KR20200139799A - 재프로그래밍 벡터 - Google Patents

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Abstract

재프로그래밍은 인간 또는 동물 신체의 성숙한 체세포를 만능성 줄기세포로 "전환"할 수 있게 한다. 재프로그래밍은 외인성 인자, 일반적으로 전사 인자를 성숙한 세포에 도입함으로써 수행될 수 있다. 이러한 과정은 배아를 사용하지 않고도 유도 만능성 줄기세포를 생성할 수 있고, 이는 개인으로부터 생성되어 동일한 개인에게 복귀/재이식될 수 있다는 이점이 있다. 본 발명자들은 일시적인 벡터를 사용하여 외인성 재프로그래밍 인자의 일시적인 발현 방법을 개발하였고, 상기 벡터는 닫힌 선형 DNA이다. 놀랍게도, 이러한 방식으로 개발된 만능성 줄기세포는 안정하고, 표현형이 ESC와 같은 천연 줄기세포에 더 가깝다.

Description

재프로그래밍 벡터
재프로그래밍 (Reprogramming)은 인간 또는 동물 신체의 성숙한 세포 또는 체세포를 만능성 (pluripotent) 줄기세포로 "전환"되도록 한다. 재프로그래밍은 외인성 인자, 일반적으로 전사 인자를 성숙한 세포에 도입함으로써 유도될 수 있다. 이러한 과정은 배아 (embryos)를 사용하지 않고도 유도 만능성 줄기세포를 생성하므로, 이는 개인으로부터 생성되어 동일한 개인에게 복귀/재이식할 수 있다는 이점이 있다.
재프로그래밍에 의해 수립된 세포주를 유도 만능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC)라고 명명하고, 배아 줄기세포 (embryonic stem cell: ESC)의 특징인 동일한 만능성 (pluripotency) 및 자가-복제 특성 (self-renewal properties)을 나타낸다.
유도 만능성 줄기세포는 무제한 증식이 가능하고, 신체의 모든 세포 타입으로 분화될 수 있는 잠재력이 있으므로, 질병 모델링 및 약물 개발에 유용하다. 줄기세포 연구는 세포-기반 치료제의 생성에 큰 가능성이 있고, 인간 발생 및 재생 의학 연구에 도움이 될 것이다. 인간 체세포를 인간 유도 만능성 줄기세포 (hiPSC)로 유전자 재프로그래밍하면, 많은 연구 용도와 궁극적으로 치료를 위한 보충 가능한 세포 공급원을 제공할 수 있다. 예를 들어, 인간 세포 집단의 생리학적 및 병리학적 반응은 유도 줄기세포를 사용하여 평가될 수 있다.
성숙한 세포 타입으로부터 만능성 줄기세포의 생성을 유도하는 것은 많은 방법에 의해 수행될 수 있지만, 대부분은 재프로그래밍을 유도하기 위해 외인성 재프로그래밍 인자의 발현을 포함한다. 성공적인 iPSC 생성은 일반적으로 2 내지 4주 동안 재프로그래밍 인자의 발현을 필요로 한다. 이러한 창은 일시적인 벡터의 단일 형질감염의 사용을 방지하는 것이다. 그러므로 이러한 외인성 재프로그래밍 인자는 일시적인 DNA 발현 벡터, 메신저 RNA 또는 단백질의 다수의 적용에 의해 제공될 수 있다. 대안으로서, 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터 통합 또는 에피솜 벡터 비-통합 게놈의 단일 형질도입/형질감염은 장기간 발현을 제공할 것이다. 형질감염된 세포의 숙주 게놈으로 DNA 카세트의 통합을 사용하는 방법은 이 삽입 돌연변이유발은 이후에 외인성 재프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자가 침묵되거나 절제되더라도, 연구 및 임상 적용 모두에서 세포의 유용성을 제한할 수 있기 때문에 덜 바람직하다. 그러므로 비-통합 에피솜 벡터를 사용하는 이점은 세포의 연속적인 증식으로 인해 DNA 벡터가 희석되고 궁극적으로 제거되어, 그들이 운반한 유전자 물질이 결국 소실되는 것을 보장한다는 것이다.
현재 재프로그래밍에 사용되는 에피솜 플라스미드 (원형 이중-가닥 DNA)는 OriP/EBNA1 (Epstein-Barr nuclear antigen-1)-기반 에피솜 벡터이다. Epstein-Barr 바이러스 (Epstein-Barr virus: EBV) 유래의 OriP/EBNA1 벡터는 바이러스 전달 벡터로 패키징되지 않고 형질감염시킬 수 있기 때문에, 재프로그래밍 인자를 체세포에 도입하는데 적합하다. 시스-작용 (cis-acting) OriP 요소 및 트란스-작용 (trans-acting) EBNA1 유전자는 포유동물 세포에서 OriP/EBNA1 벡터의 안정적인 염색체외 복제를 보장한다. 상기 OriP/EBNA1 벡터는 세포주기당 1회만 복제되며, EBNA1 단백질은 OriP를 운반하는 플라스미드를 증식하는 세포에서 효율적으로 복제 및 분리할 수 있도록 한다. EBNA1은 궁극적으로 유사분열 안정성을 위해 플라스미드를 숙주 염색체에 테더링한다. 그러나 EBNA1은 특성이 잘 규명되어 있지만; 종양유전자 (oncogene)로서의 역할은 잘 정의되어 있지 않다. 이는 EBV-관련 암에서 일관되게 발현된다. 그러므로 iPSC로부터 에피솜 플라스미드를 제거하는 기전에도 불구하고, 일부 EBNA1 코딩 서열이 유지될 가능성이 있다. EBNA1의 지속적인 발현은 세포 DNA 손상을 유발하는 것으로 입증되었다. 실제로, EBNA1 벡터를 사용하여 생성된 IPSC는 ESC보다 더 많은 유전자 돌연변이를 축적하는 것으로 입증되었다. 또한, EBNA1 단백질의 발현은 EBNA1 존재의 결과로 잠재적으로 수백 개의 활성화된 유전자를 가진 세포에서 유전자 발현에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 상기 EBV-유래 EBNA1 단백질은 또한 형질감염된 세포의 면역 세포 인식을 증가시킬 수 있고, 이는 발현이 완전히 제거되지 않는 경우 영향을 미칠 수 있다. 실시예에서, 재프로그래밍된 세포에서 인터페론 발현 수준의 비교를 수행하였다. 그 결과, OriP/EBNA1 함유 플라스미드를 사용하여 재프로그래밍된 세포는 인터페론 유전자 및 다른 면역계 관련 유전자의 발현을 증가시켰음을 보여주었다. 더욱이, 연장된 EBNA1 발현의 전사적 및 후성적 결과는 완전히 탐색되지 않았으며, iPSC로부터 생성된 임의의 질병 모델에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 있다. 그러나 이러한 잠재적인 단점과 균형을 이루는 것은, OriP/EBNA1이 없이, 플라스미드가 특히 성숙한 체세포 타입의 재프로그래밍을 수행하기에 충분한 시간 동안 유지되지 않는다는 사실이다.
상기 OriP/EBNA1 벡터는 세포주기당 1회 복제될 수 있고, 이는 일반적인 일시적 플라스미드와 같은 방식으로 빠르게 제거되지 않는다. 비선택적 조건하에, 상기 플라스미드는 세포주기 당 약 5%의 비율로 제거된다 (Nanbo, A., Sugden, A., and Sugden, B. (2007). EMBO J 26, 4252-4262.). 그러므로 이러한 벡터가 만족스러운 수준으로 제거되려면 적어도 14회의 계대 (passages)가 걸린다. 세포를 살아있게 유지하려면, 상기 세포를 새로운 용기로 부분 배양해야 한다. 이 부분 배양은 "계대"로 알려져 있다. 계대의 수는 세포 배양이 부분 배양된 횟수이다. 이러한 계대 중에, 본 발명자들은 일부 세포의 자발적인 분화가 발생할 수 있다는 것을 관찰하였고, 이로 인해 이러한 세포들은 잘라내거나 또는 세포를 완전히 버려야 한다. 그러므로 상기 iPSC가 형질감염 30일 이내에 생성되고, 벡터의 소실을 보장하기 위해 세포는 수개월 동안 배양 상태로 유지되어야 한다. 자발적인 분화는 이들 수 많은 계대 중에 재생 의학에 적용하는데 필요한 스케일-업 과정을 복잡하게 하고, EBNA1-매개 게놈 돌연변이에 대한 잠재력을 증가시킬 수 있다.
대안으로서, OriP/EBNA1을 사용하지 않고 재프로그래밍에 사용하기 위한 미니서클 벡터 (minicircle vectors)가 제안되었다. 이들은 진핵 프로모터 및 발현될 cDNA(들) 만을 함유하는 최소 벡터이다. 인간 지방세포 간질/줄기세포 (human adipose stroma/stem cell: hASC)에서 발현된 미니서클 벡터는 대략 28일내에 형질감염된 세포의 0.005% 만 재프로그래밍할 수 있었다 (Narsinh KH, Jia F, Robbins RC, Kay MA, Longaker MT, Wu JC. Nature Protoc. 2011;6:78-88). 그러나 이러한 세포 (hASC)는 이미 일부 다능 특성을 가지고 있고, 이는 만능성으로 재프로그래밍하기가 더 쉽다는 것을 시사한다. 이 방법은 신생아 섬유모세포를 재프로그래밍하는데 훨씬 덜 효율적이고, 다른 체세포의 성공적인 재프로그래밍에 대한 발표된 보고는 없다. 실제로, Narsinh 등은 "여기에 기재된 프로토콜이 성인 공급원으로부터 유래된 인간 진피 섬유모세포 (dermal fibroblasts)의 재프로그래밍에 아직 성공적으로 적용되지 않았다"라고 주의를 주었다. 그러므로 미니서클 벡터의 사용은 현재 지방 조직으로부터 단리된 다능성 hASC로 제한된다. 이러한 조직은 침습적 기술인 지방흡인 절차 중에 매우 많은 양이 채취될 수 있다. 일부 그룹은 충분한 수준의 발현을 제공하기 위해 미니서클의 반복적인 형질감염을 필요로 한다는 것을 발견하였다. 성숙하고, 용이하게 접근 가능한 공급원으로부터 유래되는 체세포를 재프로그래밍할 수 있는 것이 바람직하다. 미니서클은 플라스미드와 유사하지만 더 작은 이중-가닥 원형 DNA 분자이다. 원칙적으로 이들은 플라스미드 사용에 대한 해결책으로 보이지만, 실제로는 생산하기가 어렵고 시간이 많이 걸린다. 본 발명자들은 미니서클 생성 프로토콜이 일부 최소 박테리아 DNA의 보유를 초래하므로, 바람직하지 않다는 점에 주목하였다. 박테리아 DNA의 메틸화 마크는 인간 세포에서 벡터의 유전자 발현을 억제하는 효과를 가질 수 있으며, 이는 벡터의 유용성을 감소시키고, 박테리아 DNA에 대한 선천적 면역 반응을 유도한다.
인간 치료적 용도에서 유망함을 달성하기 위해, 인간 iPSC는 이상적으로는 외인성 DNA가 없고, 원핵 DNA 서열에 노출되지 않는다. 에피솜 벡터를 제거한 후에, 증식 및 발달 잠재력에서 인간 배아 줄기 (ES) 세포와 유사한, 벡터 및 이식유전자 서열이 전혀 존재하지 않는 iPS 세포가 유래된다. "풋-프린트가 없는 (Foot-print free)" 세포는 치료적 용도에 가장 바람직하다. iPSC의 유용성은 게놈의 무결성 및 안정성에 크게 의존하므로, 안정한 세포가 매우 바람직하다.
iPSC의 인간 치료적 사용은 아직 완전히 실현되지 않았고, 지금까지 iPSC를 사용하여 임상 시험을 실현하려는 사람들은 게놈 시퀀싱에 의해, 재프로그래밍을 촉진하기 위해 취한 조치 중 어느 것도 이식된 세포의 게놈에 유해한 영향을 주지 않았다는 것을 입증해야 한다. 그러므로 이식된 세포가 새로운 환경에서 발암성이 되지 않도록 하기 위해 근본적으로 초기 발암성 이벤트인 재프로그래밍 기술의 사용은 가능한 단계적으로 중단될 가능성이 높다. 그러므로 예를 들어, p53 억제, c-Myc 포함 및 EBNA1의 사용과 같이 발암성으로 알려진 요소들의 사용을 줄이면, 세포 치료 옵션으로 iPSC의 수용을 향상시킬 수 있다.
지금까지 출원인은 iPSC 재프로그래밍을 유도하기 위해, 완전히 이종이 없고 (xeno-free) cGMP-적합 DNA 벡터를 생성하는 강력하고 재현 가능하며 확장 가능한 기전을 알지 못하였다.
따라서, 본 발명자들은 비-에피솜 일시적인 벡터를 사용하여 외인성 재프로그래밍 인자의 일시적인 발현 방법을 개발하였고, 여기서 상기 벡터는 닫힌 선형 (closed linear) DNA이다. 본 발명자들은 닫힌 선형 DNA 벡터가 iPSC 재프로그래밍을 촉진할 수 있다는 예상치 못한 예외적인 관찰을 보여주는 새로운 데이터를 생성하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 닫힌 선형 DNA 벡터가 염색체 부착, 유지 또는 분리의 임의의 기전을 필요로 하지 않고 재프로그래밍에서 장기간 발현을 유지할 수 있는 능력을 가지고 있음을 발견하였다. 놀랍게도, 상기 닫힌 선형 DNA 분자는 p53 억제 없이 장기간 발현을 유지하고 재프로그래밍 효과를 낼 수 있다. 또한, 닫힌 선형 DNA의 형질감염을 사용하여 유래된 세포는 OriP/EBNA1을 운반하는 유사한 원형 플라스미드로 형질감염된 세포보다 더 안정한 것으로 나타났으며, 이는 상기 닫힌 선형 DNA 구조체가 OriP/EBNA1을 운반하는 플라스미드보다 훨씬 더 빠르게 세포에서 자연적으로 소실되기 때문이다. 이는 도 14a 및 14b에 제시된 데이터에 의해 뒷받침된다. 염색체 스캐폴드 부착 및/또는 p53 억제를 사용하지 않는 대부분의 벡터는 필요한 재프로그래밍 인자를 발현하기에 충분한 기간 동안 유지되지 않기 때문에, 이러한 결과는 놀라운 것이다. 또한, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 부속 서열, 요소 또는 발현 카세트에 대한 요구 없이 재프로그래밍되는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 또한 닫힌 선형 DNA 벡터가 표준 OriP/EBNA1 기반 방법을 사용하는 재프로그래밍에 타협하지 않는 세포를 재프로그래밍할 수 있음을 발견하였고, 이에 대해 실시예 5 및 도 11을 참조바란다. 놀랍게도, 이러한 방식으로 개발된 만능성 줄기세포는 안정적이고, 표현형이 배아 줄기세포와 같은 천연 줄기세포에 더 가깝다.
본 발명자들은 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하여 체세포를 재프로그래밍할 수 있음을 발견하였다. 체세포가 이러한 방식으로 형질감염되고 충분한 시간 동안 배양되면, 유도 만능성 줄기세포의 안정하고 균질한 집단을 수득할 수 있다.
충분한 기간/충분한 시간은 통상 약 30일, 즉 25 내지 35일의 기간, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35일 중 어느 하나이다.
따라서, 본 발명은 유도 만능성 줄기세포를 제조하기 위한, 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 재프로그래밍 인자들을 포함하는 하나 이상의 닫힌 선형 벡터(들)을 체세포 집단에 도입하는 단계, 및 상기 하나 이상의 재프로그래밍 인자(들)이 발현되도록 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 유도 만능성 줄기세포 (iPSC)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 도입 단계는 형질감염/뉴클레오펙션 (nucleofection)을 통해 수행될 수 있다. 상기 세포는 충분한 시간, 예를 들어 약 15-30일 동안 배양하여 상기 세포를 만능성으로의 재프로그래밍을 유도할 수 있다.
본 발명의 임의의 부분에 필요한 재프로그래밍 인자는 모두 하나의 닫힌 선형 DNA 벡터에 코딩될 수 있거나, 또는 요구되는 재프로그래밍 인자는 2개 이상의 닫힌 선형 DNA 벡터들 중에서 분할될 수 있다. 임의의 수의 닫힌 선형 DNA 벡터가 사용될 수 있다. 2개 이상, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 초과의 닫힌 선형 DNA 벡터가 사용될 수 있다.
상기 닫힌 선형 DNA 벡터(들)는 OriP/EBNA1과 같은 염색체 스캐폴드 부착 및 복제를 위한 서열이 결여될 수 있다. 추가로 또는 대안으로서, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 예를 들어 RNA 간섭에 의한, p53의 억제를 위한 서열이 결여될 수 있다.
상기 닫힌 선형 DNA 벡터(들)에 의해 발현되는 재프로그래밍 인자는 성숙한 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는데 필요한 임의의 재프로그래밍 인자일 수 있다. 상기 재프로그래밍 벡터는 천연, 변형 또는 합성 인자일 수 있다. 이들은 하나 이상의 야마나카 인자 (Yamanaka factors)일 수 있다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터(들)는 유도 만능성 줄기세포를 생성하기 위해 체세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 체세포는 일반적으로 생식 계열 세포와 달리 신체의 세포를 지칭하는데 사용되며, 난자 또는 정자 세포를 제외한 신체의 모든 세포 타입을 포함한다.
재프로그래밍을 수행하기 위해, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터(들)가 체세포로 형질감염된다. 임의의 형질감염 방법이 사용될 수 있으며, 형질감염이 수행되는 공여체 세포의 타입에 따라 달라질 수 있다. 경우에 따라 뉴클레오펙션이 요구될 수 있다.
그 다음에 상기 형질감염된 세포는 닫힌 선형 DNA 벡터로부터 재프로그래밍 인자의 발현을 허용하는 적절한 조건을 사용하여 배양된다. 재프로그래밍을 허용하는 조건은 일반적으로 당 분야에 알려져 있고, 임의의 적절한 조건이 선택될 수 있다. 이상적으로, 인간 치료적 용도의 경우, 상기 배양은 피더-프리 시스템 (feeder-free system)에서 수행될 수 있으며, 이로써 수득된 세포는 어떠한 동물 성분 오염 (이종 프리)이 존재하지 않는다. 상기 배양 단계는 세포가 만능성으로 유도되기 위해 충분한 시간 동안 수행된다. 충분한 시간은 상기에 기재하였다.
닫힌 선형 DNA는 일반적으로 각 말단이 공유적으로 닫힌 이중-가닥 DNA인 것으로 이해된다. 그러므로 상기 DNA에는 3' 또는 5' 말단이 존재하지 않는다. 선형 부분의 이중-가닥 DNA는 상보적 서열이다. 변성되는 경우, 닫힌 선형 DNA는 단일-가닥 원을 형성할 수 있다. 상기 DNA는 헤어핀 또는 헤어핀 루프와 같은 임의의 2차 구조 또는 십자형 (cruciform)과 같은 더 복잡한 구조를 형성하는, 임의의 적절한 서열에 의해 각 말단이 닫힐 수 있다. 상기 선형 DNA의 닫힌 말단에 있는 서열은 상보적이거나 또는 비-상보적일 수 있다. 상기 닫힌 선형 DNA는 임의의 적절한 방법으로 제조될 수 있다. 인간 세포에서 DNA 벡터를 사용하는 경우, 상기 닫힌 선형 DNA에 항생제 내성 유전자 또는 복제 기원과 같은 임의의 원핵 DNA 서열이 존재하지 않는다는 것을 보장하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 세포에 관한 것으로서, 본 발명자들은 이들이 대체 에피솜 벡터를 사용하여 형질감염된 세포에 비해 더 높은 등급을 갖거나 또는 더 안정하다는 것을 발견하였기 때문이다.
그러므로 본 발명은 또한 유도 만능성 줄기세포의 집단에 관한 것으로서, 상기 세포 집단은 본원에 기재된 임의의 용도 또는 방법을 사용하여 제조된다. 상기 세포 집단은 더 이상 닫힌 선형 DNA 벡터를 보유하지 않을 수 있고, 이들이 세포 유지 중에 자연적으로 소실되기 때문에, 재프로그래밍 인자가 제거되지 않는 레트로바이러스 방법을 포함하는 현재의 방법에 의해 유도된 세포보다 훨씬 더 안전하다. 그러므로 상기 발명은 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터로 유도된, 치료 및/또는 GMP (Good Manufacturing Practice) 등급의 안정한 만능성 줄기세포 집단을 포함한다.
본 발명의 세포는 바람직하게는 인간이다.
배양되는 경우, 만능성 줄기세포는 일반적으로 조밀하게 밀집된다. 분화되는 경우, 상기 세포는 덜 조밀하게 밀집되므로, 혼합 세포 집단 (만능성 및 분화 형태)에서 작은 비율의 분화된 세포는 더 많은 것처럼 보일 수 있다. 만능성 줄기세포 콜로니는 당업자에 의해 등급이 매겨진다. 등급 A의 콜로니는 가장자리와 경계가 깨끗한 투명한 만능성 줄기세포 콜로니이고, 상기 세포는 조밀하게 밀집되고, 분화가 보이지 않으며, 콜로니 가장자리 주변에 세포가 분산되어 있지 않다. 등급 B의 콜로니는 가장자리에 자발적으로 분화된 세포가 있고, 이들은 더 분산되어 있는 것으로 확인되었다. 등급 C의 콜로니는 주로 자발적으로 분화된 세포를 가지고 있고, 분산된 세포에 만능성 줄기의 포켓만이 남아 있다.
