CN104711201A - 一种解脂耶氏酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种解脂耶氏酵母，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC NO：M2013606的解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolytica cmq6-8)。本发明还公开了利用前述解脂耶氏酵母将苯乙酮转化为(R)-苯乙醇的方法。本发明保藏号为CCTCC NO：M2013606的解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolytica cmq6-8)可以高效地将苯乙酮转化为(R)-苯乙醇，克服了现有技术的缺陷，具有良好的市场应用前景。

Description

一种解脂耶氏酵母及其应用
技术领域
本发明涉及一株解脂耶氏酵母及其应用，属于发酵领域。
背景技术
(R)-苯乙醇及其衍生物是合成多种手性药物如(R)-地诺帕明、(R)-托莫西汀、(S)-氟西汀、(R)-沙丁胺醇等的重要中间体。为获得光学活性纯苯乙醇，应用最广的是化学催化不对称合成法，但是其存在反应条件剧烈，环境不友好的缺陷。近年来，生物催化法因反应条件温和、产物立体选择性高、对环境友好等优点成为获得光学活性产物的另一种有效途径。目前，生物催化法制备手性芳香酮的相关报道较多，但仍然无法实现工业化生产，主要原因是生产菌株催化活性不稳定、产物积累量不高及立体选择性较差。
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica），属于子囊酵母，是被广泛研究的非常规菌种之一，该菌株安全、无毒，既能在海水中也能在淡水中生存，可以以葡萄糖、乙醇、乙酸和脂肪酸、烃类等物质为碳源进行生长，通常用于有机废水的处理或者油脂的富集。Giancarlo Fantin etal.，“Anti-Prelog MicrobialReduction of Prochiral Carbonyl Compounds”，Tetrahedron,Vol.52.No.10,pp.3547-3552,报道了部分解脂耶氏酵母可以将苯乙酮转化为(R)-苯乙醇，但是均难以兼顾转化率和产物纯度（产物e.e.值），转化率为55-70%时，产物纯度仅为75%左右，产物纯度接近100%时，转化率最高仅25%。
发明内容
本发明提供了一种新的解脂耶氏酵母及其在将苯乙酮转化为(R)-苯乙醇中的应用。
本发明解脂耶氏酵母，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC M 2013606的解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolytica cmq6-8)。
本发明解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolytica cmq6-8)，于2013年11月27日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其地址为：中国·武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC M 2013606。
本发明还提供了将苯乙酮转化为(R)-苯乙醇的方法，包括如下步骤：
（1）取保藏号：CCTCC M 2013606的解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowialipolytica cmq6-8)，加水至菌体细胞的浓度达到0.2～0.3g/ml，调pH为6.8～7.2，加甘油至浓度为1～3%（v/v）；
（2）往步骤（1）的溶液中加入底物苯乙酮至浓度为30～60mmol/L，在温度25～35℃的条件下反应至少24h，即可。
步骤（1）中，所述菌体细胞的浓度为0.25g/mL。
步骤（1）中，调节pH为7.0。
步骤（1）中，所述甘油的浓度为2%（v/v）。
步骤（2）中，所述底物苯乙醇的浓度为45mmol/L。
步骤（2）中，所述反应温度为30℃。
步骤（2）中，所述反应时间为36h。
步骤（2）中，在添加底物苯乙酮时，同时添加乙醇至浓度为1～3（v/v）。优选地，所述乙醇浓度为2（v/v）。
本发明解脂耶氏酵母，能够高效地将苯乙酮转化成(R)-苯乙醇，可以兼顾转化率和产物纯度，转化获得的产物纯度（产物e.e.值）大于99%，同时，底物转化率高达78.4%，工业应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1基于26S rDNA D1／D2区域序列和Neighbor-Joining法构建的系统发育树
具体实施方式
实施例1本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的鉴定特征
1、鉴定方法
将从成都某手性化工厂污水处理池附近采集的土壤样品中分离得到的本发明菌株，进行如下生理生化和分子生物鉴定。
（1）生理生化特征
利用显微镜及肉眼观察细胞及固体平板上的菌落形态，并根据《酵母菌的特征与鉴定手册》所列的酵母菌种鉴定方法进行生化特征分析。
（2）分子生物学鉴定
a、酵母基因组DNA提取：参考《酵母基因组提取试剂盒》的操作说明，提取酵母基因组DNA。
b、26S rDNA D1／D2区域的PCR扩增：26S rDNA D1／D2区域的PCR扩增采用通用引物对NL1(5′-GCAT CAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)PCR反应体系(50μL)：10×PCR缓冲液，5.0μL；Mg2+(5mmol／L)，3.0μL；dNTP(各2.5mmol／L)，4.0μL；引物(10μmol／L)各1.0μL；TaqDNA聚合酶0.5μL；模板DNA2.0μL；去离子水33.5uL。扩增程序为：94℃10min；94℃1min，50℃1min，72℃1min；35个循环后72℃10min。取5μL产物于1%的琼脂糖凝胶（含GV染料）电泳，紫外灯下观测结果。
