材の表面上に形成された細胞接着領域及び該細胞接着領域の周囲を囲う細胞非接着領域とを備える細胞培養基材上に、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞から選択される細胞を播種する工程1、及び
工程1で播種された細胞を培養する工程2
を含み、
工程2が、
工程1で播種された細胞の一部が、内胚葉系細胞へ分化すること、及び
工程1で播種された細胞の一部が、外胚葉系細胞へ分化すること
を含む腸オルガノイドの作製方法。
(5) 工程2において、工程1で播種された細胞の一部の内胚葉系細胞への分化時期が、工程1で播種された細胞の一部の外胚葉系細胞への分化時期よりも先である、(4)記載の方法。(6) 工程2が、工程1で播種された細胞の一部が、播種から播種後14日までに、内胚葉系細胞へ分化することを含む、(4)又は(5)に記載の方法。
(7) 工程2が、工程1で播種された細胞の一部が、播種後15日以降に、外胚葉系細胞へ分化することを含む、(4)~(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 工程2が、インスリン様増殖因子(IGF)、及び、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む培地中で細胞を培養することを含む、(4)~(7)のいずれかに記載の方法。
(9) 前記培地が、ヘレグリンを更に含む、(8)に記載の方法。
(10) 工程2を異種成分非存在条件で行う、(4)~(9)のいずれかに記載の方法。
(11) 基材と、該基材の表面上に形成された細胞接着領域及び該細胞接着領域の周囲を囲う細胞非接着領域とを備える細胞培養基材上に、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞から選択される細胞を播種する工程1、及び
工程1で播種された細胞を培養する工程2
を含み、
工程2が、インスリン様増殖因子(IGF)、及び、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む培地中で細胞を培養することを含む、腸オルガノイドの作製方法。
(12) 前記培地がヘレグリンを更に含む、(11)に記載の方法。
(13) 工程2を異種成分非存在条件で行う、(11)又は(12)に記載の方法。
(14) インスリン様増殖因子(IGF)、及び、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む、腸オルガノイド作製用分化誘導培地。
(15) ヘレグリンを更に含む、(14)に記載の腸オルガノイド作製用分化誘導培地。
(16) 異種成分を含まない、(14)又は(15)に記載の腸オルガノイド作製用分化誘導培地。
(17) (14)~(16)のいずれかに記載の腸オルガノイド作製用分化誘導培地、並びに、
基材と、該基材の表面上に形成された細胞接着領域及び該細胞接着領域の周囲を囲う細胞非接着領域とを備える細胞培養基材
を含む、腸オルガノイド作製用キット。
本発明の腸オルガノイドの作製方法によれば、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞から選択される細胞から、腸オルガノイドを容易に製造することができる。
本発明の分化誘導培地及びキットは、腸オルガノイドの作製に有用である。
本発明において「腸オルガノイド」とは、細胞の起源生物の腸、特にヒト等の哺乳動物の腸、特にヒト腸に類似した機能(具体的には、蠕動運動する機能、粘液分泌機能、物質吸収機能等)を有する組織構造体を指す。
(i)Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子
(ii)Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
(iii)Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 largeT遺伝子
(iv)Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子
腸オルガノイドは好ましくは、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む。
腸オルガノイドは更にトランスポーター陽性細胞を含み、トランスポーターを介した物質の取り込みが可能であることが好ましい。トランスポーターとしては、腸オリゴペプチドトランスポーター(PEPT1)、ATP結合カセット(ABC)トランスポーターであるABCB1及びABCG2等が例示できる。
腸オルガノイドは更にヒスタミンH1受容体陽性細胞を含むことが好ましい。
本発明の腸オルガノイドは、以下の工程:
基材と、該基材の表面上に形成された細胞接着領域及び該細胞接着領域の周囲を囲う細胞非接着領域とを備える細胞培養基材上に、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞から選択される細胞を播種する工程1、及び
