TWI782492B

TWI782492B - 一種血液中之微小幹細胞取得方法

Info

Publication number: TWI782492B
Application number: TW110114062A
Authority: TW
Inventors: 鄧岳華
Original assignee: 鄧文炳
Priority date: 2021-04-20
Filing date: 2021-04-20
Publication date: 2022-11-01
Also published as: TW202242102A

Abstract

一種血液中之微小幹細胞取得方法，包含以下步驟：將血液與反應試劑混合得混合液，其中反應試劑包含有抗凝血劑及觸變膠體，該觸變膠體係為黏性膠體；離心混合液，使混合液中之血液與反應試劑進行反應得離心液；以及收集離心液之最上層溶液，其中最上層溶液係為含有微小幹細胞之第一血液溶液。第一血液溶液細胞中之微小幹細胞對腦部疾病以及腎臟疾病具有良好的療效。

Description

一種血液中之微小幹細胞取得方法

本發明係關於一種微小幹細胞取得方法，尤其是，關於一種血液中之微小幹細胞取得方法。

在醫學上，幹細胞已廣泛應用於細胞治療、組織工程與再生醫學領域。幹細胞具有自我更新、增生和分化成不同組織細胞的功能。研究顯示由於幹細胞能分化出新細胞，可用於修復受損的組織或器官。幹細胞可由不同組織來源分離取得，如骨髓、臍帶血、胎盤等。

脂肪組織相較骨隨和臍帶血來源廣泛，取材容易，少量脂肪組織即可獲取大量幹細胞。近年來，研究發現脂肪組織中富含多潛能的幹細胞(multipotent stem cell)，其具有促進組織修復和免疫調節等多項功能，例如脂肪細胞、骨細胞以及軟骨細胞等能力。除了有分化能力之外，亦具有與骨髓分離之幹細胞相同之特性，例如：細胞學特性、免疫學特性、組織再生能力等。

然而，於細胞治療時往往需要大量的幹細胞才能達成治療效果，五千萬至一億顆細胞。而傳統的分離幹細胞之方法中，首先需先取得細胞組織，進行消化作用後，分離其中之幹細胞，並且只能從大量組織細胞中分離微量的幹細胞，例如：脂肪、骨髓及造血幹細胞等。需要經過培養放大後才能達到治療需要的使用量。因此時常需要經過多項的處理手續，反覆離心、清洗去除不需要的部分。由於冗長的分離步驟，不僅會增加工作時間，也會因為幹細胞暴露於培養箱外太久而增加培養基汙染、細胞不健康甚至死亡的機率。

有鑑於此，本發明提供一種血液中之微小幹細胞(Small Pstem cells,SPSCs)及其取得方法。其只需要少量的血液即可分離出足夠的微小幹細胞，不需經過培養放大即可進行後續治療。

一種血液中之微小幹細胞取得方法，包含以下步驟：將血液與反應試劑混合得混合液，其中反應試劑包含有抗凝血劑及觸變膠體，該觸變膠體係為黏性膠體；離心混合液，使混合液中之血液與反應試劑進行反應得離心液；以及收集離心液之最上層溶液，其中最上層溶液係為含有微小幹細胞之第一血液溶液。

其中，將血液與反應試劑混合得混合液的步驟之前，進一步包含以真空採集管採集血液之步驟。

其中，抗凝血劑與血液之重量比為1：7~1：15之間。

其中，觸變膠體與該血液之重量比為1：7~1：15之間。

其中，觸變膠體黏度係為0.8~1.1x10⁴cps，且其密度係為1.0~1.1。

其中，離心混合液之步驟係於室溫下以600~1200RCF之轉速進行離心。

血液中之微小幹細胞取得方法，進一步包含以下步驟：以一流式細胞儀根據第一血液溶液中之微小幹細胞表面之複數個表現抗原及複數個不表現抗原，鑑定第一血液溶液中之微小幹細胞之數量。

