CN114606191A - 卵巢癌类器官模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵巢癌类器官模型的构建方法及其应用，该方法首先获取卵巢癌标本，将取部分癌灶标本置于组织保存液中浸泡,将上述部分癌灶标本用组织冲洗液冲洗后，剪碎、刮碎得到匀浆状的组织碎片悬液；重悬过滤网，裂红得到裂红后的卵巢癌类器官球体；向卵巢癌类器官球体中加入水凝胶，得到混合液，将接种了细胞球的培养板或接种了细胞球的培养皿置于细胞培养箱中培养，直至水凝胶凝固；最后取出细胞培养板于无菌细胞台中，在孔板中加入对应的类器官培养基培养，得卵巢癌类器官模型，本发明使用水凝胶代替Matrigel胶，R‑spondin，Noggin，L‑wnt3A均产于细胞上清，极大的降低了现有卵巢癌类器官的培养成本。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及一种卵巢癌类器官模型的构建方法及其应用。
背景技术
卵巢癌是目前妇科恶性肿瘤中肿瘤相关死亡的第二大病因，仅次于宫颈癌。由于早期症状不明显，起病隐匿，一经确诊，绝大多数病人已进入晚期。且卵巢癌缺乏有效的治疗手段，目前5年生存率低于50％。卵巢癌的标准治疗方案是减瘤术加放化疗，而PARP抑制剂作为卵巢癌的一线维持治疗方案，被批准用于同源重组修复基因缺失或者铂敏感复发的卵巢癌患者，但对于PARP抑制剂耐药，铂耐药复发等卵巢癌患者仍缺乏有效的治疗方案，因此新的有效治疗方案有待进一步研究，这其中，新的靶向药的开发对肿瘤的治疗至关重要。近年来，虽然针对肿瘤的新药层出不穷，但仅有20％最终进入临床，而临床试验的耗资巨大，所以研究者们迫切地需要提高临床试验地成功率。研究者发现限制临床试验的关键环节是靶向药的安全性和有效性的问题，为了减少临床试验的失败率，更具有代表性地临床前药物筛选模型急需挖掘。因此研究者们在不断地探索体外培养卵巢癌的方案。
自从1950年以来，第一个宫颈癌细胞系Hela的诞生，2D肿瘤细胞系就成为了实验室最重要的肿瘤体外模型之一。抗癌药物在体外一系列的细胞系中进行处理，得到各种癌种细胞系的IC50，通过对比药物处理前后，分析细胞系样品的基因组，转录组，蛋白组等变化，筛选可作为评估药物敏感性的生物学标记物和通路，其中AUC曲线下面积作为评估筛选的标准。NCI60是2D细胞系作为药物筛选的先行者，但9种肿瘤类型60种肿瘤细胞系并不能满足药物筛选的需求，所以近年来，CCLE(1036 个肿瘤细胞系来自于36种癌种)，GDSC(727个肿瘤细胞系，29种肿瘤组织类型)数据库的兴起，也为2D细胞系作为药物筛选模型提供了很好的平台。尽管2D细胞系培养成本低，操作简单方便，但2D细胞系在长期传代过程中积累了大量的遗传物质的突变，且失去了肿瘤组织中的其它细胞成分，如免疫，间质成分，这导致2D细胞系不能很好的反应病人对药物的反应性。精准医疗时代下，研究者致力于将病人进行个体化治疗，使得每个病人都能得到最合适的治疗方案，患者来源的类器官(PDO) 模型在这个背景下也应运而生。尽管PDO模型的研究始于1940年，但直至2009年Hans clever教授成功地在体外将小肠绒毛完整地培养出来， PDO模型才正式拉开应用在临床前药物筛选的序幕。PDO模型是将病人的新鲜肿瘤组织在体外进行3D培养，传代，保种，复苏。而PDXO模型是在卵巢癌PDX模型构建完成后，再将PDX的皮下瘤取出，构建PDXO 模型，进行后续的药物筛选，基因编辑等操作。两个模型之间相辅相成，共同进行药物筛选，提高了药敏实验结果的可信度，也为患者的个体化治疗提供了又一项选择。
由于无血清的培养基中添加了不同的细胞因子，Matrigel胶提供了肿瘤生长的支持条件，使得肿瘤组织来源的干细胞在体外生长分化出球体结构，极大地保留了肿瘤组织的基因组和形态学特征，这也意味着肿瘤PDO/PDXO模型是一个潜在的临床前药物筛选模型，很好的弥补了2D 细胞系不能很好地反应原发肿瘤反应性这一缺陷。将卵巢癌类器官球体种植在96孔板中，进行药物处理，处理一段时间后，检查卵巢癌类器官活性，根据对照组和处理组活性的差异反应卵巢癌类器官对药物的敏感性。卵巢癌类器官模型传代过程中也可保留原发肿瘤的遗传物质，可真实地反应病人对药物的反应性，指导临床病人的治疗方案。但卵巢癌类器官模型存在培养成本高，且免疫成分只能在短时间内保留，长期培养过程中肿瘤细胞会发生富集等的劣势。
综上所述，急需一种既能高效建立卵巢癌类器官模型又能降低成本以及短期药物筛选的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种卵巢癌类器官模型的构建方法及其应用。
为实现上述目的，本发明所设计一种卵巢癌类器官模型的构建方法，包括以下步骤：
1)获取卵巢癌标本，将取部分癌灶标本置于组织保存液中浸泡，并置于冰上；