工程1で播種された細胞を培養する工程2
を含む方法により作製することができる。
本発明で用いる細胞培養基材では、好ましくは、細胞非接着領域のなかに細胞接着領域が島状に複数存在する。
-((CH2)2-O)m-
(mは重合度を示す整数である)
で表される構造を指す。mは、好ましくは1~13の整数であり、より好ましくは1~10の整数である。
工程1において、細胞培養基材に播種する前の胚性幹細胞及び/又は人工多能性幹細胞は非分化誘導培地を用いて未分化性を維持したものとする。細胞培養基材表面へ播種する前後において分化誘導培地に切り換え、基材表面へ播種する。
工程2における培養温度は、通常37℃である。CO2細胞培養装置などを利用して、5%程度のCO2濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。
工程1で播種された細胞の一部が、内胚葉系細胞へ分化すること、及び
工程1で播種された細胞の一部が、外胚葉系細胞へ分化すること
を含む。
本発明はまた、IGF及びbFGFを含む、腸オルガノイド作製用分化誘導培地を提供する。 この腸オルガノイド作製用分化誘導培地の詳細は既述の通りである。
このキットにおける細胞培養基材は、腸オルガノイド作製方法に関して既述の通りである。
(一段階目の反応)
トルエン58.5g、エポキシシランTSL8350(モメンティブパフォーマンスマテリアルズ社製)20.25gを混合し、この混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。あらかじめUV洗浄した5 インチ角のガラス基板を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、20時間室温で放置した。その後、下地処理されたガラス基板をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。乾燥後の基板表面の水の接触角の平均値は56°であった。こうして、エポキシシラン処理された基板を得た。
ポリエチレングリコール(分子量400)45 gを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシシラン処理された基板を上記のポリエチレングリコールに浸漬し、120℃で30分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成されたガラス基板を作ることができた。
フォトマスクは、同じ大きさの円形の開口部が複数形成されたパターンを有する5インチサイズのものを用いた。フォトマスクは、1.5 mmの円形の開口部が形成され、開口部間のスペース、すなわち開口部間の最短距離は全て0.35 mmのパターンを有するものであった。
2.1. 細胞株
ヒトES細胞(hESC)株のSEES1、SEES2及びSEES3は、国立成育医療研究センターの生殖・細胞医療研究部で樹立したものを用いた(Akutsu H, et al. Regen. Ther. 2015;1:18-29)。これらのES細胞を、市販の無血清DMEM 商品名:KnockOutTM D-MEM (Thermo Fisher Scientific)に、20% KnockOutTM血清代替物(KnockOut Serum Replacement)(Life Technologies)、0.1 mM 非必須アミノ酸(NEAA)、1mM ピルビン酸、2 mM GlutaMAX-I、0.055 mM β-メルカプトエタノール、50 U/mlペニシリン / 50 μg/mlストレプトマイシン (Pen-Strep)、及び8 ng/mlリコンビナントヒトbFGF (全てLife Technologiesから購入)を添加した培地において、γ線照射処理マウス胚線維芽細胞 (MEF) フィーダー層上で維持した。培地は2日毎に交換した。概ね一週間に一度の頻度で、酵素的方法(dispase; Wako Pure Chemical Industries) 又は機械的方法(EZPassage; Life Technologies)を用いて細胞を継代した。
本発明者はこれまでの研究においてヒトES細胞を樹立し増殖させるための異種成分不含有(ゼノフリー、XF)条件を確立している(Akutsu H, et al. Regen. Ther. 2015;1:18-29)。ヒトES細胞を、85% KnockOutTM D-MEM、15% KnockOutTM血清代替物(Knockout Serum Replacement)XF CTS (XF-KSR; Life Technologies)、1mM ピルビン酸、2 mM GlutaMAX-I、0.1 mM NEAA、Pen-Strep、50 μg/ml L-アスコルビン酸2-リン酸 (Sigma-Aldrich)、10 ng/ml ヘレグリン-1β (リコンビナントヒトNRG-β1/HRG-β1 EGFドメイン; R&D Systems), 200 ng/ml リコンビナントヒトIGF-1 (LONG R3-IGF-1; Sigma-Aldrich)、及び、20 ng/ml ヒトbFGF (Life Technologies)を含む、XF hESC培地中で安定に維持した。
