CN109988750A - 一种视网膜色素上皮细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种视网膜色素上皮细胞的培养方法，其包括以下步骤：(1)将视网膜色素上皮细胞按照3×104‑4×104/cm2的密度接种于细胞板或细胞瓶中；(2)所述细胞培养230‑250小时后，消化；使用所述方法，视网膜色素上皮细胞在冻存复苏后具有高细胞活性。
Description
技术领域
本发明总体上涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种人视网膜色素上皮细胞的培养方法。
背景技术
RPE是位于视网膜外部的连续单层细胞，因其筛子状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能，例如吞噬消化脱落的光感受器细胞的外节(OS)、促进视循环中重要的介质11-顺式视黄醛的再生、调节眼内的免疫反应、参与形成视网膜-血管屏障等。RPE细胞的这一生理功能的异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关，例如RPE细胞屏障功能异常则易导致Best卵黄样黄斑营养不良(Bestvitelliform macular dystrophy，BVMD)和成人卵黄样黄斑营养不良(adult-onsetvitelliform macular dystrophy，AVMD)。RPE基底膜与Bruch’s membrane之间的连接或功能异常被认为与年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)和Sorsby’s眼底营养不良的发生相关。
原代培养出的成纤维细胞呈短梭形、多角形或不规则形；体外培养连续多次传代后获得形态较均一的成纤维细胞，以梭形为主，细胞呈放射状排列。目前市场上存在的视网膜色素上皮细胞培养工艺一般在30-60天左右，周期很长，需要消耗大量培养基；且冻存复苏后的人视网膜色素上皮细胞，其色素分布很不均一，分化程度很不一致。因此在临床应用上，人视网膜色素上皮细胞特有功能不仅损失较大，临床效果也不好。
由于普通的方案，例如台盼蓝染色不能有效分选出具有临床高活性的的细胞，因此，提供在不影响细胞功能的前提下可大幅度提升冻存细胞复苏后的存活率的新方法，将对人类视网膜色素上皮细胞的研究提供理论支持，对细胞的传代、制备、研究以及对最终临床效果的保证提供了便利。
发明内容
本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞(RPE)的培养方法，其包括以下步骤：
(1)将视网膜色素上皮细胞按照3×104-4×104/cm2的密度接种于细胞板或细胞瓶中；
(2)所述细胞培养144小时至250小时之间后，消化；
使用所述方法，视网膜色素上皮细胞在冻存复苏后具有高细胞活性。
在一个实施例中，所述视网膜色素上皮细胞为原代来源的人视网膜色素上皮细胞。
在一个具体实施例中，所述细胞板为细胞培养六孔板。
在一个具体实施例中，所述视网膜色素上皮细胞细胞的接种量为3×105/孔。
在一个实施例中，所述细胞培养时间为144-250小时，优选230-250小时，更优选为235-245小时，最优选为240小时。
在一个实施例中，前述的方法还包括以下步骤：
(3)将消化后的细胞冻存；
(4)复苏细胞。
在一个具体实施例中，前述方法还包括以下步骤：
(5)计算细胞冻存复苏后的贴壁率，所述细胞的冻存复苏后贴壁率≥80％，优选≥90％时，该细胞可作为合格细胞进行后续使用。
在一个具体实施例中，所述细胞的冻存复苏后贴壁率优选≥95％。
另一方面，本发明公开了一种判断视网膜色素上皮细胞冻存复苏后细胞活力的方法，其包括以下步骤：
(1)将冻存后的视网膜色素上皮细胞复苏并培养；
(2)计算细胞的贴壁率；
使用贴壁率判断视网膜色素上皮细胞冻存复苏后细胞活力，其中，所述细胞冻存复苏后贴壁率≥90％，表示为复苏后的细胞具有高活力。
在一个实施例中，所述方法不包括使用台盼蓝染色测定复苏离心后的细胞活性率。
在一个实施例中，所述视网膜色素上皮细胞为人视网膜色素上皮细胞，优选为原代来源的人视网膜色素上皮细胞。
有益效果
本发明所采用培养方法较市场上已存在的培养时间工艺有明显的提升，能缩短视网膜色素上皮细胞的培养周期，细胞同步化很好，能在很窄的时间窗获得纯度和均一性很高的细胞，同时保持细胞复苏后的活率、贴壁率，对细胞的损伤大大降低，从而在临床应用上更有优势。
附图说明
图1示出人视网膜色素上皮细胞的培养时间和细胞数量关系图。
图2示出人真皮成纤维细胞的培养时间和细胞数量关系图。
具体实施方式
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
