ES2868360T3 - Métodos para obtener progenitores retinianos, células epiteliales pigmentadas retinianas y células retinianas neurales - Google Patents

Abstract

Un método para para obtener in vitro progenitores retinianos humanos, que comprende las etapas consistentes en: (i) disponer un cultivo adherente de células madre pluripotentes humanas en forma de una monocapa de tipo colonia que alcanza al menos un 80% de confluencia, - en un sistema de cultivo adherente consistente en células nutrientes que consisten en una capa de alimentación de MEF de ratón inactivado con mitomicina C; - en un medio proneural que favorece el mantenimiento y/o crecimiento de células neuronales, estando compuesto dicho medio proneural por un medio nutritivo suplementado con un suplemento de medio de N2; y (ii) mantener este cultivo en dicho medio proneural hasta la aparición de células pigmentadas y/o de estructuras de tipo neuroepitelial.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para obtener progenitores retiñíanos, células epiteliales pigmentadas retinianas y células retinianas neurales

La afectación o pérdida completa de la función de las células fotorreceptoras o del epitelio pigmentado retiniano (RPE, por sus siglas en inglés) de soporte es la principal causa de ceguera irreversible en enfermedades de la retina, como las degeneraciones retinianas hereditarias y la degeneración macular relacionada con la edad (AMD, por sus siglas en inglés). La muerte de las células ganglionares de la retina (RGC, por sus siglas en inglés) en el glaucoma también conduce a una pérdida irreversible de la visión. El rescate de la retina degenerada es un desafío importante y el reemplazo celular es una de las estrategias más prometedoras (Pearson et a l, 2012; Barber et a l, 2013). El uso de células madre pluripotentes humanas, células madre embrionarias (ES, por sus siglas en inglés) y células madre pluripotentes inducidas (iPS, por sus siglas en inglés) abre una nueva vía para las enfermedades degenerativas retinianas humanas. Las células humanas ES (hES, por sus siglas en inglés) e iPS (hiPS, por sus siglas en inglés), que tienen la capacidad de expandirse indefinidamente en cultivo mientras conservan su estado pluripotente, podrían usarse como una fuente ilimitada de células retinianas (fotorreceptores, RPE y RGC) para el trasplante de tejidos (revisiones en: Comyn et a l, 2010; Dahlmann-Noor et a l, 2010, Boucherie et al., 2011). Sin embargo, esta nueva tecnología todavía se enfrenta muchas dificultades. En particular, los procedimientos de diferenciación actuales no son lo suficientemente sofisticados para garantizar la eficiencia y la seguridad. Varias publicaciones indicaron que las células hES y hiPS se pueden diferenciar con relativa facilidad en células RPE mediante la diferenciación espontánea de colonias en cultivos celulares (Buchholz et al., 2009; Vaajasaari et al., 2011; Zahabi et al., 2012) o mediante diferentes métodos de agregados flotantes (Idelson et al., 2009; Lu et al., 2009; Kokkinaki et al., 2011). También se pueden obtener progenitores de RPE a partir de células hES utilizando matriz extracelular y células adyacentes (gong et al., 2008). Un cuerpo creciente de datos convergentes demostró la capacidad de las hES o hiPS para comprometerse en el linaje neural de la retina después de la formación de cuerpos embrioides y diferenciarse aún más en células que expresan marcadores fotorreceptores (Lamba et al., 2006, 2009; Osakada et al., 2008, 2009; Meyer et al., 2009, Mellough et al., 2012). Los diferentes métodos previamente desarrollados, aunque constituyen un avance real, todavía presentan inconvenientes generalmente asociados con la diferenciación de células madre pluripotentes en tipos de células altamente especializadas. Estos protocolos para la diferenciación de células hES o hiPS dirigida por fotorreceptores requieren varias etapas, la adición de varias moléculas y son bastante ineficaces (Klimanskaya et al., 2004). Recientemente, otros grupos fueron más allá en su intento de obtener estructuras tridimensionales de estructuras similares a vesículas ópticas a partir de cuerpos embrioides de células hES o hiPS (Meyer et al., 2011; Nakano et al., 2012). Los métodos de diferenciación utilizaron matrigel para recrear una matriz extracelular compleja (ECM, por sus siglas en inglés) alrededor de los cuerpos embrioides, permitiendo la autoformación de un neuroepitelio y una diferenciación más o menos rápida en el linaje de células fotorreceptoras (Meyer et al., 2011; Nakano et al., 2012; Boucherie et al., 2013; Zhu et al., 2013).

Por lo tanto, en la técnica existe una necesidad de métodos simples, eficientes y fiables para obtener cultivos sustancialmente puros de ciertas células de linaje neuroepitelial humano, incluyendo células progenitoras retinianas, células RPE y células retinianas neurales, que modelen con precisión la diferenciación y el desarrollo ln vltro.

Tal como se describe más abajo en la parte experimental, los inventores han sometido ahora las células iPS a un nuevo protocolo de diferenciación retiniana, que combina sistemas de cultivo 2D y 3D. Este protocolo evita la formación de cuerpos embrioides o agregados celulares y se puede realizar en ausencia de matrigel o suero. Los inventores demostraron que las células hiPS confluentes cultivadas en medio proneural pueden generar en dos semanas estructuras de tipo neuroepitelial con una identidad de campo ocular, que, cuando se cambian a cultivos 3D, se pueden diferenciar en los principales tipos de células retinianas. En estas condiciones, las células hiPS se autoensamblaron en tejidos similares a la retina neural, con una rápida expresión de marcadores retinianos en una ventana de tiempo apropiada para el desarrollo; dieron lugar a diferentes tipos de células retinianas tales como RGC y fotorreceptores.

La materia patentable de la invención está definida por las reivindicaciones 1-15.

Por lo tanto, un primer objeto de la presente descripción consiste en un método para obtener ln vltro progenitores retinianos humanos, que comprende las etapas consistentes en:

(i) disponer un cultivo adherente de células madre pluripotentes humanas en un medio proneural; y

(ii) mantener este cultivo en dicho medio proneural hasta la aparición de células pigmentadas y/o de estructuras de tipo neuroepitelial.

En el presente texto, los "progenitores retinianos", también denominados "células progenitoras retinianas", incluyen células que son competentes para generar todos los tipos de células de la retina neural, incluyendo precursores de fotorreceptores, así como células que se pueden diferenciar en RPE.

Las "células madre pluripotentes humanas" incluyen células madre embrionarias humanas (hES) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPS). El método arriba indicado se realiza ventajosamente con células madre pluripotentes inducidas humanas.

En la presente memoria, un "medio proneural" designa cualquier medio de cultivo que favorezca el mantenimiento y/o crecimiento de células neuronales. Algunos ejemplos no limitativos de dicho medio son cualquier medio compuesto por un medio nutritivo, como Dulbeco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) o Neurobasal® Medium (Gibco®), estando dicho medio nutritivo suplementado con un suplemento de medio que comprende al menos parte de los siguientes elementos: fuentes de carbono, vitaminas, sales inorgánicas, aminoácidos y una digestión de proteínas. Algunos ejemplos no limitativos de suplementos apropiados para la obtención de un medio proneural son los suplementos N2, B27, G5 y BIT9500, así como cualquier suplemento derivado de éstos. Los componentes presentes en estos suplementos se resumen en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1: Composición de cuatro suplementos de medio para medios proneurales. a Véase Brewer et al,, 1993; b proporcionado por el fabricante (Gibco BRL, Alemania); c proporcionado por el fabricante (StemCell Technologies Inc., Canadá); d proporcionado por el fabricante (Life Technologies, EE. UU.).

En lo que precede, "estructuras de tipo neuroepitelial", también denominadas "estructuras similares a la retina neural" más abajo en la parte experimental, designan estructuras brillantes de fase que comienzan a aparecer después de unos días de cultivo en un medio proneural. Estas estructuras están formadas esencialmente por células que no expresan significativamente genes relacionados con la pluripotencia, como OCT4, y que expresan factores de transcripción asociados con la especificación del campo ocular, como LHX2, RAX, PAX6y SlX3. Tal como se describe en la parte experimental, cuando se realiza el método arriba indicado, primero aparecen células pigmentadas y las estructuras de tipo neuroepitelial aparecen con mayor frecuencia en las proximidades de un parche de células pigmentadas.

La presente invención se refiere a un método para obtener in vitro progenitores retinianos humanos, que comprende las etapas consistentes en:

(i) disponer un cultivo adherente de células madre pluripotentes humanas en forma de una monocapa de tipo colonia que alcanza al menos un 80% de confluencia,

- en un sistema de cultivo adherente consistente en células nutrientes que consisten en una capa de alimentación de MEF de ratón inactivado con mitomicina C;

- en un medio proneural que favorece el mantenimiento y/o crecimiento de células neuronales, estando compuesto dicho medio proneural por un medio nutritivo suplementado con un suplemento de medio de N2; y

(ii) mantener este cultivo en dicho medio proneural hasta la aparición de células pigmentadas y/o de estructuras de tipo neuroepitelial.

Evidentemente, al realizar los métodos según la presente descripción, el experto en la materia puede detectar la expresión de varios marcadores (para comprobar su expresión o el hecho de que ya no se expresan y/o medir cuantitativamente su nivel de expresión). Para este fin se puede utilizar cualquier técnica conocida en este campo, tal como, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa e inmunoensayos. Algunos ejemplos de marcadores de pluripotencia son OCT4, SOX2 y N^a NOG; algunos ejemplos de marcadores para el campo ocular son RAX, PAX6, OTX2, L^h X2 y SIX3, siendo preferibles los dos primeros.

Ventajosamente, el método arriba indicado se puede realizar sin utilizar medios complejos y costosos. De hecho, se pueden usar medios muy simples para obtener progenitores retinianos humanos a partir de un cultivo adherente de células madre pluripotentes. En particular, no se necesitan factores de diferenciación. Según una realización preferida del método de la invención arriba indicado, el medio proneural usado en la etapa de cultivo carece de al menos uno de los siguientes factores de diferenciación: noggin, Dkk-1 e IGF-1. En una realización particular de la invención, el medio proneural puede carecer de estos tres factores.