其中，所述卵巢癌标本为卵巢癌癌灶或者皮下瘤的卵巢癌组织
2)将步骤1)上述部分癌灶标本用组织冲洗液冲洗后，选取活性较好，形态呈恶性程度高的癌组织，然后对癌组织剪碎、刮碎；得到匀浆状的组织碎片悬液；
3)将组织碎片悬液用组织冲洗液重悬后，过滤网，得到的卵巢癌类器官球体(网膜灶需小心脂肪层沾壁难以倒出)；
4)向卵巢癌类器官球体中加入裂红液，颠倒摇匀，室温放置后离心，弃上清(去除细胞悬液中红细胞)，得到裂红后的卵巢癌类器官球体；
5)向裂红后的卵巢癌类器官球体中加入PBS重悬并离心，清洗一遍，得到大小适中且裂红后的卵巢癌类器官球体；
6)向步骤5)中得到的卵巢癌类器官球体中加入水凝胶，置于冰上，得到混合液，待用；
7)将步骤6)中的混合液种于细胞培养板或细胞培养皿内(保持适当的悬滴大小，以免浮力导致的脱胶)；
8)将接种了细胞球的培养板或接种了细胞球的培养皿置于细胞培养箱中培养，直至水凝胶凝固；最后取出细胞培养板于无菌细胞台中，在孔板中加入对应的类器官培养基培养，即得卵巢癌类器官模型，其中，卵巢癌类器官模型为卵巢癌PDO类器官模型或者卵巢癌PDXO类器官模型。
进一步地，所述步骤1)中，组织保存液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青，所述四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的 2-3％(组织保存液是卵巢癌组织的保存液，采用低浓度的血清既可以满足卵巢癌组织的运输需求，也最大程度保存卵巢癌组织的活性且降低运输途中的污染几率)。
所述步骤2)中，组织冲洗液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青和双抗，其中，所述四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％；
所述双抗的添加量为高糖DMEM培养基总体积的0.1％，所述双抗由链霉素和青霉素组成且链霉素和青霉素重量比为1:3(组织冲洗液是卵巢癌组织的冲洗液，在保存液的基础上加入了双抗，降低了卵巢癌类器官球体的污染几率，且低浓度血清也保留了卵巢癌类器官的干性，避免了诱导其分化的风险)；
所述步骤8)中，类器官培养基其配方(以1ml总体积为计)如下： 1％(v/v)的Glutanmax、1％(v/v)的HEPES、0.1％(v/v)的PS、20ng/ml 的L-wnt3A、50ng/ml的R-spondin、100ng/ml Noggin、50ng/ml的EGF、 10ng/ml的FGF10、10ng/ml的FGF2、10ng/ml的50×B27、10mmol/ml 的Nicotinamide、25mmol/ml的N-Acegglytene、1umol/ml的ProstaglandinE2、10umolg/ml的SB02190、500nmol/ml的A8301、 10umol/ml的Y27632和0.1％的万古霉素。
上述L-wnt3A为使用L-wnt3A过表达的细胞产生的上清来代替(代替商品化的细胞因子)
R-spondin为R-spondin过表达细胞产生的细胞上清(代替商品化 R-spondin)
Noggin为Noggin过表达细胞产生的细胞上清(代替商品化Noggin)。
再进一步地，所述步骤3)中，细胞球的直径为40～70μm。
再进一步地，所述步骤4)中，裂红液加入量为：每毫升的细胞球中5ml的裂红液；离心转速为1000转/分，时间为5～10min。
再进一步地，所述步骤8)中，细胞培养箱的温度为37℃，细胞时间为30min。
再进一步地，所述步骤8)中，所述卵巢癌类器官模型培养如：
在孔板中加入对应的类器官培养基，然后置于温度为37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中，培养5-6天，每隔3天换液或者根据密度进行传代和保种，卵巢癌类器官模型(每传代三次均对其进行保种(保种液配方为： 90％类器官培养基+10％DMSO培养基)。
本发明还提供了一种上述构建方法所用的培养基，其中，所述组织保存液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青，所述四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％(保存液是卵巢癌组织的保存液，采用低浓度的血清既可以满足卵巢癌组织的运输需求，也最大程度保存卵巢癌组织的活性且降低运输途中的污染几率)。
所述组织冲洗液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青和双抗，其中，所述四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％；
