CN117143800A - 一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于类器官培养技术领域,尤其涉及一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法及应用,所述方法包括:分离胎鼠肠道细胞,并利用所述胎鼠肠道细胞分别培养肠上皮细胞类器官、胎鼠肠间充质细胞和胎鼠肠神经嵴细胞;将所述肠上皮细胞类器官、所述肠间充质细胞和所述肠神经嵴细胞联合共培养,并进行诱导分化,获得具有神经系统的小鼠肠道类器官。本发明利用原代培养的三种祖细胞进行共培养,提供一种可产生神经系统的小鼠肠道类器官的模型。该类器官模型实用性强;可改善肠上皮类器官组成成分单一的缺点,能较好地模拟肠道的组织结构和生理功能,是肠道相关领域研究的较佳模型。
Description
技术领域
本发明属于类器官培养技术领域,具体涉及一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法及应用。
背景技术
常见的体外培养模型有细胞、离体组织和类器官等。细胞无组织结构,成分单一;离体组织虽有组织结构,但无法长期培养;而类器官在细胞成分和组织结构上与对应器官高度相似,是通过细胞模型构建的具有3D结构的模型,并具备相应的功能学特征,其优点在于(1)避免细胞培养不能反映组织器官功能的缺点,(2)克服了离体组织器官研究的难点,(3)存在较好的可诱导性(如外源性给予LPS刺激研究肠炎)和可操控性(如基因编辑研究基因的在体功能)。因此,在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面,显示出巨大的应用前景。
人生命的诞生从受精卵开始。受精卵发育到第2周,形成内胚层和外胚层,称二胚层。第3周时,部分细胞从外胚层迁移出来,形成中胚层,与内胚层、外胚层合成三胚层。第3~4周,三胚层胚盘向腹侧卷折,形成圆柱状的胚体,内胚层被卷入胚体内,形成原始消化管内侧;中胚层环绕在内胚层外侧,形成原始消化管外侧。其中,原始消化管的内胚层祖细胞形成肠上皮干细胞(Intestinal epithelial stem cells,ISCs),原始消化管的中胚层祖细胞形成肠间充质细胞(Intestinal mesenchymal cells,IMCs)。而来源于外胚层的迷走神经嵴细胞,离开神经管,迁入原始消化管的前肠,形成肠神经嵴细胞(Enteric neuralcrest cells,ENCCs)。ISCs、IMCs和ENCCs这三种不同胚层来源的祖细胞间的信号转导,启动了胚胎肠道的发生、促进了肠道的发育。此后,ISCs主要发育为肠上皮细胞,IMCs主要发育为平滑肌细胞和卡哈尔间质细胞,ENCCs主要发育为肠神经元。
小鼠肠类器官主要用于肠道疾病的研究。而肠道功能的实现,神经系统是不可或缺的。虽然小鼠肠类器官的培养方法已有报道,但是目前的肠类器官是源自Lgr5+标记的肠上皮类器官,主要细胞成分是肠上皮细胞和肠上皮干细胞,缺乏神经元,组成成分单一,作为肠道疾病的研究模型仍具有一定的短板。有文献报道了构建功能性人体胃肠类器官的方案:分别诱导人多能干细胞分化成ISCs、IMCs和ENCCs,再将IMCs诱导的肠上皮类器官、IMCs和ENCCs共培养,获得具有神经功能的人体胃肠类器官。但人多功能干细胞培养类器官的价格高昂、操作复杂,且经历了较长的诱导分化过程。
小鼠体型小、繁殖周期短、产仔数量多、容易饲养。肠道祖细胞ISCs、IMCs和ENCCs均可从胚胎期小鼠肠道组织中获得:ISCs可从胎鼠小肠近段获得,而IMCs和ENCCs可从同批胎鼠的剩余肠组织中获得。三种祖细胞均可从同一批胚胎小鼠的肠道中获得,可较好地减少个体差异性,且直接获取的肠道祖细胞具有很好的干性,更接近于干细胞的生理状态。