Las células madre pluripotentes humanas utilizadas en la etapa (i) se pueden cultivar en cualquier tipo de sistema de cultivo adherente. Algunos ejemplos no limitativos de superficies que se pueden usar para este cultivo son: vidrio, plástico (posiblemente tratado), colágeno, laminina, fibronectina, Matrigel™, poli-L-lisina, células nutrientes o cualquier superficie sintética disponible comercialmente, como Corning Synthemax™. En una realización preferida, el cultivo adherente utilizado en la etapa (i) del método arriba indicado está en forma de una monocapa de tipo colonia que alcanza al menos un 80% de confluencia. El experto en la materia está familiarizado con la noción de confluencia para células adherentes y podrá evaluar esta confluencia, que se puede apreciar localmente, es decir, solo en un área del receptor, especialmente si la confluencia no es homogénea en toda la superficie de cultivo. En el caso de las monocapas de tipo colonia, un "80% de confluencia" se puede definir, si es necesario, como la situación en la que algunas colonias entran puntualmente en contacto con otras colonias, mientras que entre estas colonias queda algo de espacio libre (que representa entre un 10 y un 30% de la superficie).

Tal como se describe en la parte experimental, y aunque esto no es obligatorio, el método según la presente descripción se puede realizar de manera que la etapa (i) esté precedida por una etapa de cultivo adherente de dichas células madre pluripotentes en un medio de cultivo para el mantenimiento de células madre pluripotentes, modificado de modo que carezca de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF/FGF2), durante 1 a 4 días, preferiblemente durante 2 días. Algunos ejemplos no limitativos de medios apropiados para esta etapa adicional son el Primate ES Cell Medium y el medio ReproStem de ReproCELL.

En una realización particular del método arriba indicado, la etapa (ii) se realiza durante al menos 7 días. Preferiblemente, en el método arriba indicado, la etapa (ii) se realiza durante entre 10 y 14 días, de modo que aparezca una cantidad suficiente de estructuras de tipo neuroepitelial. Evidentemente, el método de cultivo puede evolucionar de modo que la etapa (ii) pueda acortarse. Como ya se mencionó más arriba, las estructuras de tipo neuroepitelial están formadas esencialmente por células que no expresan de manera significativa genes relacionados con la pluripotencia, tales como OCT4, y que expresan factores de transcripción asociados con la especificación del campo ocular. Por lo tanto, dependiendo del sistema de cultivo, el experto en la materia puede elegir definir el final de la etapa (ii) como el momento en que al menos algunas células dejan de expresar OCT4 y/o comienzan a expresar RAX y PAX6. Como ya se ha mencionado, esta caracterización se puede realizar mediante cualquier técnica conocida, como qRT-PCR o inmunotinción.

De acuerdo con otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para obtener células RPE, comprendiendo dicho método las etapas consistentes en:

(i) disponer un cultivo adherente de células madre pluripotentes humanas en un medio proneural;

(ii) mantener este cultivo en dicho medio proneural hasta la aparición de células pigmentadas;

(^ííírpe) recoger al menos una célula pigmentada del cultivo obtenido en la etapa (ii); y

( ^ívrpe) cultivar la(s) célula(s) pigmentadas obtenidas en la etapa (^ííírpe).

En una realización, la invención se refiere a un método para obtener células epiteliales pigmentadas retinianas (células RPE), que comprende el método para obtener in vitro progenitores retinianos humanos, tal como se define más arriba, y que adicionalmente comprende las etapas consistentes en:

( ^ííírpe) recoger al menos una célula pigmentada del cultivo obtenido en la etapa (ii); y

(^ívrpe) cultivar la(s) célula(s) pigmentadas obtenidas en la etapa (^ííírpe).

Al realizar este método, el experto en la materia puede comprobar que las células recogidas en la etapa (^ííírpe) expresan el factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF, por sus siglas en inglés) y/o ZO-1. Tal como ya se ha mencionado, para este fin se puede utilizar cualquier técnica conocida en este campo (tal como qRT-PCR e inmunotinción).

Según una realización preferida del método arriba indicado para obtener de células RPE, el cultivo en la etapa ( ^ívrpe) se lleva a cabo en un sistema de cultivo adherente. Se puede utilizar cualquier sistema de cultivo adherente, como ya se ha mencionado más arriba.

Cuando se realiza el método de la descripción para obtener células RPE, las células se amplifican en la etapa (^ívrpe) durante al menos 5 días. Ventajosamente, el cultivo de la etapa (^ívrpe) se puede mantener y amplificar durante varias semanas para obtener grandes cantidades de células RPE: por ejemplo, cuando se recogen aproximadamente 10 parches de células pigmentadas en la etapa (^ííírpe) y se disponen juntos en un nueva placa de 3 cm2, se obtiene un cultivo adherente confluente sustancialmente puro (99%) de células RPE después de 3 a 4 semanas, o después de 10 a 14 días si se añade FGF2 al medio de cultivo (10 ng/ml cada 2 a 3 días).

Otro aspecto de la presente descripción consiste en un método para obtener células retinianas neurales, comprendiendo dicho método las etapas consistentes en:

( ^í) disponer un cultivo adherente de células madre pluripotentes humanas en un medio proneural;

(ii) mantener este cultivo en dicho medio proneural hasta la aparición de estructuras de tipo neuroepitelial;

( ^ííínr) recoger células de al menos una estructura de tipo neuroepitelial del cultivo obtenido en la etapa (ii); y

(^ívnr) cultivar las células pigmentadas obtenidas en la etapa ( ^ííínr).

En una realización, la invención se refiere a un método para células retinianas neurales que comprende el método del método para obtener in vitro progenitores retinianos humanos tal como se define más arriba y que además comprende las etapas consistentes en:

( ^ííínr) recoger células de al menos una estructura de tipo neuroepitelial del cultivo obtenido en la etapa (ii); y

(^ívnr) cultivar las células pigmentadas obtenidas en la etapa ( ^ííínr).

En la presente memoria, las "células retinianas neurales" incluyen RGC, células bipolares, células horizontales, células amacrinas, células fotorreceptoras (bastoncillos y conos), células gliales de Müller así como precursores de cualquiera de estos tipos de células.

Es importante destacar que las diversas células retinianas neurales no aparecen al mismo tiempo durante la etapa (^ívnr), a lo largo de la cual se diferencian las células cultivadas. Por lo tanto, dependiendo de la duración de la etapa (^ívnr), se formarán diferentes tipos de células. El orden de aparición es el siguiente: primero aparecen células ganglionares, seguidas de células amacrinas y células horizontales, y más tarde aparecen fotorreceptores. Por consiguiente, el experto en la materia realizará la etapa de cultivo ( ^ívnr) durante 21 a 42 días dependiendo del tipo de célula que se necesite.

Tal como se ejemplifica más bajo en la parte experimental, el método de acuerdo con este aspecto de la invención se puede realizar recolectando, en la etapa ( ^ííínr), al menos una estructura de tipo neuroepitelial. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, separando mecánicamente esta estructura de la capa de células adherentes. Esta estructura se puede disponer después, sola o junto con otras estructuras de tipo neuroepitelial, en otro recipiente de cultivo, como un pocillo de una placa de múltiples pocillos, una placa de Petri, un matraz, etc.

Al realizar este método, el experto en la materia puede comprobar ventajosamente que las células recogidas en la etapa (^ííínr) coexpresan PAX6 y RAX, características de las células del campo ocular. Alternativa o adicionalmente es posible medir la expresión del marcador de proliferación celular Ki67 por las células recolectadas en la etapa (^ííínr).

De acuerdo con un aspecto particularmente ventajoso, la presente invención se refiere a un método para obtener precursores de fotorreceptores, que comprende las etapas (i) a ( ^ívnr) arriba indicadas, llevándose a cabo la etapa ( ^ívnr) durante al menos 21 días, preferiblemente al menos 28 días. Evidentemente, dependiendo del desarrollo futuro de las condiciones de cultivo, esta etapa se puede acortar aún más.

En cualquier momento durante la etapa (^ívnr), el experto en la materia puede comprobar la diferenciación en el linaje de fotorreceptores midiendo la expresión de NRL y/o CRXen las células cultivadas, por ejemplo mediante qRT-PCR. Alternativa o adicionalmente, los precursores de fotorreceptores se pueden identificar con una inmunotinción RECOVERINA, tal como se describe más abajo en la parte experimental. Los inventores también han demostrado que la CD73, que se puede usar como marcador de superficie celular para la clasificación celular de precursores de fotorreceptores, se coexpresa con RECOVERINA. Esto se puede usar ventajosamente añadiendo una etapa adicional de clasificación celular de precursores de fotorreceptores después de la etapa (^ívnr), por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-CD73. La población de células resultante, enriquecida en precursores de fotorreceptores, se puede utilizar, por ejemplo, para trasplante celular o estrategias de rastreo.

Opcionalmente se puede añadir un inhibidor de Notch como DAPT al medio de cultivo durante al menos 1 día, preferiblemente durante 5 días o más en la etapa (^ívnr). DAPT es un inhibidor de la Y-secretasa e indirectamente un inhibidor de Notch, y los inventores han demostrado que su adición durante unos días en la etapa (^ívnr) favorece la generación de precursores de fotorreceptores (véase el Ejemplo 2 más abajo y la Figura 5).

En una realización, en la etapa (ivNR) del método de la invención para obtener precursores fotorreceptores se añade un inhibidor de Notch al medio de cultivo durante al menos 1 a 5 días.

En otra realización, el método de la invención para obtener precursores de fotorreceptores comprende además una etapa de clasificación celular de precursores de fotorreceptores mediante unión del marcador de superficie celular CD73. Según una realización preferida del método de la invención para obtener células retinianas neurales arriba descrito, el cultivo en la etapa (^ívnr) se lleva a cabo en un sistema de cultivo no adherente. Por ejemplo, las estructuras de tipo neuroepitelial recogidas en la etapa (^ííínr) se cultivan como estructuras flotantes. Según una realización específica, cada estructura de tipo neuroepitelial recogida en la etapa ( ^ííínr) se cultiva en un recipiente/pocillo individual como una estructura flotante.

Algunos ejemplos no limitativos de sistemas no adherentes incluyen matraces centrifugadores de rotación magnética, o matraces o placas agitados en los que las células se mantienen suspendidas activamente en el medio, así como recipientes de cultivo estacionarios o matraces en T y frascos en los que las células, aunque no se mantienen agitadas, no se pueden adherir firmemente al sustrato.