본 발명자들은 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하여 수득된 콜로니의 더 많은 수가 특히 현재의 최신 기술을 사용하여 수득된 세포와 비교할 때 카테고리 A로 분류된다는 것을 확인하였다.
안정성에 대한 지표 데이터는 등급 A로 분류되는 콜로니의 생성이다. 이러한 분석 및 분류에는 관련 세포 콜로니의 시각적 관찰 (현미경 관찰 포함)이 포함되며, 특히 자발적 분화를 검사하기 위해 콜로니의 경계를 살펴보았다. 분화된 세포는 덜 조밀하게 밀집되기 때문에, 이는 콜로니의 가장자리가 더 분산된다. 깨끗한 가장자리 또는 경계를 가진 콜로니는 등급 A로 배치되고, 만능성 표현형을 유지하고 있기 때문에 더 안정한 것으로 정의된다. 만능성 상태가 안정하지 않은 세포는 자발적으로 분화한다. 따라서, 육안 검사를 통해 콜로니에 있는 세포의 안정성이 결정되도록 한다.
자발적 분화는 분화에 대한 마커 또는 만능성에 대한 마커의 존재를 사용하여 결정될 수도 있다. 예를 들어, SSEA-1은 만능성 상태로부터 매우 초기 분화/종료의 마커이고, TRA-1-60 및 TRA-1-81은 인간의 만능성 마커이다. 콜로니를 추출하고, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 분석할 수 있다. 상기 세포는 배양물로부터 분리되고, 개별 세포를 특정 세포 마커 (즉, SSEA-1 또는 TRA-18-1)에 대한 형광단-접합된 항체를 사용하여 표지화한다. 그 다음에 상기 세포는 형광단으로 표지되었는지 여부에 따라 분리된다. 생 세포에서 FACS를 수행하고, 분류 후 배양을 계속할 수 있다.
추가로, 알칼리 포스파타제 (alkaline phosphatase: AP) 활성은 만능성 상태와 관련이 있고, 개별 세포 또는 세포 콜로니에 적용될 수 있는 비색 기질 분석 (colorimetric substrate assay)을 사용하여 정량화될 수 있다. AP 활성에 대해 세포를 염색하고, 콜로니 중의 세포가 만능성 인지를 시각적으로 결정할 수 있다. 이러한 염색은 세포를 플레이트에서 검사할 수 있을 만큼 민감하다. 또한, 정량적 결과를 제공하기 위해 콜로니에서 AP 염색 수준을 결정하는 기술을 사용할 수 있다. 이러한 정량적 데이터를 통해 방법들 간 비교가 가능하다. 추가 확인이 필요한 경우, AP는 당업자가 콜로니의 등급을 매길 수 있도록 할 수 있다.
이들은 만능성 줄기세포 콜로니의 안정성을 결정할 수 있는 방법의 모든 예이다.
그러므로 본 발명은 닫힌 선형 DNA 벡터로 유도된 안정한 만능성 줄기세포 집단, 특히 EBNA1 또는 이의 기능적 변이체 또는 유도체를 함유하지 않는 닫힌 선형 DNA 벡터로 유도된 안정한 만능성 줄기세포 집단을 포함한다. 바람직하게, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 또한 OriP 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 유도체가 결여되어 있다. 선택적으로, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터(들)는 염색체 스캐폴드 부착을위한 유전자가 결여되어 있다. 추가로 또는 대안으로서, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 p53의 억제를 위한 서열이 결여되어 있을 수 있다.
본 발명의 안정한 세포 또는 재프로그래밍된 세포는 다른 재프로그래밍 방법의 일반적인 문제인 자발적 분화를 겪을 가능성이 적다. 실제로, 실시예에서, 닫힌 선형 DNA에 의해 코딩된 재프로그래밍 벡터를 사용하여 재프로그래밍된 세포는 표준 벡터에 의해 발현된 것보다 더 안정한 것을 보여주었다 (도 5). 재프로그래밍에서, 세포의 만능성이 소실되고 분화된 주변 세포에서 콜로니가 일반적으로 관찰된다. 이 문제를 해결하기 위해, 일반적으로 세포를 콜로니에서 기계적으로 절단한다. 본 발명자들은 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하여 재프로그래밍된 세포가 주변에서 분화되지 않았고 절제될 필요가 없음을 관찰하였다. 보다 많은 콜로니가 등급 A로 분류되었다. 닫힌 선형 DNA 벡터에 의해 발현되는 재프로그래밍 인자를 사용하여 생성된 iPS 세포의 안정성은 다양한 계대 횟수 (즉, 계대 10, 15 등)에서 FACsTM (fluorescence activated cell sorting)를 사용하여 확인될 수 있다. 상기 세포 분류를 가능하게 하기 위해 초기 분화 마커 및/또는 만능성 마커를 사용하여 세포를 조사할 수 있다. 안정한 iPS 세포는 전자의 마커가 거의 없는 경우, 후자의 마커를 더 많이 가질 것이다. 이상적으로는, 본 발명의 방법에 따라 유도된 iPSC는 세포 표면 마커 SSEA1의 발현이 낮거나 전혀 없을 것이고, 세포 표면 마커 SSEA3, TRA-1-60 또는 TRA-1-81을 그의 표면에서 발현할 것이다.
FACS 분석을 사용하여 안정성을 결정하는 경우, 세포 샘플을 평가할 때 최적의 게이팅 전략을 사용하는 것이 중요할 것이다. 당업자는 적절한 게이팅 전략을 결정할 때 데브리스 (debris)를 배제하고, 적절한 음성 대조군을 포함하며, 비-생존 (non-viable) 세포를 배제하기 위해, 적절한 경우 공유 마커로 염색하고, 적절한 형광단 분석 플롯을 세팅하는, 고려해야 할 사항을 알고 있을 것이다. 수득되는 결과는 게이팅 전략의 성공 여부에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 세포는 바람직하게는 이들의 생성을 유도하는데 사용되는 닫힌 선형 DNA 벡터(들)가 결여되어 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 보다 유전적으로 및 표현형적으로 안정하고 안전한 iPSC 집단을 유도하기 때문에, 그러므로 이들은 임상적으로 및/또는 치료적으로 사용될 가능성이 더 높고, 이러한 세포를 수득하기 위해 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하는 것은 신규한 것이다. 그러므로 본 발명은 추가로 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터를 포함하는 치료적으로 허용 가능한 유도 만능성 줄기세포를 제조하기 위한 조성물에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 포함한다.
도 1: 닫힌 선형 DNA (도면에서 dbDNA로 표시됨) 재프로그래밍 구조체의 내용물을 설명하는 벡터 맵 (Vector maps). 구조체(1)는 2개의 이식유전자 L-myc 및 LIN28을 포함하는 dbDNA-hUL을 나타낸다. 구조체(2)는 dbDNA-OCT3/4이고, 상기 닫힌 선형 DNA 구조체 내에 shp53이 포함되지 않는다는 점에서 OriP-EBNA1 이식유전자와 다르다. 마지막으로, 구조체(3)는 2개의 이식유전자 SOX2 및 KLF4를 포함하는 dbDNA-hSK를 나타낸다. 그러므로 실시예에서 사용된 닫힌 선형 DNA 시스템은 재프로그래밍을 유도하는데 사용될 수 있는 5개의 이식유전자로 구성된 3개의 벡터 시스템이다.
도 2a: 닫힌 선형 DNA 또는 닫힌 선형 DNA가 유래되는 플라스미드로 형질감염된 세포로부터의 녹색 형광 단백질 (Green fluorescent protein: GFP)의 발현에 대한 MFI (median fluorescence intensity) 값을 보여주는 플롯: dbDNA-eGFP 또는 proTLx 플라스미드-eGFP. MFI 값은 6개의 시점에 걸쳐 발현 세포로부터 수집되었다. 상기 MFI 값은 GFP 발현의 강도에 대한 표시를 제공하므로, GFP를 발현하는 세포 수와 발현 강도에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
도 2b: 닫힌 선형 DNA (dbDNA), 닫힌 선형 DNA가 유래되는 플라스미드 (proTLx) 또는 OriP/EBNA1이 추가된 proTLx 중 하나로 세포를 형질감염시킨 실험에서 GFP 분해 키네틱스를 보여주는 플롯. 형질감염 후 20일까지 6개의 시점에서 발현 세포로부터 측정을 수행하였다.
도 3 (14일, 15일 및 18일 모두에서 A 및 B): 사진. 재프로그래밍 중 여러 시점에 걸친 초기 콜로니 발달의 예. 섬유모세포는 닫힌 선형 DNA (dbDNA) 및 OriP-EBNA1 재프로그래밍 벡터로 뉴클레오펙션되었다. A) 닫힌 선형 DNA 형질감염된 세포 및 14일 내지 18일 사이의 초기 콜로니 형성을 나타낸다. B) OriP-EBNA1 형질감염된 세포 및 마찬가지로 14일 내지 18일 사이의 초기 콜로니 형성을 나타낸다. 이미지는 명시된 기간 동안 동일한 실험을 나타낸다.
도 4: 사진. 이들 이미지는 닫힌 선형 DNA 또는 OriP-EBNA1을 가진 플라스미드에 의한 형질감염으로 생성된 초기 iPS 콜로니를 나타낸다. 도시된 세포는 초기 재프로그래밍 플라스크로부터 계대 이후의 모든 계대 1 세포이다.
도 5: CLN3 바텐병 (Batten disease) 환자로부터 채취하고 닫힌 선형 DNA로 형질감염된 진피 섬유모세포로부터 생성된 계대 16 iPS 세포. 상기 세포는 이미 분화를 겪었기 때문에 OriP-EBNA1 형질감염을 통해 수득된 세포 사진을 이용할 수 없다. 따라서, 닫힌 선형 DNA (dbDNA-iPSC) 기반 재프로그래밍 인자로 형질감염된 세포는 OriP/EBNA1을 보유하는 플라스미드에서 동일한 인자로 형질감염된 세포보다 훨씬 더 안정하고 더 양호한 만능성을 유지하였다.
도 6 (A 내지 J): 사진. CLN3 바텐병 환자로부터 채취하고 닫힌 선형 DNA로 형질감염된 진피 섬유모세포로부터 생성된 iPS 세포에서 만능성 마커에 대한 면역세포화학 염색 (Immunocytochemical staining: ICC), 양성 대조군 세포 사진: A) OCT4 발현을 위해 표시된 닫힌 선형 DNA 형질감염된 세포. B) SOX2 발현에 대해 표시된 닫힌 선형 DNA 형질감염된 세포. C) NANOG 발현에 대해 표시된 닫힌 선형 DNA 형질감염된 세포. D) TRA-1-81 발현에 대해 표시된 닫힌 선형 DNA 형질감염된 세포. E) OCT4 발현에 대해 표시된 OriP-EBNA1 플라스미드 형질감염된 세포. F) SOX2 발현에 대해 표시된 OriP-EBNA1 형질감염된 세포. G) TRA-1-81 발현에 대해 표시된 OriP-EBNA1 형질감염된 세포. H) OCT4에 대해 염색된 양성 대조군 피더-프리 ESC 세포. I) SOX2에 대해 염색된 양성 대조군 피더-프리 ESC 세포. J) TRA-1-81에 대해 염색된 양성 대조군 피더-프리 ESC 세포.
도 7 (A 내지 D): CLN3 바텐병 iPSC로부터 분화된 배아체 (embryoid bodies) 사진. CLN3 바텐병 환자로부터 채취하고 닫힌 선형 DNA로 형질감염된 진피 섬유모세포는 iPSc를 생성하여, 후속하여 8일 후 배아체 형성으로 분화시키고, 추가 8일 동안 후속 자연 분화하도록 하였다. A) 배아체를 형성하는 닫힌 선형 DNA로 유도된 iPSC (배율 4x). B) 배아체를 형성하는 닫힌 선형 DNA로 유도된 iPSC (배율 10x). C) 배아체를 형성한 다음 자발적 분화를 거친 닫힌 선형 DNA로 유도된 iPSC (배율 10x). D) 배아체를 형성한 다음 자발적 분화를 거친 닫힌 선형 DNA로 유도된 iPSC (배율 10x).
도 8 (A 내지 C): 닫힌 선형 DNA로 유도된 iPSC: 3개의 배엽 계통 (germ lineages)의 마커에 대해 양성 염색된 유래된 iPS 증식물 (outgrowth). A) 내배엽 계통 (endodermal lineage)에 대한 SOX17 염색. B) 중배엽 계통 (mesodermal lineages)에 대한 α-평활근. C) 신경외배엽 계통 (neurectodermal lineages)에 대한 β-III 튜불린 (tubulin). 이는 iPS 세포가 3가지 세포 타입 모두를 형성하는 능력을 보여주며, 이는 상기 세포의 만능성 능력을 나타낸다.
도 9 (A 내지 G): CLN3 바텐병 환자로부터 채취하고 닫힌 선형 DNA 또는 OriP/EBNA1 벡터로 형질감염된 진피 섬유모세포 (hDF)를 활용한 iPSC 재프로그래밍 실험 데이터. A) 개시 hDF 1일 (배율 4x). B) 닫힌 선형 DNA 벡터를 활용하여 재프로그래밍되는 세포에서 나타나는 중간엽에서 상피로의 전이의 예 (배율 10x). C) 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하여 13일차에 초기 잠재적인 콜로니 형성 (배율 20x). D) 26일차에 초기 닫힌 선형 DNA 형질감염된 공여체 세포에서 iPS 콜로니 형성 (배율 4x). E) 26일차에 초기 닫힌 선형 DNA 형질감염된 공여체 세포 iPS 콜로니 형성 (배율 20x). F) 13일차에 초기 OriP/EBNA1 형질감염된 공여체 세포에서 iPS 콜로니 형성 (배율 10x). G) 26일차에 OriP/EBNA1 형질감염된 공여체 세포로부터 초기 iPS 콜로니 형성 (배율 20x).
도 10 (A 및 B): 세포 사진. 도 10a는 음성 대조군 및 플라스미드 proTLx-K를 사용한 재프로그래밍 실험의 결과를 도시한다. 이 플라스미드는 백본이 추가된 해당 닫힌 선형 DNA 벡터의 전체 서열을 함유하고, 이중-가닥 원형 형식이다. 상기 플라스미드는 달리 명시하지 않는 한 OriP/EBNA1을 함유하지 않는다. 각 세포 타입에 대한 처음 3개의 패널은 도시된 일자의 세포 사진이다. 이 실험 중에, 단 하나의 잠재적인 콜로니를 형성하였다. 상기 단일 콜로니의 알칼리 포스파타제 생 염색 (AP)은 음성으로 판명되었으며, 이는 이들 세포가 만능성 줄기세포가 아님을 나타낸다 (마지막 패널). 그러므로 플라스미드에 제공된 닫힌 선형 DNA 벡터 서열에 존재하는 재프로그래밍 인자의 서열만으로는 세포의 재프로그래밍을 수행하기에 충분하지 않다. 도 10b는 플라스미드 proTLx-k, 닫힌 선형 DNA 및 OriP/EBNA1이 포함된 플라스미드를 사용한 재프로그래밍 실험의 비교를 나타낸다. ProTLx-k 형질감염된 세포는 완전히 재프로그래밍하지 못했고, 일부 재프로그래밍 영역은 강조 표시되었지만, 생존 가능한 콜로니가 형성되지 않았다. 이 플라스미드를 닫힌 선형 DNA로 전환하거나 또는 OriP/EBNA1을 포함함으로써, 1차 콜로니 형성을 허용하였다. 이러한 결과는 도 11에 도시된 바와 같이, 서열뿐만 아니라, 재프로그래밍에 유용한 벡터 구조에 대한 요건을 나타낸다.
도 11: 세포 사진. 이들은 닫힌 선형 DNA 및 OriP-EBNA1 벡터를 사용한 재프로그래밍 실험으로부터의 초기 결과를 나타낸다. 각 세포 타입의 처음 3개의 패널은 도시된 일자의 세포 사진이다. 알카리 포스파타제 생 염색 (AP) 결과는 양성이며, 이는 이들 세포가 만능성 줄기세포 (마지막 패널)임을 나타낸다. 그러므로 이는 닫힌 선형 DNA 벡터가 재프로그래밍을 수행하기에 충분한 재프로그래밍 인자를 발현하였음을 나타낸다.
도 12 (A 및 B): 실험 중에 형성된 iPS 세포의 진행을 나타내는 사진. 공여체 세포가 proTLx (염색체 부착 수단이 없는 플라스미드)로 형질감염된 경우, iPS 세포는 생성되지 않았다. A 열: 닫힌 선형 DNA 형질감염, B 열은 OriP/EBNA1 형질감염이다.
도 13: 다양한 공여체 세포를 사용하여 닫힌 선형 DNA 벡터에 의해 발현된 재프로그래밍 인자를 사용하여 생성된 iPS 세포. 배율은 관련이 있는 경우 표시된다. 상기 세포는 바텐병 "CLN3" (1행), "CLN7" (2행) 환자로부터 유래되거나, 또는 상기 세포는 비-질병 hDF (3행)로부터 유래된다. 세포를 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA ("dbDNA") 벡터로 형질감염시키고, 상기 세포를 배양 상태로 유지하였다. iPSC 콜로니를 형성하는 세포를 촬상하였다. 이는 여러 세포 타입에서 본 발명의 유용성을 나타낸다.
도 14a는 벡터 보유를 입증하기 위한 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 이는 형질감염된 세포에서 닫힌 선형 DNA (dbDNA) 및 OriP/EBNA1 벡터 모두의 보유를 도시하는 아가로스 겔 전기영동에 적용된 PCR 앰플리콘 (amplicons)의 사진이다. 결과는 PCR의 25 또는 35 사이클에 대해 표시된다. 상기 OriP/EBNA1 에피솜 벡터는 닫힌 선형 DNA 벡터보다 더 많은 양으로 보유된다.
도 14b는 벡터 보유를 입증하기 위한 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 35일차에 닫힌 선형 DNA 벡터 또는 에피솜 플라스미드 벡터 (OriP/EBNA1)의 양을 비교한다. 다시, 상기 에피솜 플라스미드는 닫힌 선형 DNA보다 더 많은 양으로 보유된다.
도 15는 세포가 만능성 줄기세포인지를 결정하는데 사용될 수 있는 특성을 보여주기 위해, iPSC 집단의 특성을 도시한 다이어그램이다.
도 16. 아가로스 겔 전기영동 사진. ESC 및 iPS 세포로부터 단리된 RNA (CLN3 바텐병 환자로부터 채취한 진피 섬유모세포를 사용하여 닫힌 선형 DNA 벡터에 의해 발현되는 재프로그래밍 인자를 사용하여 생성됨)를 역전사하여 만능성 유전자의 내인성 발현에 특이적인 PCR 증폭을 수행하기 전에 제1 가닥 cDNA를 생성하였다. PCR을 30 사이클 동안 수행하였다. OCT4, SOX2, LIN28, NANOG, E-카드헤린 (E-Cadherin)의 내인성 발현을 분석하였다. RN18S1을 대조군으로 사용하였다.
도 17: 40의 상대 형광 유닛 (relative fluorescence units: RFU)의 FACS 분석 역치를 갖는 OriP/EBNA1 벡터 또는 닫힌 선형 DNA를 사용하여 유도된 SSEA1 발현 iPSC 세포의 퍼센트를 보여주는 히스토그램. 이소타입 대조군에 제시된 배경 염색 (background staining)을 기반으로, SSEA-1 양성 세포를 결정하기 위해 40의 상대 형광 유닛의 역치를 사용하였고, 히스토그램 아래 면적은 퍼센트를 결정하기 위해 이들 위아래에서 계산하였다. 본 발명의 방법에 따라 유도된 세포보다 OriP/EBNA1 유도된 세포에서 더 많은 SSEA1 양성 세포가 관찰되었다.
도 18a: dbDNA (닫힌 선형 DNA) 및 OriP/EBNA1 벡터 생성 iPSC에서 만능성 관련 전사체들의 단색 히트맵 비교 (monochromatic heatmap comparison). dbDNA 벡터 또는 OriP/EBNA1 에피솜 플라스미드를 사용하여 인간 iPSC 세포주를 생성하고, 모체 정상 인간 진피 섬유모세포 세포주 및 Shef3 인간 ESC 세포주와 함께, RNA 시퀀싱을 사용하여 비교하였다. 만능성 관련 전사체들의 계층적 클러스터링은 닫힌 선형 DNA 생성 iPSC가 OriP/EBNA1을 사용하여 생성된 것보다 ESC에 더 유사하다는 것을 보여주었다. 도 18b는 동일한 색상의 히트맵이다.