なお培地組成に関し「%」は、特に限定の明示の無い場合は体積%を指す。
分化誘導培地1 (本明細書中で「XF-KSR(-)培地」と言う場合がある): 80% KnockOutTMD-MEM、20% KnockOutTM血清代替物(Knockout Serum Replacement)XF CTS (XF-KSR; Life Technologies)、1mM ピルビン酸、2 mM GlutaMAX-I、0.1 mM NEAA、Pen-Strep、0.055 mM β-メルカプトエタノール、10 μMのY-27632を含む培地
分化誘導培地2 (本明細書中で「XF hESC培地」と言う場合がある): 85% KnockOutTMD-MEM、15% KnockOutTM血清代替物(Knockout Serum Replacement)XF CTS (XF-KSR; Life Technologies)、1mM ピルビン酸、2 mM GlutaMAX-I、0.1 mM NEAA、Pen-Strep、50 μg/ml L-アスコルビン酸2-リン酸 (Sigma-Aldrich)、10 ng/ml ヘレグリン-1β (リコンビナントヒトNRG-β1/HRG-β1 EGFドメイン; R&D Systems), 200 ng/ml リコンビナントヒトIGF-1 (LONG R3-IGF-1; Sigma-Aldrich)、及び、20 ng/ml ヒトbFGF (Life Technologies)を含む培地
分化誘導培地3 (本明細書中で「XF-KSR培地」と言う場合がある): 80% KnockOutTMD-MEM、20% KnockOutTM血清代替物(Knockout Serum Replacement)XF CTS (XF-KSR; Life Technologies)、1mM ピルビン酸、2 mM GlutaMAX-I、0.1 mM NEAA、Pen-Strep、0.055 mM β-メルカプトエタノールを含む培地
浮遊するオルガノイドを、前記分化誘導培地2を入れた培養プレート中に移し、ZILOS-tk system (Hamilton Thorne)のカメラ(Cohu 3600)を備えた倒立顕微鏡を用いてビデオ記録し分析した。収縮する腸オルガノイドの数を数えるために、1つのプレート上で生成された、ヒト胚性幹細胞(hESC)浮遊オルガノイドを全て新しいディッシュに移し、10分間記録した。蠕動様の収縮運動をするオルガノイドを陽性と評価した。
RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてオルガノイドからRNAを単離し、混入しているDNAを、DNase (Life Technologies)を用いて除去した。cDNAは、SuperScript III逆転写酵素及びオリゴ-dTプライマー(Life Technologies)を説明書に基づいて使用して合成した。定量的RT-PCRを、SYBR Green PCR Master mix 及び QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System (Life Technologies)を用いて行った(n=3)。プライマー配列を下記表に示す。
オルガノイドを、4%パラホルムアルデヒド含有PBS (Wako Pure Chemical Industries)を用い5分間4℃条件で固定し、0.2% Triton X-100を用い2分間室温条件で透過処理し、更に必要に応じて各抗体について5%通常血清含有PBSによりブロッキング処理した。前記処理後のオルガノイドを4℃条件で、次の抗原に対する一次抗体とともに終夜インキュベートした。抗原は次の通り: ビリン (sc-7672, 1:50, Santa Cruz Biotechnology); E-カドヘリン(610181, 1:50, BD Pharmingen); CGA (ab16007, 1:100), CDX2 (ab76541, 1:100), 及びPGP9.5 (ab8189, 1:10) (Abcamより); DEFA6 (HPA019462, 1:500) 及びSMA (A2547, 1:400) (Sigma-Aldrichより); MUC2 (sc-7314, 1:50, Santa Cruz Biotechnology); LGR5 (LMC-1235, 1:100, Medical & Biological Laboratories); CKIT (NB100-77477AF488, 1:10, Immuno-Biological Laboratories); Na+/K+-ATPase (NB300-146, 1:100, Novus Biologicals); S-100 (422091, 1:100, Nichirei Biosciences); ニューロフィラメント(M076229, 1:50, Dako); β-アクチン(A5316, 1:1,000, Sigma-Aldrich); ヒスタミンH1レセプター (aa471-484, 1:200, LSBio); 及びCFTR (ab131553, 1:100, Abcam)。