以下实施例中的谷氨酰胺、非必须氨基酸购自LIFE TECHOLOGISE公司；DPBS(CTS)购自GIBCO公司；DispaseⅡ购自ROCHE罗氏公司；胰酶购自INVITROGEN公司；αMEM培养基、N1添加剂、牛磺酸、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸购自SIGMA公司；人血小板裂解液购自HELIOS公司。Cryo-SFM购自PromoCell公司。
本次展示的实施案例为2组，分别选取了同为贴壁细胞的人视网膜色素上皮细胞、人真皮成纤维细胞。两组案例同时培养至增殖平台期后收集冻存，然后复苏计算活率、贴壁率。
实施例1：人视网膜色素上皮细胞(RPE)培养
按照表1中的配方配置RPE培养基。
表1
按照以下步骤分离冻存人视网膜色素上皮细胞：
(1)取6孔板1个，每孔接种人视网膜色素上皮细胞30万个，共计接种5孔，放入二氧化碳培养箱培养。
(2)培养至144小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。剩余细胞换液。
(3)培养至192小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。剩余细胞换液。
(4)培养至240小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。剩余细胞换液。
(5)培养至288小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。剩余细胞换液。
(6)培养至336小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。
(7)将细胞取出，迅速置于37℃恒温水浴锅中预温1分30秒，然后置于9倍体积的RPE完全培养基中，以2000rpm/分钟，5分钟为条件离心。
(8)将离心后的细胞计算细胞量、活率，然后接种至6孔板中，每组接种2孔，放入二氧化碳培养箱中培养20小时。
(9)20小时后取出6孔板，吸去上清，用DPBS 2mL洗涤2次，加入胰酶0.5mL进行消化，3分钟后进行计数计算贴壁率。
表2
实施例2：人真皮成纤维细胞的培养
按照表3中的配方配置人真皮成纤维细胞培养基。
表3
按照以下步骤分离冻存人真皮成纤维细胞：
(1)取6孔板1个，每孔接种人真皮成纤维细胞10万个，共计接种5孔，放入二氧化碳培养箱培养。
(2)培养至96小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。剩余细胞换液。
(3)培养至144小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。剩余细胞换液。
(4)培养至192小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。剩余细胞换液。
(5)培养至240小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。剩余细胞换液。
(6)培养至288小时，取1孔细胞进行消化，计数，根据计数结果加入适量冻存液，放入冻存盒中转入超低温冰箱，第二天转入液氮中保存。
(7)将细胞取出，迅速置于37℃恒温水浴锅中预温1分钟30秒，然后置于9倍体积的真皮成纤维细胞培养基(表3)，以2000rpm/分钟，5分钟为条件离心。
(8)将离心后的细胞计算细胞量、活率，然后接种至6孔板中，每组接种2孔，放入二氧化碳培养箱中培养20小时。
(9)20小时后取出6孔板，吸去上清，用DPBS 2mL洗涤2次，加入胰酶0.5mL进行消化，3分钟后进行计数计算贴壁率。
汇总以上所得数据，进行数据分析。
表4
由以上数据可得：
(1)人视网膜色素上皮细胞在240小时到达增殖平台期。
(2)人真皮成纤维细胞在196小时到达增殖平台期。
(3)消化当天两种细胞系活率均在90％以上，无明显差异。
(4)冻存后复苏活率方面，随着时间的变化，人真皮成纤维细胞系无明显差异；人视网膜色素上皮细胞在到达增值平台期前无显著变化，但在到达增值平台期后逐步下降。
(5)在复苏后的贴壁率方面，随着时间的变化，人真皮成纤维细胞系无明显差异；人视网膜色素上皮细胞在到达增值平台期前无显著变化，但在到达增值平台期后出现断崖式下跌。
(6)综合以上考虑，在贴壁细胞里，人视网膜色素上皮细胞培养时间应优化至240小时。
