CN103003414A - 新微生物以及使用该新微生物的氢的制造方法、1,3-丙二醇的制造方法和生物柴油废液的处理方法 - Google Patents

新微生物以及使用该新微生物的氢的制造方法、1,3-丙二醇的制造方法和生物柴油废液的处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种微生物，该微生物属于肠杆菌(Enterobacter)属，具有同化甘油而生成氢气的能力和同化甘油而生成1,3-丙二醇的能力，并且在10质量％的甘油的存在下能同化甘油。

Description

新微生物以及使用该新微生物的氢的制造方法、1,3-丙二醇的制造方法和生物柴油废液的处理方法
技术领域
本发明涉及新微生物以及使用该新微生物的氢的制造方法、1,3-丙二醇的制造方法和生物柴油废液的处理方法。
背景技术
生物柴油是指以植物性油脂和废油等油脂(甘油三酯)作为主要原料制成的脂肪酸酯，期待其作为轻油等的替代燃料。
作为制造生物柴油的方法，目前广泛采用化学催化法。化学催化法是如下所述的方法：在油脂中添加甲醇和催化剂(碱)来进行酯交换反应，得到脂肪酸甲酯(Fatty Acid Methyl Ester；FAME)作为生物柴油。该反应以下述化学式(1)表示。
【化1】
Figure BDA00002261091400011
另一方面，如上述化学式(1)所示，产生以高浓度含有作为副产物的甘油的废液(生物柴油废液)，其处理成为问题。有人尝试了所谓的生物炼制方法，该生物炼制是指以该生物柴油废液作为原料，由它通过生物学方式生产能量或有用物质。
例如，专利文献1和2公开了一种将甘油同化而产生氢和乙醇的属于产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的细菌，以及利用这些细菌由生物柴油废液中所含的甘油来制造氢和乙醇的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特开2009-183162号公报
专利文献2:日本专利特开2006-180782号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
生物柴油废液中含有非常高浓度的甘油。但是，专利文献1和2公开的属于产气肠杆菌的细菌在甘油浓度高时，同化甘油的能力明显受到抑制，因此存在无法高效地处理生物柴油废液之类的含有高浓度甘油的试样的问题。
因此，本发明的目的在于提供一种在高浓度甘油的存在下也能同化甘油的新微生物。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明提供一种微生物，该微生物属于肠杆菌(Enterobacter)属，具有同化甘油而生成氢气的能力和同化甘油而生成1,3-丙二醇的能力，并且在10质量％的甘油的存在下能同化甘油。
本发明的微生物具有同化甘油而生成氢气的能力和同化甘油而生成1,3-丙二醇的能力。因此，可以用于以甘油作为原料的生物炼制。本发明的新微生物在高浓度甘油的存在下也能同化甘油，因此还能提高生物炼制的效率。
较好是所述微生物在15质量％的甘油的存在下也能同化甘油。作为所述微生物，可以采用2010年2月12日以保藏编号NITE BP-901保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮编292-0818，日本国千叶县木更津市上总镰足2丁目5番地8号)的肠杆菌(Enterobacter)属PEG8株。
所述微生物能同化甘油而生成氢气。所述微生物还能同化甘油而生成1,3-丙二醇。因此，本发明提供一种以甘油作为底物使所述微生物生成氢气的氢的制造方法。本发明还提供一种以甘油作为底物使所述微生物生成1,3-丙二醇的1,3-丙二醇的制造方法。
较好是所述氢的制造方法和1,3-丙二醇的制造方法中，所述甘油是生物柴油废液中所含的甘油。所述微生物在高浓度甘油的存在下也能同化甘油，因此能高效地处理含有高浓度甘油的生物柴油废液。
本发明还提供一种生物柴油废液的处理方法，该方法包括使所述微生物降解生物柴油废液中所含的甘油的降解工序。
较好是所述生物柴油废液的处理方法中还包括回收所述降解工序中生成的氢气或1,3-丙二醇的回收工序。所述微生物能降解甘油，生成能量或可作为有用物质加以利用的氢气和1,3-丙二醇，因此通过回收它们，能高效地进行生物炼制。
本发明还提供一种生物柴油废液的处理方法，该方法是使含生物柴油废液的原料液与所述微生物接触，使所述生物柴油废液中的甘油降解，藉此使甘油减少至预先设定好的浓度后，将甘油减少了的原料液的至少一部分与含生物柴油废液的其它原料液交换。