其中，第一血液溶液中之微小幹細胞表面之表現抗原包含CD184與CD61及不表現抗原包含Lineage與CD45。

其中，第一血液溶液中之包含表現抗原CD184與CD61及不表現抗原Lineage與CD45的微小幹細胞數量佔第一血液溶液中所有細胞數量的10%~30%。

其中，第一血液溶液中之包含表現抗原CD184與CD61及不表現抗原Lineage與CD45的微小幹細胞數量佔第一血液溶液中所有細胞數量的26%。

綜上所述，本發明所提供之血液中之微小幹細胞取得方法，可從無菌的環境下採集的血液離心分離出足夠的微小幹細胞，不需經過培養放大即可進行後續治療，兼具快速及方便的功效。同時，於離心分離出的微小幹細胞，其對於腎臟疾病與腦部疾病有良好的治療效果。

S0~S3:步驟

圖1係繪示本發明之一具體實施例之步驟流程圖。

圖2係繪示根據本發明之另一具體實施例之血液中之微小幹細胞取得方法的步驟流程圖。

圖3係繪示流式細胞儀對圖1之血液中之微小幹細胞取得方法所獲得的第一血液溶液進行檢測而得到的二維直方圖。

圖4係繪示根據本發明之另一具體實施例之大鼠腎臟細胞損害程度直條圖。

圖5係繪示各實驗組之大鼠腎臟細胞纖維化程度之數據圖。

圖6A係繪示本發明之一具體實施例之腦細胞組織和橫截面之顯微照片。

圖6B係繪示圖6A之腦細胞組織染色之示意圖。

為了讓本發明的優點，精神與特徵可以更容易且明確地了解，後續將以實施例並參照所附圖式進行詳述與討論。值得注意的是，這些實施例僅為本發明代表性的實施例。但是其可以許多不同的形式來實現，並不限於本說明書所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使本創作的公開內容更加透徹且全面。

在本發明公開的各種實施例中使用的術語僅用於描述特定實施例的目的，並非在限制本發明所公開的各種實施例。如在此所使用的單數形式係也包括複數形式，除非上下文清楚地另外指示。除非另有限定，否則在本說明書中使用的所有術語(包含技術術語和科學術語)具有與本發明公開的各種實施例所屬領域普通技術人員通常理解的涵義相同的涵義。上述術語(諸如在一般使用的辭典中限定的術語)將被解釋為具有與在相同技術領域中的語境涵義相同的涵義，並且將不被解釋為具有理想化的涵義或過於正式的涵義，除非在本發明公開的各種實施例中被清楚地限定。

此外，本發明裝置或元件前的不定冠詞“一”、“一種”和“一個”對裝置或元件的數量要求(即出現次數)無限制性。因此“一”應被解讀為包括一或至少一，並且單數形式的裝置或元件也包括複數形式，除非所述數量明顯指單數形式。

請參閱圖1，圖1係繪示根據本發明之一具體實施例之血液中之微小幹細胞取得方法的步驟流程圖。如圖1所示，於本具體實施例中，血液中之微小幹細胞取得方法包含下列步驟：步驟S1，將血液與反應試劑混合得混合液，其中反應試劑包含有抗凝血劑及觸變膠體，且觸變膠體係為黏性膠體；步驟S2，對混合液進行離心，使混合液中之血液與反應試劑進行反應得離心液；以及，步驟S3，收集離心液之最上層溶液，其中最上層溶液係為含有微小幹細胞之第一血液溶液，又稱為Small P stem cells(SPSCs)。