因此,建立经济的、高效的具有神经系统的肠道类器官培养方法对类器官模型的应用等具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足,提供一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法及应用。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
第一方面,本发明提供了一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,包括:
分离胎鼠肠道细胞,并利用所述胎鼠肠道细胞分别培养胎鼠肠上皮细胞类器官、胎鼠肠间充质细胞和胎鼠肠神经嵴细胞;
将所述胎鼠肠上皮细胞类器官、所述胎鼠肠间充质细胞和所述胎鼠肠神经嵴细胞联合共培养,并进行诱导分化,获得具有神经系统的小鼠肠道类器官。
在一个实施例中,所述肠上皮细胞类器官的培养方法,包括:
配制肠上皮类器官的消化液和肠上皮类器官的培养液;
解剖胎鼠,获取胎鼠小肠近段组织;利用所述肠上皮类器官的消化液对所述胎鼠小肠近段组织进行消化和离心,离心后利用基质胶重悬,得到重悬液;
将重悬液加入细胞培养板中,当所述重悬液中的基质胶凝固后,每孔中加入所述肠上皮类器官的培养液,在培养箱中进行培养,得到所述胎鼠肠上皮细胞类器官。
在一个实施例中,所述胎鼠肠间充质细胞的培养方法,包括:
配制肠间充质细胞的消化液和肠间充质细胞的培养液;
获取胎鼠的小肠中段、远端和结肠组织,利用所述肠间充质细胞的消化液对其进行消化和离心,离心后用肠间充质细胞的培养液重悬,重悬后在培养箱中进行培养,得到所述胎鼠肠间充质细胞。
在一个实施例中,所述胎鼠肠神经嵴细胞的培养方法,包括:
配制肠神经嵴细胞的消化液和肠神经嵴细胞的培养液;
获取胎鼠的小肠中段、远端和结肠组织,利用所述肠神经嵴细胞的消化液对其进行消化和离心,离心后用肠神经嵴细胞的培养液重悬,重悬后在培养箱中进行培养,得到所述胎鼠肠神经嵴细胞。
在一个实施例中,将所述肠上皮细胞类器官、所述肠间充质细胞和所述肠神经嵴细胞联合共培养,并进行诱导分化,获得具有神经系统的小鼠肠道类器官,包括:
配制具有神经系统的肠道类器官培养液;
利用胰蛋白酶对所述胎鼠肠间充质细胞进行消化,消化后进行离心,离心后用所述具有神经系统的肠道类器官培养液进行重悬,得到第一重悬液;
将胎鼠肠神经嵴细胞消化成单细胞悬液后再离心,离心后利用所述具有神经系统的肠道类器官培养液进行重悬,得到第二重悬液;
在含有胎鼠肠上皮细胞类器官的细胞培养板中,吸弃每孔上清液,并在每孔中同时加入所述第一重悬液和所述第二重悬液,分别培养不同的时长,获得具有神经系统的小鼠肠道类器官。
在一个实施例中,在每孔中同时加入所述第一重悬液和所述第二重悬液的步骤中,加入的所述第一重悬液中含有的胎鼠肠间充质细胞数量和所述第二重悬液中含有的胎鼠肠神经嵴细胞数量相同。
在一个实施例中,具有神经系统的肠道类器官培养液的配制方法为:向肠上皮类器官的培养液中加视黄酸,制得所述具有神经系统的肠道类器官培养液。
在一个实施例中,所选胎鼠的胎龄为E13.5~E18.5。
第二方面,本发明提供了采用上述任一项构建方法构建得到的具有神经系统的小鼠肠道类器官。
第三方面,本发明提供了采用上述任一项构建方法构建得到的具有神经系统的小鼠肠道类器官在肠道疾病中的应用。
本发明相对于现有技术的优点以及有益效果为:
为解决现有技术中存在的问题(离体组织器官无法长期培养,2D细胞模型不能反映组织器官的结构和功能的缺陷),本发明的发明人对背景技术中所列的现有技术进行深入研究,对胚胎原代祖细胞的共培养方式、消化液和培养液的种类、细胞因子、浓度和时间等因素进行了探索,在将三种原代祖细胞的联合共培养后,成功地构建了具有神经系统的肠道类器官。相比三种原代祖细胞的消化和单独培养条件,联合共培养的细胞接种密度和联合共培养的培养液成分对成功率更为重要。在此发现的基础上,本发明对部分容易忽视的操作(三种原代祖细胞的消化和单独培养条件,联合共培养的细胞接种密度和联合共培养的培养液成分)进行了明确化质量控制和条件优化,提供一种可经济、高效的产生具有神经系统的肠道类器官培养方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例中,培养第6d时,胎鼠肠上皮细胞类器官的培养形态图;