Alexa 488- 又は Alexa 546-標識された、抗マウス、抗ウサギ又は抗ヤギ二次抗体(BD Biosciences)を用いた。細胞核をDAPI により対比染色した。LSM 510 Meta Laser Scanning Confocal Microscope (Carl Zeiss Microscopy)を用いて蛍光を分析した。
オルガノイドを4%パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、4 μm厚の切片に切り分けた。切片を1つおきにスライドに設置し、H&E染色し、分析した。Alcian Blue染色のために、3%酢酸溶液中の1% Alcian BlueでpH 2.5、20分間の条件でインキュベートし、次いで、0.1% Nuclear Fast Red中で2分間インキュベートし、エタノール中で脱水し、キシレンを用いて透徹した。
腸オルガノイド試料の電子顕微鏡観察は、標準的なプロトコールに沿って行った(Tokai Electron Microscopy)。すなわち、オルガノイドを、PBS中2%パラホルムアルデヒド及び2%グルタルアルデヒドを用いて固定し、脱水し、エポキシ樹脂中に包埋した。重合完了後に前記試料を70 nmの切片に切り出し、銅グリッド上に設置し、Veleta CCD カメラ(Olympus)を備えるJEM-1200EX TEM (Jeol Ltd.)により観察した。
腸の臓器の形成過程における分化を調べるために、本発明者らは、腸の細胞株に特異的なリポーター構築物(pPB-hLgr5p-EGFP-neo)を構築した。このpPB-hLgr5p-EGFP-neoは、5-kb LGR5プロモーター及びホスホグリセリンキナーゼ (PGK) プロモーターを含み、それぞれEGFP及びネオマイシン耐性遺伝子(neo)の発現を促進する。SEES1細胞を、Y-27632とともに24時間培養したのちエレクトロポレーションに供し、PBSで洗浄し、Accuutase溶液(Life Technologies)を用いて回収し、iPSellon培地中で再懸濁した。強いピペッティングにより細胞を分離させて単細胞懸濁液とし、1~2×106 細胞をペレットにし、Opti-MEM (Life Technologies)中で、pPB-hLgr5p-EGFP-neoレポーターベクター及び過活性PiggyBacトランスポザーゼ発現ベクター(pCMV-hyPBase) (A. Bradley, Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambge, United Kingdomから提供されたもの)と混合した。こうして得られた細胞懸濁液をキュベットに移し、NEPA21 Super Electroporator (Nepa Gene)を用いてエレクトロポレーションを行いトランスフェクト細胞を得た。トランスフェクト細胞をG418 (Sigma-Aldrich)で選択した。
分化誘導培地2中で増殖した腸オルガノイドを、PBSで洗浄し、25 μMの蛍光標識ジペプチドβ-Ala-Lys-AMCA (Biotrend Chemicals)を含むDMEM中で4時間、37℃にて培養した。阻害実験のため、1 mMの、アンギオテンシン変換酵素阻害剤であるカプトプリル(Sigma-Aldrich)を添加した又は無添加の条件にて、1時間培養し、PBSでリンスし、同一のディッシュに入れ、蛍光顕微鏡(Olympus)により観察した。更に、β-Ala-Lys-AMCAの取り込み量を定量するために、腸オルガノイドを、10 μM, 100 μM又は1 mMのカプトプリルを添加した又は無添加の条件にて培養し、AMCA関連シグナルを、トップステージインキュベーター(5% CO2、37℃)を備えた蛍光顕微鏡(BZ-X710; Keyence)を用いて観察し、蛍光シグナル強度を、Hybrid Cell Count/BZ-H3C (Keyence)を用いて定量した。試料画像はいずれも標準的な条件にて記録した。各濃度条件について、3つの独立したアッセイを行った。
蠕動様の動きを示すヒト胚性幹細胞(hESC)由来腸オルガノイド(培養第80-90日)の1つを、蠕動を刺激するヒスタミン(0.2 μM)及び抗コリン薬である硫酸アトロピン(0.2 μM)により処理した。倒立顕微鏡を用いて収縮性応答を記録した。画像解析ソフトウェアCL-Quant version 3.10 (Nikon Corporation)を用いて腸オルガノイドの動きを可視化した。第一にタイムラプスイメージの各フレームにおいて、前記ソフトウェアを用いてオルガノイドの特定の領域を特定した。第二に、前記ソフトウェアにより前記領域に楕円をフィッティングし、最長径と最短径の比を算出してアスペクト比とした。このアスペクト比の経時変化をチャート上にプロットした。毎秒30フレームでビデオ撮影を行った。