所述双抗的添加量为高糖DMEM培养基总体积的0.1％，所述双抗由链霉素和青霉素组成且链霉素和青霉素重量比为1:3(组织冲洗液是卵巢癌组织的冲洗液，在保存液的基础上加入了双抗，降低了卵巢癌类器官球体的污染几率，且低浓度血清也保留了卵巢癌类器官的干性，避免了诱导其分化的风险)。
所述类器官培养基其配方(以1ml总体积为计)如下：1％(v/v)的 Glutanmax、1％(v/v)的HEPES、0.1％(v/v)的PS、20ng/ml的L-wnt3A、 50ng/ml的R-spondin、100ng/mlNoggin、50ng/ml的EGF、10ng/ml的 FGF10、10ng/ml的FGF2、10ng/ml的50×B27、10mmol/ml的 Nicotinamide、25mmol/ml的N-Acegglytene、1umol/ml的 ProstaglandinE2、10umolg/ml的SB02190、500nmol/ml的A8301、 10umol/ml的Y27632和0.1％的万古霉素。
上述L-wnt3A为使用L-wnt3A过表达的细胞产生的上清来代替(代替商品化的细胞因子)
R-spondin为R-spondin过表达细胞产生的细胞上清(代替商品化 R-spondin)
Noggin为Noggin过表达细胞产生的细胞上清(代替商品化Noggin)。
本发明还提供了一种上述方法构建的卵巢癌类器官模型在短期药物筛选中的应用。
作为优选方案，所述应用方法为：
1)将卵巢癌类器官模型消化，计数，用水凝胶重悬PDO球体，以每 10μl中5000个细胞球的密度种植于96孔板，10μl/孔，置于37℃培养箱30min，待水凝胶凝固，加入含有对应浓度药物的类器官培养基，每个处理组3个副孔，置于37度细胞培养箱中培养5～6天；
2)使Celltilter-Glo 3D cell viability assay或者CCK8检测各处理组中卵巢癌类器官的活性。
上述应用过程中，所有药物筛选实验所用卵巢癌类器官模型均采用3 代以内的类器官。
本发明还提供了一种上述方法构建的卵巢癌类器官模型在筛选DNA 损伤类药物中的应用。
本发明的有益效果：
1)本发明使用水凝胶代替Matrigel胶，R-spondin，Noggin，L-wnt3A 均产于细胞上清，极大的降低了现有卵巢癌类器官的培养成本。
2)在药物筛选的应用方面，采用卵巢癌类器官的第一代或者第二代进行药物处理，避免了卵巢癌类器官在长期传代过程中造成的肿瘤成分的富集，免疫成分的缺失等缺点，卵巢癌短期药筛结果更接近患者对药物的反应性；
综上所述，本发明在体外成功的培养了卵巢癌PDO类器官模型/卵巢癌PDXO类器官模型，并在卵巢癌PDO类器官模型/卵巢癌PDXO类器官模型中完成了短期DNA损伤类药物的筛选应用。
附图说明
图1为卵巢癌PDO类器官模型的图片；
图1A为显微镜4x倍镜下卵巢癌类器官PDO球体的白光图片；
图1B为显微镜10x倍镜下卵巢癌类器官PDO球体的白光图片；
图1C为显微镜100x倍镜下卵巢癌类器官PDO球体的白光图片；
图1D为显微镜10x倍镜下卵巢癌类器官PDO球体的HE图片；
图2为卵巢癌PDXO类器官模型的图片；
图中，图2A为显微镜4x倍镜下卵巢癌类器官PDXO球体的白光图片；
图2B为显微镜10x倍镜下卵巢癌类器官PDXO球体的白光图片；
图2C为显微镜100x倍镜下卵巢癌类器官PDXO球体的HE图片；
图2D为显微镜100x倍镜下卵巢癌类器官PDXO球体的荧光图片(使用α-Tubulin染类器官的轮廓，DAPI染类器官的核)；
图3为卵巢癌PDO类器官模型筛选药品的效果图；
图片分别为显微镜4x、10x、100x倍镜下卵巢癌类器官PDO球体在各种药物处理5天后的白光图片，而各组药物处理浓度分别为，5μmol/ml wee1抑制剂(AZD1775),5μmol/ml顺铂(DDP),10μmol/ml奥拉帕尼(Olaparib)。
图4为卵巢癌PDXO类器官模型筛选药品的效果图。
图片分别为显微镜4x、10x、100x倍镜下卵巢癌类器官PDXO球体在各种药物处理5天后的白光图片，而各组药物处理浓度分别为，5μ mol/ml wee1抑制剂(AZD1775),5μmol/ml顺铂(DDP),10μmol/ml奥拉帕尼(Olaparib)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
一种卵巢癌PDO类器官模型的构建方法，包括以下步骤：
1)获得卵巢癌癌灶作为卵巢癌标本，将取部分癌灶标本置于装有保存液的无菌管中浸泡，并将无菌管置于冰上；其中，组织保存液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青，所述四季青的添加量为高糖 DMEM培养基总体积的2-3％；