由于目前判断冻存复苏后的细胞大多是通过细胞复苏离心后细胞染色，即台盼蓝染色确定的。然而在本发明的实验中可以发现，针对成纤维细胞而言，复苏活率(台盼蓝染色)和复苏后的贴壁率均与冻存之前的细胞增长时间之间没有对应关系，即使用复苏活率(台盼蓝染色)可以用于判断细胞活力。然而，针对RPE细胞，发明人首次发现复苏活率(台盼蓝染色)没有显著变化时，如果冻存之前的细胞增长时间为240小时和288小时之间，细胞贴壁率发生断崖式的显著的变化，且288小时后的细胞贴壁率也在显著的低位。因此，对于RPE细胞，应使用复苏后的贴壁率作为判断细胞活力的标志物，且在临床治疗使用中，为了保持RPE的活力，应使用冻存之前的细胞增长时间为240小时的细胞进行冻存，且该时间点也保证了RPE细胞收获的细胞量，降低了使用成本。而且，通过后续大量的质检指标验证后发现培养240小时的细胞也出现了RPE细胞的典型形态，多批检验后均符合RPE特异性相关各项质检指标，说明其分化特性稳定(如黑色素含量)，RPE细胞特有生物学活性高(如营养因子分泌和吞噬功能等)。而相反的是，培养192小时或者216小时的细胞，其分化的成熟度不高，RPE细胞的特征性的质检指标不合格，多批细胞的质检稳定性不高。因此从细胞质检质量的控制，细胞数量的控制，以及复苏后的细胞活力三个方面，培养240小时的细胞均是最优的选择。
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等效
本发明可以在不脱离其基本特征的情况下以其他具体形式实施。因此，前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。
Claims (10)
1.一种视网膜色素上皮细胞的培养方法，其包括以下步骤：
(1)将视网膜色素上皮细胞按照3×104-4×104/cm2的密度接种于细胞板或细胞瓶中；
(2)所述细胞培养144小时至250小时之间后，消化；
使用所述方法，视网膜色素上皮细胞在冻存复苏后具有高细胞活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述视网膜色素上皮细胞为原代来源的人视网膜色素上皮细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞板为细胞培养六孔板。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述视网膜色素上皮细胞细胞的接种量为3×105/孔。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞培养时间为230小时至250小时之间。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
(3)将消化后的细胞冻存；
(4)复苏细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其还包括以下步骤：
(5)计算细胞冻存复苏后的贴壁率，所述细胞的冻存复苏后贴壁率≥80％，优选≥90％时，该细胞可作为合格细胞进行后续使用。
8.一种判断视网膜色素上皮细胞冻存复苏后细胞活力的方法，其包括以下步骤：
(1)将冻存后的视网膜色素上皮细胞复苏并培养；
(2)计算细胞的贴壁率；
使用贴壁率判断视网膜色素上皮细胞冻存复苏后细胞活力，其中，所述细胞冻存复苏后贴壁率≥80％，优选≥90％，表示为复苏后的细胞具有高活力。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述方法不包括使用胎盘蓝染色测定复苏离心后的细胞活性率。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述视网膜色素上皮细胞为原代来源的人视网膜色素上皮细胞。
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Citations (4)
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| US20160060596A1 (en) * | 2013-04-26 | 2016-03-03 | Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) | Methods for obtaining retinal progenitors, retinal pigmented epithelial cells and neural retinal cells |
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| CN106801039A (zh) * | 2016-12-14 | 2017-06-06 | 南京医科大学第附属医院 | 一种人视网膜色素上皮细胞库的构建方法 |
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-
2017
- 2017-12-29 CN CN201711474638.9A patent/CN109988750A/zh active Pending
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