100 μlの培地を含むARTカルチャーディッシュ12 (NIPRO)の1つのウェル内に1つのオルガノイドを入れた。CMVプロモーターの制御によりEGFPを恒常的に発現するEGFP-ヒト胚性幹細胞(hESC)に由来するオルガノイドを用いて体積変化を可視化した。5 μMフォルスコリンを加え、オルガノイドの形態を、タイムラプス蛍光レーザー共焦点顕微鏡(Keyence)によりモニターした。CFTRを阻害するために、オルガノイドを、50 μM のCFTR阻害剤CFTRinh172及び50 μM GlyH-101 (TOCRIS)とともに予め3時間インキュベートした。トップステージインキュベーター (5% CO2、37℃)中で20 分間に亘り1分毎に画像を取得した。各実験条件について3つのウェル中で評価した。すべての実験条件においてDMSO濃度は、0.2% (w/v)を超えない範囲で同一の濃度とした。オルガノイドの表面積を、Hybrid Cell Count/BZ-H3C (Keyence)を用いて計測した。正規化したオルガノイドの総表面積を求め、各実験条件につき3つの別個のウェルからの測定値の平均値を求めた。
腸オルガノイドの生体内での成長を確認するために、CLEA Japanから購入した免疫不全ヌードマウス(BALB/cAJcl-nu/nu)に移植した。培養第35日の腸オルガノイド1つをマウスの腎臓被膜の下に移植した。移植を施したマウスを6週間後に頸椎脱臼により安楽死させ、その腎臓をMVX10蛍光顕微鏡(Olympus)により観察した。オルガノイドを移植した部位を、H&E染色及び免疫細胞化学により更に分析した。
量的データは、少なくとも3つの独立した実験から得た平均値±SEMの値として示す。統計解析は、unpaired, 2-tailed t検定又はMann-Whitney順位和検定を用いて行った。P < 0.05を、統計的な有意差があるものとみなした。
代表的な結果を図1A~図9Bに示す。
図1A~図1Dは、細胞接着領域のパターンが形成された細胞培養基材での、ヒト多能性幹細胞からの、蠕動能を有する腸オルガノイドの形成について説明する図である。
図2A~図2Dは、腸オルガノイドの分化の特徴を説明するための図である。
図3A~図3Cは、腸オルガノイドの特徴と、腸オルガノイドの形成過程における、LGR5-EGFP陽性細胞の検出の結果を示す図である。
図4A~図4Fは、腸オルガノイドの蠕動能について説明するための図である。
図5A~図5Cは腸オルガノイドの吸収機能を説明する図である。
図6A及び図6Bは腸オルガノイドのCFTRトランスポート活性を説明する図である。
図7A~図7Dは、蠕動能を有しない腸オルガノイドの特徴を示す。
図8A~図8Dは、腸オルガノイド(培養第35日)を移植した時、腸管の高度な構造が形成されることを示す。
図9A、図9Bは、ヒトiPS細胞由来の腸オルガノイドの培養過程での変化を示す。
一般に組織の自己形成は主に3つのステップ:自律的な集合、自己パターニング、自己形態形成、からなる(Sasai Y. Nature. 2013;493(7432):318-326)。本実験では、この概念を利用して、細胞パターンが膨らむ段階、及び、自己形態形成の段階を経る、腸の形態形成を誘導するものである (図1A)。第一工程では、XF培地(Akutsu H, et al. Regen. Ther. 2015;1:18-29)中で培養されたヒト胚性幹細胞(hESCs)又はヒトiPS細胞(hiPSCs)が、分化誘導培地2中で、細胞培養基材(Okochi N, Okazaki T, Hattori H. Langmuir. 2009;25(12):6947-6953)におけるガラス表面上の細胞接着領域の円形パターンに集合した。細胞接着領域に集合した細胞は、培養第7日以降に半球ドーム状の構造を形成した (図 1C)。続いて、空洞を有する大きな構造体が形成された。この構造体は、自己形成された細胞塊による、上皮が折り畳まれ、嚢胞様突起を呈し、培養第20日までに、立方上皮細胞により被覆された。培養第30日までに、自己形成された嚢胞状のスフェロイドが細胞培養基材から遊離した。遊離したスフェロイドは2種類に大別できた。一つは、細胞からなる薄い壁を備える、簡単な嚢胞状のスフェロイドであった。もう一つは、中実の部分と、部分的に嚢胞状の突起とを有する、二成分スフェロイドであった。特筆すべきことは、後に蠕動能を持つものはこの二成分スフェロイドであった。このようなスフェロイドは全ての遊離したスフェロイドのうちの 4% (791個のうち34個、n=3)であり、長期間にわたって維持された(図1D参照)。このことは、異なる胚葉に由来する細胞種が機能を持つ細胞ネットワークを形成して集合したオルガノイドが形成されたことを示唆する。