图2是本发明实施例中,培养第6d时,胎鼠肠间充质细胞的培养形态图;
图3是本发明实施例中,培养第6d时,胎鼠肠神经嵴细胞的培养形态图;
图4是本发明实施例中,培养第30d时,胎鼠肠上皮细胞类器官(肠上皮细胞类器官单独培养组)的形态图和具有神经系统的小鼠肠道类器官(肠上皮细胞类器官联合培养组)的形态图;
图5是本发明实施例中,培养第6d时,胎鼠肠上皮细胞类器官的Wholemount免疫荧光鉴定图;
图6是本发明实施例中,培养第6d时,胎鼠肠神经嵴细胞的Wholemount免疫荧光鉴定图;
图7是本发明实施例中,培养第0d和6d时,胎鼠肠间充质细胞的流式鉴定图;
图8是本发明实施例中,培养第0d和6d时,胎鼠肠神经嵴细胞的流式鉴定图;
图9是本发明实施例中,培养第30d时,胎鼠肠上皮细胞类器官(肠上皮细胞类器官单独培养组)的H&E染色图和具有神经系统的小鼠肠道类器官(肠上皮细胞类器官联合培养组)的H&E染色图;
图10是本发明实施例中,培养第30d时,针对肠神经元的形成,胎鼠肠上皮细胞类器官(肠上皮细胞类器官单独培养组)的Wholemount免疫荧光鉴定图和具有神经系统的小鼠肠道类器官(肠上皮细胞类器官联合培养组)的Wholemount免疫荧光鉴定图;
图11是本发明实施例中,培养第30d时,针对肠神经元的形成,胎鼠肠上皮细胞类器官(肠上皮细胞类器官单独培养组)的石蜡切片免疫荧光鉴定图和具有神经系统的小鼠肠道类器官(肠上皮细胞类器官联合培养组)的石蜡切片免疫荧光鉴定图;
图12是本发明实施例中,培养第30d时,针对平滑肌细胞、免疫细胞和Cajal细胞的形成,胎鼠肠上皮细胞类器官(肠上皮细胞类器官单独培养组)的石蜡切片免疫荧光结果图和具有神经系统的小鼠肠道类器官(肠上皮细胞类器官联合培养组)的石蜡切片免疫荧光结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,包括以下步骤:
步骤1、胎鼠肠上皮细胞类器官的培养
1.1)准备无菌器械、超净台、并提前配制好肠上皮类器官的消化液和肠上皮类器官的培养液,其中,肠上皮类器官的消化液为Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL);肠上皮类器官的培养液配制方法为:Advanced DMEM/F12(Invitrogen),Glutamax(1x,Invitrogen);Hepes(0.01M,Invitrogen);Pen/Strep(0.2U/ml,Invitrogen);N2 supplement(1x,Invitrogen);B27supplement(1x,Invitrogen);n-(1.25mM,Sigma-Aldrich);EGF(0.05μg/ml,Invitrogen);R-spondin1(500ng/ml,Peprotech);Noggin(100ng/ml,Peprotech);
1.2)准备E13.5~E18.5的孕鼠,解剖4~6只胎鼠,获得胎鼠小肠近段组织;
1.3)将胎鼠小肠近段(小肠前30%肠段)组织碎成1mm大小;
1.4)将胎鼠小肠近段组织转移入50ml离心管中,加入10ml预冷PBS,800rpm,离心5min,弃上清;
1.5)将小肠组织置于盛有5ml肠上皮类器官的消化液的50ml离心管中,放置于4℃摇床上中消化30min,自然沉降后弃消化液,加入10ml预冷的PBS,充分吹打后使用70μm滤器过滤,滤液在4℃下以1500rpm,离心5min后,弃上清,用200μl基质胶重悬,细胞密度为2x 10^6个细胞/ml;