c、序列分析和系统树的构建：将扩增出的PCR产物40μL,送华大基因公司（北京）完成测序工作。根据供试菌株的26S rDNA序列，运用Blast程序在GenBank数据库中分别进行同源序列搜索。根据同源序列搜索的结果，下载相关菌种的26S rDNA序列，与供试菌株的序列一同用Clustal X1．83软件进行多序列比对，结果采用MEGA3．1中的邻接法(Neighbor．Joining)进行系统树的构建，并用Bootstrap对进化树进行1000次可信度分析。
2、鉴定结果
（1）生理生化特征
菌落成圆形,边缘整齐,乳白色,不透明,有光泽,质地软；显微镜下菌株cmq6-8的细胞呈卵圆形,无菌丝体、未见出芽，有子囊孢子，有掷孢子产生；糖发酵试验:麦芽糖+,葡萄糖+，乳糖-；碳源同化试验:麦芽糖+,乳糖V,甘露醇V；未形成类淀粉化合物；在葡萄糖浓度为50%时菌未生长；可以分解尿素。
（2）26S rDNAD1／D2区域序列分析
PCR获得了本发明菌株的26S rDNA D1/D2区域序列长度为593bp，利用BLAST软件将该序列与GenBank中收录的DNA序列进行比对，并与相关菌种构建进化树(如图1所示)。图中显示本发明分离菌株与解脂耶氏酵母ATCC18942（AF335986）聚成一支，序列同源性﹥99.00%，表明两者亲缘关系最近。
结合生理生化特征和分子生物学鉴定结果，将本发明分离菌株鉴定为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，命名为解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowialipolytica cmq6-8)，并于2013年11月27日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M2013606。
实施例2采用本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)将苯乙酮转化为(R)-苯乙醇的方法
1、实验材料
1、斜面培养基：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，ddH2O1000mL，pH自然。
2、种子培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，ddH2O1000mL，pH7.0。
3、发酵培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，(NH4)2SO45g，KH2PO42g，ddH2O1000mL，pH7.0。
4、实验菌株：本发明保藏号为CCTCC M2013606的解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolytica cmq6-8)。
2、实验方法
（1）、菌体细胞的培养
种子培养：用无菌牙签从PDA斜面上挑取少量菌苔接种于20mL种子培养基中，30℃，170r/min，摇床培养24h。
发酵培养：按5%的接种量将种子液接入50mL发酵培养基中，30℃，170r/min，摇床培养48h。
收集菌体细胞：收集发酵液，于6000r/min，4℃，离心10min后即得菌体细胞，并于60℃、加热3min，热处理后用于转化。
（2）、转化
a、取步骤（1）制得的解脂耶氏酵母，加水至菌体细胞浓度为0.2g/ml，调pH为6.8，加甘油至浓度为1%（v/v）；
b、往步骤a的溶液中加入底物苯乙酮至浓度为30mmol/L，同时添加乙醇至浓度为1%（v/v），作为底物助溶剂，在温度25℃的条件下反应24h，即可。
实施例3采用本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)将苯乙酮转化为(R)-苯乙醇的方法
1、实验材料
1、斜面培养基：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，ddH2O1000mL，pH自然。
2、种子培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，ddH2O1000mL，pH7.0。
3、发酵培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，(NH4)2SO45g，KH2PO42g，ddH2O1000mL，pH7.0。
4、实验菌株：本发明保藏号为CCTCC M2013606的解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolytica cmq6-8)。
2、实验方法
（1）、菌体细胞的培养
种子培养：用无菌牙签从PDA斜面上挑取少量菌苔接种于20mL种子培养基中，30℃，170r/min，摇床培养24h。
发酵培养：按5%的接种量将种子液接入50mL发酵培养基中，30℃，170r/min，摇床培养48h。
收集菌体细胞：收集发酵液，于6000r/min，4℃，离心10min后即得菌体细胞，并于60℃、加热3min，热处理后用于转化。
（2）、转化
a、取步骤（1）制得的解脂耶氏酵母，加水至菌体细胞浓度为0.3g/mL，调pH为7.2，加甘油至浓度为3%（v/v）；
b、往步骤a的溶液中加入底物苯乙酮至浓度为60mmol/L，同时添加乙醇至浓度为3%（v/v），作为底物助溶剂，在温度35℃的条件下反应48h，即可。
实施例4采用本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)将苯乙酮转化为(R)-苯乙醇的方法
1、实验材料
1、斜面培养基：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，ddH2O1000mL，pH自然。