较好是所述生物柴油废液的处理方法中，在使所述生物柴油废液中的甘油降解、藉此使甘油减少至预先设定好的浓度的同时回收生成的氢气或1,3-丙二醇，然后与含生物柴油废液的其它原料液交换。
发明的效果
如果采用本发明的新微生物，则在高浓度甘油的存在下也能同化甘油，因此能高效地进行含有高浓度甘油的生物柴油废液等的处理。
本发明的新微生物还能同化甘油而生成氢气、乙醇和1,3-丙二醇。因此，能制造多种多样的能量物质或有用物质，能更高效地进行以甘油作为原料的生物炼制。
附图的简单说明
图1是表示16S rDNA碱基序列的简易分子系统学分析结果的图。
图2是表示对肠杆菌属PEG8株进行分批培养时的氢气的生成量、1,3-丙二醇的生成量、乙醇的生成量、残留甘油量和OD660值的经时变化的图。
图3是表示在不同甘油浓度的条件下培养肠杆菌属PEG8株时的氢气的生成量的图。
图4是表示在含有甘油的原料液中对肠杆菌属PEG8株反复进行分批培养时的氢气的生成量、1,3-丙二醇的生成量和乙醇的生成量的图。
图5是表示在含有生物柴油废液的原料液中对肠杆菌属PEG8株反复进行分批培养时的氢气的生成量、1,3-丙二醇的生成量和乙醇的生成量的图。
图6是表示在含有各种碳源的培养基中培养肠杆菌属PEG8株时的氢气的生成量的图。
图7是表示在含有各种碳源的培养基中培养肠杆菌属PEG8株时的氢气的生成量的图。
实施发明的方式
本发明的微生物属于肠杆菌属，能同化甘油而生成氢气和1,3-丙二醇，并且在10质量％的甘油的存在下也能同化甘油而生成氢气。
较好是所述微生物在15质量％的甘油的存在下也能同化甘油。
本实施方式中，较好是所述微生物显示出表1的细菌学性质。
[表1]
表1.细菌学性质
  项目   性质
  细胞形态   杆菌
  孢子的有无   -
  革兰氏染色   -
  运动性   +
  37℃下的生长   +
  45℃下的生长   +
  过氧化氢酶反应   +
  氧化酶反应   -
  自葡萄糖的产酸/产气   +/+
  葡萄糖的氧化/发酵   +/+
  β-半乳糖苷酶活性   +
  精氨酸二水解酶活性   +
  赖氨酸脱羧酶活性   -
  鸟氨酸脱羧酶活性   -
  脲酶活性   -
  柠檬酸的利用性   +
  乙偶姻产生活性   +
  明胶酶活性   -
  D-甘露糖醇同化性   +
  D-山梨糖醇同化性   +
  L-鼠李糖同化性   +
  4℃下的生长   -
  KCN培养基上的生长   +
“＋”表示阳性，“-”表示阴性。
较好是所述微生物在LB琼脂培养基上于30℃培养48小时后形成整个周缘呈直径2.0-3.0mm的圆形、表面形状呈光滑的透镜状、不透明的黄色菌落。
较好是所述微生物具有与由序列编号1确定的碱基序列相比显示出99.7％以上的同源性的16S rDNA碱基序列，更好是具有显示出99.8％以上的同源性的16S rDNA碱基序列，进一步更好是具有显示出99.9％以上的同源性的16S rDNA碱基序列。
作为所述微生物，可以采用2010年2月12日以保藏编号NITE BP-901保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮编292-0818，日本国千叶县木更津市上总镰足2丁目5番地8号)的肠杆菌(Enterobacter)属PEG8株。
本发明的微生物例如可以通过如下方法分离：对从来自生物柴油制造工厂的废水等中采集的样品(微生物群)进行筛选，该筛选以甘油存在下的增殖能力作为指标。除了甘油存在下的增殖能力外，还可以并用甘油存在下的氢气生成能力或1,3-丙二醇生成能力作为指标进行筛选。
作为具体的方法，例如将作为碳源仅含有1～20质量％浓度的甘油的培养基(例如蛋白胨2.5g/L，酵母提取物2.5g/L，pH6.8)添加至培养瓶中，再添加少量的从来自生物柴油制造工厂的废水等中采集的样品作为微生物源。将其在合适的条件下(例如在厌氧条件下于37℃静置或以微生物不会沉降的程度搅拌24小时)培养。藉此，能使具有甘油同化性且具有甘油耐受性的微生物优先增殖。
甘油耐受性是指即使在(高浓度)甘油的存在下也能生存或增殖的性质。即使在(高浓度)甘油的存在下也能同化甘油的性质是甘油耐受性的一例。
此外，也可以在培养后对培养瓶中所含的氢气进行定量，选定生成氢气的样品。氢气的定量例如可以通过被捕集于与培养瓶连接的捕集袋中的气体量的测定以及采用气相色谱法的被捕集的气体的组成分析来进行。此外，也可以在培养后对培养瓶中所含的1,3-丙二醇进行定量，选定生成1,3-丙二醇的样品。1,3-丙二醇的定量例如可以通过液相色谱法来进行。