2)在无菌操作台中，将步骤1)上述部分癌灶标本用组织冲洗液冲洗后，并将癌灶中的坏死组织剪去，选取活性较好，形态呈恶性程度高的癌组织，随后将癌灶用无菌刷机械分离(剪碎、刮碎)，得匀浆状的组织碎片悬液；其中，组织冲洗液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青和双抗，且四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％；
3)将组织碎片悬液用组织冲洗液重悬后，过70μm滤网，取小于 70μm大小的细胞球体，再倒着过40μm的滤网，得到直径为40-70μm 的卵巢癌类器官球体；
4)在每毫升的卵巢癌类器官球体中加入5ml的裂红液，常温裂红 5min后，1000rpm/min离心5min，得到裂红后的卵巢癌类器官球体；
5)向裂红后的卵巢癌类器官球体中加入PBS重悬并离心，清洗一遍，得到大小适中且裂红后的卵巢癌类器官球体；
6)向步骤5)中得到的卵巢癌类器官球体中加入水凝胶重悬，置于冰上，使其密度为每10μl水凝胶中有5000个卵巢癌类器官球体，得到混合液(含有卵巢癌类器官的水凝胶)，待用；
7)将步骤6)中的混合液于铺于24孔板中且每孔40μl卵巢癌类器官悬液；
8)将24孔板置于37℃的细胞培养箱中30min，待水凝胶凝固后，将类器官培养基加入24孔板的孔中，每孔1ml类器官培养基；培养5-6 天，每隔3天换液或者根据密度进行传代和保种，得到卵巢癌PDO类器官模型(图1)。
利用上述卵巢癌PDO类器官模型分别筛选wee1抑制剂(AZD1775), 顺铂(DDP),奥拉帕尼(Olaparib)，具体方法如下：
1)在类器官培养基中分别加入DMSO，5μmol/ml wee1抑制剂 (AZD1775),5μmol/ml顺铂(DDP),10μmol/ml奥拉帕尼(Olaparib)；
2)将卵巢癌PDO类器官模型消化，计数，用水凝胶重悬PDO球体，以每10μl中5000个细胞球的密度种植于96孔板，10μl/孔，置于37℃培养箱30min，待水凝胶凝固，将配好药物浓度的类器官培养基分别加入 96孔板的孔中，其中，每孔100μl类器官培养基，每个处理组有3个副孔；置于37度细胞培养箱中培养5～6天；
3)使用Celltilter-Glo 3D cell viability assay或者CCK8检测各处理组中卵巢癌类器官的活性。
如图3所示：卵巢癌类器官球体在5μmol/ml wee1抑制剂(AZD1775), 5μmol/ml顺铂(DDP)处理5天后，相比于对照组，球体密度降低，结构明显被破坏，体积明显缩小，这说明这一例卵巢癌类器官PDO系对 AZD1775，顺铂均敏感；而卵巢癌类器官PDO球体在10μmol/ml奥拉帕尼(Olaparib)处理5天后，球体密度，体积，结构均未有明显变化，因此，这一例卵巢癌类器官系对奥拉帕尼相对耐药；卵巢癌PDO类器官模型是药品筛选的优良模型。
实施例2
一种卵巢癌PDXO类器官模型的构建方法，包括以下步骤：1)取到卵巢癌PDX的皮下瘤作为卵巢癌标本，立即将癌灶置于装有组织保存液的无菌管中，将无菌管置于冰上；其中，组织保存液配方以高糖DMEM 培养基为基础添加四季青，所述四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％；
2)在无菌操作台中，将步骤1)上述部分癌灶标本用组织冲洗液冲洗后，并将癌灶中的坏死组织剪去，选取活性较好，形态呈恶性程度高的癌组织，随后将癌灶用无菌刷机械分离(剪碎、刮碎)，得匀浆状的组织碎片悬液；其中，组织冲洗液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青和双抗，且四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％；
3)将组织碎片悬液用组织冲洗液重悬后，过70μm滤网，取小于 70μm大小的细胞球体，再倒着过40μm的滤网，得到直径为40-70μm 的卵巢癌类器官球体；
4)在每毫升的卵巢癌类器官球体中加入5ml的裂红液，常温裂红 5min后，1000rpm/min离心5min，得到裂红后的卵巢癌类器官球体；
5)向裂红后的卵巢癌类器官球体中加入PBS重悬并离心，清洗一遍，得到大小适中且裂红后的卵巢癌类器官球体；
6)向步骤5)中得到的卵巢癌类器官球体中加入水凝胶重悬，置于冰上，使其密度为每10μl水凝胶中有5000个卵巢癌类器官球体，得到混合液(含有卵巢癌类器官的水凝胶)，待用；
7)将步骤6)中的混合液于铺于24孔板中且每孔40μl卵巢癌类器官悬液；
8)将24孔板置于37℃的细胞培养箱中30min，待水凝胶凝固后，将类器官培养基加入24孔板的孔中，每孔1ml类器官培养基；培养5-6 天，每隔3天换液或者根据密度进行传代和保种，得到卵巢癌PDXO类器官模型(图2)。