도 19a: dbDNA (닫힌 선형 DNA) 및 OriP/EBNA1 벡터 생성 iPSC 간에 만능성 줄기세포 분화와 관련된 전사체들의 비교를 보여주는 단색 히트맵 비교. dbDNA 벡터 또는 OriP/EBNA1 에피솜 플라스미드를 사용하여 인간 iPSC 세포주를 생성하고, Shef3 인간 ESC 세포주를 시퀀싱하는 RNA를 사용하여 비교하였다. 초기 분화와 관련된 전사체들의 계층적 클러스터링은 닫힌 선형 DNA 생성 iPSC가 OriP/EBNA1을 사용하여 생성된 것보다 ESC에 더 유사하다는 것을 보여주었다. 도 19b는 동일한 색상의 히트맵이다.
도 20a 및 20b. RNA 시퀀싱 데이터의 히스토그램, 실시예 9. 도 20a (OriP-EBNA1 풍부 유전자의 reactome 경로 분석)는 면역계, 신호 전달, 대사작용, 단백질 대사작용, 유전자 발현 (전사), 발달 생물학, 질병, 세포외 기질 조직화, 지혈, 외부 자극에 대한 세포 반응, 소분자의 수송, 소포-매개 수송, RNA 대사작용, 세포 주기, 근육 수축, 세포-세포 전달, 신경계, 프로그램된 세포 사멸, 크로마틴 (chromatin) 조직화, 세포소기관 (organelle) 생합성 및 유지, DNA 복구, 복제, 일주기 시계 (circadian clock), DNA 복제, 미토파지 (mitophagy) 및 소화 및 흡수와 관련된 유전자를 나타낸다. 도 20b (면역계 반응 - Orip-EBNA1)는 reactome 하위-카테고리화가 인터페론 알파, 베타 및 감마 신호전달이 dbDNA (닫힌 선형 DNA) 매개 iPSC 생성과 비교할 때 OriP/EBNA1에서 가장 강력하게 과다 표현됨을 보여준다. 인터루킨 및 NF-KB 염증성 신호전달도 또한 과다 표현된다. dbDNA (닫힌 선형 DNA) 매개 iPSC 생성과 비교할 때, 선천성 면역 및 면역계의 사이토카인 신호전달은 OriP/EBNA1에서 가장 과다 표현되는 reactome이다. 닫힌 선형 DNA iPSC에 비해 OriP/EBNA1 iPSC에서 가장 유의하게 과다 표현된 전사체는 Reactome 경로 분석을 사용하여 분석되었다.
도 21 (A 내지 G). dbDNA (닫힌 선형 DNA) iPSC에 대한 OriP/EBNA1에서 인터페론 (IFN) 신호전달의 정량적 RT-PCR 비교. OriP/EBNA1 에피솜 플라스미드 또는 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하여 생성된 iPSC로부터 전체 RNA를 추출하였다. 모든 선천성 IFN 신호전달-관련 전사체는 dbDNA-iPSC에 비해 OriP/EBNA-iPSC에서 상승하였다. 조사한 마커는 하기와 같다:
21A - IRF9, 21B - IRAK1, 21C - IFI27, 21D - IRAK4, 21E - IRF7, 21F - MYD88, 및 21G - IRF1 및 상대 발현 수준이 표시되었다.
도 22 (A 및 B) dbDNA (닫힌 선형 DNA) iPSC에 대한 OriP/EBNA1에서 염증 마커의 정량적 RT-PCR 비교. OriP/EBNA1 에피솜 플라스미드 또는 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하여 생성된 iPSC로부터 전체 RNA를 추출하였다. 도 22A는 HMOX1 (산화 스트레스 마커) 및 도 22B NFKB1 (염증 마커)에 대한 데이터 모두가 닫힌 선형 (dbDNA)-iPSC에 비해 OriP/EBNA1-iPSC에서 상향 조절된다는 것을 나타낸다.
도 24 (A 내지 C): 닫힌 선형 DNA-iPSC (doggybone - 닫힌 선형 DNA)와 비교하여 OriP/EBNA1-iPSC에서 분화 마커의 상향조절을 나타내는 플롯이다. 정량적 RT-PCR을 사용하여 초기 분화의 마커로서 초기 내배엽 및 중배엽 형성을 나타내는 전사체를 평가하였다. 모든 경우에 정상 상태 (steady state) 조건하에 배양된 닫힌 선형 DNA-iPSC와 비교하여 OriP/EBNA1-iPSC에서 초기 분화의 마커가 증가하였다. 또한, dbDNA-iPSC와 비교하여 OriP/EBNA1-iPSC에서, 세포주기 억제제인 CDKN1A (p21)의 발현이 증가하였다. CDKN1A-매개 증식 억제는 만능성 줄기세포의 분화에 대한 추가 지표이다. 도 24A는 구스코이드 (goosecoid), 도 24B는 SOX17 및 도 24C는 CDKN1A를 나타낸다. 재프로그래밍 단계의 벡터 타입에 대해 상대 발현 값을 플로팅하였다.
본 발명자들은 세포 분열 중에 세포 염색체에 테더링 및/또는 이와 분리하는 수단 또는 세포에서 벡터의 유지를 연장하는 수단이 결여된 일시적인 벡터를 사용하여 유도 만능성 줄기세포를 생성하는 방법을 개발하였다. 이는 잠재적인 종양성 EBNA1 또는 다른 발현된 유전자의 사용을 피할 수 있다는 점에서 많은 이점을 갖는다. 또한, 코딩된 재프로그래밍 인자의 발현은 충분하면서도 일시적이기 때문에, 이는 또한 발현이 해로울 수 있는 재프로그래밍 과정 이후에 유도된 세포가 이러한 인자에 장기간 노출되지 않도록 보장한다. 일부 재프로그래밍 인자는 자체적으로 알려진 종양유전자 (oncogenes), 예를 들어 c-Myc이기 때문에 유익할 수 있다. 따라서, 이러한 인자의 시간-제한 발현이 바람직하다. 본 발명자들이 개발한 용도 및 방법은 만능성을 유도하는데 필요한 최소한의 시간 동안만 필요한 인자가 발현되도록 한 다음에, 벡터의 소실과 함께 세포가 증식함에 따라 발현이 자연적으로 소실되는 것을 보장한다. 본 발명의 벡터는 세포에서 복제할 수 없다. 이 벡터의 사용은 안정한 만능성 줄기세포 콜로니의 생성을 유도하는 것으로 밝혀졌고, 이러한 세포는 에피솜 벡터를 제거하기 위해 더 오래 배양되어야 하기 때문에, 표준 OriP/EBNA1 벡터로 제조된 것보다 전에 사용할 수 있다.
만능성은 만능성 세포에 특이적인 신호전달 분자 및 유전자 네트워크의 복잡한 시스템에 의해 지원된다. 만능성 유지와 가장 관련이 높은 유전자는 전사 인자를 코딩하는 Oct4, Sox2 및 NANOG 유전자이다. 유도 만능성 줄기세포는 광범위한 특징에서 ESC와 매우 유사하다. 이들은 유사한 형태 및 성장 거동을 가지고 있고, 성장 인자 및 신호전달 분자와 동일하게 민감하다. ESC와 마찬가지로, iPSC는 모두 3가지 주요 배엽 (신경외배엽, 중배엽 및 내배엽)의 유도체로 인 비트로 분화할 수 있다. NANOG 발현과 같은 만능성 유전자 발현은 후기 단계에서만 유도되고, 충실한 재프로그래밍을 나타낸다. 그러므로 NANOG 발현은 예를 들어 만능성의 지표로 사용될 수 있다.
따라서, 다양한 체세포 타입으로부터 만능성 줄기세포를 제조하면서 세포를 "풋프린트가 없는" (재프로그래밍 인자를 발현하는 유전자가 없음) 상태로 남겨 두는 우수한 방법이 이러한 세포의 치료적 사용을 원하는 사람들에게 큰 관심을 끌고 있다. 이상적으로, 체세포를 개인으로부터 수확하여, 만능성 상태로 유도하고, 필요에 따라 변형시키고, (필요한 경우) 필요한 세포 타입으로 분화하고, 동일한 개인에게 다시 도입할 수 있다. 따라서, 인간 및 동물 치료법은 필요한 경우 iPSC로의 전환 및 후속 분화 후에 세포의 자가 이식을 고려한다. 제대혈과 같은 출처로부터 공여체 또는 원래 세포를 수확하는 경우 동종이식 (allogenic transplantation)이 적절할 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 따라서 유도 만능성 줄기세포를 제조하기 위한 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터의 용도에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 하나 이상 또는 둘 이상의 닫힌 선형 DNA 벡터가 필요할 수 있다.
상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 세포, 바람직하게는 체세포, 가장 바람직하게는 성숙한 체세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 형질감염은 임의의 적절한 수단에 의해 수행될 수 있으며, 이들 중 일부는 본원에 기재되어 있다.
형질감염 후에, 만능성 줄기세포로의 재프로그래밍을 돕는 것으로 알려진 임의의 적절한 조건을 사용하여 세포를 배양한다; 이러한 방법들 중 일부는 본원에 기재되어 있다.
상기 용도는 하나 이상의 재프로그래밍 인자들을 코딩하는 하나의 닫힌 선형 DNA 벡터 종일 수 있거나, 각각이 적어도 하나의 상이한 재프로그래밍 인자를 코딩하는 2개 이상의 닫힌 선형 DNA 벡터일 수 있다. 단독으로 또는 조합하여, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 만능성을 유도하는데 필요한 재프로그래밍 인자를 세포에 공급할 수 있다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 필요한 재프로그래밍 인자의 일부를 공급하고, 나머지 필요한 인자는 세포에서 발현된 재프로그래밍 인자의 효과를 "충전 (top up)"하기 위해 세포에 외인적으로 공급될 수 있다. 이 경우, 상기 닫힌 선형 DNA는 만능성을 유도하는데 필요한 재프로그래밍 인자의 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 이상을 제공할 수 있다. 나머지 비율은 예를 들어 세포의 배양 배지에 직접 부가되는 인자에 의해 외인적으로 공급될 수 있다.
하나 이상의 재프로그래밍 인자를 다른 것보다 더 많은 양으로 발현해야 할 수 있으므로, 특정 재프로그래밍 인자는 2개 이상의 닫힌 선형 DNA 분자에서 코딩될 수 있거나, 또는 하나의 닫힌 선형 DNA 벡터는 2개의 재프로그래밍 인자 카피를 포함하여 다른 인자에 비해 그 인자의 발현을 증가시킬 수 있다. 대안으로서, 각 재프로그래밍 인자에 대해 독립적인 프로모터를 사용하여 발현을 조절할 수 있다. 추가의 대안으로서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 상류에 있는 하나 이상의 IRES 서열 (내부 리보솜 진입 부위)을 사용하여 발현을 조절할 수 있다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 포함하는 하나 이상의 닫힌 선형 벡터(들)를 체세포 집단에 도입하는 단계, 및 상기 하나 이상의 재프로그래밍 인자(들)가 발현되도록 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 유도 만능성 줄기세포 (iPSC)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 세포는 만능 특성이 관찰될 때까지 배양될 수 있고, 필요에 따라 추가 증식을 위해 이러한 콜로니가 단리될 수 있다. 배양 조건은 당업자에게 알려져 있으며, 일부 예시되는 방법이 본원에서 논의된다. 만능성이 유도될 수 있도록 충분한 시간동안 상기 세포를 배양한다.
상기 닫힌 선형 DNA는 형질감염을 통해 체세포에 도입될 수 있다. 임의의 적절한 형질감염 수단이 사용될 수 있고; 이 중 일부는 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 임의의 부분에 필요한 재프로그래밍 인자는 모두 하나의 닫힌 선형 DNA 벡터에 코딩될 수 있거나, 또는 요구되는 재프로그래밍 인자는 2개 이상의 닫힌 선형 DNA 벡터 중에서 분할될 수 있다. 임의의 수의 닫힌 선형 DNA 벡터가 사용될 수 있다. 결과적으로 iPSC를 유도하기 위해, 하나 이상의 상이한 닫힌 선형 벡터가 본 발명의 방법 또는 용도에 사용될 수 있다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 각각 하나 이상의 상이한 재프로그래밍 인자를 발현할 수 있다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 각각 2, 3, 4, 5 또는 6개의 재프로그래밍 인자들과 같은 2개 이상의 재프로그래밍 인자들을 발현할 수 있다.
본 발명의 임의의 양상의 닫힌 선형 DNA는 바람직하게는 재프로그래밍 인자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 또는 인핸서 (enhancer)를 포함한다. 필요에 따라 하나 이상의 프로모터 또는 인핸서를 사용할 수 있다. 각각은 다른 인자에 연결될 수 있다.
"프로모터 (promoter)"는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터는 유도성 프로모터 (프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우), 억제성 프로모터 (프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 억제되는 경우) 및 구성적 프로모터를 포함할 수 있다. 용어 "프로모터" 또는 "인핸서"는 전장 프로모터 영역 및 이들 영역의 기능적 (예: 전사 또는 번역 제어) 세그먼트를 포함하는 것으로 의도된다.
"작동 가능하게 연결된 (operably linked)"은 기재된 성분들이 이들의 일반적인 기능을 수행하도록 구성되는 요소들의 배열을 지칭한다. 따라서, 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 주어진 프로모터는 적절한 효소가 존재할 때 그 서열을 발현시킬 수 있다. 상기 프로모터는 그 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 상기 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개재된 비-번역 전사된 서열은 프로모터 서열과 핵산 서열 사이에 존재할 수 있고, 상기 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 전사 복합체에 의한 프로모터 요소의 인식 시에 관심 DNA 서열의 전사를 개시할 수 있는, 프로모터 요소와 관심 DNA 서열 (예: 재프로그래밍 인자)의 임의의 간격 또는 방향을 포함하는 것으로 의도된다. 실시예에서, CAG 합성 프로모터 융합 서열이 사용된다. CAG는 효율적인 발현을 위한 조합된 융합인, CMV 인핸서, 닭 (chicken) 베타-액틴 프로모터 및 토끼 (rabbit) 베타-글로빈 스플라이스 수용체 부위를 나타낸다. 따라서, 이 융합에서, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus: CMV) 인핸서는 닭의 베타-액틴 프로모터의 상류에서 사용되고, 이는 닭의 베타-액틴 유전자의 제1 엑손 및 제1 인트론과 결합한다. 이는 실시예에서 사용하기에 특히 유용한 서열이지만, 다른 적절한 서열이 사용될 수 있다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 바람직하게는 숙주/공여체 세포의 분열 중에 복제 및 분할 능력이 결여된다. 따라서, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터(들)는 염색체 스캐폴드 부착을 위한 임의의 기능적 서열이 결여될 수 있다. 그러므로 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 바람직하게는 EBNA1, 또는 이의 기능적 유도체, 변이체 또는 변형에 대한 서열이 결여된다. EBNA1의 이러한 기능적 유도체, 변이체 또는 변형된 버전은 EBNA1의 천연 서열에 대해 90% 이상, 바람직하게는 95% 상동성일 수 있다. EBNA1은 AT-풍부 염색체 영역에 결합하는 LR1 및 LR2인 N-말단 후크 모티프를 통해 숙주 세포 DNA에 벡터를 부착시킬 수 있다. 상기 닫힌 선형 DNA는 또한 또는 대안으로서, OriP에 대한 서열이 결여될 수 있다. OriP는 인간 세포에서 벡터의 복제 및 안정된 유지를 지원하는 Epstein-Barr 바이러스 (EBV) 염색체의 1.7-kb 영역이다. OriP는 DS 및 FR이라는 2가지 필수 성분들을 함유하고, 이들 모두는 EBV-코딩된 단백질인 EBNA-1에 대한 다수의 결합 부위를 함유한다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 바람직하게는 OriP 서열 또는 이의 기능적 유도체가 결여되어 있다. 이러한 OriP의 기능적 유도체 또는 변형된 버전은 OriP에 대한 천연 서열에 대해 90% 이상, 바람직하게는 95% 상동성일 수 있다. 본원에서 사용된 기능적이란 상기 변이체 또는 유도체가 에피솜 벡터의 복제 및 분할에서 변형되지 않은 버전과 동일한 방식으로 작동하는 것을 의미한다. OriP 서열은 또한 유전자 발현의 인핸서로 기능할 수 있다. 크로마틴에 테더링하는 능력은 유지되지 않으면서 유전자 발현을 증진시키는 능력을 보유하는 OriP 서열의 단편 또는 일부를 사용할 수 있다. 상기 OriP 서열의 이러한 단편 또는 부분은 세포 분열 동안 서열의 보유와 관련되는 한 OriP의 기능적 유도체인 것으로 간주되지 않을 것이다.
염색체 스캐폴드 부착으로 작용할 수 있는 다른 유전자 또는 서열은 스캐폴드/매트릭스 부착 영역 (S/MAR)을 포함한다. 부착 능력을 보유하는 이러한 서열 또는 기능적 상동체 또는 유도체는 또한 상기 닫힌 선형 DNA 벡터에 부재할 수 있다.
그러나 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 단순히 기능적인 OriP/EBNA1 서열이 결여되고, 그러므로 세포 분열 중에 공여체/숙주 세포의 염색체에 테더링될 수 없는 것이 바람직하다.
닫힌 선형 DNA 벡터는 원하는 기능 및 구조에 필요한 서열 (즉, 이들이 전달하는 서열 및 이중-가닥 선형 부분의 말단에서 닫힌 말단, 예를 들어 십자형, 헤어핀 또는 헤어핀 루프를 코딩하는 서열)만 포함하는, 최소 벡터로 디자인될 수 있다. 닫힌 선형 DNA 벡터로부터 제외될 수 있는 불필요한 또는 외래 서열 (또한 박테리아 또는 바이러스 서열로도 기재됨)은 박테리아 복제 기원, 박테리아 선택 마커 (예: 항생제 내성 유전자) 및 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 서열을 포함하지 않음으로써, 이는 외래 유전자 물질을 함유하지 않는 "최소" 벡터를 형성시킬 수 있다. 이는 벡터의 성능에 영향을 미치거나 불필요한 부작용을 유발할 수 있는 유전자 물질 (즉, 항생제 내성 유전자)이 도입되지 않기 때문에, 상기 세포를 치료 목적으로 사용하려는 경우 선호될 수 있다.
또한, 프로모터, 인핸서 또는 종결인자 서열 이외에, 포유동물 바이러스로부터 유래된 서열을 생략하는 것이 바람직할 수 있다. 포유동물 바이러스 서열은 벡터 DNA의 숙주 세포 DNA로의 통합을 촉진하는 능력을 가질 수 있다. 그러므로 상기 닫힌 선형 DNA에는 통합을 촉진하는 바이러스 서열이 존재하지 않을 수 있다. 이러한 서열은 임의의 포유동물 바이러스로부터 유래할 수 있지만, 특히 레트로바이러스와 같이, 숙주 DNA 내에 통합될 가능성이 있는 바이러스로부터 유래한다. 이들의 DNA를 통합할 수 있는 능력을 가진 다른 바이러스 부류는 파보비리데 (Parvoviridae) (인간 파보바이러스 및 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated virus: AAV) 포함), 헤파드나비리데 (Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스 포함), 헤르페스비리데 (Herpesviridae) (헤르페스 바이러스), 파필로마비리데 (Papillomaviridae) (인간 파필로마바이러스 (papillomavirus) 포함) 및 폴리오마비리데 (Polyomaviridae) (시미안 바이러스 40 (Simian virus 40) 포함)를 포함한다. 통합을 촉진하는 요소는 인테그라제 (integrase) 효소 또는 역-말단 반복부에서 Rep-결합 부위와 같은 서열을 포함할 수 있다.
실시예에서, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터(들)는 p53의 억제를 위한 임의의 수단이 결여될 수 있음이 밝혀졌다. 종양 단백질 53 (p53) 유전자의 녹아웃 (knockout)은 재프로그래밍을 촉진하는 것으로 보고되었지만, 게놈 불안정성과도 관련이 있다. 세포-주기 조절인자 p53은 중요한 보호 기전 (safeguard mechanism)으로 작용하여, 세포가 DNA 손상 후 제어되지 않은 증식을 겪는 것을 막는다. 또한, p53은 재프로그래밍 과정에 대한 장벽으로서 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. p53의 억제는 재프로그래밍 효율에 유리하지만, 게놈 불안정성을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 본 출원의 발명자들은 닫힌 선형 DNA 벡터가 p53의 억제를 유발하는 서열 없이도 재프로그래밍을 일으킬 수 있음을 발견하였다. p53의 녹다운 (knockdown)은 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)의 발현을 포함하는 많은 수단에 의해 달성될 수 있다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 일반적으로 sip53 및 shp53으로 표시되는 p53에 대해 표적화된 siRNA 및 shRNA가 모두가 결여된 것이 바람직하다.