可以从通过培养而增殖的微生物群中通过纯化分离将本发明的微生物分离出来。纯化分离可通过本领域技术人员所熟知的方法来进行，例如通过接种于琼脂培养基上进行培养，可形成纯化分离的菌落，挑取该菌落即可分离出目标微生物。较好是使琼脂培养基中预先含有甘油。
此外，也可以在培养后将一部分的培养液再次接种于添加有新鲜的含甘油的培养基的培养瓶中，再次进行培养。对于培养后的样品，既可以进行所述纯化分离，也可以再次重复进行该培养循环。通过增加培养循环，可使目标微生物富集。
如上所述分离出的微生物的鉴定、性状和性质等的分析可以采用公知的各种鉴定试验方法或市售的鉴定试剂盒来进行。此外，也可以对16S rDNA碱基序列进行测序，通过同源性检索、分子系统学分析来进行微生物的鉴定。
作为一种实施方式，本发明包括以甘油作为底物使所述微生物生成氢气的氢的制造方法。
所述氢的制造方法中，使所述微生物与含有作为底物的甘油的原料液接触，使所述微生物进行发酵产氢。作为发酵产氢的方法，可例举对所述微生物进行种子培养后或在未进行种子培养的情况下在原料液中进行液体培养的方法、将固定有所述微生物的支承体或载体添加至原料液中的方法等。
此外，可以根据供给原料液的方法采用不同的培养方法。具体而言，可例举例如下述方法：一边在以恒定的速度供给原料液的同时抽取等量的原料液，一边连续地进行培养的方法(灌流培养法)；每次都准备新的原料液，在培养过程中不进行原料液(成分)的添加和抽取来进行培养的方法(分批培养法)；在培养过程中不进行原料液(成分)的添加和抽取而与分批培养同样地进行培养后，向一部分的培养液中供给新的原料液来反复进行分批培养的方法(重复分批培养法)；进行原则上与分批培养相同的操作，但在培养过程中仅追加添加原料液中的特定成分的培养方法(补料分批培养法)等。其中，在本实施方式的氢的制造方法中，从避免因副产物导致的氢气生成效率的降低的角度考虑，优选重复分批培养法。
作为氢的制造中所用的原料液，只要含有甘油即可，无特别限定，具体可例举制皂废液、生物柴油废液等。其中优选生物柴油废液。生物柴油废液含有大量的甘油，而且所含的甘油没有有用的用途，因此可优选用作本实施方式的原料。原料液中所含的生物柴油废液的含量可以考虑制氢的效率(成本、收率等)等来适当设定，例如设定在以甘油浓度换算为0.1～35质量％的范围内。
原料液中除了甘油之外，也可以含有营养成分(甘油以外的碳源、氮源等)、生长促进剂、抗生素等杀菌剂、pH调整剂、分散剂、乳化剂、消泡剂等。
作为发酵产氢时的反应条件(培养条件)，例如可以将反应温度(培养温度)设定在10～45℃的范围内，较好是设定在15～40℃的范围内。pH可以设定在4.0～9.0的范围内，较好是设定在4.5～8.0的范围内。反应时间既可以设为例如6～48小时，也可以实时测量原料液中的甘油浓度，在甘油达到预先设定好的浓度以下时结束反应。作为对反应液中的甘油浓度进行定量的方法，可例举例如通过液相色谱法来测定的方法等。“预先设定好的浓度”可以考虑制氢的效率(成本、收率等)等来适当设定。例如可以设为1.0质量％或0.5质量％。也可以设为0质量％(甘油的完全降解)。
本说明书中，生物柴油废液是指将油脂甲酯(或乙酯)化、再除去脂肪酸甲酯(或乙酯)(生物柴油)后的含甘油的废液。
作为所述油脂，无特别限定，可例举例如菜籽油、棕榈油、橄榄油、葵花油、豆油、米糠油、大麻籽油(大麻油)等植物油，鱼油或猪油、牛油等动物油以及废弃食用油(所谓的天妇罗油等)等。
作为另一种实施方式，本发明也包括一种以甘油作为底物使所述微生物生成1,3-丙二醇的1,3-丙二醇的制造方法。
所述1,3-丙二醇的制造方法中，使所述微生物与含有作为底物的甘油的原料液接触，使所述微生物进行发酵产1,3-丙二醇。作为发酵产1,3-丙二醇的方法，可例举对所述微生物进行种子培养后或在未进行种子培养的情况下在原料液中进行液体培养的方法、将固定有所述微生物的支承体或载体添加至原料液中的方法等。
作为原料液的供给方法，可例举例如灌流培养法、分批培养法、重复分批培养法、补料分批培养法等。其中，在本实施方式的1,3-丙二醇的制造方法中，从避免因副产物导致的1,3-丙二醇生成效率的降低的角度考虑，优选重复分批培养法。
作为1,3-丙二醇的制造中所用的原料液，只要含有甘油即可，无特别限定，具体可例举制皂废液、生物柴油废液等。其中优选生物柴油废液。原料液中所含的生物柴油废液的含量可以考虑制氢的效率(成本、收率等)等来适当设定，例如设定在以甘油浓度换算为0.1～35质量％的范围内。
原料液中除了甘油之外，也可以含有营养成分(甘油以外的碳源、氮源等)、生长促进剂、抗生素等杀菌剂、pH调整剂、分散剂、乳化剂、消泡剂等。