En una realización del método de la invención para obtener células retinianas neurales arriba descrito, el cultivo en la etapa (^ívnr) se lleva a cabo en condiciones de agitación.

Ventajosamente, tal como se describe en la parte experimental, las células o estructuras de tipo neuroepitelial se pueden mantener suspendidas activamente en el medio realizando la etapa (^ívnr) en condiciones de agitación. Para ello se puede utilizar cualquier agitador, tal como, por ejemplo, un rotador que agita los cultivos en tres dimensiones.

De acuerdo con otra realización preferida del método de la invención para obtener células retinianas neurales, el medio de cultivo utilizado en la etapa ( ^ívnr) se suplementa con FGF2 durante al menos 5 días. Este medio de cultivo es preferiblemente un medio proneuronal tal como se define más arriba.

Una ventaja de la presente descripción consiste en que, a partir de un primer cultivo adherente, se pueden realizar dos cultivos diferentes en paralelo con el fin de obtener tanto células RPE (primer cultivo, preferiblemente adherente) como precursores de la retina neural (segundo cultivo, preferiblemente no adherente). Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para obtener tanto células RPE como precursores de la retina neural, que comprende las etapas (i) y (^íí) tal como se definen más arriba, seguidas de las etapas (^ííírpe) y (^ívrpe) arriba definidas, realizadas en paralelo con las etapas (^ííínr) y (^ívnr) también descritas más arriba.

Lo más importante es que la presente invención proporciona métodos fiables para obtener con facilidad y rapidez grandes cantidades de células retinianas de cualquiera de los tipos principales (RPE, RGC, células amacrinas, células horizontales, células gliales de Müller y fotorreceptores), con un alto grado de pureza. Por ejemplo, en menos de un mes se puede obtener un cultivo que comprende más de un 75% de precursores de fotorreceptores.

Se prevé que estos métodos, y los cultivos celulares sustancialmente puros obtenidos a través de los mismos, sean útiles en las siguientes áreas:

• Trasplante/terapia celular: algunos ejemplos no limitativos incluyen el uso de células RPE y/o células progenitoras retinianas o células diferenciadas de las mismas en terapia de reemplazo de células perdidas para ayudar a restaurar la visión previamente perdida. Los métodos y cultivos también se podrían utilizar con el fin de desarrollar tejidos para utilizarlos en terapia de reemplazo de tejido completo.

• Rastreo de fármacos para identificar agentes capaces de proteger o mejorar la función de todas las células, incluyendo RGC, bastoncillos, conos y células RPE. En la presente memoria, por "agente" se entiende cualquier tipo de molécula o composición, pero también agentes no químicos tales como cualquier radiación electromagnética o corpuscular (UV, luz visible, radiación ionizante, etc.).

• Producir modelos de enfermedades de la retina humana a partir de células pluripotentes, especialmente a partir de células hiPS, que también se pueden utilizar para estudiar la fisiopatología y para el rastreo de fármacos o la terapia personalizada utilizando células madre o derivados de las mismas.

• Como un modelo único de desarrollo neural humano, que sería un recurso útil para estudiar una variedad de procesos, incluyendo, sin limitación, el desarrollo retiniano, la formación de tejidos y la formación de sinapsis.

La descripción se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Derivación y caracterización de células hiPS libres de integración.

(A) Diagrama esquemático que muestra las etapas que intervienen en la reprogramación de AHDF. (B) Aparición de colonias heterogéneas de hiPS en fibroblastos. (C) Tinción con fosfatasa alcalina positiva de células hiPS bien establecidas. (D, E) Expresión de marcadores de pluripotencia mediante inmunohistoquímica en células hiPS (subclón 2). (F) Análisis por qRT-PCR de marcadores de pluripotencia y autorrenovación en células hiPS, AHDF y células hES (n = 3 experimentos). Los datos están normalizados en células hES. (G) Análisis por qRT-PCR de varios marcadores de la capa germinal en cuerpos embrioides derivados de células hiPS después de dos semanas (n = 3 experimentos). Los datos están normalizados en células hiPS indiferenciadas (H-J). Inmunotinción de cuerpos embrioides derivados de células hiPS (subclón 2) después de dos semanas para marcadores de endodermo (SOX17), mesodermo (SMA) y ectodermo (PAX6, TUJI-1). (K) Análisis del cariotipo del subclón 2 de hiPS. (L) Rastreo por PCR utilizando cebadores dirigidos a oriP para la detección de vectores oriP/EBNA1 en la fracción de ADN genómico (ADNg) y en la fracción episomal (extracto Epi) del subclón 2 de hiPS después de 5 (AHDFc2p5) o 15 pases (AHDFc2p15) y de AHDF nativo como control. Barras de escala = 100 pm.

Figura 2: Generación eficiente de progenitores retinianos a partir de células hiPS libres de integración.

(A) Diagrama esquemático que muestra las diferentes etapas del protocolo de diferenciación. (B, C) Morfología de las células hiPS que se diferencian en medio proneural después de 7 y 14 días. (D) Análisis por qRT-PCR de factores de transcripción del campo ocular (SIX3, LHX2, RAX, PAX6, MITF y VSX2), n Rl , CRX y marcador de pluripotencia POU5F1 en estructuras de tipo neuroepitelial en D14 (n = 3 experimentos). Los datos están normalizados en las células hiPS en D0. (E-O) Tinción por inmunofluorescencia de estructuras de tipo neuroepitelial D14 para PAX6 y RAX (E-G), Ki67 y LHX2 (H-J), o MITF y VSX2 (K-O). Barras de escala = 100 pm (B, C, E, H y K); 50 pm (F, G, I, J, L-O). (P) Análisis por qRT-PCR de NOGGIN y d Kk i en hiPSC-2 en D0, D7 y D14. Los datos están normalizados en colonias individuales de hiPSC-2.

Figura 3: Diferenciación de múltiples tipos de células retinianas de estructuras flotantes similares a la Retina Neural (NR, por sus siglas en inglés).

(A) Ilustración esquemática que describe el protocolo de diferenciación para generar células retinianas = agitación 3D). (B-D) Morfología de las estructuras flotantes similares a la NR en diferentes momentos después del aislamiento. (E, F) Análisis por qRT-PCR de factores de transcripción específicos del campo ocular y del fotorreceptor en estructuras similares a la NR en diferentes momentos (n = 3 experimentos). Los datos están normalizados en células de estructuras similares a la NR en D14. (G-I) Inmunotinción de estructuras similares a la NR D21 para MITF (G), VSX2 (G, H), PAX6 (H), OTX2 (I) y BRN3A (I). (J-L) Inmunotinción de estructuras similares a la NR para CRX en D14 (J), D21 (K) y D28 (L). (M-N) Inmunotinción de estructuras similares a la NR D21 para CALRETININA (M) y LIM1 (N). (O) Inmunotinción de estructuras similares a la NR D28 para RECOVERINA. Barras de escala = 100 pm (B-D, G-L), 50 pm (M-O).

Figura 4: Generación y amplificación de células RPE a partir de células hiPS libres de integración.

(A) Ilustración esquemática del experimento. (B, C) Microscopía de contraste de fase de monocapa de células RPE derivadas de células hips después de 30 días. (D) Inmunotinción de monocapa de células RPE derivadas de células hips después de 30 días para ZO-1 y MITF. Barras de escala = 100 pm. (E) Análisis por qRT-PCR de marcadores RPE maduros en células hiRPE en el pase 0 (P0), P1 y P2. Los datos están normalizados para controlar el ARN aislado de células RPE adultas humanas. (F) Evaluación de la actividad fagocítica de células RPE; relación de fluorescencia de FITC/DAPI en cultivos de células hiRPE en P1 y en la línea celular RPE-J de control después de 3 horas de incubación con POS marcado con FITC. La unión y la absorción de POS se ensayaron tal como se describe en los Materiales y Métodos (Ejemplo 1).

Figura 5: Aceleración de la generación de precursores de fotorreceptores a partir de estructuras flotantes similares a la NR por inhibición de Notch.

(A) Ilustración esquemática del experimento con la adición de DAPT de D21 a D28 o de D28 a D35 ( ° = agitación 3D). (B) Inmunotinción de estructuras similares a la NR en D28 o D35 para CRX y RECOVERINA en presencia o en ausencia (control) de DAPT. Barras de escala = 100 gm. (C y D) Cuantificación de precursores de fotorreceptores (CRX, RECOVERINA) y progenitores mitóticos (Ki67) en D28 y D35 con o sin (control) DAPT. Los valores representan el porcentaje medio de células positivas ± SEM (n = 4, * P < 0,05). (E) Análisis por qRT-PCR de marcadores de fotorreceptores en maduración y GLAST (marcador para células gliales de Müller) en estructuras similares a la NR D35 tratadas con DAPT. Los datos están normalizados a estructuras similares a la NR en D35 sin tratamiento con DAPT. Barras de escala = 100 gm.

Figura 6: Diferenciación temprana de precursores de fotorreceptores en estructuras similares a la NR.

(A) Análisis por qRT-PCR de factores de transcripción NRL y CRX en la diferenciación de estructuras similares a la NR. Los datos se expresan como cambio de ciclo en el nivel de expresión de PCR en comparación con hiPSC-2 en D0. (B) Tinción por inmunofluorescencia de estructuras similares a la NR crioseccionadas en D14 para CRX. (C-H) Tinción por inmunofluorescencia de estructuras similares a la NR crioseccionadas en D21 y D35 para CRX y OTX2. Imágenes confocales que demuestran la colocalización de OTX2 y CRX en secciones de estructuras similares a la NR en D21 (C-E) y D35 (F-H). (M-N) Análisis inmunohistoquímico de estructuras similares a la NR crioseccionadas en D28 para Ki67 (M) PAX6 (N), OTX2 (N), CRX (M). Barras de escala = 100 gm (B); 50 gm (C-H y M-N).

Figura 7: Análisis de espesor de estructuras similares a la NR derivadas de hiPSC-2.

(A-C) Evolución del espesor (línea negra) de una estructura representativa similar a la NR de D17 a D24. (D) Representación gráfica de la evolución del espesor de trece estructuras similares a la NR independientes. Cada línea corresponde a una estructura similar a la NR. (E) Histograma que representa el espesor (media ± SEM; ** P < 0,01; **** P < 0,0001) de las trece estructuras similares a la NR independientes que indican un aumento de un 80,6 ± 10,2% entre D17 y D24. Barras de escala = 100 gm.