하나 이상의 닫힌 선형 DNA 벡터(들)에 의해 발현되는 재프로그래밍 인자는 체세포를 iPSC로 재프로그래밍하기 위해 필요한 임의의 재프로그래밍 인자일 수 있다. 상기 재프로그래밍 벡터는 자연적, 변형 또는 합성 인자일 수 있다. 상기 재프로그래밍 인자는 닫힌 선형 DNA 벡터로부터 발현된 폴리펩티드, 글리코펩티드 또는 단백질일 수 있다. 이러한 재프로그래밍 인자는 전사 인자를 포함한다. 전사 인자는 특정 DNA 서열에 결합하여, DNA로부터 메신저 RNA로 유전자 정보의 전사 속도를 제어하는 단백질이다. 대안으로서, 상기 재프로그래밍 인자는 닫힌 선형 데옥시리보핵산 (DNA)으로부터 발현되는 기능성 리보핵산 (RNA) 분자일 수 있다. 이러한 기능적 RNA 분자는 마이크로RNA (miRNA - 메신저 RNA에서 상보적 서열에 결합하고 유전자의 발현을 차단하는 짧은 RNA 분자)를 포함한다. 배아 줄기세포-특이적 마이크로RNA 분자 (예: miR-291, miR-294 및 miR-295)는 c-Myc/L-Myc의 하류에서 작용하여 유도 만능성의 효율을 증진시킨다. 발현될 수 있는 다른 타입의 RNA는 리보자임, 압타머 및 작은 간섭 RNA (siRNA)를 포함한다. 또한, 상기 재프로그래밍 인자는 긴 비-코딩 RNA일 수 있다. 이들은 길이가 200개의 뉴클레오티드보다 길고, 펩티드를 코딩하지 않으며, 조절 기능을 가지고 있다. 긴 비-코딩 RNA는 세포 분화 및 발달에 중요하다. 이들은 이전에 HOTAIR RNA 및 Xist RNA를 포함한 긴 비-코딩 DNA의 예인 유전자 클러스터를 차단할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
하나 이상의 재프로그래밍 인자는 전사 인자일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상은 Yamanaka 인자일 수 있다; 이는 전사 인자 Myc, Oct3/4, Sox2 및 Klf4를 포함한다. 이들은 Yamanaka 등 (Takahashi, K; Yamanaka, S (2006). "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors". Cell. 126 (4): 663-76. doi:10.1016/j.cell.2006.07.024)에 의해 입증된 바와 같이, 성숙한 세포를 만능성으로 유도할 수 있는 처음 4가지 인자가 밝혀졌다.
그러나 그 이후로 추가 연구를 통해 다른 재프로그래밍 벡터들의 조합이 사용될 수 있음이 입증되었다. 예를 들어, OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28의 조합이 체세포에서 만능성을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
그러므로 전사 인자들의 임의의 조합은 본 발명의 임의의 양상에 따른 재프로그래밍 인자로서 사용될 수 있다. 임의의 전사 인자는 또한 siRNA, miRNA, 긴 비-코딩 RNA, 리보자임 및/또는 압타머와 같은 다른 재프로그래밍 인자들과 조합될 수 있다.
Oct-3/4 및 Sox 유전자 패밀리의 소정의 산물 (Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15)은 유도 과정에 관여된 전사 조절인자로 확인되었다.
그러나 Klf 패밀리 (Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 패밀리 (c-myc, L-myc 및 N-myc), NANOG 및 LIN28의 소정의 구성원들을 포함한 추가의 유전자들이 동정되어 유도 효율을 증가시켰다.
Oct-3/4 (Pou5f1)는 8량체 (octamer) 전사 인자들의 패밀리의 구성원이고, 만능성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 따라서, Oct-3/4의 존재는 배아 줄기세포의 만능성 및 분화 잠재력을 유도한다.
전사 인자 중 Sox 패밀리는 Oct-3/4와 유사한 방식으로 만능성을 유지하는 것과 관련이 있다. Sox2가 유도 (Yamanaka)에 사용된 초기 유전자였지만, Sox 패밀리의 다른 전사 인자가 유도 과정에서 작동하는 것으로 밝혀졌다. Sox1, Sox3, Sox15 및 Sox18은 효율이 떨어지지만 만능성 세포를 생성한다.
전사 인자 중 Klf 패밀리의 Klf4는 처음에 Yamanaka에 의해 인간 만능성 세포의 생성을 위한 인자로 동정되었다. 그러나 다른 연구에서는 Klf4가 인간 만능성 세포의 생성에 불필요하다는 것에 주목하였다. Klf2 및 Klf4는 만능성 세포를 생성할 수 있는 인자인 것으로 밝혀졌고, 관련 유전자 Klf1 및 Klf5는 유사한 효과를 가질 수 있다.
전사 인자 중 Myc 패밀리는 암과 관련된 프로토-종양유전자 (proto-oncogenes)이다. Yamanaka는 c-myc가 인간 만능성 세포의 생성과 관련된 인자임을 입증하였다. 만능성 줄기세포의 유도에 "myc" 패밀리의 유전자를 사용하는 것은 이러한 세포를 임상 요법으로 최종적으로 사용하는데 문제가 된다. N-myc 및 L-myc는 c-myc 대신에 유사한 효율로 유도하기 위해 동정되었다.
배아 줄기세포에서, NANOG는 Oct-3/4 및 Sox2와 함께, 만능성을 촉진하는데 필요하다. 인자들 중 하나로서 NANOG를 사용하여 만능성 줄기세포를 생성하는 것이 가능하다.
LIN28은 배아 줄기세포에서 발현되는 mRNA 결합 단백질이다. LIN28은 때때로 OCT4, SOX2 및 NANOG와 조합하여 만능성 줄기세포 생성 인자라는 것이 입증되었다.
Glis1은 c-Myc를 대체하여, 만능성을 유도하는데 Oct-3/4, Sox2 및 Klf4와 함께 사용될 수 있는 전사 인자이다.
따라서, 본 발명에 따르면, 하나 이상의 재프로그래밍 인자는 하기의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다:
Oct 3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox18, Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, c-myc, L-myc, 및 N-myc, NANOG, 및 LIN28.
현재, 임의의 출처로부터 전체적으로 세포에 공급되는 재프로그래밍 인자의 최소 개수는 4개인 것으로 당 분야에서 고려되었다. 이 최소 수는 재프로그래밍을 촉진하기 위해 필요한 것으로 나타났다. 그러나 미래에는 2개, 3개 또는 그 이상의 재프로그래밍 인자들을 사용하여 재프로그래밍을 촉진할 수 있다.
코딩된 재프로그래밍 벡터는 본원에 기재된 임의의 서열의 기능적 유도체 또는 변이체일 수 있다. 이러한 기능적 유도체 또는 변이체는 재프로그래밍에서 동일한 기능적 효과를 갖지만, 야생형 서열과 비교할 때 변경된 서열을 갖는다. 상기 기능적 유도체 또는 변이체는 야생형 서열과 적어도 90% 동일, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
특정 일 구체예에서, 상기 닫힌 선형 DNA는 세포에 대한 필요한 재프로그래밍 벡터의 비율의 발현을 제공하고; 배양 중에 세포에 공급되는 외래로 공급된 재프로그래밍 인자가 만능성에 도달하기 위해서 필요하다. 그러므로 혼성 접근법이 고려된다. 이러한 외인성 성장 인자는 전사 인자의 작용을 모방하는 작은 화학물질일 수 있으며, BIX-01294에 의한 히스톤 메틸 트란스퍼라제 (HMT) 억제, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제 발프로산을 포함한다. 이러한 소분자 화합물은 재프로그래밍 인자를 보완할 수 있다. 그러나 임의의 혼성 접근법에서, 요구되는 재프로그래밍 인자의 적어도 50%는 상기 닫힌 선형 DNA 벡터의 발현에 의해 제공될 것이다. 이는 예를 들어 4개의 필수 인자들 중 적어도 2개가 상기 닫힌 선형 DNA 벡터에 제공될 것이라는 것을 의미한다. 필요한 재프로그래밍 인자들의 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95%가 상기 닫힌 선형 DNA 벡터를 통해 공급되는 것이 바람직할 수 있다.
상기 닫힌 선형 DNA 벡터(들)는 유도 만능성 줄기세포를 생성하기 위해 체세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 체세포는 줄기세포 또는 성숙한 세포일 수 있다. 이들 세포는 "공여체 세포"로 지칭될 수 있다. 성체 줄기세포는 몸 전체에서 발견되는 미분화 세포이다. 이들은 세포 분열에 의해 증식하여 죽어가는 세포에 보충되고 손상된 조직을 재생시킬 수 있다. 성체 또는 체세포 줄기세포는 뇌, 골수, 말초혈, 혈관, 골격근, 피부, 치아, 심장, 장, 간, 난소 상피 및 고환을 포함한 많은 장기 및 조직에서 확인되었다. 이들은 "줄기세포 틈새 (stem cell niche)"라고 불리는 각 조직의 특정 영역에 존재하는 것으로 사료되며, 해당 조직에만 세포 공급원을 제공한다. 성체 줄기세포의 타입은 조혈 줄기세포 (모든 타입의 혈액 세포를 유도함), 중간엽 줄기세포 (예를 들어 골수에 있는 많은 조직에 존재), 신경 줄기세포 (뇌 및 신경계), 상피 줄기세포 (소화관), 피부 줄기세포 (표피 기저층 및 모낭 기저)를 포함한다. 성체 줄기세포는 일단 체외로 번식하는데 문제가 있을 수 있다.
성숙한 세포를 공여체 세포로 수확하는 경우, 이는 신체로부터 임의의 조직, 장기, 체액 또는 배설물로부터 유래될 수 있다. 따라서, 상기 세포는 뼈, 치아, 치조직 (dental tissue), 심장, 폐, 뇌, 췌장, 간, 신장, 방광, 자궁, 장, 위, 담낭, 근육, 지방, 고환, 점막, 눈, 포피 (foreskin), 전립선, 비장 또는 임의의 다른 조직을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 조직 또는 장기로부터 피부 세포, 모낭 세포, 혈액 세포, 소변에서 추출된 세포, 생검에 의해 수집된 세포 또는 유사물일 수 있다.
세포 요법의 임상적 적용은 환자로부터의 조직 수집이 가능한 최소한으로 침습적이어야 하며, 생검으로 인간 진피 섬유모세포를 채취하면 환자의 몸에 작은 흉터가 남는다. 만능성 줄기세포가 최근에 뽑은 모발로부터 유도된 인간 각질세포로부터 생성되었다. 구강 치은 및 구강 점막 섬유모세포는 덜 침습적으로 수득될 수 있고; 또한 iPSC 생성에 대해서도 연구되었다. 소변으로 배설되는 신장 세포가 또한 유용한 세포 공급원이고, 비-침습적으로 수집될 수도 있다.
제대혈은 또한 다른 공여체 세포 공급원이다. 제대혈-유래 세포는 재프로그래밍 인자를 도입하기 전에 침습적 생검을 필요로 하지 않는다. 뱅크 (banked) 제대혈 세포는 이들의 면역학적 정보가 이미 이용 가능하기 때문에 iPSC 생성에 사용하기에 상대적으로 복잡하지 않아서, 동종 이식이 일어날 수 있다.
말초혈 세포는 또한 환자의 세포 샘플링 방법이 덜 침습적이기 때문에 매력적인 세포 공급원이다.
그러나 임의의 적절한 세포 공급원이 본 발명의 용도 및 방법을 위한 "공여체 세포"로 사용될 수 있다.
치료적, 임상적 목적을 위해, 환자로부터 세포를 생성하고, 이들 세포를 동일한 환자에게 복귀 (자가 이식)하는 것이 목표이지만, 본 발명의 용도 및 방법은 또한 한 대상의 세포를 다른 대상에게 전달하는 동종간 이식으로 확장된다.
재프로그래밍을 수행하기 위해, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터(들)가 체세포로 형질감염된다. 임의의 형질감염 방법이 사용될 수 있고, 형질감염되는 공여체 세포의 타입에 따라 달라질 수 있다.
양이온성 지질이 공여체 세포로의 DNA 전달을 촉진하는 경우 양이온성 지질 형질감염이 사용될 수 있다. 이 방법에 대한 대안은 양이온성 펩티드 및 그 유도체 (예: 폴리리신, 폴리오르니틴), 선형 또는 분지형 합성 폴리머 (예: 폴리브렌, 폴리에틸렌이민), 폴리사카라이드-기반 전달 분자 (예: 시클로덱스트린, 키토산), 천연 폴리머 (예: 히스톤, 콜라겐), 및 활성화 및 비-활성화 덴드리머를 포함한다.
전기영동 기술은 세포막에 일시적인 공극을 형성하여 전기장을 사용하여 DNA 진입을 허용하거나, DNA의 세포내이입을 촉진한다. NucleofectionTM (Lonza)은 특정 전압 및 시약을 적용하여 DNA 및 RNA와 같은 핵산을 세포로 전달할 수 있는 전기영동-기반 형질감염 방법이다.
칼슘 포스페이트 공침법 (Calcium phosphate co-precipitation)이 소정의 공여체 세포에 사용될 수 있다.
상기 형질감염된 세포는 그 다음에 상기 닫힌 선형 DNA 벡터로부터 재프로그래밍 인자의 발현을 허용하는 적절한 조건을 사용하여 배양된다. 재프로그래밍을 허용하는 조건은 일반적으로 당 분야에 알려져 있고, 임의의 적절한 조건이 선택될 수 있다. 이상적으로, 인간 치료적 용도를 위해, 수득된 세포에 어떠한 동물 (이종) 오염도 존재하지 않도록, 피더-프리 시스템에서 배양을 수행할 수 있다.
실시예에서, 0일차에 인간 진피 섬유모세포 (hDF)는 만능성 상태를 유도하는데 필요한 닫힌 선형 DNA-기반 재프로그래밍 인자들 (SOX2, OCT4, KLF4, L-Myc, LIN28)로 뉴클레오펙션되었다. 그 다음에 상기 세포를 완전 DMEM에서 단일 6-웰 상에 시딩하였다.
후속하여, 1일차에 배지를 새로 공급한 후에, 2일마다 계속 교체하였다. >90%의 융합 (confluency)에 도달하면, 그 다음에 상기 hDF를 계대하고, 플라스크로 시딩하였다. 8일차에, 세포 분리 효소를 사용하여 재프로그래밍 hDF를 분리시킨 후에, 피더층 iMEF를 함유하는 플라스크에 60,000개의 세포를 재플레이팅하였다. 24시간 후에, 상기 세포 배지를 그 다음에 완전 DMEM에서 hESC 배지로 교체하고, 2일마다 보충하였다.
닫힌 선형 DNA는 일반적으로 각 말단이 공유적으로 닫힌 이중-가닥 DNA인 것으로 이해된다. 그러므로 상기 DNA의 이중-가닥 부분은 상보적이다. 변성되면, 닫힌 선형 DNA는 단일-가닥 원을 형성할 수 있다. 상기 DNA는 선호도에 따라 십자형, 헤어핀 또는 헤어핀 루프를 포함하는 임의의 적절한 구조에 의해 각 말단이 닫힐 수 있다. 상기 닫힌 선형 DNA의 말단은 비-상보적 서열로 구성될 수 있으므로, 상기 DNA를 십자형, 헤어핀 또는 헤어핀 루프에서 단일-가닥 배열 형태로 한다. 대안으로서, 상기 서열은 상보적일 수 있다. 상기 말단은 프로텔로머라제 (protelomerase) 효소에 대한 표적 서열의 일부에 의해 형성되는 것이 바람직할 수 있다. 프로텔로머라제 표적 서열은 DNA 주형에 존재하여 프로텔로머라제의 효소적 활성을 허용하는 임의의 DNA 서열이며, 이는 DNA의 이중-가닥 부분을 절단하고, 이들을 재-연결하여, 공유적으로 닫힌 말단을 생성한다. 일반적으로, 프로텔로머라제 표적 서열은 임의의 완전한 회문 서열, 즉 2-배 회전 대칭 또는 완전한 역전 반복부를 갖는 임의의 이중-가닥 DNA 서열을 포함한다. 상기 닫힌 선형 DNA는 한쪽 또는 양쪽 말단에 프로텔로머라제 표적 서열의 일부를 가질 수 있다. 상기 프로텔로머라제 표적 서열은 각 말단에서 동일한 동족 프로텔로머라제를 가질 수 있거나, 또는 각 말단에 대해 상이한 프로텔로머라제를 필요로 할 수 있다. 다양한 프로텔로머라제 효소들의 작용을 통해 제작된 닫힌 선형 DNA는 WO2010/086626, WO2012/017210 및 WO2016/132129의 출원인에 의해 이전에 개시되었고, 이들 모두는 참고로 통합된다. 인 비트로 DNA 증폭 후 프로텔로머라제 효소로 절단하여 제작된 닫힌 선형 DNA는 상기 닫힌 선형 DNA가 인 비트로 무-세포 환경에서 생성되고 상업적 제조를 위해 확장될 수 있다는 이점을 갖는다. 이러한 닫힌 선형 DNA 벡터는 Doggybone DNA 또는 dbDNATM로 알려져 있다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 적어도 하나의 프로텔로머라제 표적 서열을 가진 DNA 주형의 폴리머라제-기반으로 증폭하고, 프로텔로머라제를 가진 증폭된 DNA를 닫힌 선형 DNA를 생성하도록 가공하는 것에 기반하는 인 비트로 무-세포 방식으로, 출원인의 이전 방법들을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다.
닫힌 선형 DNA는 필요한 프로텔로머라제 표적 서열을 가진 플라스미드를 닫힌 선형 DNA 벡터로 전환하여 제작될 수 있지만, 이는 효율적인 제조 방법은 아니다.
다른 닫힌 선형 DNA 벡터는 PCR 산물의 캡핑 (capping) 및 "최소 면역원성으로 정의된 유전자 발현 (minimalistic immunogenic defined gene expression: MIDGE)" 벡터를 포함한 다양한 인 비트로 전략에 의해 제작되었다. MIDGE는 박테리아 세포로부터 플라스미드의 단리 후에 원핵 및 진핵 백본 모두를 소화시키고, 필요한 DNA 서열을 말단-재충전을 위해 헤어핀 서열로 연결하여 생성된다.
프로텔로머라제의 작용에 기초하여 세포 배양에서 인 비보 방식으로 생성되는 DNA "미니스트링 (ministrings)"은 또한 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 닫힌 선형 DNA 벡터이다.
적합할 수 있는 다른 형태의 닫힌 선형 DNA는 십자형 구조로 말단이 닫힌 DNA를 포함하고, 이는 세포 배양에서 다시 제조될 수 있다.
상기 닫힌 선형 DNA는 제품의 순도를 보장하기 때문에 무-세포 시스템에서 제조되는 것이 바람직할 수 있고, 대안으로서 세포 방법에 의해 제조된 닫힌 선형 DNA의 엄격한 정제가 규제 기관에 의해 요구될 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 세포에 관한 것으로서, 이는 본 발명자들이 p53을 녹다운시키는 서열 및/또는 OriP/EBNA1을 포함하는 벡터와 같은, 대체 에피솜 벡터를 사용하여 형질감염된 세포들에 비해 더 안정하다는 것을 발견하였기 때문이다.
본 발명의 세포는 만능성 줄기세포의 모든 필수 특성을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다: 다양한 타입의 특수 세포로 분화할 수 있는 잠재력, 미분화 상태를 유지하면서 수많은 세포 분열주기를 수행하는 능력, 만능성 유전자의 발현, 배아 줄기세포와 관련된 후성적 패턴, 배아체 및 기형종 (teratoma)을 형성하는 능력, 생존 가능한 키메라를 형성하는 능력. 이에 대해서는 하기에서 상세하게 토의된다.
형태학적으로, 상기 iPSC는 둥근 형태의, 큰 핵소체 (nucleolus) 및 부족한 세포질 (cytoplasm)을 가질 것으로 예상된다. iPSC의 콜로니는 hESC와 유사한 날카 로운-가장자리의 편평하고 밀집된 콜로니를 형성할 것으로 예상된다.
배가되는 시간 및 유사분열 활성은 줄기세포 성장의 초석이고, 이들은 이들 정의의 일부로서 자가-재생되어야 하기 때문이다. 본 발명에 따른 iPSC는 유사분열 활성, 능동적인 자가-재생 및 증식성일 것으로 예상된다.
알칼리 포스파타제 (AP) 염색은 콜로니가 출현하기 전에 iPSC의 초기 동정에 사용될 수 있다. 추가적 배양 (예: ThermoFisher의 AP Live) 및 반복 테스트를 가능하게 하는 다양한 염색을 생 세포에 사용할 수 있다. AP는 ESC, 배아 생식 세포 및 iPSC를 포함하는 세포에 일반적으로 적용 가능한 만능성 마커이다. 줄기세포의 만능성 상태는 선택적으로 하나 이상의 전사 인자들인 Nanog, Oct4, Sox2, 단계-특이적 배아 항원, 및 종양 관련 항원인 TRA-1-60, TRA-1-81을 포함하는 다수의 만능성 마커의 발현과 함께, 표시하는 AP 발현에 의해 특성화될 수 있다.
줄기세포 마커: iPSC는 ESC에서 발현된 세포 표면 항원 마커를 발현하였다. 인간 iPSC는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E 및 NANOG를 포함하는, hESC에 특이적인 마커를 발현하였다. 인간 iPSC는 또한 SSEA-1과 같은 분화와 관련된 마커가 결여될 수 있다.