作为发酵产1,3-丙二醇时的反应条件(培养条件)，例如可以将反应温度(培养温度)设定在10～45℃的范围内，较好是设定在15～40℃的范围内。pH可以设定在4.0～9.0的范围内，较好是设定在4.5～8.0的范围内。反应时间既可以设为例如6～48小时，也可以实时测量原料液中的甘油浓度，在甘油达到预先设定好的浓度以下时结束反应。作为对反应液中的甘油浓度进行定量的方法，可例举例如通过液相色谱法来测定的方法等。“预先设定好的浓度”可以考虑制氢的效率(成本、收率等)等来适当设定。例如可以设为1.0质量％或0.5质量％。也可以设为0质量％(甘油的完全降解)。
作为另一种实施方式，本发明还包括一种生物柴油废液的处理方法，该方法包括使所述微生物降解生物柴油废液中所含的甘油的降解工序。本实施方式中，较好是还包括回收伴随着甘油的降解而生成的氢气或1,3-丙二醇的回收工序。
所述生物柴油废液的处理方法中，在降解工序中使所述微生物与含有作为底物的甘油的生物柴油废液接触，使所述微生物进行甘油的同化。较好是将生物柴油废液稀释，使其达到规定的甘油浓度，制成含生物柴油废液的原料液，然后与所述微生物接触。作为规定的甘油浓度，可以考虑生物柴油废液的处理效率(成本等)等来适当设定，例如设定在0.1～35质量％的范围内。
作为甘油的同化方法，可例举对所述微生物进行种子培养后或在未进行种子培养的情况下在原料液中进行液体培养的方法、将固定有所述微生物的支承体或载体添加至原料液中的方法等。作为原料液的供给方法，可例举例如灌流培养法、分批培养法、重复分批培养法、补料分批培养法等。其中，在本实施方式的处理方法中，从可进一步减小副产物对处理效率降低的影响的角度考虑，优选重复分批培养法。
原料液中除了甘油之外，也可以含有营养成分(甘油以外的碳源、氮源等)、生长促进剂、抗生素等杀菌剂、pH调整剂、分散剂、乳化剂、消泡剂等。
作为甘油同化时的反应条件(培养条件)，例如可以将反应温度(培养温度)设定在10～45℃的范围内，较好是设定在15～40℃的范围内。pH可以设定在4.0～9.0的范围内，较好是设定在4.5～8.0的范围内。反应时间既可以设为例如6～48小时，也可以实时测量原料液中的甘油浓度，在甘油达到预先设定好的浓度以下时结束反应。作为对反应液中的甘油浓度进行定量的方法，可例举例如通过液相色谱法来测定的方法等。“预先设定好的浓度”可以考虑制氢的效率(成本、收率等)等来适当设定。例如可以设为1.0质量％或0.5质量％。也可以设为0质量％(甘油的完全降解)。
所述生物柴油废液的处理方法中，较好是还包括回收伴随着甘油的降解而生成的氢气或1,3-丙二醇的回收工序。氢气的回收可以如下所述进行：配置用于将氢气回收于反应容器(培养容器)的管道，在降解工序的同时进行回收。1,3-丙二醇的回收可以回收降解工序后的原料液后通过蒸馏等来进行。
作为另一种实施方式，本发明还提供一种生物柴油废液的处理方法，该方法是使含生物柴油废液的原料液与所述微生物接触，使所述生物柴油废液中的甘油降解，藉此使甘油减少至预先设定好的浓度后，将甘油减少了的原料液的至少一部分与含生物柴油废液的其它原料液交换。所述生物柴油废液的处理方法中，可以采用如下所述的生物柴油废液的处理方法：在使甘油减少至预先设定好的浓度的同时回收生成的氢气或1,3-丙二醇，然后与含生物柴油废液的其它原料液交换。
本实施方式中，使所述微生物与含有作为底物的甘油的原料液接触，使所述微生物进行甘油的同化。较好是将生物柴油废液稀释，使其达到规定的甘油浓度，制成含生物柴油废液的原料液，然后与所述微生物接触。作为规定的甘油浓度，可以考虑生物柴油废液的处理效率(成本等)等来适当设定，例如设定在0.1～35质量％的范围内。
作为甘油的同化方法，可例举对所述微生物进行种子培养后或在未进行种子培养的情况下在原料液中进行液体培养的方法、将固定有所述微生物的支承体或载体添加至原料液中的方法等。本实施方式的特征在于，反复进行分批培养(重复分批培养法)。
原料液中除了甘油之外，也可以含有营养成分(甘油以外的碳源、氮源等)、生长促进剂、抗生素等杀菌剂、pH调整剂、分散剂、乳化剂、消泡剂等。
作为甘油同化时的反应条件(培养条件)，例如可以将反应温度(培养温度)设定在10～45℃的范围内，较好是设定在15～40℃的范围内。pH可以设定在4.0～9.0的范围内，较好是设定在4.5～8.0的范围内。反应时间既可以设为例如6～48小时，也可以实时测量原料液中的甘油浓度，在甘油达到预先设定好的浓度以下时结束反应。作为对反应液中的甘油浓度进行定量的方法，可例举例如通过液相色谱法来测定的方法等。“预先设定好的浓度”可以考虑制氢的效率(成本、收率等)等来适当设定。例如可以设为1.0质量％或0.5质量％。也可以设为0质量％(甘油的完全降解)。
本实施方式中，较好是回收伴随着甘油的降解而生成的氢气或1,3-丙二醇。氢气的回收可以如下所述进行：配置用于将氢气回收于反应容器(培养容器)的管道，在甘油降解的同时进行回收。1,3-丙二醇的回收可以回收反应后(培养后)的原料液后通过蒸馏等来进行。