利用上述卵巢癌PDXO类器官模型分别筛选wee1抑制剂 (AZD1775)、顺铂(DDP)和奥拉帕尼(Olaparib)，具体方法如下：
1)在类器官培养基中分别加入DMSO，5μmol/ml wee1抑制剂 (AZD1775),5μmol/ml顺铂(DDP),10μmol/ml奥拉帕尼(Olaparib)；
2)将卵巢癌PDXO类器官模型消化，计数，用水凝胶重悬PDO球体，以每10μl中5000个细胞球的密度种植于96孔板，10μl/孔，置于 37℃培养箱30min，待水凝胶凝固，将配好药物浓度的类器官培养基分别加入96孔板的孔中，其中，每孔100μl类器官培养基，每个处理组有3 个副孔；置于37度细胞培养箱中培养5～6天；
3)使用Celltilter-Glo 3D cell viability assay或者CCK8检测各处理组中卵巢癌类器官的活性。
如图4所示：卵巢癌类器官PDXO球体在5μmol/ml wee1抑制剂(AZD1775),5μmol/ml顺铂(DDP)，10μmol/ml奥拉帕尼(Olaparib) 处理5天后，相比于对照组，球体密度降低，结构明显被破坏，体积明显缩小，说明卵巢癌类器官PDXO球体对AZD1775，顺铂，奥拉帕尼均相对敏感，卵巢癌PDXO类器官模型是药品筛选的优良模型。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例。
Claims (10)
1.一种卵巢癌类器官模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)获取卵巢癌标本，将取部分癌灶标本置于组织保存液中浸泡，并置于冰上；其中，所述卵巢癌标本为卵巢癌癌灶或者皮下瘤的卵巢癌组织
2)将步骤1)上述部分癌灶标本用组织冲洗液冲洗后，选取活性较好，形态呈恶性程度高的癌组织，然后对癌组织剪碎、刮碎；得到匀浆状的组织碎片悬液；
3)将组织碎片悬液用组织冲洗液重悬后，过滤网，得到的卵巢癌类器官球体；
4)向卵巢癌类器官球体中加入裂红液，颠倒摇匀，室温放置后离心，弃上清，得到裂红后的卵巢癌类器官球体；
5)向裂红后的卵巢癌类器官球体中加入PBS重悬并离心，清洗一遍，得到大小适中且裂红后的卵巢癌类器官球体；
6)向步骤5)中得到的卵巢癌类器官球体中加入水凝胶，置于冰上，得到混合液，待用；
7)将步骤6)中的混合液种于细胞培养板或细胞培养皿内；
8)将接种了细胞球的培养板或接种了细胞球的培养皿置于细胞培养箱中培养，直至水凝胶凝固；最后取出细胞培养板于无菌细胞台中，在孔板中加入对应的类器官培养基培养，即得卵巢癌类器官模型，其中，卵巢癌类器官模型为卵巢癌PDO类器官模型或者卵巢癌PDXO类器官模型。
2.根据权利要求1所述卵巢癌类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中，组织保存液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青，所述四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％。
所述步骤2)中，组织冲洗液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青和双抗，其中，所述四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％；
所述双抗的添加量为高糖DMEM培养基总体积的0.1％，所述双抗由链霉素和青霉素组成且链霉素和青霉素重量比为1:3；
所述步骤8)中，类器官培养基其配方如下：1％的Glutanmax、1％的HEPES、0.1％的PS、20ng/ml的L-wnt3A、50ng/ml的R-spondin、100ng/ml的Noggin、50ng/ml的EGF、10ng/ml的FGF10、10ng/ml的FGF2、10ng/ml的50×B27、10mmol/ml的Nicotinamide、25mmol/ml的N-Acegglytene、1umol/ml的ProstaglandinE2、10umolg/ml的SB02190、500nmol/ml的A8301、10umol/ml的Y27632和0.1％的万古霉素。
3.根据权利要求1所述卵巢癌类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中，细胞球的直径为40～70μm。
4.根据权利要求1所述卵巢癌类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中，裂红液加入量为：每毫升的细胞球中5ml的裂红液；离心转速为1000转/分，时间为5～10min。
