JP5196423B2 - 新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株およびその利用 - Google Patents
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谷生 重晴ら、「Enterobacter aerogenes の発酵水素発生と利用基質について」、醗酵工学会誌、第67巻、第1号、p29−34、1989 Y. Nakashimada, M.A. Rachman, T. Kakizono, N. Nishio, "Hydrogen production of Enterobacter aerogenes altered by extracellular and intracellular redox states" International Journal of Hydrogen Energy 27(2002),1399-1405
本発明に係る菌株であるエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株は、本発明者らが自然界から独自に分離した菌株であり、検討の結果、高濃度でグリセロールを含むバイオディーゼル廃液を資化することができることを見出したものである。そこで、まず、これらの菌株について具体的に説明する。
表1に示す培地に生育したエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株およびHU202菌株の形態的性質および培養的性質を説明する。
y=0.198x−3.52(x:time、R2=0.993)・・・(1)
また、上方の検量線は式2で表される。
y=0.186x−3.09(x:time、R2=0.963)・・・(2)
式1で表されるグラフの傾きより、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株の比増殖速度を0.198h-1、式2で表されるグラフの傾きより、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株の比増殖速度を0.186h-1と決定した。
エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株およびHU202菌株の生理学的性質は、表2に示すとおりである。
エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株およびHU202菌株の特徴を示すために必要な性質は、表3に示すとおりである。
エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株およびHU202菌株の化学分類学的性質として、例えば以下のものを挙げることができる。
まず、福井県敦賀市の砂浜、砂浜付近松林、広島大学構内等からサンプリングした土壌及び余剰汚泥をリン酸バッファーで10倍希釈して、5分間振盪後、静置した。この際に分離した上清をサンプル微生物含有液とした。また、広島県内河川水の場合は、そのままサンプル微生物含有液とした。
市販グリセロールを炭素源とした上記液体培地にて対数増殖期まで培養した上記HU201菌株およびHU202菌株の培養液各15mlを3000rpm、15分、4℃で遠心分離して集菌し、上清を除去した。菌体を1.5mlのTE bufferに懸濁し、5mgのリゾチーム(シグマ製)を加えた後、37℃で30分間ゆっくりと振盪した。溶菌液を2.5ml加え、静かに混合した後、55℃で60分間インキュベートした。次に、フェノールクロロホルム混液(東京化成工業製)を1.25ml加えて10分間振盪し、完全に混合した後、11,000rpm、15分間遠心して3層に分離し、上層を新しいチューブに移した。
本発明に係るグリセロール資化剤は、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株および/またはエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株を含有する。なお、本明細書において、「資化」とは、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含む原料液を発酵させ、水素および/またはエタノールを生産することをいう。
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株および/またはエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株によって発酵させる発酵工程を含む。以下、構成ごとに分けて具体的に説明する。
本発明の製造方法の原料液を構成するバイオディーゼル廃液は、バイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られるグリセロールを多量に含むものである。バイオディーゼル燃料の製造原理は、式Iに示す反応式に示すようにして行なわれる。
本発明の製造方法に用いる上記原料液は、上記バイオディーゼル廃液が含まれていれば特に限定されるものではなく、バイオディーゼル廃液そのものを原料液として用いても良く、また適宜、水等の溶媒を添加し原料液として用いてもよい。上記溶媒の添加率(換言すれば希釈率)は特に限定されるものではなく、後に行なう本発明に係る菌株による発酵工程に用いる原料液として好適なものとなるように適宜検討の上、決定すればよい。
本発明の製造方法における発酵工程に用いる微生物は、既に説明したように、通性嫌気性細菌のエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株および/またはエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株である。エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路について図10に示す。
本発明にかかる製造方法は、既述の原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株および/またはエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株によって発酵させる発酵工程を含んでいる。かかる発酵工程は、本発明に係る菌株が原料液から水素およびエタノールを発酵生産する工程である。その発酵条件としては、本発明に係る菌株が水素およびエタノールを発酵生産する条件として好ましい条件であれば特に限定されるものではなく、その発酵方法は連続培養であっても回分培養(バッチ培養)であっても半回分培養であってもよい。