本实施方式中的重复分批培养法也可以是一种生物柴油废液的处理方法，该方法包括：使含生物柴油废液的原料液与所述微生物接触的工序；使所述微生物降解生物柴油废液中的甘油，藉此使甘油减少至预先设定好的浓度的工序；将甘油减少了的原料液的至少一部分与含生物柴油废液的其它原料液交换的工序。较好是在使甘油减少至预先设定好的浓度的工序中回收生成的氢气或1,3-丙二醇。
实施例
(实施例1)
[甘油同化性产氢菌的探索]
以生物柴油(FAME)制造工厂的废水作为微生物源，通过富集培养进行了甘油同化性产氢菌的探索。
将生物柴油制造工厂的废水添加至FAME培养基(组成：生物柴油废液按照以甘油浓度换算为1质量％的条件添加，蛋白胨2.5g/L，酵母提取物2.5g/L，pH6.8)中，在厌氧条件下于37℃在安装有气体捕集袋的培养瓶(メジウムボトル)内富集培养24小时。进行被捕集于捕集袋中的生物气体量的测定以及采用气相色谱法(株式会社岛津制作所(島津社)制GC-14B)的气体组成分析，确定氢气量。气体组成分析的条件如下所述。
·检测器：TCD(60mA)
·柱：Porapak N，分子筛13X，Porapak Q
·载气：氩
·柱温:60℃
·进样温度：60℃
·检测器温度：80℃
将培养后的培养液50ml添加至新的FAME培养基200ml中，藉此进行传代，反复进行培养，直至氢气的产生量稳定为止。当氢气的生成稳定后，将培养液接种于甘油琼脂培养基(甘油10g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母提取物2.5g/L，琼脂15g/L，pH6.8)，在37℃的培养箱中厌氧培养48小时，形成菌落。分离所形成的菌落，接种于含有10ml的FAME培养基的20ml管瓶中，在密闭状态下在厌氧条件下于37℃培养24小时。培养后，通过上述方法对管瓶的上部空间内所含的氢气进行定量，选择生成氢气的菌株。
(实施例2)
[PEG8株的基于16S rDNA碱基序列分析的鉴定]
对于作为实施例1中取得的菌株之一的PEG8株，通过16S rDNA碱基序列分析进行了菌株的鉴定。
使用InstaGene Matrix(伯乐公司(BioRad社)制)从PEG8株抽提DNA，通过使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(宝生物公司(タカラバイオ社)制)的PCR扩增全长16S rDNA。以所得的PCR产物为模板，使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit)(应用生物系统公司(アプライドバイオシステム社)制)进行循环测序。对于进行了循环测序的样品，使用ABI PRISM3130x1基因分析系统(ABI PRISM 3130x1Genetic Analyzer System)(应用生物系统公司制)装置分析碱基序列数据，分析数据用ChromasPro1.4(Technelysium公司(Technelysium Pty Ltd.))软件进行分析，确定碱基序列(序列编号1)。各实验步骤遵循各试剂盒附带的使用手册的记载。
对于确定了的PEG8株的16S rDNA碱基序列，使用a-poron2.0(tecsrg-lab公司制)软件进行同源性检索，该检索针对的是a-poronDB-BA ver5.0(tecsrg-lab公司制)数据库或国际碱基序列数据库(GenBank/DDBJ/EMBL)。使用a-poron DB-BA ver5.0数据库的检索结果是，PEG8株的16S rDNA碱基序列和阴沟肠杆菌阴沟亚种(Enterobacter cloacaesubsp.cloacae)ATCC13047株的16S rDNA碱基序列显示出97.6％的同源性(表2)。使用国际碱基序列数据库的检索结果是，PEG8株的16S rDNA碱基序列和来源于肠杆菌属的16S rDNA碱基序列显示出高同源性，和水稻肠杆菌(Enterobacter oryzae)Ola50株显示出99.6％的同源性(表3)。
[表2]
表2.使用a-poron DB-BA ver5.0数据库的同源性检索结果(前20位)
Figure BDA00002261091400141
[表3]
表3.使用国际碱基序列数据库的同源性检索结果(前20位)
Figure BDA00002261091400151
接着，使用PEG8株的16S rDNA碱基序列和表2所示的前20位菌株及水稻肠杆菌Ola 51株的16S rDNA碱基序列，进行了简易分子系统学分析。