세포 표면 항원 발현은 이전에 기재된 바와 같이 트립신-EDTA를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 배양물을 수확한 후 유세포 형광측정법 (flow cytofluorometry)에 의해 검출된 면역형광을 사용하여 평가될 수 있다 (Andrews PW, et al In: Robertson EJ, editor. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. Oxford: IRL Press; 1987a). 모노클로날 항체를 사용하여 표면 항원 발현을 검출할 수 있다.
실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 유도된 iPSC는 표준 벡터를 사용하여 유도된 세포보다 SSEA-1 (Stage-Specific Embryonic Antigen-1)의 발현 수준이 더 낮음을 알 수 있다 (도 17). SSEA-1은 세포-표면 탄수화물 에피토프이고, 초기 분화의 마커이며, 만능성 상태로부터 가장 초기 출구 단계에 존재하는 반면, 만능성이 남아있는 세포에는 부재한다. 그러므로 이는 세포가 자발적 분화의 초기 단계에 있음을 나타내는 매우 초기 마커이며, 따라서 만능성 세포 중에 이 마커의 발현 수준이 낮은 것이 바람직하다. 인간 배아 줄기세포는 SSEA1을 발현하지 않는다 (Henderson J.K et al, Stem Cells, 20 (2002), pp. 329-337). 그러므로 상기 iPSC가 만능성 상태에서 안정하다는 한 가지 표시로는 세포 표면에서 SSEA-1의 발현이 부재한다는 것이다.
SSEA-3은 만능성 상태의 세포에서 발현되는 세포-표면 글리코스핑고리피드 (glycosphingolipid)이며, 상기 세포가 이 만능성 상태를 소실하고 분화함에 따라 발현이 소실된다. 인간 배아 줄기세포는 이의 표면에서 SSEA-3을 발현한다 (Henderson et al). 그러므로 상기 iPSC가 만능성 상태에서 안정하다는 또 다른 표시로는 세포 표면에 SSEA-3의 발현이 존재한다는 것이다.
TRA-1-81은 만능성 상태의 세포에서 발현되는 세포-표면 탄수화물이며, 상기 세포가 이 만능성 상태를 소실하고 분화함에 따라 이 탄수화물의 발현이 소실된다. 인간 배아 줄기세포는 이의 표면에서 탄수화물 TRA-1-81을 발현한다. 그러므로 상기 iPSC가 만능 상태에서 안정하다는 또 다른 표시로는 세포 표면에 탄수화물 TRA-1-81의 발현이 존재한다는 것이다. TRA-1-81은 분화 중에 하향조절된다.
SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81과 같은 다수의 줄기세포 마커는 탄수화물 에피토프이다. 그러므로 줄기세포는 분화된 세포 타입과 이들을 구별되는 특징적인 글리코실화 프로파일을 나타낼 수 있다. 그러므로 상기 안정한 세포는 세포 표면에서 글리코실화 프로파일로 표시될 수 있으며, 이는 인간 배아 줄기세포에서 보이는 패턴과 유사할 수 있다.
iPSC는 미분화된 ESC에서도 발현되는, Oct-3/4, Sox2, NANOG, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 hTERT를 포함한 유전자들을 발현할 수 있다. 상기 목록에는 H3K4me3 및 H3K27me3의 유전자 발현을 추가로 포함할 수 있다.
iPSC는 또한 높은 텔로머라제 (telomerase) 활성을 나타낼 수 있고, 텔로머라제 단백질 복합체의 필수 성분인 hTERT (인간 텔로머라제 역전사효소)를 발현할 수 있다.
iPSC는 또한 신경 분화 및 심장 분화가 가능할 수 있다. 또한, 이들은 면역 결핍 마우스에 주사되는 경우 기형종을 형성할 수 있다. 기형종은 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 3가지 배엽층에서 유래된 조직을 함유하는 여러 계통의 종양이다. 상기 줄기세포는 또한 배아체를 형성할 수 있다; 배양에서 "배아체 (embryoid body)"라고 불리는 공-모양의 배아-유사 구조를 자발적으로 형성하는데, 이는 유사분열 활성 및 분화 줄기세포의 코어와 3가지 배엽층 모두로부터 완전히 분화된 세포의 주변으로 구성된다. 또한, 키메라를 형성하는 능력은 iPSC의 표시이다: 이는 세포를 배반포 (blastocyst)의 영양막 (trophoblast)에 주입하고 수용자 암컷 동물 (마우스)로 옮기고, 결과로 생긴 자손의 키메리즘 (chimerism)을 테스트함으로써 시험될 수 있다.
모니터링될 수 있는 iPSC의 후성적 재프로그래밍에는 프로모터에서 CpG 부위의 탈메틸화 (demethylation), 예컨대 Oct-3/4, Rex1 및 NANOG를 포함한, 만능성-관련 유전자에 대한 것을 포함한다. 보다 전체적으로, 히스톤 탈메틸화를 포함한, DNA 메틸화 패턴이 변경될 수 있다.
상기 특성들 중 어느 하나 이상을 이용하여, 세포가 본 발명에 따라 iPSC인지를 결정할 수 있다.
"안정한 (stable)"은 본 발명의 방법 및 용도에 따라 생성된 유도 만능성 줄기세포가, OriP/EBNA1 벡터로부터 발현된 다른 동일한 재프로그래밍 인자를 사용하여 제조된 세포와 비교할 때, 상기 세포는 자발적 분화 능력이 감소되고, 상기 세포는 만능성을 유지하기에 적합한 조건하에 배양되고, 이러한 조건은 "만능성 배지 (pluripotency media)"로 지칭될 수 있는 관련 배양 배지에서 계대를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다는 것을 의미한다. 대안으로서, 이는 상당한 비율의 세포 (5% 이상)가 자발적으로 분화하지 않고 만능성 줄기세포가 적어도 28일 동안 배양될 수 있음을 의미한다. 상기 세포는 적어도 25일 내지 60일, 선택적으로 28일 내지 50일, 추가 선택적으로 30일 내지 40일, 더 나아가 적어도 35일 동안 배양될 것이다. 상기 기간 중에 만능성을 유지하는 세포의 비율은 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 또는 초과이다. 그러므로 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 초과는 자발적으로 분화될 수 있다.
안정한 세포는 앞서 논의한 바와 같이, 등급 A로 분류될 수 있다.
안정한 세포는 또한 게놈 안정성과 온전성을 가진 세포로도 기재될 수 있다. 게놈 안정성은 장기간 배양에서 세포의 게놈 (karyotypic 및 subkaryotypic 수준으로 포함) 및 후성유전학적 이상을 조사하여 정량화될 수 있다. 게놈 및 후성적 안정성을 수립하기 위해 다양한 방법이 적용될 수 있고, 여기에는 캐리오타이핑 (karyotyping) (G-banded 캐리오타이핑 포함), FISH (fluorescent in situ hybridisation), SKY (Spectral Karyotyping), 복제 수 변이 (copy number variation: CNV) 검출을 위한 어레이 기반 비교 게놈 혼성화, CNV 및 이형접합성 소실을 검출하기 위한 SNP (single nucleotide polymorphism) 기반 마이크로어레이, 게놈 통합 부위 분석, 글로벌 유전자 발현 메타-분석 (global gene expression meta-analysis) 및 가장 포괄적으로 전체 게놈 시퀀싱을 포함한다. 이 중, G-밴드 캐리오타이핑은 전체 게놈의 스냅샷을 제공할 수 있고, 전체 이상 (gross abnormalities)을 빠르게 검출하는데 유용할 수 있지만, 큰 이상으로 제한된다. 그러므로 여러 기술들의 혼합이 필요할 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 세포는 장기간 배양된 만능성 세포의 게놈에서 볼 수 있는 일반적인 변화가 결여된 경우 안정한 것으로 기재될 수 있다. 이러한 반복적 인 변화에는 3염색체성 (trisomy) 또는 12p의 증폭, 3염색체성 X, 3염색체성 17, 17q의 증폭, 20q11.21의 증폭, 동완 (isodicentric) X, 18q12.1의 결실, 1p36.13의 증폭, 1p36.33의 증폭, 2p11.2의 증폭, 7q35의 증폭, 14q32.32의 증폭, 15q11.2의 결실, 21q11.2의 증폭, 21q11.22의 증폭, 22q11.21의 결실, 3염색체성 8, 3염색체성 20q, 증폭 1q31.3, 17q21.1의 결실 및 8q24.3의 결실을 포함한다. 이는 상기에서 설명한 방법으로 평가될 수 있다. 본 발명의 세포에는 이러한 모든 이상이 결여되어 있는 것이 바람직하다. 이 중, 3염색체성 또는 12p의 증폭, 3염색체성 X, 17q의 증폭, 17q의 증폭, 20q11.21의 증폭, 3염색체성 8, 3염색체성 20q, 증폭 1q31.3, 17q21.1의 결실 및 8q24.3의 결실이 인간 iPSC 배양에서 가장 흔하게 볼 수 있다. 선택적으로, 상기 안정한 세포에는 이러한 모든 이상이 결여되어 있다.
소정의 게놈/후성유전학적 이상은 종양 형성을 유발할 가능성이 있으므로, 게놈이 안정한 세포를 생성하는 것이 바람직함을 이해할 것이다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포는 실시예에서 이들 세포, 이들의 전사체에서 다양한 RNA 서열의 수준에 기초한 추가 분석을 수행하였다. RNA 시퀀싱 기반 분석 (RNA-seq)은 분자 프로파일링 데이터의 시각화를 가능하게 하는 히트맵을 생성한다. 세포 내에 RNA를 분석하면 상대적 발현 수준과 함께, 발현되는 유전자를 검출할 수 있다는 이점을 갖는다. 이러한 방식으로 세포 또는 세포 집단의 RNA 분자 세트를 분석할 수 있다. 전체 RNA는 세포/집단으로부터 단리되고, 분석 방법이 이 단계를 필요로 하는 경우 DNA로 역전사될 수 있고, 바람직하게는 고-처리 방법 (high-throughput method)으로 서열 분석될 수 있다. 다수의 방법이 이용 가능하고, 미세유체 플랫폼 (microfluidic platforms) (즉, Fluidgm Cl) 또는 미세역가 플레이트 플랫폼 (microtitre plate platforms) (즉, Smart-Seq 2)과 같은 시스템을 사용할 수 있다.
대안으로서, 특정 RNA 서열에 대한 포획제 (capture agents) 및 고정 표지된 프로브를 포함하는 마이크로어레이 칩 등이 이용될 수 있다. 특정 RNA 서열의 결합이 검출될 수 있고, 이는 또한 검출된 각 서열의 양이 결정될 수 있기 때문에 세포/집단에 존재하는 RNA 서열의 히트맵이 작성될 수 있도록 하였다. 상기 어레이로부터의 신호 강도는 RNA 수준에 직접 비례할 것이다.
이러한 방법에 의해 결정된 RNA 시퀀싱 히트맵은 본 발명의 방법에 따라 제조된 세포의 경우 줄기세포의 분화와 관련된 RNA 발현 수준이 낮고, 실제로 현재 기술을 사용하여 유도된 비교 가능한 세포보다 더 낮다고 수립되었다. 이는 분화와 관련된 RNA의 발현 수준이 OriP/EBNA1 벡터로 유도된 세포보다 더 낮고, 발현 수준이 천연 유래 줄기세포에서와 유사하기 때문에, 본 발명의 세포가 OriP/EBNA1 벡터를 사용하여 유도된 세포보다 더 안정하다는 것을 나타낸다.
도 18 (a 및 b) 및 19 (a 및 b)는 세포가 이의 발현 수준에 대해 조사될 때 수득된 RNA 서열 지도이다. 실시예 9는 수행된 실험을 기재하였다.
본 발명자들은 배아 줄기세포와 비교하여, iPSC 내에 다양한 RNA 서열을 연구하였다. 실시예에서, 다양한 RNA 서열을 조사하고, 다양한 표현형/조건/상태와 관련된 것으로 알려진 RNA 서열 그룹을 조사하였다. 특히, 인터페론 신호전달과 관련된 RNA 서열을 조사하였다. 이 RNA 서열 세트를 살펴보면, 본 발명의 방법에 따라 유도된 세포가 OriP/EBNA1 벡터로 유도된 세포보다 ESC에 대한 이들 RNA 서열의 수준과 관련하여 더 가깝다는 것이 분명하다 (도 18a 또는 18b 참조). 상기 인터페론 (IFN) 경로는 인간 면역 반응에서 중요한 역할을 하며, 이러한 결과로부터, 본 발명의 방법을 사용하여 유도된 세포에서, 이러한 세포의 인터페론 신호전달 수준이 EBNA1 벡터-유도 iPSC에 비해 감소되었음을 볼 수 있다. 만능성을 유지하는데 필요한 인자는 IFN-기반 반응을 유도하는데 관여하는 인자와 호환되지 않는 것으로 밝혀졌다 (타입 I 인터페론 반응은 만능성 줄기세포의 분화 잠재력을 손상시킴, Julie Eggenberger et al, PNAS January 22, 2019 116 (4) 1384-1393.). 그러므로 iPSC에서, IFN 경로 유전자의 발현은 만능성이 유지되어야 하는 경우에는 바람직하지 않다. 실시예에서 조사된 인터페론 신호전달 RNA 서열 (도 20a 및 20b 및 도 21 (A 및 B), 실시예 9 참조)은 STAT1, IRAK1, EIF2AK2, STAT2, IRF9, IRF7, ISG20, IFIT1, MyD88, IFI27, TNFSF10, MX1, ISG15 및 NFKBIA를 포함한다. 세포 또는 세포 집단 내에서 이들 RNA 서열 수준의 전부 또는 일부 분석은 iPSC의 안정성에 대한 중요한 지표를 제공할 수 있고, 이러한 마커에 대한 RNA의 높은 수준은 만능성이 유지될 수 없다는 것을 나타내기 때문이다.
실제로, 실시예는 STAT1이 표준 벡터에 의해 형질도입된 세포에서 대량으로 상향조절되는 반면, 본 발명에 따라 형질도입된 세포는 이러한 상향조절이 결여되어 있음을 보여준다. STAT1 (Signal transducer and activator of transcription 1)은 전사 인자이고, 인터페론의 주요 조절인자이다.
또한, 분화와 관련된 RNA 서열이 연구되었고, 이들은 CXCR4, FGF8, SOX17, GOOSECOID, Brachyury, GBX2, OLIG3, HAND1, WNT3, TWIST1, MEOX1, CER1, FOXA2, GDF3, BMP4, SLUG, EOMES, AFP, CDH1 및 TUJ1을 포함하였다. 이는 본 발명에 따라 유도된 세포의 RNA 수준이 OriP/EBNA1 벡터를 사용하여 유도된 iPSC에서 보이는 수준보다 ESC에서 보이는 천연 수준과 더 밀접한 관련이 있다는 것이 발견되었다 (도 19a 및 19b, 실시예 9 참조). 세포 또는 세포 집단 내에서 이러한 RNA 서열 수준의 전부 또는 일부 분석은 iPSC의 안정성에 대한 중요한 지표를 제공할 수 있고, 이러한 마커에 대한 RNA의 높은 수준은 세포가 분화를 시작할 가능성이 있거나, 또는 이미 그렇게 수행하였음을 나타내기 때문이다.
유사하게, RNA Seq를 사용하여 만능성 마커를 조사하였다. 이러한 마커에는 LIN28, SOX2, BUB1 TET1, SALL4, ZIC3, LIN28B, MYC, POU5F1, NANOG, TCL1B, REXO1 및 KLF4를 포함한다. 이는 본 발명에 따라 유도된 세포에서 RNA 수준이 OriP/EBNA1 벡터를 사용하여 유도된 iPSC에서, 실제로 두 세트의 iPSC가 유래되는 분화된 세포에서 보이는 수준보다 ESC에서 보이는 천연 수준과 더 밀접한 관련이 있다는 것이 발견되었다 (도 18a 및 18b, 실시예 9 참조). 세포 또는 세포 집단 내에서 이러한 RNA 서열 수준의 전부 또는 일부 분석은 iPSC의 안정성에 대한 중요한 지표를 제공할 수 있고, 이러한 만능성 마커에 대한 RNA의 더 낮은 수준은 세포가 분화를 시작할 가능성이 있거나, 또는 이미 그렇게 수행하였음을 나타내기 때문이다.
CDKN1A-매개 증식 억제는 만능성 줄기세포의 분화에 대한 추가 지표이다.
안정한 유도 만능성 줄기세포는 형태학적 외관에 기반하여, 등급 A로 분류된다. 줄기세포의 등급은 이전에 논의되었다. 안정한 iPSC는 ESC와 유사한 분류를 갖는다.
안정한 유도 만능성 줄기세포는 OriP/EBNA1 벡터를 사용하여 재프로그래밍된 세포보다 표현형이 배아 줄기세포에 더 가깝다. 본원에 제시된 데이터는 이러한 주장을 뒷받침한다.
유도 만능성 줄기세포의 문맥에서, 안정한은 그러므로 하기 표현형들 중 임의의 하나 이상으로 정의될 수 있다:
(a) 배양물에서 자발적 분화 수준의 감소;
(b) 세포 표면에서 SSEA1의 낮은 발현;
(c) 만능성 상태와 관련된 세포 표면 항원의 발현 (예: SSEA3, TRA-1-81 및/또는 Tra-1-60);
(d) 분화와 관련된 RNA 서열의 낮은 수준 또는 무시할 수 있는 수준 (예: CXCR4, FGF8, SOX17, GOOSECOID, Brachyury, GBX2, OLIG3, HAND1, WNT3, TWIST1, MEOX1, CER1, FOXA2, GDF3, BMP4, SLUG, EOMES, AFP, CDH1 및/또는 TUJ1 중 임의의 1개, 2개, 3개 또는 초과);
(e) 인터페론 신호전달과 관련된 RNA 서열의 낮은 수준 또는 무시할 수 있는 수준 (예: STAT1, IRAK1, EIF2AK2, STAT2, IRF9, IRF7, ISG20, IFIT1, MyD88, IFI27, TNFSF10, MX1, ISG15 및/또는 NFKBIA 중 임의의 1개, 2개, 3개 또는 초과); 및/또는
(f) 만능성과 관련된 RNA 서열의 존재 (예: LIN28, SOX2, BUB1 TET1, SALL4, ZIC3, LIN28B, MYC, POU5F1, NANOG, TCL1B, REXO1 및/또는 KLF4 중 임의의 1개, 2개, 3개 또는 초과).
무시할 수 있음 (negligible)은 양이 너무 적거나 중요하지 않음을 나타낸다.
그러므로 본 발명은 또한 유도 만능성 줄기세포 집단에 관한 것으로서, 상기 세포 집단은 본원에 기재된 임의의 용도 또는 방법을 사용하여 제조된다. 따라서, 상기 세포는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 발현하는 형질감염된 닫힌 선형 DNA를 사용하여 생성된다. 상기 세포는 바람직하게는 동질이고 미분화되어 있다. 세포 집단 또는 콜로니 중에 세포의 10% 미만으로 분화되는 것이 바람직하며, 바람직하게는 세포의 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 미만이 재분화되는 것이 바람직하다.
상기 세포 집단은 상기 닫힌 선형 DNA 벡터를 더 이상 보유하지 않을 수 있고, 이는 이들이 세포 유지 중에 자연적으로 소실되기 때문에, 재프로그래밍 인자가 제거되지 않는 레트로바이러스 방법을 포함하여 현재의 방법에 의해 유도된 세포보다 훨씬 더 안전하다. 상기 재프로그래밍 인자의 발현이 더 이상 필요하지 않기 때문에, 세포는 유도에 사용되는 닫힌 선형 DNA 벡터가 결여되어 있는 것이 바람직하다. 이는 이전에 논의된 바와 같이 일부 재프로그래밍 인자가 종양유전자일 수 있기 때문에 유익하며, 세포에 대한 외래 서열이 소실될 때 DNA 벡터가 소실되는 것이 바람직하다.
그러므로 상기 발명은 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터로 유도된 치료 등급의 안정한 만능성 줄기세포 집단을 포함한다. 상기 세포는 상기 닫힌 선형 DNA 벡터가 적어도 90% - 100%로 부재하고, 선택적으로 상기 닫힌 선형 DNA 벡터가 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%로 부재한다. 이는 상기 닫힌 선형 DNA 벡터에 고유한 서열을 찾는 PCR 증폭을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, CAG 프로모터 모듈이 사용되는 경우, 이의 고유 서열로 인해 증폭에 적합한 표적이다. 도 14a 및 14b는 세포로부터 벡터가 소실되는 과정을 나타낸다.
대안으로서, 안정한 만능성 줄기세포는 닫힌 선형 DNA 벡터의 결여로 인해 치료적 용도에 적합한, GMP (Good Manufacturing Practice) 등급으로 기재될 수 있다. 대안으로서, 상기 세포는 "임상 등급 (clinical grade)"으로 기재될 수 있다.
본 발명의 세포는 세포 배양물, 바람직하게는 피더층-프리 배양물로서 제공될 수 있다.
본 발명의 세포는 바람직하게는 동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.