2、种子培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，ddH2O1000mL，pH7.0。
3、发酵培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，(NH4)2SO45g，KH2PO42g，ddH2O1000mL，pH7.0。
4、实验菌株：本发明保藏号为CCTCC M 2013606的解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolytica cmq6-8)。
2、实验方法
（1）、菌体细胞的培养
种子培养：用无菌牙签从PDA斜面上挑取少量菌苔接种于20mL种子培养基中，30℃，170r/min，摇床培养24h。
发酵培养：按5%的接种量将种子液接入50mL发酵培养基中，30℃，170r/min，摇床培养48h。
收集菌体细胞：收集发酵液，于6000r/min，4℃，离心10min后即得菌体细胞，并于60℃、加热3min，热处理后用于转化。
（2）、转化
a、取步骤（1）制得的解脂耶氏酵母，加水至菌体细胞浓度为0.25g/ml，调pH为7.0，加甘油至浓度为2%（v/v）；
b、往步骤a的溶液中加入底物苯乙酮至浓度为45mmol/L，同时添加乙醇至浓度为2%（v/v），作为底物助溶剂，在温度30℃的条件下反应36h，即可。
（3）、转化率和纯度检测
按照体积比1:1的量向转化体系中加入乙酸乙酯，充分震荡后，静止2～3min，于6000r/min，4℃，离心10min，取上清液进行GC检测。
GC检测：使用GC-960气相色谱仪，HP Chiral 10％ 3-Cyclodextrin手性色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；检测条件：载气为氮气，进样器、色谱柱和FID检测器温度分别为220℃、110℃和200℃；分流比为1:100；进样量为0.1mL。分别以底物的转化率(Conversion)和产物的对映体过量值(e.e.value)表示反应的转化程度和立体选择性，其表达式如下：
Conversion(%)=C苯乙醇/C0×100(1)
e.e.(%)=|(CR-Cs)|/(Cs+CR)×100(2)
其中，C0为底物的初始浓度，C苯乙醇为反应终止时的产物浓度，CR和Cs分别为R-型和S-型产物的浓度。
3、实验结果
检测发现，采用本发明方法转化苯乙酮，最终获得的产物中，(R)-苯乙醇的e.e.值﹥99%，底物转化率为78.4%。
采用现有解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)转化苯乙酮，难以兼顾转化率和产物纯度（产物e.e.值），转化率为55-70%时，产物e.e.仅为75%左右，产物e.e.接近100%时，转化率最高仅25%。
而采用本发明解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolytica cmq6-8)转化苯乙酮，在制得纯度大于99%的(R)-苯乙醇的同时，转化率也高达78.4%，克服了现有解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)难以兼顾转化率和产物纯度的缺陷。
综上，本发明解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolytica cmq6-8)可以高效转化苯乙酮，在制备得到纯度高的(R)-苯乙醇的同时，转化率也非常高，具有优良的应用前景。

Claims (10)

1.一种解脂耶氏酵母，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC M 2013606的解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowia lipolyticacmq6-8)。
2.一种将苯乙酮转化为(R)-苯乙醇的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取保藏号：CCTCC M 2013606的解脂耶氏酵母cmq6-8(Yarrowialipolytica cmq6-8)，加水至菌体细胞的浓度达到0.2～0.3g/mL，调pH为6.8～7.2，加甘油至浓度为1～3%（v/v）；
（2）往步骤（1）的溶液中加入底物苯乙酮至浓度为30～60mmol/L，在温度25～35℃的条件下反应至少24h，即可。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述菌体细胞的浓度为0.25g/mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，调节pH为7.0。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述甘油的浓度为2%（v/v）。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述底物苯乙醇的浓度为45mmol/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述反应温度为30℃。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述反应的时间为36h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，在添加底物苯乙酮时，同时添加乙醇至浓度为1～3%（v/v）。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述乙醇浓度为2%（v/v）。
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