简易分子系统学分析的结果是，PEG8株的16S rDNA碱基序列包含于由肠杆菌属形成的簇(图1)。而且与水稻肠杆菌Ola 51株的16S rDNA碱基序列形成了簇(图1)。图1中，位于系统树的分支的数字表示自展值(bootstrapvalue)。另一方面，在PEG8株和水稻肠杆菌Ola51株的16S rDNA碱基序列之间存在7个碱基的不同点(数据未示出)。
根据以上结果，PEG8株虽然和水稻肠杆菌是近缘，但16S rDNA碱基序列之间存在明确的不同点，因此认为两者为不同种的菌株的可能性高。
(实施例3)
[PEG8株的细菌学性质的分析]
对于PEG8株，进行采用光学显微镜(BX50F4，奥林巴斯公司(オリンパス社)制)的形态观察和基于Barrow等人的方法(医学细菌鉴定手册(Cowanand Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria).第三版.1993年,剑桥大学出版社)的过氧化氢酶反应、氧化酶反应、自葡萄糖的产酸/产气、葡萄糖的氧化/发酵(O/F)的试验。此外还使用FavorG“Nissui”(日水制药公司(日水製薬社)制)进行革兰氏染色性分析。还使用API20E试剂盒(生物梅里埃公司(ビオメリユ一社)制)进行表4和5所示的各项目的相关试验。各项目的判定遵循试剂盒附带的使用手册。
[表4]
表4.肠杆菌属PEG8株的细菌学性质(形态等)
  项目   结果
  细胞形态   杆菌
  细胞的直径   0.6-0.8×1.2-2.0μm
  孢子的有无   -
  革兰氏染色   -
  运动性   +
  4℃下的生长   -
  37℃下的生长   +
  45℃下的生长   +
  过氧化氢酶反应   +
  氧化酶反应   -
  自葡萄糖的产酸/产气   ＋/＋
  葡萄糖的氧化/发酵   ＋/＋
  KCN培养基上的生长   +
“＋”表示阳性，“-”表示阴性。
[表5]
表5.肠杆菌属PEG8株的细菌学性质(同化性等)
  项目   结果
  β-半乳糖苷酶活性   +
  精氨酸二水解酶活性   +
  赖氨酸脱羧酶活性   -
  鸟氨酸脱羧酶活性   -
  柠檬酸的利用性   +
  H2S产生活性   -
  脲酶活性   -
  色氨酸脱氨酶   -
  吲哚产生活性   -
  乙偶姻产生活性   +
  明胶酶活性   -
  氧化酶活性   -
  NO2产生活性   +
  还原成N2气体的活性   -
 麦康凯(MacConkey)琼脂培养基上的生长   +
  葡萄糖同化性   +
  D-甘露糖醇同化性   +
  肌醇同化性   -
  D-山梨糖醇同化性   +
  L-鼠李糖同化性   +
  白糖同化性   +
  D-蜜二糖同化性   -
  D-苦杏仁苷同化性   +
  L-阿拉伯糖同化性   +
“＋”表示阳性，“-”表示阴性。
将PEG8株在LB琼脂培养基上于30℃培养48小时，进行形态观察。其结果是，PEG8株形成整个周缘呈直径2.0-3.0mm的圆形、表面形状呈光滑的透镜状、不透明的黄色菌落。
PEG8株的细菌学性质的分析结果示于表4和5。表4和5所示的各种性状虽然与水稻肠杆菌种的性状类似，但也可见不同点(参照Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2009年,59卷,1650-1655页)。PEG8株不呈现赖氨酸脱羧酶活性和鸟氨酸脱羧酶活性，在这一点上不同于水稻肠杆菌种的性状。
综上所述，根据实施例2和3的结果，PEG8株虽然和水稻肠杆菌种是近缘种，但16S rDNA碱基序列和细菌学性质存在明确的不同点，因此认为是新微生物。因而得出结论，PEG8株是肠杆菌属的新种。将PEG8株记作肠杆菌(Enterobacter)属PEG8，于2010年2月12日保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮编292-0818，日本国千叶县木更津市上总镰足2丁目5番地8号)(保藏编号NITE BP-901)。
(实施例4)
[通过分批培养由甘油生产氢和1,3-丙二醇]
将在5ml的LB培养基中于37℃振荡培养11小时后的PEG8株添加至含500ml原料液(组成：酵母提取物2.5g/L，蛋白胨2.5g/L，甘油7质量％，pH6.5)的1L容量的小瓶中。用氮气置换小瓶中的气体，使用1L的发酵罐(BMJ-01PI，ABLE&Biott公司制)在厌氧条件下于37℃以150rpm的振荡速度进行培养。培养13小时后，留存约50ml的培养液，添加450ml的新原料液，反复进行培养。经时进行培养液和气体的采样，进行氢气的生成量、1,3-丙二醇的生成量、乙醇的生成量、残留甘油量和OD660值的测定。