1.6)于24孔板中,胎肠细胞分配4孔培养,每孔加50ul基质胶。即每孔基质胶中含5x10^5个细胞,将基质胶置于37℃培养箱中10min,固化基质胶,固化后每孔再加500μL肠上皮类器官的培养液,于37℃培养箱中进行培养;
1.7)每2天更换肠上皮类器官的培养液,培养至第6天,备用。图1为培养第6d时,胎鼠肠上皮细胞类器官的培养形态图。
步骤2、胎鼠肠间充质细胞的培养
2.1)准备无菌器械、超净台、并提前配制好肠间充质细胞的消化液和肠间充质细胞的培养液。肠间充质细胞的消化液的配制方法为:Dispase II(浓度2mg/ml),胶原酶IV(浓度0.5mg/ml),DNAseI(浓度5mg/ml)加入到DMEM基础培养基中,混匀用无菌微孔滤器过滤后备用;肠间充质细胞的培养液的配制方法为:10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素加到DMEM Advanced(Gibco)培养液中;
2.2)将上述胎鼠的小肠剩余段(剩余的70%肠段)和结肠组织置于盛有5ml肠间充质细胞消化液的广底皿中,于37℃培养箱中消化,每隔8min吹打一次,重复2-3次。加入等体积基础培养基中止消化。,使用70μm滤器过滤,滤液在4℃下1500rpm,离心5min后,弃上清,用4ml培养液重悬。细胞接种密度为5x 10^5个细胞/ml,即总细胞数为2x 10^6个细胞;
2.3)培养24h后,去除非贴壁细胞。贴壁细胞呈成纤维细胞样形态,当培养达到80%汇合时,消化后传代分瓶。培养至第6天,备用。图2为培养第6d时,胎鼠肠间充质细胞的培养形态图;
步骤3、胎鼠肠神经嵴细胞的培养
3.1)准备无菌器械、超净台、并提前配制好胎鼠肠神经嵴细胞的消化液和胎鼠肠神经嵴细胞的培养液。胎鼠肠神经嵴细胞的消化液的配制方法为:Dispase II(浓度2mg/ml),胶原酶IV(浓度0.5mg/ml),DNAseI(浓度5mg/ml)加入到DMEM/F-12基础培养基中,混匀用无菌微孔滤器过滤后备用;胎鼠肠神经嵴细胞的培养液的配制方法为:N2 supplement(浓度1%)、B27supplement(浓度1%)、FGF(10ng/ml)、EGF(10ng/ml)、谷氨酸(浓度1%)、双抗(浓度1%)加到DMEM/F-12基础培养基中,垂悬吹打混匀后用无菌微孔滤器过滤后备用;
3.2)获取上述胎鼠的小肠中段、远端和结肠组织,按上述同样的消化方法消化细胞,使用40μm滤器过滤,滤液4℃以下1500rpm,离心5min后,弃上清,用4ml培养液重悬。细胞接种密度为5x 10^5个细胞/ml,即总细胞数为2x 10^6个细胞;
3.3)第二天补加2ml的神经嵴细胞的培养液,第四天半时换液,每天在显微镜下观察,并拍照保存,记录生长形态变化。培养至第6天,获得神经球。图3为培养第6d时,胎鼠肠神经嵴细胞的培养形态图;
步骤4、胎鼠肠上皮细胞类器官、胎鼠肠间充质细胞和胎鼠肠神经嵴细胞的共培养
4.1)提前配制具有神经系统的肠道类器官培养液:向肠上皮类器官的培养液中加视黄酸(2μM),备用;
4.2)胎鼠肠神经嵴细胞肠间充质细胞为贴壁状态,用1ml胰蛋白酶消化2min后,加入1ml基础培养基中止消化,1500rpm离心5min,用200ul具有神经系统的肠道类器官培养液重悬,控制细胞数量在1万个;
4.3)含有胎鼠肠神经嵴细胞的神经球为悬浮状态,将上清吸取出来,离心后,用1ml胰蛋白酶消化2min后,加入1ml基础培养基中止消化,1500rpm离心5min,用200ul具有神经系统的肠道类器官培养液重悬,控制细胞数量在1万个;
4.4)胎鼠肠上皮类器官的细胞培养板中,每孔约30个类器官,吸弃上清。将4.2和4.3中的各200ul含细胞的培养液混合加到1孔肠上皮类器官中,分别培养6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d,获得具有神经系统的小鼠肠道类器官。图4为培养第30d时,具有神经系统的小鼠肠道类器官的形态图(联合培养组)和无神经系统的小鼠肠道类器官的形态图(单独培养组)。