5.根据权利要求1所述卵巢癌类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤8)中，细胞培养箱的温度为37℃，细胞时间为30min。
6.根据权利要求1所述卵巢癌类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤8)中，所述卵巢癌类器官模型培养如：
在孔板中加入对应的类器官培养基，然后置于温度为37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中，培养5-6天，每隔3天换液或者根据密度进行传代和保种，卵巢癌类器官模型。
7.一种权利要求1所述构建方法所用的培养基，其特征在于：
所述组织保存液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青，所述四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％；
所述组织冲洗液配方以高糖DMEM培养基为基础添加四季青和双抗，其中，所述四季青的添加量为高糖DMEM培养基总体积的2-3％；
所述双抗的添加量为高糖DMEM培养基总体积的0.1％，所述双抗由链霉素和青霉素组成且链霉素和青霉素重量比为1:3；
所述类器官培养基其配方如下：1％的Glutanmax、1％的HEPES、0.1％的PS、20ng/ml的L-wnt3A、50ng/ml的R-spondin、100ng/ml的Noggin、50ng/ml的EGF、10ng/ml的FGF10、10ng/ml的FGF2、10ng/ml的50×B27、10mmol/ml的Nicotinamide、25mmol/ml的N-Acegglytene、1umol/ml的ProstaglandinE2、10umolg/ml的SB02190、500nmol/ml的A8301、10umol/ml的Y27632和0.1％的万古霉素。
8.一种权利要求1所述方法构建的卵巢癌类器官模型在短期药物筛选中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于：所述应用方法为：
1)将卵巢癌类器官模型消化，计数，用水凝胶重悬PDO球体，以每10μl中5000个细胞球的密度种植于96孔板，10μl/孔，置于37℃培养箱30min，待水凝胶凝固，加入含有对应浓度药物的类器官培养基，每个处理组3个副孔，置于37度细胞培养箱中培养5～6天；
2)使Celltilter-Glo 3D cell viability assay或者CCK8检测各处理组中卵巢癌类器官的活性。
10.一种权利要求1所述方法构建的卵巢癌类器官模型完成在模型中筛选DNA损伤类药物中的应用。
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| CN117143800A (zh) * | 2023-07-20 | 2023-12-01 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法及应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110447633A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-15 | 北京吉尚立德生物科技有限公司 | 一种肺癌实体瘤组织样本保存液 |
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2022
- 2022-03-10 CN CN202210230877.4A patent/CN114606191A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110447633A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-15 | 北京吉尚立德生物科技有限公司 | 一种肺癌实体瘤组织样本保存液 |
Non-Patent Citations (5)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117143800A (zh) * | 2023-07-20 | 2023-12-01 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 一种具有神经系统的小鼠肠道类器官的构建方法及应用 |
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