Figura 8: Reproducibilidad del protocolo de diferenciación retiniana con diferentes clones de hiPSC.

(A-C) Morfología de las estructuras similares a la NR flotantes derivadas de hiPSC-1 en D17, D21 y D24. (D-F) Morfología de las estructuras similares a la NR flotantes derivadas de hiPSC-2 en D17, D21 y D24. (G y H) Análisis por qRT-PCR de factores de transcripción del campo ocular en D17 y D35 en estructuras similares a la NR derivadas de hiPSC-1 o hiPSC-2. (I y J) Análisis por qRT-PCR de factores de transcripción específicos de fotorreceptores en D17 y D35 en estructuras similares a la NR derivadas de hiPSC-1 o hiPSC-2. Los datos son relativos a D14 para cada gen. Barras de escala = 100 gm.

Figura 9: Diferenciación de todos los tipos de células retinianas a partir de estructuras similares a la NR flotantes.

(A-E) Análisis por qRT-PCR de tipos de células retinianas neurales seleccionados en estructuras similares a la NR en diferentes momentos. Los datos están normalizados a estructuras similares a la NR en D14 y en D35 tanto para R/G como para OPSINA AZUL. (F-Q) Análisis inmunohistoquímico de una estructura similar a la NR crioseccionada en diferentes etapas de diferenciación utilizando marcadores para RGC (BRN3A, PAX6, CALRETININA), células amacrinas (pAX6, AP2, CALRETININA), células horizontales (LIM, PAX6, CALRETININA), fotorreceptores (OTX2, RECOVERINA, CRX, CD73, ARRESTINA DE CONOS, RODOPSINA, OPSINA AZUL y R/G), células bipolares (PKCa), células gliales de Müller (GS, SOX9) y para progenitores mitóticos (Ki67). Barras de escala = 50 gm (F-N), 25 gm (O-Q).

Figura 10: Presencia de fotorreceptores maduros en estructuras similares a la NR después de cultivos a largo plazo.

Tinción de inmunofluorescencia de estructuras similares a la NR crioseccionadas en D112 para RECOVERINA (A-D), RODOPSINA (A-B) y Acetil TUBULINA (C-D). El análisis inmunohistoquímico confirmó la presencia predominante de fotorreceptores en rosetas internas, con la aparición de estructuras positivas en tubulina acetilada en la zona luminal de las rosetas (flecha en D). Barras de escala = 25 gm (A-C) y 10 gm (D).

Ejemplos

Ejemplo 1: Diferenciación fiable y eficiente de células madre pluripotentes inducidas libres de integración humanas en neuronas retinianas y células epiteliales pigmentadas retinianas

1.1 Procedimientos experimentales

Cultivos de células iPS y fibroblasto humanos

Unos Fibroblastos Dérmicos Adultos Humanos (AHDF, por sus siglas en inglés) de un niño de 8 años (obsequio del Dr. Rustin, INSERM U676, París, Francia) se cultivaron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) alto en glucosa, Glutamax II (Life Technologies) suplementado con un 10% FBS (Life Technologies), Piruvato de Sodio 1 mM (Life Technologies), 1 x MEM aminoácidos no esenciales (Life Technologies) a 37 °C en una incubadora estándar con un 5% de CO2/95% de aire. Este medio se denominó "medio de fibroblastos". Unas células iPS humanas establecidas se mantuvieron sobre una capa de alimentación de fibroblasto embrionario de ratón (MEF, por sus siglas en inglés) inactivado con mitomicina-C (Zenith) en un medio ReproStem (ReproCell) con 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano 2 (FGF2, por sus siglas en inglés) (Preprotech). Las células se incubaron rutinariamente a 37 °C en una incubadora estándar con un 5% de CÜ2/95% de aire. Este medio se denominó "medio iPS". Las células se pasaron manualmente bajo el microscopio estereoscópico (Vision Engineering Ltd) una vez a la semana.

Reprogramación de fibroblastos humanos

La reprogramación se realizó con una estrategia episomal tal como se ha descrito (Yu e ta l, 2009). En pocas palabras, los vectores episomales basados en oriP/EBNAl pEP4EO2SEN2K (plásmido 20925, Addgene), pEP4EO2SET2K (plásmido 20927, Addgene) y pCEP4-M2L (plásmido 20926, Addgene) se cotransfectaron en AHDF mediante nucleofección (Nucleofector 4D, V4XP, con programa DT-130, Lonza). Los fibroblastos transfectados (106 células por nucleofección) se dispusieron directamente en placas sembradas con MEF de 3 x 10 cm (5.106 células/cm2) en "medio de fibroblastos". El día 4 después de la transfección, el "medio de fibroblastos" se sustituyó con "medio iPS" suplementado con moléculas descritas como un aumento de la eficiencia de reprogramación (Zhang et al. 2013): 500 pM de ácido valproico (Sigma, Francia), 0,5 pM de PD- 0325901 (Selleck, Euromedex, Francia) y 2 pM de SB431542 (Selleck). Después de 14 días, las células se cultivaron en "medio iPS" solo. Entre 30 y 40 días, se cortó el grupo de células compactas y se transfirió a una placa de cultivo celular Organ Style de 60 mm (Dutscher, Francia). Las colonias de hiPS emergentes se recogieron bajo un microscopio estereoscópico de acuerdo con su morfología de colonia similar a células ES humanas. Se expandieron sobre una capa de alimentación de MEF inactivada con mitomicina-C tal como se ha descrito más arriba para la caracterización posterior. La pérdida completa de vectores episomales y la no integración de genes de reprogramación se lograron mediante PCR tal como se describe más abajo.

Análisis por PCR de vectores episomales

La purificación de ADN episomal de células hiPS se llevó a cabo con el kit Nucleospin Plasmid Quick Pure (Macherey-Nagel, Francia) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN genómico se aisló mediante el método de extracción con fenol/cloroformo. Debido a la naturaleza de los métodos de purificación, el ADN genómico purificado probablemente estaba contaminado con una cantidad residual de ADN episomal de las mismas células y, del mismo modo, el ADN episomal purificado estaba contaminado con una pequeña cantidad de ADN genómico, como informaron claramente Yu et al. (2009). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con polimerasa Go Taq flexi (Promega, Francia). Para cada reacción de PCR se añadieron como molde 10 pl de ADN genómico o episomal extraído de 104 células equivalentes a un contenido de 100 ng. La mezcla de PCR contenía 1 x tampón Go Taq Flexi, MgCl22 mM, 0,2 mMdNTPs, 0,5 pM de cada cebador y 1,25 U de polimerasa con el siguiente programa: desnaturalización inicial durante 1 minuto a 94 °C; 35 ciclos de 94 °C durante 45 segundos, 60 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1 minuto y a continuación 72 °C durante 5 minutos. Se utilizó ADN episomal y genómico de fibroblastos nativos como controles negativos y vectores episomales basados en oriP/EBNA1 (véase más arriba, Yu et al. 2009) como controles positivos.

Análisis de cariotipo

Unas colonias de células hiPS en crecimiento activo (80% de confluencia) se trataron con colchicina (20 mg/ml, Eurobio, Francia) durante 90 minutos a 37 °C. Las células se disociaron con tripsina-EDTA al 0,05% y después se incubaron en KCl 75 mM (Sigma Aldrich) durante 10-14 minutos a 37 °C, seguido de fijación con alcohol metílico/ácido acético glacial 3:1. Para analizar el cariotipo de mFISH, las células fijadas se hibridaron durante la noche a 37 °C con una sonda "pintura de cóctel mFISH" desnaturalizada (MetaSystems, Altussheim, Alemania). Los portaobjetos se lavaron en baños sucesivos de 1 x SSC y 0,4 x SSC, y los núcleos se tiñeron con 250 ng/ml de diamidino-fenil-indol (DAPI). Las sondas biotinadas se revelaron usando el kit de detección Cy5 MetaSystems B-tect (MetaSystems). Se capturaron de diez a veinte metafases utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Z1 equipado con una lámpara UV HBO de 100 W acoplada a una cámara AxioCam (Carl Zeiss, Francia). En todas las metafases analizadas se determinó el cariotipo utilizando el software MetaSystems Isis (MetaSystems).

Tinción con fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés)

Se fijaron células iPS humanas en cultivo en MEF con etanol al 95% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron con PBS y se incubaron durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente con una mezcla de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP, por sus siglas en inglés) y azul de nitrotetrazolio (NBT, por sus siglas en inglés) (Roche, Francia) en Tampón Tris pH 9,5 con MgCl25 mM y 0,05% de Tween-20. Después de la tinción, las células se lavaron con PBS antes de la visualización con un microscopio de campo brillante.

Formación y análisis de cuerpos embrioides

Unas colonias de células iPS humanas se separaron mecánicamente de la capa de MEF bajo un microscopio estereoscópico (Vision Engineering Ltd.) y después se cultivaron en suspensión en placas de cultivo de adhesión ultrabaja (Nunc, Dutscher, Francia) en medio ReproStem. El medio se cambió cada dos días y los cuerpos embrioides se cultivaron durante 2 semanas antes de la extracción de ARN o el análisis inmunohistoquímico.

Diferenciación retiniana

Las células iPS humanas se expandieron hasta la confluencia sobre la capa de alimentación de MEF de ratón inactivada con mitomicina-C en medio iPS. En este punto, definiéndolo como día 0, se cultivaron células hiPS confluentes en medio iPS sin FGF2. Después de 2 días, el medio se cambió a un "medio proneural" compuesto por Medio de Eagle Modificado de Dulbecco: Mezcla de Nutrientes F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamina), un 1% de aminoácidos no esenciales MEM y un 1% de suplemento de N2 (Life Technologies). El medio se cambió cada 2-3 días. El día 14 se aislaron estructuras de tipo neuroepitelial identificadas rodeadas por células pigmentadas y se cultivaron individualmente como estructuras flotantes (3D) con "medio proneural" suplementado con 10 ng/ml de FGF2 en placas de 24 pocillos montadas en un agitador 3D Nutator (VWR, Francia) durante los 2 primeros días y el medio se cambió cada 2-3 días. Al ser cultivadas en una plataforma agitadora, quedaron estructuras aisladas suspendidas en el medio y por lo general no se adhirieron al fondo de la placa de cultivo. El día 19, 20 o 21 se eliminó el FGF2 y durante las siguientes semanas se cambió la mitad del "medio proneural" cada 2-3 días.