步驟S1加入的反應試劑包含有抗凝血劑及觸變膠體，其中，加入抗凝血劑之目的為避免血小板活化而造成血液凝結。所加入的抗凝血劑與血液之重量比為1：7~1：15之間。

此外，加入觸變膠體之目的為有利於離心時得到高純度的微小幹細胞。觸膠變體外觀為無色透明膠狀體，其為具有化學惰性、觸變性的黏性膠體。觸變性又稱搖變性，亦即在震盪、壓迫等機械力的作用下發生之可逆的溶膠現象。觸變膠體黏度係為0.8~1.1x10⁴cps，且其密度係為1.0~1.1。觸變膠體可黏附不同分子量與密度的細胞，然而微小幹細胞分子量小不易被觸膠變體黏附，因此可於離心時得到高純度的微小幹細胞。於本具體實施例中，所加入的觸變膠體與血液之重量比為1：7~1：15之間。

步驟S2中，混合液係於無菌環境中及室溫下以600~1200RCF之轉速進行離心。

上述第一血液溶液中的微小幹細胞，可透過如下之方法進行檢測。步驟S3離心完後，收集最上層的溶液為含有微小幹細胞之第一血液溶液，微小幹細胞因為分子量小、密度低。於離心完時，會懸浮於最上層溶液，因此收集最上層的溶液做後續的實驗。

以下再進一步針對本具體實施例之血液中之微小幹細胞取得方法步驟進一步說明。

請參照圖2，圖2係繪示根據本發明之另一具體實施例之血液中之微小幹細胞取得方法的步驟流程圖。如圖2所示，本具體實施例與前一具體實施例不同處在於本具體實施例之血液中之微小幹細胞取得方法在步驟S1之前包含下列步驟：步驟S10，以真空採集管採集血液。以真空採集管採集血液，利於快速採集樣品以及避免血液汙染，可使血液保持於無菌的環境中，其中，真空採集管的重量係為1.0~1.2克，採集之血液係為7mL。

實務中，血液中微小幹細胞可能包含多種表現抗原及不表現抗原，其中部分的微小幹細胞所表現的抗原包含CD184與CD61，且不表現抗原則包含Lineage與CD45。因此，離心完後得到的第一血液溶液，可進一步以流式細胞儀進行根據上述表現抗原和不表現抗原來檢測第一血液溶液中之特定微小幹細胞的細胞含量。

流式細胞儀(flow cytometry)鑑定血液中特定微小幹細胞的原理是先將已結合上螢光染料的單株抗體加入第一血液溶液中以對待測之帶有特定抗原(例如抗原CD184與CD61)的微小幹細胞進行染色，再將經過染色的第一血液溶液以雷射光(波長488nm的氬離子雷射)照射，接著以適當的濾片去篩選過濾所欲測定的波長，最後使用光子偵測器(photodetectors)將訊號接收放大後，再轉換處理成二維直方圖。

請參閱圖3，圖3係繪示流式細胞儀對圖1之血液中之微小幹細胞取得方法所獲得的第一血液溶液進行檢測而得到的二維直方圖。其中，二維直方圖中之橫軸為螢光強度，縱軸為發出該螢光強度之細胞的數量。螢光強度的亮度值須達到特定的數值，才會被計算細胞帶有抗原CD184,CD61。如圖3所示，圖1之血液中之微小幹細胞取得方法所離心出的第一血液溶液中，帶有表現抗原CD184之細胞約佔所有細胞的26.04%與帶有表現抗原CD61之細胞約佔所有細胞的42.16%。不表現抗原Lineage之細胞與不表現抗原CD45之細胞，大部分皆未有偵測到螢光強度的訊號，只有少部分細胞偵測到螢光訊號，其不表現抗原Lineage之細胞約占所有細胞3.27%與不表現抗原CD45之細胞約占所有細胞4.37%。其證實所離心後的第一血液溶液中，帶有大量的微小幹細胞。如上所述，由於帶有表現抗原CD184與帶有表現抗原CD61之細胞分別約佔所有細胞的26.04%及42.16%，而本發明之微小幹細胞需同時表現這兩個抗原，故取最小值為26%。