그러므로 본 발명은 닫힌 선형 DNA 벡터로 유도된 안정한 만능성 줄기세포 집단, 특히 OriP/EBNA1을 함유하지 않는 닫힌 선형 DNA 벡터로 유도된 안정한 만능성 줄기세포 집단을 포함한다. 본 발명의 청구범위를 생성하는데 사용된 닫힌 선형 DNA 벡터 및 방법은 상기에 광범위하게 기재되었으며, 이는 또한 여기에도 적용된다.
본 발명의 세포는 바람직하게는 닫힌 선형 DNA 벡터(들)가 결여되어 있다.
앞서 기재된 바와 같이, 본 발명의 닫힌 선형 DNA의 사용을 통해 생성된 세포는 OriP/EBNA1 벡터를 사용하여 생성된 세포와 비교할 때 더 안정한 것으로 밝혀졌다.
상기 세포는 OriP/EBNA1 벡터를 사용하여 유도된 세포보다 표현형에서 자연 발생 줄기세포에 더 가까운 것을 볼 수 있다. 이 표현형은 본원에 제시된 실시예에서 광범위하게 연구되었고, 하기를 포함한다:
(i) 분화에 대한 마커 (즉, SSEA1);
(ii) 만능성에 대한 마커;
(iii) 면역계 유전자 발현;
(iv) 사이토카인 신호전달;
(v) 인터페론 신호전달; 및/또는
(vi) 염증 반응.
상기 표현형은 유전자 발현 분석을 사용하여 수립될 수 있으며, 이는 분석 및 계층적 클러스터링이 뒤따를 수 있다. 실험으로 본 발명의 방법에 의해 유도된 만능성 줄기세포가 다른 유도 만능성 줄기세포 타입보다 천연 인간 줄기세포에 더 가깝게 클러스터링된다는 것을 광범위하게 보여준다.
본 발명의 방법 및 용도는 보다 안정한 iPSC 집단을 생성하므로, 따라서 치료적으로 사용될 가능성이 더 높고, 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하여 이러한 세포를 얻는 것도 신규한 것이다. 그러므로 본 발명은 추가로 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터를 포함하는 치료적으로 허용 가능한 유도 만능성 줄기세포를 제조하기 위한 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 임의의 허용 가능한 형식일 수 있고, 임의의 적절한 부형제를 포함할 수 있다. 이는 형질감염 시약과 같은 형질감염 절차를 돕는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 본 발명의 세포는 궁극적으로 인간 치료 환경에서 사용될 수 있으며, 이들 세포의 제조 방법은 GMP를 준수하는 것이 중요하다. 그러므로 닫힌 선형 DNA 벡터의 약학적 조성물이 필요할 수 있으며, 상기 약학적으로 적절한 부형제는 상기 닫힌 선형 DNA를 안정화시키거나, 형질감염을 보조하거나, 또는 상기 세포 제조에 유익할 수 있는 제제를 포함한다.
만능성이 달성되면, 본 발명의 세포는 만능성 세포로서 치료적으로 사용될 수 있거나 또는 유전자 요법 등의 목적으로 변형될 수 있다. 상기 세포가 배양되는 조건을 변경함으로써, 상기 세포를 다능성 성체 줄기세포로 분화시킬 수 있거나, 또는 특정 세포 타입으로 최종 분화시킬 수 있다. 상기 iPSC를 원하는 타입의 세포로 분화시키기 위한 방법이 당 분야에 많이 알려져 있다.
iPSC로부터 유래된 세포를 포함하는, 본 발명의 세포는 경피, 피하, 근육내, 비경구, 장내, 정맥내, 복강내, 안와내, 망막내, 조직 이식 및 뇌척수액으로의 주입을 포함하는, 임의의 적절한 수단에 의해 수용자의 체내로 이식될 수 있다.
iPSC로부터 유래된 세포를 포함하는, 본 발명의 세포는 약학적으로 허용 가능한 배지 중에 투여될 수 있다. 이들은 그대로, 또는 예를 들어 이들의 성장을 지원하기 위한 적절한 배지 또는 기질과 함께 제공될 수 있다.
iPSC로부터 유래된 세포를 포함하는, 본 발명의 세포가 치료에 사용될 수 있다.
일반적인 줄기세포 및 초기 분화에 대한 몇 가지 마커:
만능성 줄기세포
알칼리 포스파타제: 이 효소의 발현 증가는 미분화된 만능성 줄기세포 (PSC)와 관련이 있다.
AFP (Alpha-fetoprotein): 내배엽. 원시 내배엽 발달 중에 발현되는 단백질; 내배엽 분화 만능성 줄기세포를 반영한다.
뼈 형태형성 단백질-4 (Bone morphogenetic protein-4): 중배엽. 초기 중배엽 형성 및 분화 중에 발현되는 성장 및 분화 인자.
Brachyury: 중배엽. 중배엽 형성 및 분화의 초기 단계에서 중요한 전사 인자; 중배엽 형성의 초기 지표로 사용된다.
CD30 (Cluster designation 30) PSC에서 특이적으로 발견되는 표면 수용체 분자.
Cripto (TDGF-1) 심근세포. ES 세포, 원시 외배엽 및 발달하는 심근세포에 의해 발현되는 성장 인자에 대한 유전자.
GATA-4 유전자: 내배엽. ES가 내배엽으로 분화함에 따라 발현이 증가한다.
GCTM-2 ES: 미분화된 PSC에 의해 합성되는 특정 세포외 기질 분자에 대한 항체
발생 (Genesis): PSC의 미분화 상태 또는 그 중에 ES 세포에 의해 고유하게 발현되는 전사 인자
생식 세포 핵 인자 (Germ cell nuclear factor): PSC에 의해 발현되는 전사 인자.
HNF-4 (Hepatocyte nuclear factor-4): 내배엽. 내배엽 형성 초기에 발현된 전사 인자.
네스틴 (Nestin): 외배엽, 신경 및 췌장 선조세포. 세포내 중간체 필라멘트; 원시 신경외배엽 형성의 특징.
N-CAM (Neuronal cell-adhesion molecule): 외배엽. 세포-세포 상호작용을 촉진하는 세포-표면 분자; 원시 신경외배엽 형성을 나타낸다.
OCT4/POU5F1: PSC에 고유한 전사 인자; 미분화된 PSC의 제작 및 유지에 필수적이다.
Pax6: ES 세포가 신경상피로 분화될 때 발현되는 전사 인자
SSEA-3 (Stage-specific embryonic antigen-3): 초기 배아 발달 및 미분화된 PSC에 의해 특이적으로 발현되는 당단백질
SSEA-4 (Stage-specific embryonic antigen-4): 초기 배아 발달 및 미분화된 PSC에 의해 특이적으로 발현되는 당단백질.
줄기세포 인자 (SCF 또는 c-Kit 리간드): ES 및 EC 세포, 조혈 줄기세포 (HSC) 및 중간엽 줄기세포 (MSC)의 증식을 증진시키는 막 단백질; 수용체 c-Kit에 결합한다.
텔로머라제 (Telomerase): 불멸 세포주와 고유하게 관련된 효소; 미분화된 PSC를 동정하는데 유용하다.
TRA-1-60: 특정 세포외 기질 분자에 대한 항체는 미분화된 PSC에 의해 합성된다.
TRA-1-81: 미분화된 PSC에 의해 일반적으로 합성되는 특정 세포외 기질 분자에 대한 항체.
비멘틴 (Vimentin): 외배엽, 신경 및 췌장 선조세포. 세포내 중간체 필라멘트; 원시 신경외배엽 형성의 특징.
서열에 대한 GenBank 수탁 번호:
EBNA1의 게놈 서열: NC_007605.1.
OriP의 게놈 서열: AJ012167.1
Oct 3/4: Z11898.1 및 NM_002701.5
Sox2의 유전자 서열: KU342033.1
Sox1의 유전자 서열: Y13436.1
Sox3의 유전자 서열: X71135.1
Sox15의 mRNA 서열: NM_006942.1
klf1의 mRNA 서열: NM_006563.4
전사 변이체 1 klf4의 mRNA 서열: NM_001314052.1, 변이체 2 mRNA klf4: NM_004235.5, 짧은 이소형태의 klf4 CDS: HM026463.1.
klf5의 mRNA 서열: AF287272.1; 변이체 2 klf5 mRNA: NM_001286818.1; 변이체 1 mRNA klf5: NM_001730.4; 이소형태의 D klf5 CDS: HQ628641.1; 이소형태의 B klf5 CDS: HQ628639.1.
c-Myc의 유전자 서열: AH002906; c-Myc의 mRNA 서열: AH004538.1.
L-Myc의 유전자 서열: M19720.1; L-Myc의 엑손 1-2: X07262.1
N-Myc의 유전자 서열: Y00664.1; N-Myc의 엑손 2&3: M13241.1.
NANOG의 유전자 서열: JX105036.1
LIN28A 동종체의 유전자 서열: NM_024674.5 및 LIN28B 동종체의 유전자 서열: NM_001004317.3.
GenBank 수탁번호 LQ432011.1, LQ432012.1, LQ432013.1, LQ432014.1, LQ432015.1, LQ432016.1, LQ432017.1 및 LQ432018.1은 본 발명의 닫힌 선형 DNA에서 사용될 수 있는 특정 프로텔로머라제 표적 서열을 서술한다.
본 발명은 이제 하기 비-제한적인 실시예를 참조하여 기재될 것이다.
실시예:
물질 및 방법
세포 배양:
세포 배양 시약
시약 회사
DMEM Sigma
MEM 비-필수 아미노산 Life Technologies
우태아 혈청 Gibco, Life Technologies
L-글루타민 Sigma
페니실린/스트렙토마이신 Sigma
Dulbecco 인산염 버퍼 식염수 Sigma
DMEM/F12 Gibco, Life Technologies
녹아웃 혈청 대체물 Gibco, Life Technologies
β-메르캅토에탄올 Life Technologies
미토마이신 C Sigma Aldrich
TrypLE 발현 효소 Gibco, Life Technologies
FGF2 R&D Systems
라미닌 Millipore
돼지 피부 유래 젤라틴 Sigma
Rock 억제제 (Y-27632) Sigma
디메틸 설폭시드 Sigma
N2 보충물 Life Technologies
B27 보충물 Life Technologies
헤파린 Sigma
마트리겔 BD Bioscience
mTeSRTM 1 Stemcell Technologies
Rock 억제제 (Y-27632) Sigma
폴리에틸렌이민 Sigma
OptiMEM Gibco, Life Technologies
배지 및 구성 성분:
완전 DMEM :
구성 성분 부피
DMEM 435mL
FBS 50mL
L-글루타민 (200mM) 10mL (4mM)
PenStrep (100x) 5mL (1x)
인간 배아 줄기세포 ( hESC ) 배지:
구성 성분 부피
DMEM/F12 (1:1) 38.5mL
비-필수 아미노산 (NEAA) 0.5mL (1x)
녹아웃 혈청 대체물 (KSR) 10mL (20%)
bFGF (100ug/mL) 5uL (10ng/mL)
PenStrep (100x) 0.5mL (1x)
대조군 신생아 진피 섬유모세포 (nhDF)를 Fisher Scientific (C0045C)으로부터 구입하였다. CLN3, CLN6 및 CLN7 유전자의 돌연변이로 인한 바텐병 (BD) 환자로부터 입수한 인간 진피 섬유모세포는 Sara Mole 교수의 the Laboratory for Molecular Cell Biology at UCL로부터 입수하였다. Shef3 인간 배아 줄기세포 (hESC)는 영국 줄기세포 은행 (SCSC10-48)으로부터 조달하였다. 마지막으로, MEF 피더 세포는 Cambridge Bioscience (CBA-310)로부터 구입하였다.
인간 소변-유래 세포의 단리 및 배양:
본 연구는 윤리위원회로부터 승인을 받고 인간 소변 샘플을 사전 동의하에 수집한 후에 수행하였다. 세포를 단리하기 위해, 소변을 멸균 용기로 수집하였다.
표준 재프로그래밍 방법을 사용하여 소변으로부터 단리된 세포에서 iSPC를 생성하는 대체 방법을 제시하는, Zhou et al, Nature Protocols volume 7, pages 2080-2089 (2012)에 기재된 방법에 따라 세포를 단리하고 재프로그래밍을 위해 준비하였다. 일단 재프로그래밍을 위해 준비되면, 상기 세포는 본원에 기재된 방법을 사용하여 본원에 기재된 벡터로 형질감염시킴으로써 재프로그래밍되었다.
말초혈 샘플로부터 단핵구를 포함한 혈액 세포의 단리 및 배양:
본 연구는 윤리위원회로부터 승인을 받고 인간 혈액 샘플을 사전 동의하에 수집한 후에 수행하였다. 단핵구는 말초혈 중에 약 3% - 8%의 비율로 함유되어 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 재프로그래밍하기 전에, Isogai et al, Cell Reprogram. 2018 Dec 1; 20(6): 347-355에 기재된 방법에 따라 세포를 단리하고 재프로그래밍을 위해 준비하였다.
세포 배양 방법:
마우스 배아 섬유모세포 ( MEF )의 배양 및 불활성화:
해동시에, MEF를 1x (v/v) 비-필수 아미노산이 보충된 완전 DMEM에서 배양하였다. 상기 세포 배지를 일상적으로 격일로 교체하고, 90-95%의 융합에 도달하면, 그 다음에 세포를 계대하였다. MEF는 1:4 비율로 분할되었고, 먼저 150μL/cm2의 TrypLE을 사용하여 트립신 처리하여 세포를 분리한 후 수집하고 258g에서 5분 동안 원심분리하였다. 또한, 상기 세포 펠렛을 재-플레이팅하기 전에 적절한 부피의 배양 배지 중에 재현탁시켰다.
계대 4 (P4)로 증폭시킨 후에, 상기 MEF는 그 다음에 37℃에서 3시간 동안 완전 DMEM에서 미토마이신 (Mitomycin) C (0.1μg/uL)와 함께 인큐베이션한 후 유사분열로 불활성화되었다. 인큐베이션 후에, 상기 MEF는 10mL의 Dulbeccos 인산염 버퍼 식염수 (DPBS)에서 4회의 세척 단계를 거쳐 다시 150 μL/cm2의 TrypLE을 사용하여 효소적으로 박리시켰다. 일단 > 90%의 세포가 플라스크 표면에서 분리되면, 이들은 그 다음에 ~ 5 x 106 세포/mL의 밀도로 10 % (v/v) 디메틸 설폭시드 (DMSO)가 보충된 FBS 중에 -80℃에서 보관되었다. 또한, 만능성 줄기세포 (PSC)의 배양 전에 - MEF는 0.1 % (w/v) 젤라틴으로 사전 코팅된 배양 접시/플라스크에 5 x 104 세포/cm2의 밀도로 시딩하였다.
일시적 형질감염을 위해, 세포를 > 90 %의 융합까지 배양하였다. 설정된 부피의 PEI를 먼저 OptiMEM 중에 재현탁시킨 후에, 설정된 농도의 DNA를 OptiMEM 중에 별도로 재현탁하였다. PEI-DNA 복합체 형성을 강화하기 위해 PEI/DNA 분취량들을 조합하였다. 20분 실온 인큐베이션 기간 후에, 상기 PEI-DNA 복합체를 HEK293T 세포의 웰로 옮겼다. 그 후에 37 ℃에서 2-3시간 인큐베이션을 수행하였다. 인큐베이션 후에, 상기 OptiMEM 및 임의의 남아있는 PEI/DNA를 상기 웰로부터 제거하고, 2mL의 완전 DMEM을 부가하였다.
PEI 제조: OptiMEM 부피 327.25 μL, PEI 부피 2.75 μL.
DNA 제조: OptiMEM 부피 327.25 μL, DNA 농도 2.75 μg
인간 진피 섬유모세포 ( hDF ) 배양 및 유지:
hDF를 완전 DMEM 중에 배양하고, 배지는 격일로 규칙적으로 교체하였다. 상기 세포를 258g에서 5분 동안 원심 분리하기 전에, TrypLE를 사용하여 효소적으로 분리시켜서 일상적으로 계대하였다. 그 다음에 상기 세포를 ~ 3 x 104 cm2의 밀도로 시딩하였다.
만능성 줄기세포 ( PSC )의 배양 및 계대 :
hESC 및 iPSC (PSC)를, 격일로 정기적으로 새로 보충되는 hESC 배지 중에 MEF 피더층 (iMEF)에서 배양하였다. PSC 콜로니는 콜로니 형태에 따라 4-10일마다 정기적으로 계대하였다. 계대하기 전에, 신선한 hESC 배지를 세포 상에 배치하였다. 그 다음에 PSC 콜로니를 플라스크에서 수동으로 절제하여 신선한 배지로 넣었다. 그 다음에 피펫으로 계대시킬 콜로니를 추가로 분리한 후에, 새로운 iMEF에 배치하였다.
체세포 재프로그래밍 및 iPSC의 제조:
HDF를 재프로그래밍하는 방법이 본원에 제시되어 있고, 발명자들이 수집하고 재프로그래밍한 다른 체세포 타입에 대해 유사한 방법이 사용되었다.
HDF는 Amaxa Nucleofector 2b를 사용하여 뉴클레오펙션되었다. 이는 만능성 상태를 유도하는데 필요한 에피솜 플라스미드-기반 또는 닫힌 선형 DNA-기반 재프로그래밍 인자 (SOX2, OCT4, KLF4, l-Myc, shp53)를 세포에 공급하였다. 또한, 효율을 향상시키기 위해, 플라스미드 시스템이 활용되는 경우 추가의 EBNA1 발현 플라스미드를 또한 부가하였다.
재프로그래밍 벡터
플라스미드 카탈로그 번호 구조체 농도
pCXLE - hSK Addgene ID: 27078 dbDNA-hSK 2.33μg
pCXLE-hUL Addgene ID: 27080 dbDNA-hUL 2.33μg
pCXLE - hOCTshp53 Addgene ID: 27077 dbDNA-OCT4 2.33μg
pCXLE - EBNA1 Addgene ID: 37624 도 1에 도시됨
먼저, 110μl의 뉴클레오펙터 용액을 제조하였다. 이는 90μL의 NHDF NucleofectorTM 용액 + 20μL의 보충제 1 (LONZA: VPD-1001)로 구성되었다. 총 8μg을 뉴클레오펙터 용액 중에 예입하였다. ~ 4.5 x 105 hDF를 이후에 뉴클레오펙터/플라스미드 용액 중에 재현탁시킨 후에 큐벳으로 옮기고, 뉴클레오펙션을 수행하였다 (P-022 프로그램: 인간 진피 섬유모세포 - 높은 생존율). 그 다음에 세포를 완전 DMEM의 단일 6-웰 상에 시딩하고 - 이를 0일로 간주하였다.
후속하여, 1일차에 배지를 새로 보충하고, 2일마다 계속하여 교체하였다. > 90%의 융합에 도달하면, 그 다음에 상기 hDF를 계대하고, T75cm2 플라스크로 시딩하였다. 8일차에, 재프로그래밍 hDF를 150μL/cm2 TrypLE을 사용하여 분리시킨 후에, 피더층 iMEF를 함유하는 T25cm2에 60,000개의 세포를 재플레이팅하였다. 또한, 24시간 후에, 상기 세포 배지를 완전 DMEM에서 hESC 배지로 교체하고, 이는 마찬가지로 2일마다 보충하였다.
iPSc 생성을 위한 실험실 프로토콜. 공정은 0일차에 재프로그래밍 인자 (어떤 벡터든 사용함)로 섬유모세포를 형질감염시키는 것으로 시작하였다. 상기 세포를 완전 DMEM에서 계속 배양하고, 그에 따라 분할하였다. 8일차에, hESC 배지로 교체하기 전에 T25cm2의 iMEF 피더층에 60,000개의 세포를 재-플레이팅하였다. 상기 세포는 콜로니가 형성될 때까지 계속 배양하였다.