Para cultivos de células RPE, se cortaron parches pigmentados identificados entre el día 7 y 14 sin las estructuras de gemación no pigmentadas y se transfirieron a placas recubiertas de gelatina al 0,1% (indicadas como P0). Las células RPE se expandieron en medio "proneural" (véase más arriba) y el medio se cambió cada 2-3 días hasta la confluencia, y las células se disociaron en tripsina-EDTA al 0,05% y se sembraron en nuevas placas recubiertas de gelatina (consideradas como pase P1).

Extracción de ARN y ensayo Taqman

Se extrajeron ARN totales utilizando el kit Nucleospin RNA II (Macherey-nagel, Francia) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y los rendimientos y la calidad del ARN se verificaron con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific, Francia). Se sintetizaron ADNc a partir de 500 ng de ARN total usando el kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los ADNc sintetizados se diluyeron después a 1/20 en agua libre de ADNasa antes de realizar la PCR cuantitativa. El análisis por qPCR se realizó en sistemas de PCR en tiempo real de Applied Biosystems (7500 Fast System) con placas a medida TaqMan® Array 96-Well Fast y TaqMan® Gene expression Master Mix (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los cebadores y sondas de MGB marcados con FAM para amplificación se adquirieron en Applied Biosystems (Life Technologies, Francia). Los resultados se normalizaron frente a 18S y la cuantificación de la expresión génica se basó en el método Delta Ct en tres experimentos independientes. El ARN de control de las células RPE adultas humanas corresponde a las células RPE aisladas de las copas oculares disecadas a nivel de la fóvea.

Criosección, inmunotinción y adquisición de imágenes

Para la criosección, unas estructuras similares a la retina se fijaron durante 15 minutos en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C y se lavaron en PBS. Las estructuras se incubaron a 4 °C en solución de PBS/sacarosa al 30% (Sigma) durante un mínimo de 2 horas. Las estructuras se incrustaron en PBS, gelatina al 7,5% (Sigma), solución de sacarosa al 10%, y se congelaron en isopentano a -50 °C y se recogieron criosecciones de 10 pm de espesor.

La tinción por inmunofluorescencia de las secciones se realizó tal como se ha descrito anteriormente (Roger et al.

2006). En pocas palabras, los portaobjetos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con solución de bloqueo (PBS, gelatina al 0,2% y Triton X-100 al 0,25%) y después con el anticuerpo primario (véase la Tabla 2) durante la noche a 4 °C. Los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS con Tween al 0,1% (PBT) y después se incubó durante 1 hora con el anticuerpo secundario apropiado conjugado con AlexaFluor 488 o 594 (Life Technologies) diluido a 1:600 en tampón de bloqueo con 1:10.000 DAPI. Las señales de tinción fluorescente se capturaron con un microscopio DM6000 (Leica) equipado con una cámara CCD CoolSNAP-HQ (Roper Scientific) o utilizando un microscopio confocal Olympus FV1000 equipado con láseres de 405, 488 y 543 nm. Las imágenes confocales se adquirieron utilizando un tamaño de paso de 1,55 o 0,46 pm y cada adquisición consistía en la proyección de 2-4 pilas o 4-8 secciones ópticas.

Tabla 2. Lista de anticuerpos utilizados para el análisis inmunohistoquímico

Ensayo de formación de teratomas

Se llevó a cabo un ensayo de formación de teratomas tal como se ha descrito anteriormente (Griscelli et al., 2012) con ligeras modificaciones. En pocas palabras, se inyectaron de 1 x 106 a 2 x 106 células en el músculo de la pata trasera de ratones NOD Scid gamma (NSG) de 6 semanas de edad (Charles River). Después de 9 a 10 semanas, los teratomas se disecaron y se fijaron en paraformaldehído al 4%. A continuación, las muestras se incluyeron en parafina y las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina.

Ensayo de fagocitosis

Se purificaron unos segmentos externos de fotorreceptor (POS, por sus siglas en inglés) de ojos porcinos y se marcaron de forma covalente con colorante fluorescente mediante incubación con 0,1 mg/ml de FITc (isómero 1) de acuerdo con los procedimientos establecidos (2). Unas RPE-J (línea celular RPE de rata inmortalizada) en el pase 3 y células hiRPE en el pase 1 se dispusieron en pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. En cada pocillo se dispuso una capa de 100 pl de DMEM que contenía 1 x 106 partículas de POS y se incubó a 32 °C (RPE-J) o 37 °C (hiRPE) durante 3 horas antes de lavar los filtros de los pocillos tres veces con PBS que contenía MgCl2 1 mM y CaCl20,2 mM (PBS-CM). Para la detección exclusiva de partículas internalizadas, la fluorescencia de FITC-POS unidos a la superficie se inactivó selectivamente mediante incubación en azul tripán al 0,2% en PBS-CM durante 10 minutos antes de la fijación celular. Las células se fijaron mediante incubación en metanol helado durante 5 minutos seguida de rehidratación e incubación con DAPI durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las señales fluorescentes se cuantificaron con el lector de placas Infinite M1000 Pro (Tecan). La línea celular RPE-J se utilizó como control positivo para la actividad fagocítica y las células hiRPE en ausencia de POS se utilizaron como control negativo.

Análisis estadístico

El análisis de varianza se realizó con la prueba no paramétrica de Friedman seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunn o la prueba de Mann-Whitney para todos los análisis por pares (Prism 6, software GraphPad). Los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

1.2 Resultados

Generación y caracterización de células iPS libres de integración humanas

Se cotransfectaron fibroblastos dérmicos humanos adultos (AHDF) con tres plásmidos que codifican OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, KLF4y cMYC, correspondientes a los vectores plasmídicos previamente descritos por Yu et al. (2009). Los fibloblastos transfectados se cultivaron en "medio iPS", en presencia de moléculas pequeñas (Figura 1A), lo que se ha descrito anteriormente como acelerar el proceso de reprogramación y reducir la pérdida de vectores episomales (Zhang et al. 2012). Las colonias tipo ES se hicieron visibles por primera vez aproximadamente entre los días 30 y 40 después de la transfección con una estructura en forma de cúpula muy compacta (Figura 1B). Cuando se recogieron y expandieron, estas colonias de células hiPS mostraron una morfología típica de células ES humanas. El análisis de estas células hiPS demostró que los clones desarrollaron actividad de fosfatasa alcalina (AP) junto con la expresión de los marcadores pluripotentes Nanog, TRA-1-81, OCT4 y SSEA4 (Figuras 1C-E). La sonda TaqMan basada en qRT-PCR reveló que los genes pluripotentes de expresión aumentaban notablemente con respecto a la población de fibroblastos respectiva y eran comparables a los observados en células ES humanas (Figura 11). Las colonias de iPS podrían diferenciarse ln vltro en derivados de las tres capas germinales, según lo observado mediante la sonda TaqMan basada en qRT-PCR (Figura 1J) e inmunohistoquímica en cuerpos embrioides después de dos semanas en cultivo (Figuras 1F-H). Además, la línea celular iPS humana mostró un cariotipo normal (Figura 1K). Las células hiPS no mostraron integración genómica del transgén y habían perdido por completo los vectores episomales después de 15 pases, como lo demuestra el análisis por RT-PCR en el sitio OriP en el episoma (Figura 1L). La pluripotencia de las líneas iPSC humanas se validó mediante un ensayo de formación de teratomas.

Diferenciación de células hiPS en estructuras de tipo neuroepitelial con una identidad de campo ocular

Dado que un requisito previo para la diferenciación de las células iPS consiste en el cierre de la maquinaria de autorrenovación, se eliminó el FGF2 del medio para estimular la diferenciación espontánea de células iPS confluentes. La retirada de FGF2 del medio de cultivo también puede promover la inducción de neuroectodermo como bien demostraron Greber et al. (2011) en células ES humanas. Para favorecer esta diferenciación de las células hiPS en un linaje de neuroectodermo, se cultivaron colonias en un medio proneural que contenía medio DMEM/F12 con un 1% de aminoácidos no esenciales MEM y un 1% de suplemento de N2 (Figura 2A). Esto condujo a la aparición de colonias pigmentadas en 4 días. Después de 7 días, las estructuras de fase brillante comenzaron a aparecer cerca de más de la mitad de los parches de células pigmentadas (Figura 2B). En dos semanas, todas estas estructuras estaban organizadas en estructuras de tipo neuroepitelial rodeadas en parte por un parche de células pigmentadas (Figura 2C), correspondiendo a 1 a 2 estructuras por cm2. Las otras colonias pigmentadas no desarrollaron estructuras de tipo neuroepitelial y la formación de estas estructuras rara vez se observó en áreas no pigmentadas. El día 14, la sonda TaqMan basada en qRT-PCR reveló que todas las estructuras de tipo neuroepitelial formadas perdieron la expresión del gen OCT4 (POU5F1) relacionado con la pluripotencia y adquirieron la expresión de factores de transcripción asociados con la especificación del campo ocular, como LHX2, RAX, PAX6, SIX3 (Figura 2D). La inmunotinción de las estructuras de tipo neuroepitelial demostró que todas las células coexpresaban PAX6 y RAX (Figuras 2E-G), lo que es característico de las células del campo ocular (Mathers y Jamrich 2000). Casi todas las células eran positivas para LHX2 (Figuras 2H, 2J) y su estado progenitor se confirmó utilizando el marcador de proliferación celular Ki67 (Figuras 2H-J). La qRT-PCR demostró además que la expresión de MITF y VSX2, dos factores de transcripción implicados en la especificación de la retina durante la formación de la vesícula/copa óptica (Horsford et al. 2005), aumenta en un factor 10 y 100, respectivamente, el día 14 (Figura 2D). La inmunohistoquímica reveló un gradiente opuesto de expresión de VSX2 y MITF, con la tinción más intensa para VSX2 en las estructuras de tipo neuroepitelial, mientras que la expresión de MITF más fuerte se encontró en la parte pigmentada periférica de las estructuras (Figuras 1K-O). Tomados en conjunto, estos hallazgos demuestran que las estructuras de tipo neuroepitelial tienen un perfil de expresión de marcador típico de los progenitores de la retina neural y se pueden renombrar como estructuras similares a la Retina Neural (NR). Curiosamente, la qRT-PCR reveló que la expresión de factores de transcripción de precursores de fotorreceptores como NRL y CRXaumenta en un factor 5 en estructuras similares a la NR después de tan solo 14 días en cultivo (Figura 2D), lo que sugiere que algunos progenitores retinianos podrían haber participado ya en el linaje de fotorreceptores.