第一血液溶液中之微小幹細胞的所有細胞之數量可透過以下計算方式直接得到：取出20μL的細胞樣本並加入20μL的台酚藍(Trypan Blue)均勻混合染色後，接著滴入細胞計數盤中以計算存活細胞(非染色細胞)。結果顯示7ml之血液可分離出3.6*10⁸顆細胞，並且如上所述，第一血液溶液同時表現Lin^-CD45^-CD184⁺CD61⁺的細胞佔26%，約9.36*10⁷顆細胞，因此，7ml血液中具有將近一億顆微小幹細胞。

上述第一血液溶液可直接用於治療。於另一具體實施例中，建立四種不同對照模組的實驗大鼠，觀察其注入上述第一血液溶液之腎臟細胞之受損及恢復程度，其中，大鼠的來源係為成年雄性大鼠。第一實驗組：假手術組(sham-operated control，SC)，腹壁和頸部皮膚打開再縫合；第二實驗組：假手術組+注射第一血液溶液(Small P stem cells,SPSCs)，其中第一血液溶液係自左頸總動脈和腹主動脈注射，並於手術後2小時進行注射；第三實驗組：動物急性缺血性中風與腎缺血性病變共病症組(cerebro renal syndrome，CRS)；第四實驗組：動物急性缺血性中風與腎缺血性病變共病症組+注射第一血液溶液(CRS+SPSCs)，其中第一血液溶液係自左頸總動脈和腹主動脈注射，於動物急性缺血性中風與腎缺血性病變共病症組建立後2小時進行。

第三實驗組，亦即動物急性缺血性中風與腎缺血性病變共病症組(cerebro renal syndrome，CRS)的模型建立，係將大鼠進行急性缺血性中風手術與腎缺血性再灌注手術等兩種手術處理。首先進行腎缺血性再灌注手術，其流程為：大鼠接受2%異氟醚(isoflurane)麻醉後，置於仰臥位，在37℃的加熱墊上進行中線剖腹術，使用非創傷性血管夾鉗住腎蒂60分鐘，然後通過釋放阻塞物進行再灌注以造成腎臟缺血性病變。手術後，閉合傷口，並在便攜式動物重症監護室(ThermoCare®)中，將動物從麻醉中恢復24小時。接著，再對進行腎缺血性再灌注手術後的大鼠進行急性缺血性中風手術，其流程為：大鼠接受2%異氟醚(isoflurane)麻醉後，通過橫向頸切口暴露左總頸動脈後，在左總頸動脈上做一個小切口，將尼龍細絲(直徑0.28mm)通過該切口推進到左頸內動脈遠端，以閉塞左主幹冠狀動脈從而誘發腦梗塞。閉塞後50分鐘，將尼龍絲去除，然後將肌肉和皮膚分層縫合。手術後，閉合傷口，並在便攜式動物重症監護室(ThermoCare®)中，將動物從麻醉中恢復24小時。請注意，第四實驗組之手術模型建立同第三實驗組。

將上述四組實驗組所有動物的腎臟標本浸泡在10%福爾馬林緩衝液中，並包埋於石蠟，切成5μm的切片，染色觀察其腎臟細胞切片之細胞變化。請參閱圖4，圖4係繪示根據本發明之另一具體實施例之大鼠腎臟細胞損害程度直條圖。如圖4所示，其橫軸表示上述四組實驗大鼠，縱軸反應對應各實驗組腎小管壞死的評分等級，腎小管壞死的評分等級如下：0(無)，1(

10%)，2(11-25%)，3(26-45%)，4(46-75%)和5(

76%)，百分比係為組織切片中之壞死的細胞。由圖5可知，SC組與SC+SPSCs組在注射SPSCs溶液後之細胞損害程度並無明顯恢復，而CRS組與CRS+SPSCs組溶液於注射SPSCs溶液後，腎小管壞死的等級從原本約4.5分下降至3.8分，亦即，細胞約有20%程度的復原。由此實驗可知，大鼠在同樣接受手術的條件下，CRS組在接受SPSCs溶液的注射後，細胞有明顯的的恢復。