蠕動能、ペプチド吸収性、粘液分泌能という腸に特有の機能を腸オルガノイドが備えるかを調べた。腸オルガノイドは収縮運動を示すことから、機能的に成熟した間葉層の存在が示唆された。腸の運動は、腸管神経系及びカハール介在細胞(ICC)等のペースメーカー細胞により制御される(Sanders KM, Koh SD, Ward SM. Annu Rev Physiol. 2006;68:307-343; uizinga JD, Lammers WJ. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009;296(1):G1-G8)。腸の収縮運動にどの細胞種が関与しているかを特定するために、免疫化学的分析を行った。中胚葉由来の平滑筋細胞は、α-平滑筋アクチン(SMA)を染色することにより、粘膜下層領域に確認された(図4A)。このことから、オルガノイドの形成には中胚葉が関与していることが示された。腸上皮下の筋線維芽細胞は、ヒト腸上皮の生体内及び生体外の成長をサポートする(Lahar N, et al. PLoS One. 2011;6(11):e26898)。定量的RT-PCRを用いて、腸管神経系マーカーであるprotein gene product 9.5 (PGP9.5)(図3A)、並びに、ICCマーカーであるCD34及びCKIT (図2D)を発現する細胞を特定した。また、免疫染色を用いて、グリア細胞マーカーである、CKIT及びS-100の二重陽性細胞が、粘膜下の領域に局在していることを特定した(図4B)。セロトニンは、胃腸機能(蠕動、分泌等)を制御する主な神経伝達物質であり、腸粘膜の腸管内分泌細胞により合成される(Mawe GM, Hoffman JM. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2013;10(8):473-486)。免疫組織化学的分析の結果、腸オルガノイドの上皮層にセロトニン陽性細胞が存在することが明らかとなった(図4C)。腸オルガノイドの収縮速度はヒスタミン処理により増加し、アトロピン処理によって低下した(図4D)。このように、ヒスタミン又はアトロピンによる処理後に収縮性が変化することから、腸オルガノイドは成熟した腸と同様の運動性を備えることが明らかとなった(Mittal RK, Padda B, Bhalla V, Bhargava V, Liu J. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006;290(3):G431-G438)。蠕動能を有する腸オルガノイドはこのように薬物に応答するのに対して、蠕動能を有さない腸オルガノイドは収縮を促進するヒスタミンにも応答しなかった(n=6, 図4E)。一方、ヒスタミンH1受容体は、蠕動能を有するオルガノイド及びヒト腸の上皮及び間葉系領域で発現していた(図4F)。蠕動能を有さないオルガノイドもヒスタミンH1受容体を発現しており、また、定量的RT-PCR及び腸組織特異的遺伝子の免疫染色分析により、腸に類似した組織であることが確認された(図7A)。成熟した内胚葉由来細胞のマーカーであるアルブミン及びインスリンは腸オルガノイドでは発現していなかった(図7B)。蠕動能を有さないオルガノイドは、ヒト成人腸と類似した遺伝子発現レベルを示したが、免疫染色では、蠕動能を有さないオルガノイドの間葉層に未成熟/欠陥が確認された。蠕動能を有さないオルガノイドでの平滑筋マーカーSMAの染色は、蠕動能を有するオルガノイドと比較して低レベルであった(図7C)。ニューロフィラメントが、蠕動能を有するオルガノイドでは間葉系領域の全体に分布していたのに対して、蠕動能を有さないオルガノイドではまばらであった(図7D)。間葉系領域で筋細胞層とニューロンの発達が不十分であることが、蠕動能を有さない原因である可能性がある。
上記の実験結果は、異種成分不含有条件下で作製されたヒト幹細胞由来腸オルガノイドは、腸に関連する主要な細胞種が高度に組織化された構造を有し、成熟した腸と同等の機能を有することを示す。本実験で得られた腸オルガノイドは少なくとも3つの利点を有する。
Claims (21)
- 空洞を内包する構造を有し、
外表面の少なくとも一部に腸上皮細胞を含む上皮層を含み、
前記上皮層よりも内部に筋細胞及び/又は神経細胞を含み、
前記上皮層が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)陽性細胞を含み、
Villinが、前記上皮層の外表面に局在し、且つ、
前記腸上皮細胞は、CDX2の発現が陽性である、
ことを特徴とする、
腸オルガノイド。 - 前記上皮層が、前記腸オルガノイドの外側に向いた微絨毛を含む、請求項1に記載の腸オルガノイド。
- 粘液及び/又はセロトニンを外部に分泌する能力を有する、請求項1又は2に記載の腸オルガノイド。