1,3-丙二醇、乙醇、甘油通过高效液相色谱法在如下分析条件下定量。氢气的定量方法如实施例1所述。
·流动相：纯水
·柱：Shim-pack SCR-102H(株式会社岛津制作所制)
·柱温：70℃
·流速：0.6mL/分钟
·检测器：差示折射计
结果示于图2。随着PEG8株的菌数(OD660)的增加，残留甘油量减少。这表示甘油被PEG8株降解(图2)。此外，伴随着甘油的降解，生成了氢气、1,3-丙二醇和乙醇(图2)。
(实施例5)
[甘油浓度的影响]
将含2.5g/L的酵母提取物、2.5g/L的蛋白胨、53.3g/L的2-吗啉基乙磺酸(MES)以及1.0％、2.5％、5.0％、7.5％、10.0％、15.0％、20.0％、25.0％、30.0％的甘油(均为质量％)的原料液10ml(pH6.5)加入20ml的管瓶中，接种PEG8株，于37℃静置培养22小时。测定培养后的氢气生成量和OD660值，分析甘油浓度造成的影响。
结果示于图3。PEG8株即使在存在10质量％这样的高浓度甘油的情况下，生长也毫无问题，而且氢气的生成量维持在1.0质量％时的约55％(图3)。而且，即使在甘油浓度为15.0质量％、20.0质量％、25.0质量％、30.0质量％的情况下，也分别维持1.0质量％时的约43％、约22％、约10％、约2.2％的氢气的生成量(图3)。
专利文献1公开的产气肠杆菌菌株在甘油浓度高于8质量％时几乎不生成氢气。因此，上述的高浓度甘油耐受性是在现有的甘油降解菌中未曾见到的特性。
(实施例6)
[重复分批培养中的氢收率的变化]
在与实施例4相同的条件下培养PEG8株23～25小时。培养后留存50ml的培养液，添加450ml的新原料液，反复进行培养。重复该操作8次，测定各次培养后的氢的生成量、1,3-丙二醇的生成量、乙醇的生成量。
氢生成量稳定的第3次～第8次的结果示于图4。各次的氢的生成量、1,3-丙二醇的生成量、乙醇的生成量均无很大变化(图4)。即，这就表示通过进行重复分批培养，能稳定地进行甘油的降解、氢的制造、1,3-丙二醇的制造、乙醇的制造。
(实施例7)
[使用生物柴油废液的重复分批培养中的氢收率的变化]
除了使用生物柴油废液(甘油浓度87.6质量％)来代替纯甘油以外，在与实施例4相同的条件下培养PEG8株23～25小时。培养后留存50ml的培养液，添加450ml的新原料液，反复进行培养。重复该操作8次，测定各次培养后的氢的生成量、1,3-丙二醇的生成量、乙醇的生成量。作为生物柴油废液，使用以植物油作为原料制造生物柴油时的废液。所述生物柴油废液按照甘油浓度相当于7.5质量％的条件添加至原料液中。
氢生成量稳定的第3次～第8次的结果示于图5。各次的氢的生成量、1,3-丙二醇的生成量、乙醇的生成量均无很大变化(图5)。即，这就表示即使在使用生物柴油废液的情况下，通过进行重复分批培养，也能稳定地进行甘油的降解、氢的制造、1,3-丙二醇的制造、乙醇的制造。
(实施例8)
[PEG8株的其它特性]
为了分析PEG8株的特性，进行了培养基pH的影响、发酵温度的影响、培养基中的乙醇的影响和各种碳源的同化性的试验。
通过如下方法分析了培养基pH的影响：将含2.5g/L的酵母提取物、2.5g/L的蛋白胨、1质量％的甘油和0.4M的Good缓冲液的原料液10ml加入20ml的管瓶中，接种PEG8株，于37℃培养18小时，测定pH4.5～8.0时的氢气的生成量。作为Good缓冲液，pH为5.0、5.5、6.0、6.5和7.0时使用MES，pH为7.5和8.0时使用2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)。pH为4.5时未添加Good缓冲液。
结果示于表6。培养基pH为酸性对于氢气的生成更有利。
[表6]
表6.培养基pH对氢气生成量的影响
Figure BDA00002261091400221
通过如下方法分析了发酵温度的影响：将含2.5g/L的酵母提取物、2.5g/L的蛋白胨、1质量％的甘油和250mM的MES(pH6.5)的原料液10ml加入20ml的管瓶中，接种PEG8株，于15℃、20℃、25℃、30℃、34℃、37℃和40℃培养22小时，测定氢气的生成量。
结果示于表7。发酵温度在34℃附近时，氢气生成量达到最大，发酵温度更高或更低时，氢气生成量减少。
[表7]
表7.发酵温度对氢气生成量的影响
  发酵温度(℃)   氢气生成量(ml)   OD660
  15   0.6   0.25
  20   1.5   0.58
  25   2.7   0.71
  30   3.4   0.72
  34   5.9   0.71