於另一具體實施例，可利用馬森三色染色法(Masson's trichrome stain)與天狼猩红(Sirius red,SR)染料對上述四個實驗組的大鼠腎臟標本進行染色，以研究腎臟標本纖維化的程度，並且使用Image Tool 3(IT3)軟體(University of Texas,Health Science Center,San Antonio,UTHSCSA；Image Tool for Windows,Version 3.0,USA)計算每個區域腎臟標本中的纖維化積分面積(μm²)，其結果可參閱圖4，圖4係繪示各實驗組之大鼠腎臟細胞纖維化程度之數據圖。如圖5所示，其縱軸係為上述四組實驗大鼠，橫軸係為腎臟細胞纖維化的面積。其縱軸顯示CRS組之纖維化面積遠遠大於另外兩組實驗，而於第四組實驗大鼠顯示在注入SPSCs溶液後，細胞纖維化面積大大的縮小，有利於受損細胞復原。

任何原因能引起組織細胞損傷，均可能導致組織細胞發生變性、壞死和炎症反應，如果損傷很小，損傷細胞周邊正常實質細胞將發生增生修復，這種修復可完全恢復正常的結構和功能。然而，如果損傷較大或反覆損傷超出了損傷周圍實質細胞的再生能力時，間質纖維結締組織(細胞外基質)將大量增生對缺損組織進行修復，即為上述細胞纖維化的病理改變。

腦梗、腦梗塞、缺血性腦疾病占全部腦疾病中的70%~80%，係為腦動脈阻塞後，相對應部位的腦組織的破壞，可伴發腦出血。腦梗的大小和位置的準確性是可以通過2,3,5-三苯四唑氯化物(TTC)染色來評估腦部缺血的重要參數。由上述實施例中，得知第一血液溶液中之微小幹細胞在腎臟疾病中的療效後，於下述實施例則詳述微小幹細胞對於腦細胞損傷的改善。

三苯基氯化四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride,TTC)，又稱為紅四氮唑，是一種氧化還原指示劑，用於對哺乳動物組織的缺血梗塞染色檢測。TTC作為呼吸鏈中吡啶核苷結合酶系統的質子受體，於正常組織中TTC在脫氫酶的作用下會被還原成紅色，但於缺血組織中由於其脫氫酶活性下降而無法與TTC反應，故TTC不會有顏色變化而呈蒼白色。

於另一具體實施例，再以上述四組實驗大鼠進行腦組織細胞的研究。其檢測步驟包含：以2毫米的切片獲得大鼠的腦組織軸截面，接著利用TTC染色法檢測腦梗塞區域(brain infarct area，BIA)，換言之，以2%TTC(Alfa Aesar)對腦組織的每個橫截面進行染色，進行BIA分析。將所有腦部切片放置在帶有比例縮放的垂直桿托盤上，直接從上方以固定的方式高度捕獲圖像。然後使用圖像分析軟件Image Tool 3(IT3)對獲得的圖像進行分析，觀察到梗塞區為白色或淺黃色區域。再通過組織學染色(H & E染色)進一步確認梗塞區域，並通過光學顯微鏡進行分析。最後將梗塞區域面積除以大腦的總橫截面積來獲得梗塞面積的百分比。

此外，蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin stain,H & E Stain)是組織學最常用的染色方法之一，這種染色方法的基礎是組織結構對不同染料酸鹼的結合程度不同，造成染色差異。蘇木素是鹼性染料，藍紫色，可以使細胞核等著色。被蘇木素著色的結構本身為酸性，具有嗜鹼性(Basophilic)；伊紅是酸性染料，粉紅色。可以將大多數細胞的細胞質染成紅色。被伊紅著色的結構本身為鹼性，具有嗜酸性(Acidophilic)。然而，於本發明中，大腦組織梗塞區為呈現白色或淺黃色區域。