형질감염으로부터 일수 조치
0일 섬유모세포 뉴클레오펙션
4-8일 중간엽에서 상피로의 전환
8일 iMEF 피더층 T25cm2에 60,000개의 세포를 재-플레이팅
9일 hESC 배지로 교체
18-21일 초기 콜로니 형성
24-30일 성숙한 iPSC 콜로니 형성
분자 생물학 시약:
시약 회사
RIPA 버퍼 Thermo Scientific
Bradford 시약 BioRad
아크릴아미드/비스-아크릴아미드 40% Sigma
TEMED Sigma
Tween 20 Sigma
Precision Plus ProteinTM KaleidoscopeTM 사전-염색된 단백질 표준 Biorad
Marvel 원 탈지분유 Supermarket
프로테아제 억제제 칵테일 Sigma Aldrich
인산염 완충 식염수 정제 Sigma
Immobilon Western Chemiluminescent HRP 기질 Merck
APS Sigma
Blot 흡착 여과지 Biorad
메탄올 Fisher scientific
글리신 Sigma
Tris 염기 Fisher scientific
소듐 도데실 설페이트
프로테나제 K Fisher scientific
Qiaprep spin miniprep 키트 Qiagen
RNeasy mini 키트 Qiagen
RQ1 무-RNase DNase 키트 Promega
dNTPs Promega
M-MLV 역전사효소 Promega
RNasin 플러스 억제제 Promega
무작위 프라이머 Promega
KAPA SYBR FAST universal 2x qPCR 마스터 믹스 KAPA Biosystems
GelRed 핵산 염색 시약 VWR International
아가로스 Sigma
O'Generuler 래더 믹스 Fisher Scientific
이소프로판올 Sigma
4% 파라포름알데히드
Triton 100x Sigma
소혈청 알부민 Sigma
면역세포화학:
먼저 조직 배양 처리된 플라스틱 웰에서 배양된 세포로부터 배양 배지를 제거한 후에 DPBS로 3회 세척하였다. 그 다음에 상기 세포를 PBS 중 4 % 파라포름알데히드 (PFA) (v/v)를 사용하여 실온에서 대략 20분 동안 고정시켰다. 그 다음에 관심 단백질이 막을 형성하지 않는 경우 고정 후 투과되기 전에, 상기 세포를 세척하였다. 투과는 PBS 중 0.3% Triton X (v/v)를 사용하여 실온에서 10분 동안 수행하였다. 투과 후에, 상기 세포를 추가 DPBS 세척을 거친 후에, PBS 중 2% 우혈청 알부민 (BSA) (w/v) + 0.1% (v/v) Tween20을 사용하여 최소 30분 동안 차단시켰다. 그 다음에 1차 항체를 차단 버퍼에서 적절한 농도 (표)로 희석시킨 다음 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후 상기 세포를 세척한 후 2차 항체를 블록으로 희석 (1:500)하고, 실온의 암실에서 1시간 동안 세포에 두었다. 추가 세척 단계 후에, DAPI를 PBS 중에 1분 동안 첨가한 후 제거하고, 세포를 Leica CTR 6000 생세포 이미징 현미경으로 시각화하였다.
항체
항체 희석 카탈로그 번호
OCT4 1:100 Abcam (Ab18976)
SOX2 1:200 Biotechne (AF2018)
SSEA1 1:200 Abcam (Ab16285)
βIII-튜불린 1:200 R&D systems (MAB1195)
α-평활근 액틴 (SMA) 1:100 Abcam (ab5694)
SOX17 1:60 R&D systems (AF1924)
벡터 구조 및 PCR 검출:
벡터 구조 (vector rescue)를 위해 세포를 형질감염/뉴클레오펙션시키고, 최소 24시간 동안 인큐베이션하여 용해시켰다. 그 후, 세포로부터 배지를 제거한 후에, DPBS를 사용하여 세척하고, 150μL/cm2의 TrypLE로 트립신 처리하였다. 상기 세포를 1000 rpm (Eppendorf centrifuge 5804 R)에서 5분 동안 원심 분리한 후 펠릿화하였다. 하기 표 8에 설명된 단계에서는 QIAprep Spin Mini-Prep Kit의 구성 성분들을 사용하였다.
단계
단계 조치
1 세포를 250μl의 버퍼 P1 중에 재현탁시킨 후에 250μl의 버퍼 P2를 부가하였다.
실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
2 20μl의 프로테나제 K (20 mg/ml)를 세포 현탁액에 부가한 후 55 ℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다.
3 350μl의 버퍼 N3를 용해물에 부가하고 교반하였다. 얼음에 5분 동안 보관하였다.
용해물을 13,000rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다.
4 상등액을 mini-prep 스핀 컬럼에 넣고, 1분 동안 원심 분리하였다. 유동 폐기시켰다
5 500μl의 버퍼 P8을 스핀 컬럼에 부가하고, 1분 동안 원심 분리하고, 유동 폐기시켰다.
750μl의 버퍼 PE를 부가하고, 1분 동안 원심 분리하고, 유동 폐기시켰다.
막을 건조시키기 위해 1분간 공 회전시켰다.
6 스핀 컬럼으로 공기 건조시켜서 - 에탄올을 제거하였다.
30μl의 물을 컬럼에 넣고, 1분간 정치한 후에 1분간 원심 분리하여 임의의 벡터를 용출시켰다.
벡터 단리 후에, PCR 분석을 수행하여 반-정량적 (semi-quantifiable) 및 정성적 (qualitative) 방식으로 존재하는 임의의 벡터를 증폭시켰다. 각 벡터의 비-전사된 영역을 증폭하도록 프라이머를 디자인하였다 - CAG 인핸서 (하기 서열). 관련 시점에서, 반-정량적 측정을 위해 25 사이클 및 정성적 측정을 위해 35 사이클의 PCR을 사용하여 CAG 인핸서 DNA 서열의 존재에 대해 벡터 구조 샘플을 분석하였다.
서열: CAG 인핸서 :
정방향 프라이머: ACGCCAATAGGGACTTTCCA
역방향 프라이머: TAGGGGGCGTACTTGGCATA
반응 설정:
시약 부피
Q5 고신뢰도 DNA 폴리머라제 0.5μL
Q5 5x 반응 버퍼 5μL
10mM dNTPs 0.5μL
10μM 정방향 프라이머 1.25μL
10μM 역방향 프라이머 1.25μL
샘플 2μL
H2O 9.5μL
PCR 사이클 파라미터:
반-정량적 벡터 검출:
95℃ x 5분, 95℃ x 15초*, 60℃ x 30초*, 72℃ x 60초* (*는 25 사이클을 나타냄), 72℃ x 5분, 10℃에서 유지
정성적 벡터 검출:
95℃ x 5분, 95℃ x 15초**, 60℃ x 30초**, 72℃ x 60초** (**는 35 사이클을 나타냄), 72℃ x 5분, 10℃에서 유지
RNA 추출, cDNA 합성:
인간 세포주로부터 RNA 추출:
Qiagen RNeasy Minikit 및 이의 후속 프로토콜을 사용하여 전체 RNA 추출을 수행하였다. 추출하는 동안, 상기 RNA는 RQ1 DNase 키트 (Promega)를 사용하여 컬럼에서 DNase 처리하였다. 상기 Minikit는 세포 용해물로부터의 RNA에 결합하는 실리카 막을 사용하였다. 또한 고순도 RNA를 30μL의 무-RNase 물을 사용하여 컬럼으로부터 용출시킨 후에 -80 ℃에서 보관하였다. 용해하기 어려울 수 있는 세포의 경우, 균질화 단계 중에 플라스틱 페슬 (plastic pestle)을 사용하였다.
역전사효소를 사용하여 RNA로부터 cDNA 생성:
RNA 출발 산물은 사용하여 무작위 6량체 프라이머 (Promega)와 함께 Promega Moloney 뮤린 백혈병 역전사효소를 사용하여 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. 1μg의 RNA를 0.5μg (1μL)의 무작위 프라이머에 부가하여 H2O에서 총 부피 15μL로 제조하였다. 그 다음에 상기 샘플을 5분 동안 70℃로 가열하여 - 2차 구조 형성을 방지한 후에, 얼음에서 즉시 냉각시켰다. 후속하여, 표 10의 구성 성분들을 하기 순서로 부가하여 역전사효소 반응 및 cDNA 합성을 촉진하였다.
구성 성분
구성 성분 부피
M-MLV 반응 버퍼 5μL
dNTPs 5μL
RNAsin 0.6μL
M-MLV 역전사효소 1μL
dH2O 최대 25μL
그 다음에 상기 반응을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션한 후 -20℃에서 보관하였다.
iPSC 만능성 RT- PCR 특성 규명:
주요 만능성 인자의 내인성 발현을 역전사효소-PCR (RT-PCR) 증폭을 통해 결정하였다. RNA는 전술한 바와 같이 Qiagen RNeasy Minikit를 사용하여 단리하였다. cDNA 합성은 마찬가지로 무작위 6량체 프라이머와 함께 Promega Moloney 뮤린 백혈병 역전사효소를 사용하여 개시하였다. 그 다음에 cDNA를 RT-PCR 증폭을 위한 개시 산물로 사용하였다 - 내용물은 하기 표 11에 요약되어 있다.
구성 성분
구성 성분 부피
(5X) Q5 반응 버퍼 5 μL
10mM dNTPs 0.5μL
10μM 프라이머 (정방향/역방향) 2.5μL
cDNA 1.0μL
Q5 고신뢰도 DNA 폴리머라제 0.25μL
ddH2O 최대 25μL
프라이머
표적 정방향 프라이머 역방향 프라이머
내인성 OCT4 GCGATCAAGCAGCGACT TTCACCTTCCCTCCAACC
내인성 SOX2 CATGTCCCAGCACTACCAGA GGGTTTTCTCCATGCTGTTT
내인성 LIN28 TGTCCAAATGCAAGTGAG GCAGGTTGTAGGGTGATTCC
NANOG TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG
E-카드헤린 TGCCCAGAAAATGAAAAAG GTGTATGTGGCAATGCGTTC
RN18S1 ACACGGACAGGATTGACAGA GGACATCTAAGGGCATCACAG
PCR 사이클링 파라미터:
98℃ x 5분, 98℃ x 30초*, 55℃ x 30초*, 72℃ x 60초* (*는 35 사이클을 나타냄), 72℃ x 5분
실시예 1: 발현 비교 - GFP
본 발명자는 일단 세포로 형질감염된 벡터로부터 발현 강도를 조사하였다. 이는 GFP를 마커로 사용하여 수행하였고, GFP를 발현하는 닫힌 선형 DNA (dbDNA-eGFP) 벡터, 또는 닫힌 선형 DNA 벡터의 동일한 서열을 함유하고, 또한 GFP를 발현하지만, 닫힌 선형 DNA 벡터에 존재하지 않는 백본 서열을 포함하는 플라스미드 (proTLx 플라스미드-eGFP)로 세포를 형질감염시켰다. 그러므로 서로 다른 형식으로 제시된 동일한 서열들 간에 비교를 수행하였다. 상기 플라스미드는 OriP/EBNA1을 함유하지 않았다. 상기 세포를 형질감염시키고, GFP 양성 세포들 내에 발현 강도를 측정하였다. 상기 세포의 중앙 형광 강도 (MFI)의 분석을 수행하였다. MFI는 GFP 양성 세포 집단 내 발현 강도에 대한 데이터를 제공한다. 6개 시점에 걸쳐 dbDNA-eGFP 및 proTLx 플라스미드-eGFP 발현 세포 모두에 대한 중앙 형광 강도 값. 도 2a는 상기 결과의 플롯이다. 상기 MFI 값은 GFP 발현의 강도를 나타낸다. 도 2a로부터, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터에 대한 MFI 값이 비교 가능한 플라스미드의 MFI 값보다 높기 때문에, 상기 벡터의 구조가 유전자 발현에 중요하다는 결론을 도출하는 것을 볼 수 있다. 이러한 결과로부터, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 플라스미드의 유사한 서열보다 더 많은 GFP를 발현한다는 것이 분명하다.
상기 결과는 dbDNA-eGFP 벡터가 플라스미드 기반 proTLx 시스템에 대해 상당히 연장된 수명을 나타내는 것을 보여준다. 상기 벡터는 1일 이후의 모든 시점에서 세포의 더 높은 비율로 발현되었으므로, 그 발현은 실험 시간 과정 동안 유지되었다. proTLx 및 dbDNA 벡터들 모두에 대해 계산된 중앙 형광 강도 (MFI)는 dbDNA 벡터가 플라스미드 대응물보다 더 긴 수명으로 발현될 뿐만 아니라 마찬가지로 더 큰 강도로 발현됨을 보여준다.
상기 닫힌 선형 DNA 벡터로부터 발현을 추가로 분석하기 위해, 상기에서 설명한 방법을 사용하여, GFP 분해 키네틱스 분석을 완료하였다. 세포를 하기 중 하나로 형질감염시켰다: 닫힌 선형 DNA (dbDNA), 닫힌 선형 DNA가 유래된 플라스미드 (proTLx) 또는 OriP/EBNA1을 부가한 proTLx. 형질감염으로부터 최대 20일까지 6개의 시점에서 발현 세포로부터 측정을 수행하고, 도 2b에서와 같이 플로팅하였다. 이러한 결과는 상기 닫힌 선형 DNA 벡터가 실험 과정을 따라 최고 수준의 발현을 허용하였음을 보여주었다.
실시예 2: OriP - EBNA1 벡터에 대한 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용한 재프로그래밍.
닫힌 선형 DNA 재프로그래밍 벡터가 원하는 단백질 생성을 상향조절하고 (데이터는 표시되지 않음) 상대적 기능을 나타내는 확인 분석 (confirmatory analysis) 후에, 재프로그래밍 실험을 수행하였다. 상기 OriP-EBNA1 구조체는 또한 비교 목적으로 실험 내에서 활용되었으며, 상기 닫힌 선형 DNA에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다 (도 1). 실험실 프로토콜 (표 8)에 따라 배양하기 전에 닫힌 선형 DNA 또는 OriP-EBNA1 벡터들의 총 8μg으로 HDF를 개별적으로 형질감염시켰다. 2017년에 조직 검사를 수행하여 바텐병으로 진단된 환자로부터 단리된 CLN3-HDF를 먼저 활용하였다. 상기 세포는 이전의 재프로그래밍 실험을 통해 만능성 능력을 가지고 있음이 입증되었고, 초기 iPS 세포를 생성하는 것으로 입증되었지만 성공적으로 안정화되지 않았다. 그러므로 이러한 세포들은 재프로그래밍에 대해 상대적으로 저항성이거나 또는 비타협적이었다.
도 3은 이 실험 중에 개발된 초기 콜로니의 예를 보여준다. A로 표시된 것은 닫힌 선형 DNA 벡터로, B는 OriP-EBNA1 벡터로 형질감염되었다.
후속하여, 세포를 iPS 발달의 성숙기를 통해 이식유전자 비의존성 안정화기로 매개하기 위해 상기 세포를 계속하여 계대하였다. 이 실험 이전에, CLN3-hDF로부터 생성된 iPS 세포는 진정한 (bona-fide) iPS 세포를 생성하기 위해 안정화를 거치지 않았다. 또한, OriP-EBNA1 벡터로부터 이 재프로그래밍 실험으로부터 생성된 세포는 계대 5를 초과하여 안정화되지 않았으며, 자발적 분화를 겪었다 (데이터는 표시되지 않음). 그러나, dbDNA 재프로그래밍 벡터로부터 생성된 iPS 세포는 계대 18에서 여전히 지속되는 보다 안정된 성질의 iPS 세포를 생성하였다.
상기 세포의 관련 사진은 도 4 및 5에 도시되어 있다.
이는 닫힌 선형 DNA 벡터가 이전에 대체 벡터를 사용하는 재프로그래밍 방법에 내성이 있었던 공여체 세포에서 재프로그래밍 인자의 발현에 효과적인 비히클이라는 것을 보여준다. 실제로, 상기 표준 플라스미드는 이 실험에서 세포를 재프로그래밍하지 못하였다.
실시예 3: 만능성의 결정
형태학적으로 iPS 세포와 유사한 세포를 생성한 후에, 본 발명자는 상기 세포가 만능성 세포로도 기능하는지 확인하기 위해 특성화 시험을 수행하였다. 그러므로 상기 세포가 본질적으로 만능성이고, 주요 만능성 마커를 발현하는지 결정하기 위해, 면역세포화학적 염색 (ICC)을 사용하였다. 이식유전자 관련 및 내인성 모두 유사하게 다수의 마커를 선택하였다. OCT4 및 SOX2는 선택된 만능성의 이식유전자 특이적 마커이다. OCT4 및 SOX2는 모두 만능성의 재구성 및 세포 자가-재생 능력의 유지에 중요하고 - 그러므로 iPS 세포는 이러한 만능성 마커의 존재에 대해 양성으로 염색되어야 한다. 그러나 형질감염된 이식유전자를 통해 과발현되지 않는 만능성 마커를 염색하는 것도 중요하다. TRA-1-81은 미분화된 세포에서 일반적으로 발현되고 분화 중에 상당히 하향조절되는 케라틴 설페이트 프로테오글리칸이다. 그러므로 양성으로 발현되는 내인성 마커는 상기 세포가 만능성을 재구성하기 위해 완전한 재프로그래밍을 거쳤음을 보여준다. 또한, 다른 내인성 만능성 인자인 NANOG는 dbDNA iPS 세포에서 염색되었지만, OriP-EBNA1 iPS 콜로니는 이 시점까지 분화를 겪었고, 추가의 데이터는 수집될 수 없었다. NANOG는 만능성 세포 분열 및 자가-재생을 유지하도록 작용하는 전사 인자이다.
다시, 닫힌 선형 벡터는 재프로그래밍 벡터가 표준 에피솜 재프로그래밍 플라스미드에 포함된 세포보다 더 양호하게 수행되는 재프로그래밍된 세포를 생성하였다.
도 6은 만능성 마커에 대한 iPS 세포의 면역세포화학적 염색 (ICC)을 보여준다.
만능성 인자에 대한 ICC 염색을 사용한 성공적인 특성화 후에, 추가 특성화 시험을 수행하였다. 만능성 세포는 3개의 배엽층의 세포로 분화하는 능력을 유지한다. 그러므로 재프로그래밍 중에 형성된 iPS 세포는 분화하여, 내배엽, 외배엽 및 중배엽 마커를 발현하는 세포를 형성할 수 있어야 한다. dbDNA 재프로그래밍 벡터 구조체로부터 생성된 iPS 세포를 선택하여 배아체 (EB)를 형성한 후에 재-플레이팅하여 자발적인 성장을 허용하였다.
후속하여, 플레이팅된 EB로부터 유래된 임의의 자발적인 성장은 3개의 배엽층의 세포에 해당하는 마커에 대해 염색되었다. 첫째, 상기 세포를 외배엽 발달에 주로 관여하는 전사 인자이므로, 확정적인 외배엽 마커인 SOX17에 대해 염색하였다. 마찬가지로, B-III-튜불린은 뉴런 특이적 마커이고, 이는 뉴런 수행의 최초 마커들 중 하나이므로, 내배엽 마커 존재에 대한 완벽한 후보이다. 마지막으로, 중배엽 특이적 마커와 관련하여, 고도로 보존된 세포골격 단백질이고, 일반적으로 사용되는 α-평활근 액틴 (α-SMA)을 사용하였다. 따라서, 이러한 3가지 마커들에 대해 염색된 결과물은 dbDNA 재프로그래밍 구조체들에 의해 생성된 iPS 세포의 분화 잠재력에 대한 통찰력을 제공해야 한다.
이들 세포의 사진을 도 7 및 8에 도시되어 있다. 상기 세포는 iPS 세포에 대해 예상한 바와 같이 거동하여, 닫힌 선형 DNA가 재프로그래밍을 수행하는데 효과적인 벡터임을 보여준다.
후속하여, dbDNA에 의해 생산된 iPS 세포의 특성화의 마지막 단계는 RT-PCR 분석이었다. ESC 대조군과 비교하여 다수의 만능성 유전자의 내인성 발현에 대해 반-정량화를 수행하기 전에 RNA를 단리 및 역전사하였다. OCT4, SOX2 및 LIN28은 모두 이식유전자 발현 만능성 인자인 반면, NANOG 및 E-카드헤린은 비의존성 내인성 만능성 인자이다. RT-PCR의 전제는 리보솜 단백질 (RN18S1) 대조군과 함께, 내인성 만능성 유전자 발현에 대한 반-정량적 통찰력을 제공하는 것이다. 결과는 도 16에 도시되어 있다.
닫힌 선형 DNA 벡터에 의해 생성된 iPS 세포는 ICC 염색에서 양성 결과를 생성하는 많은 확인 분석들을 거쳤다. 따라서, 상기 세포는 이식유전자-유래뿐만 아니라 내인성으로 발현되는 만능성 유전자를 발현하는 것으로 나타났다. 이는 상기 세포가 만능성 능력을 가지고 있음을 나타낸다. ICC 염색은 iPS 세포에서 수행되는 표준 절차이다. 상기 닫힌 선형 DNA 형질감염 시스템은 다른 방법으로 형질감염된 세포에 동일한 양성 염색을 제공하며, 상기 벡터의 부가된 특징은 일시적인 임상-등급 DNA 벡터이다. 또한, 2개의 세포 타입의 정성적 검사에서 언급된 일반적인 특징은 닫힌 선형 DNA를 사용하여 생성된 iPSC가 자발적 분화에 대한 경향이 감소된 것처럼 보인다는 것이다. 상기 iPSC가 만능성 배지 중에 있는 동안, 닫힌 선형 DNA를 사용하여 만든 iPSC는 OriP-EBNA1을 사용하여 생성된 iPSC보다 더 큰 정도로 만능성 능력을 유지하는 것으로 보인다. 이는 닫힌 선형 DNA로부터 이식유전자의 보다 일시적인 발현을 포함한, 여러 가지 이유일 수 있다. 그러나 배양 중에 최소 분화 수준을 유지함에도 불구하고, 상기 iPS 세포는 필요할 때 분화하고 3개의 배엽층들의 세포를 형성하는 능력을 여전히 전달하는 것으로 입증되었다. 따라서, 이러한 세포는 만능성 줄기세포의 모든 특성을 보여준다.