实施例2
对胎鼠肠上皮细胞类器官、胎鼠肠间充质细胞和胎鼠肠神经嵴细胞进行鉴定
5.1)胎鼠肠上皮类器官的wholemount免疫荧光染色
5.1.1)在细胞培养板中将基质胶用200μl胰蛋白酶消化;800rpm离心5min,弃上清,用4%多聚甲醛固定30min;
5.1.2)用PBS在摇床上洗涤3次,每次5min;
5.1.3)吸去PBS,用含0.1%Triton X-100的5%BSA溶液覆盖爬片(PBS配制),室温封闭30min;
5.1.4)吸去BSA溶液,用PBS在摇床上洗涤爬片3次,每次5min,每张爬片滴加足量PBS稀释的一抗CK18(AF7619,NOVUS),ZO-1(66452-1-Ig,Proteintech),E-cadherin(20874-1-AP,Proteintech)并放入湿盒,4℃孵育过夜;
5.1.5)在摇床上用PBS清洗爬片3次,每次5min,吸去PBS后滴加稀释好的荧光二抗CoraLite488-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(SA00013-1,Proteintech)、CoraLite594-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)(SA00013-8,Proteintech)和Donkey Anti-Sheep IgG H&L(Alexa555)(ab150178,Abcam),室温避光孵育1h后PBS在摇床上洗涤3次,每次5min;
5.1.6)吸去PBS,滴加DAPI染液复染细胞核,避光孵育5min,PBS在摇床上洗涤3次,每次5min;
5.1.7)荧光显微镜下观察采集图像。图5是本发明实施例中,培养第6d时,胎鼠肠上皮细胞类器官的Wholemount免疫荧光鉴定图;采用三种标记物共同(CK18、ZO-1、E-cadherin)标记肠上皮类器官中的肠上皮细胞。
5.2)胎鼠肠神经嵴细胞的Wholemount免疫荧光染色
实验步骤同5.1,使用的一抗为CD57(sc-6261,Santa Cruz Biotechnology),CD271(ab52987,Abcam);使用的荧光二抗CoraLite488-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(SA00013-1,Proteintech)和CoraLite594-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)(SA00013-8,Proteintech);图6是本发明实施例中,培养第6d时,胎鼠肠神经嵴细胞的Wholemount免疫荧光鉴定图;采用两种标记物共同(CD57和CD271)标记神经球中的肠神经嵴细胞;
5.3)流式细胞术鉴定胎鼠肠间充质细胞
5.3.1)细胞消化重悬后,1400rpm,4℃,离心5min,弃上清,用PBS(含1% BSA)洗涤细胞一次,以0.25-1x107个细胞/mL的浓度将细胞重悬在1mL PBS(含1%BSA)中;
5.3.2)空白对照、同型对照、待测样本每管取100uL上述重悬的细胞至离心管中,空白对照管不加抗体,同型对照和待测管分别加入0.5uL FVS染料(564406,BDbioscience),轻轻混匀,4℃避光孵育20min,每10min轻轻混匀一次,1400rpm,4℃,离心5min,去上清;
5.3.3)100uL PBS(含1%BSA)重悬细胞,空白对照管不加抗体,同型对照和待测管分别加入1uL CD90抗体(140318,Biolegend)、0.4uL CD73抗体(127220,Biolegend)、1uLCD105抗体(120412,Biolegend),4℃避光孵育30min,10min轻轻混匀一次;