CSLは、コーンスターチ製造工業でコーンスターチを生産する際に生じる副産物である。CSLは、コーンスターチ製造過程で、とうもろこし粒を0.1〜0.3%の亜硫酸液に45〜50℃、約40〜48時間乳酸発酵させながら浸漬する工程があり、浸漬を終わった後、浸漬槽から抜液され、真空蒸発装置によって固形分50%前後まで濃縮されることによって生成される。CSLは、酵母エキスに替わる安価な炭素源の候補物質として用いられている。
本発明にかかる製造方法は、上記発酵工程のほかに、本発明に係る菌株を予め増殖させておく前培養工程、多孔質担体に予め本発明に係る菌株を固定化しておく固定化工程、生成した水素またはエタノールを精製する精製工程、生成した水素またはエタノールをガスクロマトグラフィー等で分析する工程、バイオディーゼル燃料の製造工程等の工程が含まれていてもよい。
本発明に係るキットは、上記本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットであって、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株および/またはエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれる。
試験管に、表1に示す合成培地からグリセロールを除いたもの8mlに、グリセロール濃度が原料液に対して25g/lとなるようにリン酸バッファーで希釈した炭素源を加えて原料液を調製し、これにエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株の1白金耳を1mlリン酸バッファーに懸濁した液1mlをそれぞれ接種し、pHをリン酸バッファーによって7.0に調整し、37℃、5日間暗所にて静置培養を行い、ガス量測定、ガス組成測定、サンプリングを適時行った。
そこで、次に、原料液のグリセロール濃度を50g/lに引き上げ、様々な土地から採取したサンプル菌(10種類)を用いて、実施例1と同様の実験を行った。結果は図14に示した。図14の横軸は、サンプル番号と、実施例1に示した炭素源の種類の組み合わせになっており、例えば、「1−BM」はサンプル1に、メタノールを除去したバイオディーゼル廃液を50g/lで供したことを示し、「1−BW」は、サンプル1に、表7に示すバイオディーゼル廃液を50g/lで供したことを示す。図14には、10種類のサンプル菌のうち、水素生成を行ったもののみを表示している。このうち、サンプル1が上記HU201菌株であり、サンプル2が上記HU202菌株である。なお、サンプル4,5,6はそれぞれ未同定の細菌である。
表7に示すバイオディーゼル廃液の濃度をさらに上げ、上記HU201菌株およびHU202菌株が生育可能な最大グリセロール濃度を検討した。試験管に、表1に示す合成培地からグリセロールを除いたもの8mlに、グリセロール濃度が原料液に対して50、60,70,80,90g/lとなるようにリン酸バッファーで希釈したバイオディーゼル廃液を加えて原料液を調製し、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株の1白金耳を1mlリン酸バッファーに懸濁した液を1mlそれぞれ接種し、pHをリン酸バッファーによって7.0に調整し、37℃、5日間暗所にて静置培養を行った。5日間培養後の水素生成量を、実施例1と同様にガスクロマトグラフィーを用いて測定した。
これまでは、培養開始時の減量液のpHを7.0に調整し、試験管内で回分培養を行ってきたが、発酵に伴って産生される有機酸の影響によって原料液のpHが低下すると、図15に示すようにグリセロールの消費が停止する。
試験管に、表1に示す合成培地からグリセロールを除いたもの8mlに、グリセロール濃度が原料液に対して90g/lとなるようにリン酸バッファーで希釈したバイオディーゼル廃液を加えて原料液を調製し、当該原料液に、CSL(ヤエガキ醗酵技研(株)より提供)を0.1ml、0.4ml,0.7mlまたは1.0ml加えた。次に、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU202菌株の1白金耳をリン酸バッファー1mlに懸濁した液1mlを接種しpHをリン酸バッファーによって7.0に調整した。37℃、5日間暗所にて静置培養を行った後の水素生成量を、実施例1と同様にガスクロマトグラフィーを用いて測定した。
2 発酵槽
3 恒温ジャケット
3a 恒温水流出孔
3b 恒温水流入孔
3c 恒温水槽
4 細菌固定化多孔質担体
5 原料液流入孔
6 発酵液流出孔
7 原料液タンク
8 ポンプ
9 排気口
10 ガス回収槽
11 半回分培養装置
12 発酵槽
13 アルカリ液貯留槽
14 アルカリ液流入孔
15 サンプリング孔
16 pH測定装置
17 電極
18 ポンプ
19 排気口
20 発酵液
21 コンピュータ
Claims (8)
- エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)HU201菌株(FERM P−21492)。
- 油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含み、グリセロール濃度が50g/lである原料液中のグリセロールを15g/l以上資化できることを特徴とする請求項1に記載の菌株。
- 請求項1に記載の菌株を含有することを特徴とするグリセロール資化剤。
- 原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、請求項1に記載の菌株によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴とする水素およびエタノールの製造方法。
- 上記原料液がコーンスティープリカーを含有することを特徴とする請求項4に記載の水素およびエタノールの製造方法。
- 上記原料液のグリセロール濃度が20g/lを超えることを特徴とする請求項4または5に記載の水素およびエタノールの製造方法。
- 上記発酵工程において、原料液および/または上記発酵によって得られた発酵液のpHを6.5以上7.5以下に保持することを特徴とする請求項4から6のいずれか1項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
- 請求項4から7のいずれか1項に記載の水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットであって、請求項1に記載の菌株および上記菌株を培養可能な培地が含まれることを特徴とするキット。
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