El análisis de expresión génica reveló la expresión endógena de antagonistas de Wnt y BMP, DKK1 y NOGGIN, en cultivos de hiPSC confluentes y ambos genes aumentaron durante la formación de estructuras de tipo neuroepitelial (Figura 2P).

Los progenitores retinianos derivados de células hiPS se diferencian eficientemente en neuronas retinianas Las estructuras completas, correspondientes a las estructuras similares a la NR con el parche de células pigmentadas circundante (Figura 2C) se aislaron mecánicamente el día 14 y se cultivaron posteriormente como estructuras flotantes bajo agitación 3D (Figura 3A). Se cultivaron estructuras flotantes en presencia de FGF2 para favorecer la diferenciación neural retiniana en lugar de la diferenciación en el linaje RPE (Fuhrmann 2010; Martinez-Morales et al.

2004). Un día después del aislamiento (día 15), la estructura similar a la NR había formado una esfera hueca, que continuó aumentando de tamaño durante el cultivo (Figuras 3B-D). El análisis cuantitativo mostró un aumento en el grosor del neuroepitelio de 139 ± 19 gm a 251 ± 41 gm entre D17 y D24 (Figura 7). Los inventores analizaron el transcurso del tiempo y la adquisición de fenotipos retinianos específicos, utilizando tanto qRT-PCR mediante el aislamiento de ARN de la esfera en crecimiento como inmunohistoquímica. A lo largo del proceso de diferenciación, desde el día 14 hasta el día 42 todavía se expresaron los factores de transcripción que intervienen en la especificación y diferenciación de la retina, como LHX2, Ra X, SIX3, PAX6, VSX2 y MITF (Figura 3E). El día 21, las células que expresan VSX2 se localizaron en el neuroepitelio en desarrollo de la estructura similar a la NR, y las células positivas para MITF se encontraron exclusivamente en las células RPE en la periferia de las estructuras (Figura 3G). La restricción de la expresión de MITF en las células RPE se confirmó mediante la disminución de su expresión de ARNm en la estructura similar a la NR (Figura 1E). Las células positivas para VSX2 se localizaron predominantemente a lo largo de la parte exterior del neuroepitelio y también expresan PAX6 (Figura 3H). En la parte interior del neuroepitelio se congregaron células positivas para PAX6/negativas para VSX2, que podrían corresponder a las primeras neuronas retinianas diferenciadoras y no portaban el marcador de proliferación Ki67. De hecho, ya en el día 21 se identificaron células ganglionares y células amacrinas mediante inmunohistoquímica en la misma localización interna con anticuerpos dirigidos de nuevo a BRN3A (Figura 3I) o CALRETININA (Figura 3M). También se encontraron células positivas para LIM1 correspondientes a células horizontales diferenciadas en el neuroepitelio en desarrollo (Figura 3N). La expresión de OTX2 y NEUROD1, dos genes que codifican factores de transcripción que intervienen en la diferenciación de células retinianas como fotorreceptores (Basset y Wallace 2012), aumentó en gran medida durante el cultivo flotante (Figura 3E). El análisis inmunohistoquímico mostró la expresión de OTX2 en las células RPE en la periferia de las estructuras y la aparición de células positivas para OTX2 en el neuroepitelio (Figura 3I), correspondientes a los precursores comprometidos de fotorreceptores (Nishida et al., 2003). La diferenciación en el linaje de fotorreceptores se confirma por el gran aumento de la expresión de NRL y CRXpor qRT-PCR desde el día 14 hasta el día 42 (Figura 3F y Figura 6A). Las células positivas para CRX fueron identificables en el neuroepitelio ya en el día 14 (Figura 3J), con un aumento progresivo en número a los 21 y 28 días (Figuras 3K, L). En esta etapa, los precursores de fotorreceptores se identificaron con una inmunotinción de RECOVERINA (Figura 3O).

En D21 se coexpresaron células CRX+ con OTX2 en el neuroepitelio (Figuras 6C-H). En D28 se expresó esencialmente CRX en células Ki67 postmitóticas (Figura 6M). Como era de esperar (Nishida et al., 2003), los precursores de fotorreceptores comprometidos OTX2+ no expresaron PAX6 (Figura 6N). Todos estos datos demuestran que estas condiciones de cultivo permiten la diferenciación de células hiPS en los principales tipos de células retinianas (células ganglionares, células amacrinas/horizontales y fotorreceptores) en 3 semanas. Además, el protocolo aquí desarrollado mostró una buena reproducibilidad cuando se compararon dos líneas hiPSC no integradoras distintas (hiPSC-1 y hiPSC-2) (Figura 8).

Generación de células RPE a partir de células hiPS

Dada la rápida aparición del parche pigmentado de células procedentes de células hiPS confluentes cultivadas en medio proneural, los inventores trataron de aislarlas y diferenciarlas en células RPE. Entre los días 7 y 14 se seleccionaron mecánicamente parches pigmentados de células y se volvieron a disponer en placas recubiertas de gelatina para su expansión (Figura 4A). Después de un tiempo de tres semanas a un mes, formaron una monocapa de células confluentes que mostraba la morfología adoquinada clásica de las células del RPE (Figuras 4B-C). La mayoría de las células eran inmunorreactivas para un factor de transcripción específico de RPE clave, MITF, y las interfaces de célula a célula estaban revestidas por ZO-1, un marcador de unión estrecha del epitelio pigmentado de la retina (Figura 4D). El análisis por qRT-PCR, normalizado a células RPE humanas adultas, demostró que las células hiRPE retuvieron la expresión de marcadores asociados a RPE maduros tales como MERTK, RPE65, BEST1 y PEDF después de varios pases (Figura 4E). Para determinar si las células hiRPE eran funcionales, se probó su capacidad para llevar a cabo la fagocitosis de segmentos externos de fotorreceptores (POS, por sus siglas en inglés) marcados con FITC. Se detectó una actividad de fagocitosis pronunciada, tan eficiente como para la línea celular de control RPE-J con un promedio de un 30% de POS internalizado en un plazo de 3 horas (Figura 4F).

Ejemplo 2: Diferenciación de células progenitoras retinianas en tipos de células retinianas de nacimiento tardío

El mantenimiento prolongado de estructuras similares a la NR aisladas en cultivo flotante permitió una mayor diferenciación de las RPC en los tipos de células retinianas de nacimiento tardío, tal como se demuestra mediante qRT-PCR (Figuras 9A-E). De hecho, después de la primera expresión de marcadores retinianos de células RGC (BRN3A y B), amacrinas (CALRETININA y GAD2) y horizontales (LIM) en maduración (Figuras 9A y B), se observó la aparición de marcadores de tipos de células retinianas tardías, correspondientes a fotorreceptores de conos (OPSINA R/G, OPSINA AZUL y ARRESTINA DE CONOS) y de bastoncillos (RODOPSINA y RECOVERINA) (Figuras 9C y D), células bipolares (PKCa) y gliales de Müller (GLAST1) (Figura 9E). Entre D21 (Figura 9F) y D42 (Figura 9G), la mayoría de las estructuras similares a la NR perdieron su aspecto laminar y desarrollaron rosetas internas que contenían células OTX2+, CRX+ y RECOVERINA+, correspondientes a los fotorreceptores diferenciadores (Figuras 9G, J-L y Figuras 6F-H), rodeadas por células que expresaban diferentes marcadores de células RGC (BRN3A y CALRETININA), amacrinas (CALRETINIn A y AP2) y horizontales (LIM) (Figuras 9G-J). Curiosamente, en D42, las células de RECOVERINA+ expresaron el marcador de superficie celular CD73 (Figura 9L), un marcador utilizado para la clasificación celular de precursores de fotorreceptores para trasplantes (Eberle et al., 2011). En D77, PAX6 estaba presente solo fuera de las rosetas en células posmitóticas (KI67-), lo que es coherente con su expresión en células RGC, amacrinas y horizontales (Figura 9M). Antes de D112 aparecieron RODOPSINA y OPSINA R/G en estructuras similares a la NR, lo que refleja la maduración tanto de los bastoncillos como de los conos (Figuras 9N, O). En D112, las células de RECOVERINA+ y RODOPSINA+ estaban localizadas comúnmente en la parte más interior de las rosetas residuales (Figuras 10A y B). Curiosamente, la inmunohistoquímica utilizando el marcador de cilio de conexión TUBULINA acetilada reveló la existencia de estructuras muy delgadas en la zona luminal de rosetas yuxtapuestas a las células de RECOVERINA+, lo que sugiere la formación de cilios potenciales y segmentos externos de fotorreceptores (Figuras 10C y D). La diferenciación de los otros dos tipos de células retinianas de nacimiento tardío, las células bipolares y gliales de Müller, también requirió un mayor tiempo en cultivo (D112) para ser detectadas respectivamente mediante tinción con PKCa (Figura 9P) y mediante coexpresión de glutamina sintetasa (GS) y SOX9 (Figura 9Q). Por lo tanto, estas condiciones de cultivo celular permitieron la generación de todos los tipos de células retinianas a partir de las RPC presentes en las estructuras similares a la NR de forma secuencial.