- 前記上皮層が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)陽性細胞、杯細胞、及び、セロトニン陽性細胞を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の腸オルガノイド。
- 前記腸上皮細胞が、内部に顆粒を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の腸オルガノイド。
- 外部から物質を吸収する能力を、腸オルガノイドの構造を破壊することなく測定することができる、請求項1~5のいずれか1項に記載の腸オルガノイド。
- 内部に液体を保持している、請求項1~6のいずれか1項に記載の腸オルガノイド。
- 前記上皮層よりも内部にカハール介在細胞を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の腸オルガノイド。
- 胚性幹細胞に由来する、請求項1~8のいずれか1項に記載の腸オルガノイド。
- 基材と、該基材の表面上に形成された細胞接着領域及び該細胞接着領域の周囲を囲う細胞非接着領域とを備える細胞培養基材上に、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞から選択される細胞を播種する工程1、及び
工程1で播種された細胞を培養する工程2
を含み、
工程2が、
工程1で播種された細胞の一部が、内胚葉系細胞へ分化すること、及び
工程1で播種された細胞の一部が、外胚葉系細胞へ分化すること
を含み、
工程2は、インスリン様増殖因子(IGF)、ヘレグリン、及び、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む培地中で、播種から30日後~130日後まで細胞を培養することを含む、
腸オルガノイドの作製方法により作製されたものである、請求項1~9のいずれか1項に記載の腸オルガノイド。 - 前記腸オルガノイドの作製方法の工程2は、前記培養の前に、工程1で播種された細胞を、Y-27632を含み、異種成分を含まず、血清代替物を含む培地で1日培養した後、Y-27632及び異種成分を含まず、血清代替物を含む培地で3日培養することを含む、請求項10に記載の腸オルガノイド。
- 前記腸オルガノイドの作製方法の工程2における、インスリン様増殖因子(IGF)、ヘレグリン、及び、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む前記培地は、異種成分を含まない、請求項10又は11に記載の腸オルガノイド。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の腸オルガノイドを培養する方法であって、
前記腸オルガノイドを、インスリン様増殖因子(IGF)、及び、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む培地中に浮遊培養すること
を含む方法。 - 前記培地がヘレグリンを更に含む、請求項13に記載の方法。
- 前記培地が異種成分を含まない、請求項13又は14に記載の方法。
- インスリン様増殖因子(IGF)、及び、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の腸オルガノイドを培養するための培地。
- ヘレグリンを更に含む、請求項16に記載の培地。
- 異種成分を含まない、請求項16又は17に記載の培地。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の腸オルガノイドを作製する方法であって、
基材と、該基材の表面上に形成された細胞接着領域及び該細胞接着領域の周囲を囲う細胞非接着領域とを備える細胞培養基材上に、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞から選択される細胞を播種する工程1、及び
工程1で播種された細胞を培養する工程2
を含み、
工程2が、
工程1で播種された細胞の一部が、内胚葉系細胞へ分化すること、及び
工程1で播種された細胞の一部が、外胚葉系細胞へ分化すること
を含み、
工程2は、インスリン様増殖因子(IGF)、ヘレグリン、及び、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む培地中で、播種から30日後~130日後まで細胞を培養することを含む、
前記方法。 - 工程2は、前記培養の前に、工程1で播種された細胞を、Y-27632を含み、異種成分を含まず、血清代替物を含む培地で1日培養した後、Y-27632及び異種成分を含まず、血清代替物を含む培地で3日培養することを含む、請求項19に記載の方法。
- 工程2における、インスリン様増殖因子(IGF)、ヘレグリン、及び、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む前記培地は、異種成分を含まない、請求項19又は20に記載の方法。
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