請參閱圖6A及圖6B，圖6A係繪示本發明之一具體實施例之腦細胞組織和橫截面之顯微照片，圖6B係繪示圖6A之腦細胞組織染色之示意圖。如圖6A所示，全腦TTC染色橫截面的顯微照片可以識別和定量腦梗塞區域，其中，SC組(圖7A；a)和SC+SPSCs組(圖7A；b)的腦組織血液分佈區域無明顯差異；CRS組(圖7A；c)相比於SC組(圖7A；a)腦組織血液分佈區域明顯減少，其顯示腦梗塞面積增大。然而，CRS組在注射SPSCs溶液後，腦血腫面積減少(圖7A；d)。如圖7B所示，透過組織學H & E染色進一步確認腦梗塞區域，其中，SC組(圖7B；a)與SC+SPSCs組，腦組織染色區域則無明顯差異；CRS組(圖7B；c)相比於SC組(圖7B；a)，可見CRS組左半球皮層中較淺的組織染色(圖7B；c)。然而，CRS(圖7B；c)組，在注射SPSCs溶液恢復，可見原本左半球皮層中較淺的組織染色區域已經恢復(圖7B；d)。其顯示了腦梗塞面積的減少，也支持了SPSCs的這種治療功效。

綜上所述，本發明之血液中微小幹細胞取得方法，於離心時加入抗凝血劑及觸變膠體，其可提高於離心時，得到較高純度的微小幹細胞，並且可得到血液中同時表現Lin-CD45-CD184+CD61+26%的微小幹細胞，並證實了其具有對腎臟以及腦部損傷具有良好的治療功效，將有利於醫療治療的進步。

藉由以上較佳具體實施例之詳述，係希望能更加清楚描述本發明之特徵與精神，而並非以上述所揭露的較佳具體實施例來對本發明之範疇加以限制。相反地，其目的是希望能涵蓋各種改變及具相等性的安排於本發明所欲申請之專利範圍的範疇內。因此，本發明所申請之專利範圍的範疇應根據上述的說明作最寬廣的解釋，以致使其涵蓋所有可能的改變以及具相等性的安排。

S1~S3

Claims

一種血液中之微小幹細胞取得方法，包含以下步驟：將一血液與一反應試劑混合得一混合液，其中該反應試劑包含有一抗凝血劑及一觸變膠體，該觸變膠體係為黏性膠體，該觸變膠體黏度係為0.8~1.1 x 10⁴cps，且其密度係為1.0~1.1，該觸變膠體與該血液之重量比為1：7~1：15之間；於室溫下以600~1200RCF之轉速離心該混合液，使該混合液中之該血液與該反應試劑進行反應得一離心液；以及收集該離心液之一最上層溶液，其中該最上層溶液係為含有微小幹細胞之一第一血液溶液。
如申請專利範圍第1項所述之血液中之微小幹細胞取得方法，其中該抗凝血劑與該血液之重量比為1：7~1：15之間。
如申請專利範圍第1項所述之血液中之微小幹細胞取得方法，進一步包含以下步驟：以一流式細胞儀根據該第一血液溶液中之微小幹細胞表面之複數個表現抗原及複數個不表現抗原，鑑定該第一血液溶液中之微小幹細胞之數量。
如申請專利範圍第3項所述之血液中之微小幹細胞取得方法，其中該第一血液溶液中之微小幹細胞表面之該等表現抗原包含CD184與CD61及該等不表現抗原包含Lineage與CD45。
如申請專利範圍第4項所述之血液中之微小幹細胞取得方法，其中該第一血液溶液中之包含表現抗原CD184與CD61及不表現抗原Lineage與CD45的微小幹細胞數量佔該第一血液溶液中所有細胞數量的10%~30%。
如申請專利範圍第5項所述之血液中之微小幹細胞取得方法，其中該第一血液溶液中之包含表現抗原CD184與CD61及不表現抗原 Lineage與CD45的微小幹細胞數量佔該第一血液溶液中所有細胞數量的26%。