Ejemplo 3: Aceleración de la generación de precursores de fotorreceptores por inhibición de Notch

El análisis inmunohistoquímico con anticuerpos contra CRX y RECOVERINA demostró que el número de precursores de fotorreceptores aumentó gradualmente entre D14 (Figura 3J) y D28 (Figura 3L, Figura 5B). Entre el día 21 y el día 35, las estructuras similares a la NR perdieron sus estructuras laminares y desarrollaron rosetas internas que contenían células positivas para CRX y RECOVERINA (Figura 5B). Curiosamente, la adición del inhibidor DAPT de Notch el día 21 durante 7 días es suficiente para aumentar drásticamente el número de células positivas para CRX y RECOVERINA (Figura 5B). El tratamiento posterior con DAPT, desde el día 28 hasta el día 35, también condujo a un gran aumento en el número de células que expresan CRX y RECOVERINA (Figura 5B). Un tratamiento de una semana con DAPT entre D21 y D28 permitió una generación mejorada de precursores de fotorreceptores, ya que en D28 el número de células CRX+ y RECOVERINA+ aumentó en un factor de 2,2 y de 2,6, respectivamente, en comparación con el control (Figura 5C). Al mismo tiempo, la población de progenitores mitóticos evaluados en D28 mediante tinción Ki67 disminuyó en gran medida (en un factor 3) después del tratamiento en D28 (Figura 5C). El efecto de la inhibición de Notch también se evaluó entre D28 y D35, en lugar de una exposición prolongada a DAPT, porque pocas RPC permanecieron en D28 después del tratamiento con DAPT. En estas condiciones, la inhibición de Notch también condujo a un aumento en el número de precursores de fotorreceptores dentro de las estructuras similares a la NR, en concreto un aumento en un factor de 1,7 y de 4,1 en D35 en el número de células CRX+ y RECOVERINA+, respectivamente (Figura 5D). Curiosamente, las células de ARRESTINA DE CONOS+, que normalmente no se detectaron en D35, pudieron identificarse claramente en ese momento después del tratamiento con DAPT (no mostrado). Además, el análisis por qRT-PCR confirmó el aumento en la expresión de ARRESTINA DE CONOS en D35 después del tratamiento con DAPT, mientras que no se observaron cambios significativos en la expresión génica de RODOPSINA, OPSINA AZUL ni OPSINA G/R (Figura 5E). La expresión de GLAST1 disminuyó después del tratamiento con DAPT (Figura 5E).

Estos hallazgos demuestran que la señalización de Notch ralentiza la diferenciación de fotorreceptores de las células hiPS, tal como se ha sugerido recientemente para las células hES (Nakano et al.2012) y, por lo tanto, que su inhibición favorece la diferenciación de fotorreceptores y acelera la generación de precursores de fotorreceptores a partir de RPC multipotentes.

Ejemplo 4: Discusión

Este estudio muestra el nuevo hallazgo de que un simple cultivo de hiPSC confluentes en un medio proneural libre de suero es suficiente para generar estructuras similares a la NR y células RPE en 2 semanas. El proceso descrito en la presente memoria evita las etapas de formación y selección de EB, adición de moléculas inductivas tales como DKK1, NOGGIN y WNT y/o Matrigel, así como el recubrimiento de EB sobre sustratos adherentes. Las estructuras generadas temprano presentan un fenotipo OV revelado mediante la coexpresión de PAX6 y RAX, y gradiente opuesto de VSX2 y MITF entre el neuroepitelio y el RPE. Es probable que esta eficiencia se deba en parte a la creciente producción endógena por las hiPSC confluentes de DKK1 y NOGGIN, dos inductores de especificación neural y retiniana, generalmente añadidos para la diferenciación retiniana de hESCS o hiPSCs (Meyer et al., 2011; Boucherie et al., 2013). Sin embargo, estudios previos informaron de que el IGF-I añadido al medio de cultivo o presente en el Matrigel puede dirigir las hESC a una identidad de progenitor retiniano (Lamba et al., 2006; Zhu et al., 2013), lo que sugiere que la insulina, ya presente en el suplemento N2, es suficiente para desempeñar una función similar en las condiciones arriba indicadas.

Los cultivos flotantes de estructuras similares a la NR derivadas de hiPSC aisladas permitieron la diferenciación de las RPC en todos los tipos de células retinianas, de una manera secuencial coherente con la retinogénesis de vertebrados in vivo, demostrando la multipotencia de las RPC derivadas de hiPSC. Curiosamente, los inventores también informan de que la inhibición de la vía Notch cuando los RPC están comprometidos con el linaje de fotorreceptores mejora claramente la proporción de precursores de fotorreceptores en las estructuras similares a la NR, con un aumento al doble en células CRX+. Un tratamiento de una semana con el inhibidor de Notch, DAPT, es de hecho suficiente para inducir la salida del ciclo celular para una gran mayoría de las RPC, lo que permite la generación después de 35 días de aproximadamente un 40% de precursores de fotorreceptores CRX+, que también expresan marcadores de precursores de conos. Esta estrategia es ventajosa para la generación eficiente de células con aplicaciones terapéuticas. Las estructuras similares a la NR no se invaginaron formando copas de dos capas tal como informaron elegantemente Nakano etal. (2012) en un protocolo dependiente de EB/Matrigel usando hESC. En cambio, las estructuras derivadas de hiPSC mantuvieron una organización laminar hasta D21 y posteriormente desarrollaron rosetas que contenían células similares a fotorreceptores en la región central, rodeadas por ambas células con una identidad específica de la capa nuclear interna de la retina y RGC. Sin embargo, la generación de tejido de NR maduro y estratificado no es un requisito para futuras estrategias de terapia celular basadas en precursores de fotorreceptores purificados u otras células derivadas de la retina. En este contexto, el presente protocolo permite, en 42 días, la generación de candidatos prometedores para trasplante, es decir, precursores de fotorreceptores CD73+. Estos precursores han sido previamente purificados y trasplantados con éxito en la retina de ratón (Eberle et al., 2011). La posibilidad de combinar la inhibición de NOTCH y la selección de CD73 permite el aislamiento de una gran cantidad de células trasplantables, lo que es muy prometedor para el reemplazo de fotorreceptores degenerados en distrofias retinianas. La capacidad de producir RGC a partir de estructuras similares a la NR tiene implicaciones importantes para el tratamiento del glaucoma. Además de la generación de neuronas retinianas, el presente protocolo permite de forma concomitante la generación de células RPE (hiRPE) que se pueden pasar y amplificar fácilmente conservando su fenotipo, cercano a su estado in vivo. El presente protocolo tiene un gran potencial para generar rápidamente bancos de células hiRPE previstas para el tratamiento futuro de la AMD y otras enfermedades relacionadas con el RPE.

Con el objetivo de mantener un grado clínico, los inventores generaron hiPSC mediante reprogramación episomal, ya que el uso de vectores lentivirales implica un riesgo de genotoxicidad. Las alimentaciones autólogas se pueden utilizar para el mantenimiento de hiPSC; será preferible un sistema sin xeno y sin alimentación para la terapia regenerativa. Desde una perspectiva farmacológica, las hiPSC ofrecen un valioso potencial para perfilar nuevos compuestos en el primer proceso de descubrimiento de fármacos. La capacidad proliferativa de las células RPE y RPC derivadas de hiPS debería asegurar el desarrollo de nuevas herramientas celulares para el cribado de alto rendimiento basado en el fenotipo y la diana con el objetivo de identificar compuestos activos específicos para futuros tratamientos de distrofias retinianas.

Este nuevo protocolo, que elimina la necesidad de las etapas manuales que requieren mucho tiempo y mano de obra para diferenciar las hiPSC en un linaje retiniano específico, proporciona una estrategia fácilmente escalable para generar una gran cantidad tanto de células RPE como de RPC multipotentes. Por lo tanto, en un período de tiempo relativamente corto, los métodos descritos en la presente memoria producen una fuente de precursores de fotorreceptores o RGC que prometen una estrategia novedosa para la medicina regenerativa y las pruebas farmacéuticas/rastreo de fármacos. Esta estrategia que utiliza hiPSC también brinda la oportunidad de estudiar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen al desarrollo de la retina humana y debería promover el desarrollo de modelos in vitro de enfermedades degenerativas de la retina humana.

REFERENCIAS

Barbcr, A.C., Hippert, C., Duran, Y., West, E.L., Bainbridgc, J.W., Warre-Cornish, K.. Luhmann, U.F., Lakowski, J.. Sowdcn, J.C., Ali, R.R., and Pcarson, R.A. (2013) Rcpair of thc dcgencratc retina by photoreceptor transplantation. Proc. Nati. Acad. Sci. U S A. 110, 354-359.

Basett. E.A.. and Wallacc, V.A. (2012) Cell fate determination in thc vertébrate retina. Trends Neurosci. 9, 565-573.

Boucherie, C., Mukheijee, S., Henckaerts. E., Thrasher, A.J.. Sowden. J.C., and Ali. R.R. (2013) Self-organizing neuroepithelium from human pluripotent stem cells facilitates derivation of photoreceptors. Stem Cells. 31, 408-414.

Boucherie, C., Sowden, J.C., and Ali, R.R. (2011) Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regen. Med. 4. 469-479.

Buchholz. D.E., Hikita. S.T., Rowland. T.J., Friedrich, A.M., Hinman, C.R.. Johnson, L.V.. and Clegg. D.O. (2009) Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells 27, 2427-2434.

Chen. M.. Chen. Q.. Sun. X.. Shen. W.. Liu, B.. Zhong, X., Lcng. Y.. Li, C., Zhang. W.. Chai. F„ Huang, B., Gao. Q., Xiang, A.P., Zhuo, Y., and Ge. J.(2010) Gencration of retinal ganglion-like cells from reprogrammed mousc fibroblasts. lnvcst. Ophthalmol. Vis. Sci. 11, 5970-5978.

Comyn, O.. Lee, E., and MacLaren, R.E. (2010) Induced pluripotent stem cell therapies for retinal disease. Curr. Opin. Neurol. 1, 4-9.

Dahlmann-Noor. A., Vijay. S.. Jayaram, H., Limb, A., and Khaw. P.T. (2010) Current approaches and futuro prospeets for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Can. J. Ophthalmol.4, 333-341.

Eberle D. et al. (2011) Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina, lnvest Ophthalmol Vis Sci 52: 6462-71.

Fuhrmann, S. (2010) Eye tnorphogenesis and patteming of the optic vesicle. Curr. Top. Dev. Biol. 93. 61-84.

Greber. B., Coulon. P., Zhang. M., Moritz, S., Frank. S.. Müller-Molina. A.J., Araúzo-Bravo, M.J., Han, D.W., Pape, H.C., and Schíilcr, H.R. (2011) FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30.4874-4784.

Griscelli F. et al. (2012) Malignan! germ cell-like tumors, expressing Ki-1 antigen (CD30), are revealed during in vivo differentiation of partially reprogrammed human-induced pluripotent stem cells. Am J Pathol 180: 2084-96.