5.3.4)加100uL PBS(含1%BSA),1400rpm,4℃,离心5min,洗1-2次,500uL PBS(含1%BSA)重悬后加入至流式管内,过滤后上机检测。图7是本发明实施例中,培养第0d和第6d时,胎鼠肠间充质细胞的流式鉴定图。第0d和第6d时的CD90+细胞比例具有统计学差异(P<0.001),CD90+细胞比例由第0d的23.6%升高到35.0%;第0d和第6d时的CD90+细胞中的CD73+CD271+细胞比例也具有统计学差异(P<0.001),CD73+CD105+细胞比例由第0d的2.64%升高到9.97%。说明经过6d的培养,肠间充质细胞的比例(CD90+CD73+CD105+)升高明显;
5.4)流式细胞术鉴定胎鼠肠神经嵴细胞
实验步骤同5.3,使用流式抗体为CD271(130-128-624,Miltenyi)、CD57(359610,biolegend),用来标记ENCCs;图8是本发明实施例中,培养第0d和6d时,胎鼠肠神经嵴细胞的流式鉴定图。第0d和第6d时的CD57+CD271+细胞比例也具有统计学差异(P<0.001),CD57+CD271+细胞比例由第0d的1.06%升高到4.14%。说明经过6d的培养,肠神经嵴细胞的比例(CD57+CD271+)升高明显;
5.5)胎鼠肠上皮细胞类器官H&E染色
5.5.1)肠上皮类器官收集后4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片;
5.5.2)依次将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20分钟进行脱蜡,切片入100%(Ⅰ、Ⅱ)、90%、80%、70%乙醇各5min进行水化,自来水洗;
5.5.3)切片入苏木素染液染色3-5min,根据染色情况,可以适当增加或减少染色时间,流水冲洗;乙酸分化,自来水洗;氨水返蓝,流水冲洗;
5.5.4)切片入85%、95%梯度酒精脱水各5min,伊红染液染色5min,根据染色情况,可以适当增加或减少染色时间,流水冲洗;
5.5.5)切片依次放入70%、80%、90%、100%乙醇中各5min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min,自然晾干后中性树胶封片,显微镜镜检,图像采集分析。图9是本发明实施例中,培养第30d时,胎鼠肠上皮细胞类器官(肠上皮细胞类器官单独培养组)的H&E染色图和具有神经系统的小鼠肠道类器官(肠上皮细胞类器官联合培养组)的H&E染色图;从组织细胞的结构层面观察肠上皮细胞类器官单独培养组和肠上皮细胞类器官联合培养组的一般形态结构;
5.6)具有神经系统的胎鼠肠上皮细胞类器官Wholemount免疫荧光染色
实验步骤同5.1,使用的一抗为Tuj1(ab78078,Abcam);使用的荧光二抗CoraLite488-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(SA00013-1,Proteintech);图10是本发明实施例中,培养第30d时,针对肠神经元的形成,胎鼠肠上皮细胞类器官(肠上皮细胞类器官单独培养组)的Wholemount免疫荧光鉴定图和具有神经系统的小鼠肠道类器官(肠上皮细胞类器官联合培养组)的Wholemount免疫荧光鉴定图;说明当肠上皮类器官、肠间充质细胞和肠神经嵴细胞联合共培养时,肠神经嵴细胞迁移到类器官中,并分化成了神经元;而肠上皮类器官单独培养时,不具有以上效果;
5.7)具有神经系统的胎鼠肠上皮细胞类器官石蜡切片免疫荧光染色
5.7.1)依次将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20分钟进行脱蜡,切片入100%(Ⅰ、Ⅱ)、90%、80%、70%乙醇各5min进行水化,自来水洗;