  37   4.6   0.65
  40   3.1   0.44
通过如下方法分析了培养基中的乙醇的影响：在含2.5g/L的酵母提取物、2.5g/L的蛋白胨、1质量％的甘油、250mM的MES(pH6.5)和乙醇的原料液中于37℃培养17小时，测定乙醇浓度为0、1、2、3体积％时的氢气的生成量。
结果示于表8。随着乙醇浓度的升高，氢气生成量减少。
[表8]
表8.培养基中的乙醇对氢气生成量的影响
  乙醇浓度(体积％)   氢气生成量(ml)
  0   4.8
  1   4.9
  2   4.2
  3   2.2
  4   0
各种碳源的同化性试验中，在含2.5g/L的酵母提取物、2.5g/L的蛋白胨、53.3g/L的MES、1质量％的图6所示的各碳源(葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精、纤维二糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖)的pH6.5的原料液9.5ml中添加PEG8株的预培养液0.5ml，于37℃培养18小时，测定氢气的生成量。接着，在培养后的培养液0.5ml中添加所述原料液9.5ml，于37℃培养18小时，测定氢气的生成量。重复该操作3次，根据4次的培养结果进行了评价。
结果示于图6。PEG8株不仅能同化甘油，还能同化除阿拉伯糖外的其它碳源而生成氢气。
(实施例9)
[PEG8株的其它特性2]
在如下条件下进行了各种碳源(葡萄糖、甘露糖醇)的同化性试验。在含2.5g/L的酵母提取物、2.5g/L的蛋白胨、53.3g/L的MES、2质量％的图7所示的各碳源(葡萄糖、甘露糖醇)的pH6.5的原料液9.5ml中添加PEG8株的预培养液0.5ml，于34℃培养19小时，测定氢气的生成量。接着，在培养后的培养液0.5ml中添加所述原料液9.5ml，于34℃培养19小时，测定氢气的生成量。重复该操作2次，根据3次的培养结果进行评价。
结果示于图7。PEG8株不仅能同化葡萄糖，还能同化甘露糖醇而生成氢气。
产业上利用的可能性
本发明的新微生物在高浓度甘油的存在下也能同化甘油，因此适合用于生物柴油废液的处理。本发明的新微生物还能同化甘油而生成氢气、1,3-丙二醇。它们可以用作能源或树脂原料等，例如，氢气可以用作燃料电池的燃料，1,3-丙二醇可以用作作为合成纤维原料的一种的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的原料。
Figure IDA00002261092300021
PCT/RO/134表
Figure QDA00002261092200011

Claims (11)

1.一种微生物，其特征在于，属于肠杆菌(Enterobacter)属，具有同化甘油而生成氢气的能力和同化甘油而生成1,3-丙二醇的能力，并且在10质量％的甘油的存在下能同化甘油。
2.如权利要求1所述的微生物，其特征在于，在15质量％的甘油的存在下也能同化甘油。
3.一种微生物，其特征在于，鉴定为独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心的保藏编号NITE BP-901的肠杆菌属PEG8。
4.一种氢的制造方法，其特征在于，以甘油作为底物使权利要求1～3中任一项所述的微生物生成氢气。
5.如权利要求4所述的氢的制造方法，其特征在于，所述甘油是生物柴油废液中所含的甘油。
6.一种1,3-丙二醇的制造方法，其特征在于，以甘油作为底物使权利要求1～3中任一项所述的微生物生成1,3-丙二醇。
7.如权利要求6所述的1,3-丙二醇的制造方法，其特征在于，所述甘油是生物柴油废液中所含的甘油。
8.一种生物柴油废液的处理方法，其特征在于，包括使权利要求1～3中任一项所述的微生物降解生物柴油废液中所含的甘油的降解工序。
9.如权利要求8所述的生物柴油废液的处理方法，其特征在于，还包括回收所述降解工序中生成的氢气或1,3-丙二醇的回收工序。
10.一种生物柴油废液的处理方法，其特征在于，使含生物柴油废液的原料液与权利要求1～3中任一项所述的微生物接触，使所述生物柴油废液中的甘油降解，藉此使甘油减少至预先设定好的浓度后，将甘油减少了的原料液的至少一部分与含生物柴油废液的其它原料液交换。
11.如权利要求10所述的生物柴油废液的处理方法，其特征在于，在使所述生物柴油废液中的甘油降解、藉此使甘油减少至预先设定好的浓度的同时回收生成的氢气或1,3-丙二醇，然后与含生物柴油废液的其它原料液交换。
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