Gong, J„ Sagiv, O., Cai. I!., Tsang. S.. Del Priore, L. (2008) Effeets of extracellular matrix and neighboring cells on inducción of human embryonic stem cells into retinal or retina! pigment epithelial progenitors. Experimental Eye Research. 86. 957-965.

Horsford. D.J.. Nguyen. M.T.. Sellar. G.C.. Kothary. R.. Amhciter. H.. and Mclnnes, R.R. (2005) ChxlO repression of Mitf is required for the maintenance of mammalian neuroretinal identity. Development 1. 177-187.

Idelson, M., Alpcr, R., Obolensky, A., Ben-Shushan, E., Hcmo, I., Yachimovich-Cohen, N.. Khaner. H.. Smith. Y.. Wiser. O.. Gropp. M.. Cohén. M.A.. Even-Ram. S., Bcrman-Zakcn, Y., Mat/.rafi, L., Rcchavi. G.. Banin, E„ and Rcubinoff, B. (2009) Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell 5. 396-408.

Kokkinaki. M., Sahibzada. N.. and Golestaneh. N. (2011) Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport. membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion. and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells 5. 825-835.

Jagatha. B.. Divya. M.S.. Sanalkumar. R.. hidulekha. C.L.. Vidyanand. S., Divya, T.S., Das, A.V., and James, J. (2009) In vitro differentiation of retinal ganglion-like cells from embryonic stem cell derived neural progenitors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 230-235.

Jin, Z.B., Okamoto, S., Xiang. P.. and Takahashi, M. (2012) Integrationfree induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transí. Med. 6. 503-509.

Klimanskaya. 1.. Hipp J.. Rczal. K.. West. M.. Atala. A. and Lanza. R. (2004) Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning and Stem Cells. 6, 3, 217-245.

Lamba. D.A., Karl. M.O., Warc. C.B., and Rch. T.A. (2006) Efficicnt generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103, 12769-12774.

Lamba. D.A.. Gust, J. and Reh, T.A. (2009) Transplantation of human embryonic stem ccll-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-dcficient mice. Cell Stem Cell 1,73-79.

Lu, B.. Malcuit, C.. Wang. S„ Girman, S., Francis, P., Lemieux, L., Lanza. R., and Lund, R. (2009) Long-tcmi safety and function of RPE from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration. Stem Cells. 9. 2126-2135.

Martínez-Morales. J.R., Rodrigo. 1., and Bovolenta. P. (2004) Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 7, 766-777.

Mathers, P.TI., and Jamrich M. (2000) Regulation of eye formation by the Rx and paxó homeobox genes. Cell. Mol. Life Sci. 2. 186-194.

Mcllough, C.B., Scrnagor, E„ Morcno-Gimcno, .1. Steel. D.H., and Lako, M. (2012) Efficient stage-speeific differentiation of human pluripotent stem cells toward retinal photoreceptor cells. Stem Cells 30, 673-686.

Meyer, J.S., Shearer. R.L.. Capowski. E.E.. Wright. L.S.. Wallace. K.A., McMillan, E.L., Zhang, S.C., and Gamm, D.M. (2009) Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 106, 16698-16703.

Meyer, J.S., Howdcn, S.E., Wallace, K.A., Verhocven, A.D., Wright, L.S., Capowski, E.E., Pinilla, I., Martin, J.M.. Tian, S., Stewart. R.. Pattnaik. B.. Thomson. J.A., and Gamm. D.M. (2011) Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilítate a customi/ed approach to retinal disease treatment. Stem Cells 29,1206-1218.

Nakano, T., Ando. S., Takata, N'., Kawada. M., Muguruma, K„ Sckiguchi, K.. Saito. K.. Yoncmura. S., Eiraku. M.. and Sasai. Y. (2012) Self-fonnation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell 10. 771-785.

Nishida. A., Furukawa. A., Koike, C.. Taño, Y.. Aizawa, S„ Matsuo, I., and Furukawa. T. (2003) Otx2 homeobox gene Controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nat. Neurosci. 12. 1255-1263.

Osakada. F., lkeda. H., Mandai. M.. Wataya. T., Watanabe, K., Yoshimura. N.. Akaike. A.. Sasai, Y., and Takahashi, M. (2008) Toward the generation of rod and conc photorcccptors from mouse, monkcy and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26.215-224.

Osakada. F.. Jin, Z.B.. Hirami. Y.. lkeda. H.. Danjyo. T., Watanabe. K., Sasai, Y., and Takahashi, M. (2009) In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molcculc induction. J. Cell. Sci. 122. 3169-3179.

Parameswaran, S., Balasubramanian, S., Babai, N.. Qiu, F., Eudy, J.D., Thoreson. W.B., and Ahmad. 1. (2010) Induced pluripotent stem cells genérate bolh retinal ganglion cells and photoreceptors: therapeutic implications in degenerative changes in glaucoma and agc-rclated macular dcgcncration. Stem Cells 4, 695-703.

Pearson. R.A., Barber, A.C., Rizzi. M.. Hippert. C.. Xue. T.. West, E.L., Duran, Y., Smith. A.J., Chuang, J.Z., Azam. S.A., Luhmann. U.F., Benucci, A., Sung, C.H., Bainbridge. J.W.. Carandini. M.. Yau. K.W., Sowden. J.C.. and Ali, R.R. (2012) Restoration of visión after transplantation of photoreceptors. Nature 485. 99-103.

Roger, J., Brajeul, V., Thomasseau. S., Hienda. A.. Sahel, J-A., Guillonneau. X.. and Goureau, O. (2006) Involvemenl of Pleiotrophin in CNTF-mcdiated differentiation of the late retina] progenitor cells. Dev.Biol. 298, 527-539.Tucker, B.A., Anfinson. K.R.. Mullins. R.F., Stone, E.M.. and Young. MJ. (2013) Use o f a synthetic xenofree culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transí. Med. 1, 16-24.

Zaliabi, A.. Shahbazi, E., Ahmadieh, H., Hassani, S.N.. Totonchi. M., Taei, A., Masoudi. N.. Ebrahimi. M.. Aghdatni. N.. Seifínejad, A.. Mehmejad. F.. Daftarian, N., Salekdeh, G.H., and Baharvand, H. (2012) A new cfficient protocol for directed differentiation of retinal pigmented epithclial cells from normal and retinal diseasc induccd pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 21. 2262-2272.

Vaajasaari. H.. llmarinen. T.. Juuti-Uusitalo. K.. Rajala. K., Onnela, N„ Narkilahti, S„ Suuronen. R.. Hyttinen. J.. Uusitalo. H.. and Skottman, H. (2011) Toward the dcflned and xcno-frcc differentiation of functional human pluripotent stem ccll-dcrivcd retinal pigment epithelial cells. Mol. Vis. 17. 558-575

Yu. J.. Hu, K.. Smuga-Otto, K.. Tian. S„ Stewart. R.. Slukvin. I.I., and Thomson, J.A. (2009) Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene scquenccs. Science 324. 797-801.

Zhang, Y.. Ei, W., I jurent, T., and Ding. S. (2012) Small molecules, big roles - the Chemical manipularon of stem cell fate and somatic cell reprogramming. J. Cell. Sci. 125,5609-5620.

Zhu, Y., Carido, M.. Meinhardt, A., Kurth, T.. Karl. M.O., Adcr. M., and Tanaka, E.M. (2013) Three-dimensional neuroepithelial culture from human embryonic stem cells and its use for quantitative conversión to retinal pigment epithelium. PLoS One.

2013;8(l):c54552.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para para obtener in vitro progenitores retiñíanos humanos, que comprende las etapas consistentes en: (i) disponer un cultivo adherente de células madre pluripotentes humanas en forma de una monocapa de tipo colonia que alcanza al menos un 80% de confluencia,

- en un sistema de cultivo adherente consistente en células nutrientes que consisten en una capa de alimentación de MEF de ratón inactivado con mitomicina C;

- en un medio proneural que favorece el mantenimiento y/o crecimiento de células neuronales, estando compuesto dicho medio proneural por un medio nutritivo suplementado con un suplemento de medio de N2; y

(ii) mantener este cultivo en dicho medio proneural hasta la aparición de células pigmentadas y/o de estructuras de tipo neuroepitelial.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho medio proneural carece de al menos uno de los siguientes factores de diferenciación: noggin, Dkk-1 e IGF-1.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho medio proneural carece de noggin, Dkk-1 e IGF-1.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (ii) se realiza durante al menos 7 días.

5. Un método para obtener células epiteliales pigmentadas retinianas (células RPE), que comprende el método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y que adicionalmente comprende las etapas consistentes en:

( ^ííírpe) recoger al menos una célula pigmentada del cultivo obtenido en la etapa (ii); y

(^ívrpe) cultivar la(s) célula(s) pigmentadas obtenidas en la etapa (^ííírpe).

6. El método de la reivindicación 5, en el que el cultivo en la etapa ( ^ívrpe) se lleva a cabo en un sistema de cultivo adherente.

7. Un método para obtener células retinianas neurales que comprende el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y que además comprende las etapas consistentes en:

( ^ííínr) recoger células de al menos una estructura de tipo neuroepitelial del cultivo obtenido en la etapa (ii); y (^ívnr) cultivar las células pigmentadas obtenidas en la etapa ( ^ííínr).

8. El método de la reivindicación 7, en el que en la etapa ( ^ííínr) se recoge al menos una estructura de tipo neuroepitelial.

9. El método de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el cultivo en la etapa (^ívnr) se lleva a cabo en un sistema de cultivo no adherente.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que en la etapa (^ívnr) el medio de cultivo se suplementa con FGF2 durante al menos 5 días.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el cultivo en la etapa (^ívnr) se lleva a cabo en condiciones de agitación.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, para obtener precursores de fotorreceptores, en el que la etapa (^ívnr) se lleva a cabo durante al menos 21 días.

13. El método de la reivindicación 12, en el que en la etapa (^ívnr) se añade un inhibidor de Notch al medio de cultivo durante al menos 1 a 5 días.

14. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, que además comprende una etapa de clasificación celular de precursores de fotorreceptores mediante unión del marcador de superficie celular CD73.

15. Un método para obtener tanto células RPE como precursores de la retina neural, que comprende el método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 y el método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, llevándose a cabo las etapas (^ííírpe) y (^ívrpe) definidas en la reivindicación 5 o la reivindicación 6 en paralelo con las etapas (^ííínr) y ( ^ívnr) definidas en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13.