5.7.2)将切片置于盛满EDTA抗原修复液的切片盒中于微波炉内加热16min进行抗原修复,过程中及时补充缓冲液,防止干片;
5.7.3)切片甩干后用组化笔在组织周围画圈,滴加3%双氧水溶液,室温避光孵育30min,用于封闭内源性过氧化物酶,将玻片置于PBS中在摇床上晃动洗涤3次,每次5min;
5.7.4)切片甩干后滴加5%BSA,室温封闭30min;
5.7.5)提前将一抗Tuj1(ab78078,Abcam)、α-SMA(55135-1-AP,Proteintech)、C-kit(18696-1-AP,Proteintech)、CD45(ab40763,Abcam)溶于PBS中,轻轻甩去封闭液后,在切片上滴加,切片平放于湿盒内4℃孵育过夜;
5.7.6)将玻片置于PBS中在摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片甩干后在圈内滴加二抗CoraLite594-conjugated Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)(SA00013-7,Proteintech)和CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(SA00013-2,Proteintech),覆盖组织,避光室温孵育1h。将玻片置于PBS中在摇床上洗涤3次,每次5min;
5.7.7)甩干切片后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育5-10min;
5.7.8)将玻片置于PBS中在摇床上洗涤3次,每次5min,甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片;
5.7.9)切片置于荧光显微镜下采集图像。
图11是本发明实施例中,培养第30d时,针对肠神经元的形成,胎鼠肠上皮细胞类器官(肠上皮细胞类器官单独培养组)的石蜡切片免疫荧光鉴定图和具有神经系统的小鼠肠道类器官(肠上皮细胞类器官联合培养组)的石蜡切片免疫荧光鉴定图;说明当肠上皮类器官、肠间充质细胞和肠神经嵴细胞联合共培养时,肠神经嵴细胞迁移到类器官中,并分化成了神经元;而肠上皮类器官单独培养时,不具有以上效果;
图12是本发明实施例中,培养第30d时,针对平滑肌细胞、免疫细胞和Cajal细胞的形成,胎鼠肠上皮细胞类器官(肠上皮细胞类器官单独培养组)的石蜡切片免疫荧光结果图和具有神经系统的小鼠肠道类器官(肠上皮细胞类器官联合培养组)的石蜡切片免疫荧光结果图;说明当肠上皮类器官、肠间充质细胞和肠神经嵴细胞联合共培养时,这三种祖细胞分化并形成了平滑肌细胞、免疫细胞和Cajal细胞,而肠上皮类器官单独培养时,不具有以上效果。联合共培养不仅可形成具有神经系统的肠道类器官,还可出现平滑肌、免疫细胞和Cajal细胞;相较于单独培养的肠上皮类器官,联合共培养获得的肠道类器官能较好地模拟肠道的组织结构和生理功能,是肠道相关领域研究的较佳模型。
实施例3
本实施例提供了一种具有神经系统的小鼠肠道类器官,具有神经系统的小鼠肠道类器官是利用前面实施例中的制备方法制备得到的。
实施例4
本实施例提供了一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的应用。
本发明利用原代培养的三种祖细胞(肠上皮干细胞、肠间充质细胞、肠神经嵴细胞)进行共培养,提供一种可产生神经系统的小鼠肠道类器官的模型。该类器官模型实用性强;可改善肠上皮类器官组成成分单一的缺点,能较好地模拟肠道的组织结构和生理功能,是肠道相关领域研究的最佳模型,如:肠道发育的研究;肠道发育异常的靶向治疗研究;肠道菌群、病毒、类毒素等诱导的肠炎的研究;肠道肿瘤的研究;药物筛选的研究;肠道屏障的研究;肠道神经免疫调节的研究;类器官移植治疗模式的研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,其特征在于,包括:
分离胎鼠肠道细胞,并利用所述胎鼠肠道细胞分别培养胎鼠肠上皮细胞类器官、胎鼠肠间充质细胞和胎鼠肠神经嵴细胞;
将所述胎鼠肠上皮细胞类器官、所述胎鼠肠间充质细胞和所述胎鼠肠神经嵴细胞联合共培养,并进行诱导分化,获得具有神经系统的小鼠肠道类器官。
2.根据权利要求1所述的具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,其特征在于,所述胎鼠肠上皮细胞类器官的培养方法,包括:
配制肠上皮类器官的消化液和肠上皮类器官的培养液;
解剖胎鼠,获取胎鼠小肠近段组织;利用所述肠上皮类器官的消化液对所述胎鼠小肠近段组织进行消化和离心,离心后利用基质胶重悬,得到重悬液;
将重悬液加入细胞培养板中,当所述重悬液中的基质胶凝固后,每孔中加入所述肠上皮类器官的培养液,在培养箱中进行培养,得到所述胎鼠肠上皮细胞类器官。
3.根据权利要求1所述的具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,其特征在于,所述胎鼠肠间充质细胞的培养方法,包括:
配制肠间充质细胞的消化液和肠间充质细胞的培养液;
获取胎鼠的小肠剩余段和结肠组织,利用所述肠间充质细胞的消化液对其进行消化和离心,离心后用肠间充质细胞的培养液重悬,重悬后在培养箱中进行培养,得到所述胎鼠肠间充质细胞。
4.根据权利要求1所述的具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,其特征在于,所述胎鼠肠神经嵴细胞的培养方法,包括:
配制肠神经嵴细胞的消化液和肠神经嵴细胞的培养液;
获取胎鼠的小肠中段、远端和结肠组织,利用所述肠神经嵴细胞的消化液对其进行消化和离心,离心后用肠神经嵴细胞的培养液重悬,重悬后在培养箱中进行培养,得到所述胎鼠肠神经嵴细胞。
5.根据权利要求1所述的具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,其特征在于,将所述胎鼠肠上皮细胞类器官、所述胎鼠肠间充质细胞和所述胎鼠肠神经嵴细胞联合共培养,并进行诱导分化,获得具有神经系统的小鼠肠道类器官,包括:
配制具有神经系统的肠道类器官培养液;
利用胰蛋白酶对所述胎鼠肠间充质细胞进行消化,消化后进行离心,离心后用所述具有神经系统的肠道类器官培养液进行重悬,得到第一重悬液;
将胎鼠肠神经嵴细胞消化成单细胞悬液后再离心,离心后利用所述具有神经系统的肠道类器官培养液进行重悬,得到第二重悬液;
在含有胎鼠肠上皮细胞类器官的细胞培养板中,吸弃每孔上清液,并在每孔中同时加入所述第一重悬液和所述第二重悬液,分别培养不同的时长,获得具有神经系统的小鼠肠道类器官。
6.根据权利要求5所述的具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,其特征在于,在每孔中同时加入所述第一重悬液和所述第二重悬液的步骤中,加入的所述第一重悬液中含有的胎鼠肠间充质细胞数量和所述第二重悬液中含有的胎鼠肠神经嵴细胞数量相同。
7.根据权利要求5所述的具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,其特征在于,具有神经系统的肠道类器官培养液的配制方法为:向肠上皮类器官的培养液中加视黄酸,制得所述具有神经系统的肠道类器官培养液。
8.根据权利要求1所述的具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法,其特征在于,所选胎鼠的胎龄为E13.5~E18.5。
9.根据权利要求1-8中任一项构建方法构建得到的具有神经系统的小鼠肠道类器官。
10.根据权利要求1至8中任一项构建方法构建得到的具有神经系统的小鼠肠道类器官在肠道疾病中的应用。
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