대부분의 이전 문헌은 OriP-EBNA1 시스템과 무관한 표준 에피솜 플라스미드 재프로그래밍과 관련된 어려움을 개시하였다. 플라스미드 단독으로는 너무 일시적이어서 완전한 재프로그래밍을 유도하지 못한다 - 이후 실시예에 개시된 바와 같음 (proTLx 시스템). 따라서 종양바이러스-유래 OriP-EBNA1 시스템의 사용은 벡터 수명을 연장하는데 사용되었고, iPS 세포 생성을 훨씬 넘어서는 기간 동안 사용되었다. 단일 형질감염으로부터 GMP 등급의 박테리아 서열이 없는 DNA로 구성된 닫힌 선형 DNA 벡터는 여러 hDF 세포주로부터 iPS 세포를 생성할 수 있다. 상기 구조체는 고기능성 iPS 세포를 생성하는 것으로 입증되었다. 그러므로 이 시스템은 임상 등급의 iPS 세포를 더 높은 안정성 (만능성 세포로 배양될 때 분화가 적음)으로 생성할 수 있는 보다 안전한 재프로그래밍 벡터의 새로운 세대를 나타낸다.
실시예 4: 추가 재프로그래밍 연구
다수의 상이한 기원 유래의 재프로그래밍 섬유모세포 내에서 닫힌 선형 DNA 벡터 능력을 결정하기 위해 다수의 추가 재프로그래밍 실험을 수행하였다. 다른 바텐병 유전자 변이체인 CLN7로부터의 섬유모세포는 대조군 신생아 섬유모세포와 함께 사용되었다. 이는 상기 구조체가 건강한 대조군 섬유모세포뿐만 아니라 "질병 상태" 섬유모세포를 재프로그래밍할 수 있는 능력을 갖는 지를 결정하기 위한 것이다. 결과는 도 9에 도시되어 있다. 또한, 소변으로부터 단리된 신장 세포 및 말초혈로부터 단리된 단핵구를 포함하여, 기원이 상이한 세포들을 재프로그래밍하였다.
닫힌 선형 DNA 벡터 및 OriP-EBNA1 구조체들 모두로 형질감염에 의해 생성된 iPS 세포들을 확인 염색하여 내인성 및 이식유전자-발현 만능성 인자들 모두의 발현이 있는지 확인하였다. 결과는 도 13에 도시되어 있다. 이 실시예에서, 벡터들 모두는 공여체 세포를 재프로그래밍할 수 있었다.
실시예 5: 이전에 비타협적인 세포의 재프로그래밍
이전에 OriP/EBNA1 구조체로 재프로그래밍한 후 불안정하여 안정한 iPSC를 생성하지 못했던 CLN3 바텐병 환자로부터 채취한 진피 섬유모세포에서 추가 재프로그래밍 실험을 수행하였다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터가 이러한 세포를 재프로그래밍하고 안정한 iPS 세포를 생성할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 실험을 수행하였다.
닫힌 선형 DNA 벡터 및 OriP-EBNA1 벡터들 모두를 섬유모세포를 형질감염시키는데 사용하였다. 계대 1에서 (도 11), 벡터들 모두는 재프로그래밍을 유도할 수 있었지만, 이후에 데이터 (개시되지 않음)에서 표준 에피솜 플라스미드 (OriP/EBNA1)는 분화 없이 재프로그래밍된 세포를 유지할 수 없는 반면 닫힌 선형 DNA로 형질감염된 세포는 이의 만능성을 유지할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: 재프로그래밍: 음성 대조군, proTLx 플라스미드, 닫힌 선형 DNA (dbDNA) 및 OriP-EBNA1 플라스미드의 비교.
물질 및 방법: 표 13a, b 및 c - 재프로그래밍을 위한 DNA 벡터
구조체 농도
proTLx-hSK 2.33μg
proTLx-hUL 2.33μg
proTLx - OCT4 2.33μg
구조체 농도
dbDNA-hSK 2.33μg
dbDNA-hUL 2.33μg
dbDNA-OCT4 2.33μg
플라스미드 카탈로그 번호
pCXLE-hSK Addgene ID: 27078
pCXLE-hUL Addgene ID: 27080
pCXLE-hOCTshp53 Addgene ID: 27077
pCXLE-EBNA1 Addgene ID: 37624
90μL NHDF NucleofectorTM 용액 + 20μL의 보충제 1 (LONZA: VPD-1001)로 구성된 110μl의 뉴클레오펙터 용액을 생성하였다. dbDNA, OriP-EBNA1 및 proTLx-K에 대한 총 8μg의 DNA를 상기 뉴클레오펙터 용액에 개별적으로 예입하였다. ~ 4.5 x 105 hDF를 뉴클레오펙터/DNA 용액 중에 재현탁시킨 후에 큐벳으로 옮기고, 뉴클레오펙션하였다 (P-022 프로그램: 인간 진피 섬유모세포 - 높은 생존율). 그 다음에 세포를 완전 DMEM 중에 단일 6-웰에 시딩하였다 - 이를 0일로 간주하였다.
1일차에, 상기 배양 배지를 새로 교체하고, 2일마다 계속하여 교체하였다. 8일차에, 상기 재프로그래밍 hDF는 150μL/cm2 TrypLE을 사용하여 분리시키고, 피더층 iMEF를 함유하는 단일 6-웰에 30,000개의 세포를 재-플레이팅하였다. 또한, 24시간 후에, 상기 세포 배지를 완전 DMEM에서 hESC 배지로 교체하고, 2일마다 보충하였다. 후속하여, 28일차에, 상기 세포를 생존 가능한 콜로니 형성을 결정하기 위해 알칼리 포스파타제 염색을 수행하였다. 단일 SIGMAFAST™ BCIP®/NBT (B5655) 정제를 실온에서 10mL의 DPBS 중에 완전히 용해시켰다. 2mL의 SIGMAFAST™ BCIP®/NBT 용액을 상기 웰에 부가하기 전에 임의의 배양 배지를 먼저 제거하였다. 암실에서 ~ 30-60분 동안 실온 인큐베이션한 후에, 생존 가능한 콜로니의 존재를 나타내기 위해 색상을 변화시키는 EVOS XL 코어 세포 이미징 시스템 (Core Cell Imaging System)을 사용하여 콜로니를 분석하였다. 생존 가능한 콜로니의 존재를 나타내기 위해 색상을 변화시키는 EVOS X1 코어 세포 이미징 시스템을 사용하여 콜로니를 분석하였다.
결과는 도 10 내지 12에서와 같이 도시하였다. 이 데이터는 재프로그래밍에 필요한 것이 서열만이 아님을 분명히 보여준다; 상기 닫힌 선형 DNA의 구조가 중요하다. 상기 닫힌 선형 DNA 벡터 서열을 함유하는 플라스미드 (세포를 재프로그래밍하지 못함)를 사용한 실험은 이러한 결론을 뒷받침한다.
실시예 7: 벡터 구조
벡터 특이적 프라이머를 사용하여, 뉴클레오펙션 1일 후 및 뉴클레오펙션 35일 후에, OriP-EBNA1 벡터에 대한 닫힌 선형 DNA 벡터의 보유를 반-정량적으로 평가하였다. 상기 방법 섹션에 기재된 바와 같이 벡터를 구조한 다음, 25 및 35 사이클로 PCR 증폭하였다. 사이클링 조건들 모두에서, OriP-EBNA1 벡터가 닫힌 선형 DNA 벡터보다 더 많은 정도로 보유되는 것이 분명하였다.
결과는 도 14a 및 14b에 도시되어 있다. 상기 결과는 동등한 OriP-EBNA1 벡터와 비교할 때, 세포가 시험된 시점에서 닫힌 선형 DNA 벡터가 더 적은 양으로 보유된다는 것을 분명히 보여주었다.
실시예 8: 만능성의 세포 표면 마커
본 발명의 방법 (닫힌 선형 DNA) 또는 표준 OriP-EBNA1 벡터를 사용하여 유도된 iPSC는 세포 표면 마커에 대한 관련 항체를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다.
세포 표면 항원 발현은 이전에 기재된 바와 같이, 트립신-EDTA를 사용하여 단일 세포 현탁액으로서 배양물을 수확한 후 유동 세포형광법에 의해 검출된 면역형광에 의해 평가되었다 (Andrews PW, et al. In: Robertson EJ, editor. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. Oxford: IRL Press; 1987. pp. 207-248, and Andrews PW, et al. Cancer Res. 1987;47:740-746.).
하기 모노클로날 항체를 사용하여 표면 항원 발현을 검출할 수 있다:
항-단계 특이적 배아 항원-3 (SSEA3), 항-단계 특이적 배아 항원-1 (SSEA1), TRA-1-60 및 TRA-1-81.
SSEA1의 경우, 이소타입 대조군에서 제시된 배경 염색을 기반으로, SSEA-1 양성 세포를 결정하기 위해 40의 상대 형광 유닛의 역치를 사용하였고, 히스토그램 아래 면적은 퍼센트를 결정하기 위해 이들 위아래를 계산하였다. EBNA1 유도 세포에서 더 많은 양성 세포가 관찰되어, 현재의 최신 기술에 따라 유도된 세포는 분화가 일어나기 시작하고, 만능성이 소실되기 시작하였다는 결론에 이르렀다.
도 17은 SSEA1 샘플링의 결과를 도시하였다.
실시예 9: iPSC에서 유전자 발현의 RNA 시퀀싱
분석:
고처리량 시퀀싱 (High throughput sequencing)을 전체 RNA 준비에서 Illumina NextSeq 550 플랫폼에서 수행하였다. 서열 QC 분석 후에, 닫힌 선형 DNA 벡터 (dbDNA) 또는 oriP-EBNA1 벡터에 의해 유도된 만능성 세포로부터의 프로브는 컷오프 p-값 (cut off p-value)이 ≤0.05인 student's t-테스트 분석을 수행하였다. 이로부터, 상기 결과는 FDR (False Discovery Rate)을 결정하기 위해 Benjamini-Hochberg 분석을 수행하였다. 이는 타입 1 오류의 가능성을 줄여 데이터세트 내에 위양성 결과 (false positive results)의 포함을 제한하기 위한 것이다. FDR 컷오프 ≤0.05가 사용되었다. 후속하여, 닫힌 선형 DNA (dbDNA) 및 oriP-EBNA1 벡터를 사용하여 유도된 세포들 간에 배수 변화 발현 (fold change expression)을 계산하고, ≥1.5의 배수 변화 차이를 갖는 프로브를 앞으로 가져 왔다.
이러한 중요한 프로브를 사용하여, 소프트웨어를 사용하여 전사 인자 농축 항목을 결정하였다. Reactome 데이터베이스 (https :// reactome . org)는 세포주기, 대사작용, 면역 기능 등과 관련된 상호작용 경로를 밝히는데 도움이 되는 유의한 프로브를 인간 게놈에 투영하는데 사용되었다. 또한, GSEA (Gene Set Enrichment Analysis)로부터 MSigDB 기능을 사용하여 농축 분석 (enrichment analysis)을 수행하였다. 그 다음에 이 기능은 MSigDB 시스템 내의 유전자 세트들 간 중복을 통해 생성된 특별히 잘-정의된 생물학적 과정을 요약하여 나타내는 홀마크 유전자 (hallmark genes)에 대한 정보를 제공할 수 있다. 후속하여, 상기 분석은 각각의 주어진 유전자 세트에 대한 변화가 얼마나 유의한지를 보여주는 각 홀마크 과정에 대한 p-값을 제공할 수 있고; 통계의 절대 값이 높을수록, 그 유의도는 더 커진다. GSEA는 또한 k/K 값을 제공하고, 여기서 k = 쿼리 세트의 유전자 수, K = MSigDB 데이터베이스의 유전자 수이다. 그러므로 이는 각 유의한 프로브에 대한 생물학적 과정의 변화 방향에 대한 정보를 제공할 수 있다. 마지막으로, 다중 가설 검정에 대한 수정 후 p-값의 FDR 유사체이고, 다시 위양성 결과를 포함할 가능성을 줄이는, q-값이 제공된다.
히트맵 생성:
상기 분석 후에, 프로브 발현 값을 히트맵으로 발전시켜서 다양한 세포 타입에 대한 유전자 발현 프로필의 전체적인 시각화를 제공할 수 있다. 히트맵은 R 스튜디오를 사용하여 생성되었다.
수득된 결과의 히트맵은 도 18a 및 18b 및 도 19a 및 19b에 도시되어 있다.
히스토그램 생성:
상기 분석 후에, 특정 유전자 또는 특정 유전자 그룹에 대한 특정 유전자 발현 프로파일을 수득할 수 있다. 다양한 유전자 발현 패턴이 도 20a 및 20b 및 21 (A 및 B)에 도시되어 있다.
도 20a 및 20b는 면역계 및 선천성 면역에서 사이토카인 신호전달에 대한 유전자 발현을 도시한다. 이러한 유전자는 닫힌 선형 DNA (dbDNA) 매개 iPSC 생성과 비교할 때, OriP/EBNA1 유도 세포에서 가장 많이 표현되는 reactomes임을 알 수 있다. 닫힌 선형 DNA 유도 iPSC에 비해 OriP/EBNA1 iPSC에서 가장 현저하게 과다 표현된 전사체를 Reactome 경로 분석을 사용하여 분석하였다.
도 21 (A 및 B)은 reactomes 하위-카테고리화를 도시하였다. 결과는 인터페론 알파, 베타 및 감마 신호전달이 닫힌 선형 DNA (dbDNA) 매개 iPSC 생성과 비교할 때, OriP/EBNA1 유도된 세포에서 가장 강하게 과다-표현된다는 것을 보여주었다. 인터루킨 및 NF-KB 염증성 신호전달이 또한 과다-표현되었다.
실시예 10: 정량적 RT- PCR
표준 OriP/EBNA1 벡터 또는 닫힌 선형 DNA에 의해 유도된 iPSC에서 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 특히, 인터페론 신호전달, 선천성 면역계 및 염증 마커와 관련된 유전자, 또는 중배엽 형성 및 초기 내배엽을 나타내는 전사체를 조사하였다. 전체 RNA는 표준 방법을 사용하여 세포로부터 추출되었다.
밝혀진 결과는 하기와 같다:
도 22 (A 내지 G)는 닫힌 선형 DNA (dbDNA)-유도 iPSC에 대한 OriP/EBNA1 유도 iPSC에서 인터페론 신호전달의 비교 및 정량적 RT-PCR 결과를 나타낸다. 전체 RNA를 OriP/EBNA1 에피솜 플라스미드 또는 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하여 생성된 세포들로부터 추출하였다. 모든 선천성 IFN 신호전달-관련 전사체는 dbDNA-iPSC에 비해 OriP/EBNA-iPSC에서 상승하였다.
도 23 (A 및 B)는 닫힌 선형 DNA (dbDNA)-유도 iPSC에 대한 OriP/EBNA1-유도 iPSC에서 염증 마커의 비교 및 정량적 RT-PCR 결과를 나타낸다. 전체 RNA는 OriP/EBNA1 에피솜 플라스미드 또는 닫힌 선형 DNA 벡터를 사용하여 생성된 iPSC로부터 추출되었다. HMOX1 (산화 스트레스 마커) 및 NFKB1 (염증 마커)은 닫힌 선형 DNA-iPSC에 비해 OriP/EBNA1-iPSC에서 상향조절되었다.
도 24 (A 내지 D): 닫힌 선형 DNA-iPSC (doggybone/dbDNA)에 비해 OriP/EBNA1-iPSC에서 분화 마커의 상향조절을 나타낸다. 정량적 RT-PCR을 사용하여 초기 분화의 마커로서 중배엽 형성 및 초기 내배엽을 나타내는 전사체를 평가하였다. 모든 경우에, 정상 상태 조건에서 배양된 닫힌 선형 DNA (dbDNA)-iPSC에 비해 OriP/EBNA1-iPSC에서 초기 분화 마커가 증가하였다. 또한, 본 발명자들은 닫힌 선형 DNA-iPSC에 비해 OriP/EBNA1-iPSC에서 세포주기 억제제인 CDKN1A (p21)의 발현 증가에 주목하였다. CDKN1A-매개 증식 억제는 만능성 줄기세포의 분화에 대한 추가적 지표이다.
SEQUENCE LISTING <110> Touchlight IP Limited <120> Reprogramming vectors <130> P9831WO1 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CAG Enhancer <400> 1 acgccaatag ggactttcca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CAG Enhancer <400> 2 tagggggcgt acttggcata 20 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for OCT 4 <400> 3 gcgatcaagc agcgact 17 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for OCT 4 <400> 4 ttcaccttcc ctccaacc 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SOX2 <400> 5 catgtcccag cactaccaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SOX2 <400> 6 gggttttctc catgctgttt 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for LIN28 <400> 7 tgtccaaatg caagtgag 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for LIN28 <400> 8 gcaggttgta gggtgattcc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NANOG <400> 9 tttgtgggcc tgaagaaaac t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NANOG <400> 10 agggctgtcc tgaataagca g 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-Cadherin <400> 11 tgcccagaaa atgaaaaag 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-Cadherin <400> 12 gtgtatgtgg caatgcgttc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RN18S1 <400> 13 acacggacag gattgacaga 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RN18S1 <400> 14 ggacatctaa gggcatcaca g 21

Claims (21)

  1. 유도 만능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)를 제조하기 위한 하나 이상의 재프로그래밍 인자 (reprogramming factors)를 코딩하는 닫힌 선형 (closed linear) DNA 벡터의 용도.
  2. 유도 만능성 줄기세포 (iPSC)를 제조하는 방법으로서,
    하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 닫힌 선형 벡터(들)를 체세포 집단에 도입하는 단계, 및
    상기 하나 이상의 재프로그래밍 인자(들)가 발현되도록 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 2개 이상의 닫힌 선형 DNA 벡터가 제공되고, 각각은 하나 이상의 상이한 재프로그래밍 인자를 코딩하는 것인 용도 또는 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재프로그래밍 인자는 Oct 3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox18, Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, c-myc, L-myc, 및 N-myc, NANOG, 및/또는 LIN28 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 것인 용도 또는 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 EBNA1, 또는 EBNA1의 기능적 유도체 또는 변이체, 및/또는 OriP, 또는 OriP의 기능적 유도체 또는 변이체가 결여되어 있는 것인 용도 또는 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 p53의 녹다운 (knockdown)을 위한 임의의 서열이 결여되어 있는 것인 용도 또는 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 바람직하게는 상기 닫힌 선형 DNA 벡터 상의 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것인 용도 또는 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 하기 중 하나 이상이 결여되어 있는 것인 용도 또는 방법:
    (i) 박테리아 CpG 모티프;
    (ii) 박테리아 복제 기원; 및/또는
    (iii) 항생제 내성 유전자.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터가 체세포, 선택적으로 성숙한 체세포에 도입되는 것인 용도 또는 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 닫힌 선형 DNA 벡터는 형질감염 (transfection)을 통해, 선택적으로 뉴클레오펙션 (nucleofection)을 통해 도입되는 것인 용도 또는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 세포는 형질감염 또는 뉴클레오펙션 후 재프로그래밍이 완료되기 전 약 30일 동안, 바람직하게는 28일 내지 32일 동안 배양되는 것인 용도 또는 방법.
  12. 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 닫힌 선형 DNA 벡터로 유도된 만능성 줄기세포 집단.
  13. 청구항 12에 있어서, 각각이 하나 이상의 상이한 재프로그래밍 인자를 코딩하는, 2개 이상의 닫힌 선형 DNA 벡터로 유도된 세포가 제공되는 것인 세포 집단.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 닫힌 DNA 벡터는:
    (i) Oct 3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox18, Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, c-myc, L-myc, 및 N-myc, NANOG, 및/또는 LIN28 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된, 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하고;
    (ii) EBNA1, 또는 EBNA1의 기능적 유도체 또는 변이체, 및/또는 OriP, 또는 OriP의 기능적 유도체 또는 변이체가 결여되어 있으며;
    (iii) p53의 녹다운을 위한 임의의 서열이 결여되어 있고; 및/또는
    (iv) 하기 중 하나 이상이 결여되어 있는 것인 세포 집단:
    (a) 박테리아 CpG 모티프;
    (b) 박테리아 복제 기원; 및/또는
    (c) 항생제 내성 유전자.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 세포는 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 용도 또는 방법에 따라 제조되는 것인 세포 집단.
  16. 청구항 12 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 치료 및/또는 GMP 등급인 것인 세포 집단.
  17. 청구항 12 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 이들을 유도하는데 사용되는 닫힌 선형 DNA 벡터가 결여되어 있는 것인 세포 집단.
  18. 청구항 12 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, OriP/EBNA1 벡터로 유도된 만능성 줄기세포보다 배아 줄기세포 (embryonic stem cells)에 표현형이 더 가까운 것인 세포 집단.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 표현형은 하기로부터 선택될 수 있는 것인 세포 집단:
    (i) 분화에 대한 마커;
    (ii) 만능성에 대한 마커;
    (iii) 면역계 유전자 발현;
    (iv) 사이토카인 신호전달;
    (v) 인터페론 신호전달; 및/또는
    (vi) 염증 반응.
  20. 청구항 12 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 안정하고, 선택적으로 계대 (passaging) 중에 자발적 분화에 저항하거나 또는 이를 지연시키는 것인 세포 집단.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 인간의 것인 용도, 방법 또는 세포 집단.
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